BREVE REVISÃO SOBRE A DETECÇÃO DE GLIFOSATO, AMPA E CHIQUIMATO POR HPLC UV OU FC

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(1)BREVE REVISÃO SOBRE A DETECÇÃO DE GLIFOSATO, AMPA E CHIQUIMATO POR HPLC-UV OU FC. Jéssica da Silva Carnietto 1 Simone Noremberg Kunz 2. Resumo: O Glifosato é um herbicida amplamente utilizado para controle de ervas daninhas em diferentes culturas. Apesar de não possuir alta toxicidade, o seu uso indiscriminado pode causar danos ao meio ambiente e a população em geral. Existem poucos estudos sobre o comportamento e absorção deste composto e de seus metabólitos nas plantas e a determinação destes em tecido vegetal é importante para que este modo de ação seja elucidado. Através de um levantamento bibliográfico com consulta em sites como o Periodico Capes, Science Direct e Google Acadêmico, foi realizado a escolha dos parâmetros cromatográficos e derivatizantes para a determinação de glifosato, AMPA e ácido chiquímico a fim de determinar esses analitos em capim Annoni.. Palavras-chave: Cromatografia, glifosato, ácido chiquímico. Modalidade de Participação: Iniciação Científica. BREVE REVISÃO SOBRE A DETECÇÃO DE GLIFOSATO, AMPA E CHIQUIMATO POR HPLCUV OU FC 1 Aluno de graduação. jhecarnietto@gmail.com. Autor principal 2 Docente. simonenoremberg@unipampa.edu.br. Orientador. Anais do 9º SALÃO INTERNACIONAL DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO - SIEPE Universidade Federal do Pampa | Santana do Livramento, 21 a 23 de novembro de 2017.

(2) BREVE REVISÃO SOBRE A DETECÇÃO DE GLIFOSATO, AMPA E CHIQUIMATO POR HPLC-UV OU FC 1. INTRODUÇÃO O glifosato [N-(fosfonometil)glicina] é um herbicida sistêmico, pós-emergente e não seletivo largamente utilizado na agricultura. O glifosato pertence ao grupo químico dos aminoácidos fosfonados e tal como seu precursor, a glicina, apresenta comportamento zwiteriônico, com separação de duas cargas em pH neutro, uma positiva no grupo amino e uma negativa no grupo fosfonato (COUTINHO e MAZO, 2005). As concentrações mais altas de glifosato e seu metabólito, o ácido aminometilfosfônico (AMPA), tem sido encontradas em folhagens novas. A degradação do glifosato no solo é muito rápida e efetuada por grande variedade de microrganismos que usam o produto como fonte de energia e fósforo, produzindo AMPA como principal metabólito. A degradação de AMPA é geralmente mais lenta do que aquela atribuída ao glifosato (DICK e QUINN, 1995). O modo de ação do glifosato consiste na alteração de diferentes processos bioquímicos vitais nas plantas, como a biosíntese de aminoácidos, proteínas e ácidos nucléicos. O herbicida é absorvido pelo tecido vivo e translocado, via floema, através da planta para raízes e rizomas, e sua ação inibe enzimas específicas como a enolpiruvil shikimato-3-fosfato sintase (EPSP) suspendendo a síntese de aminoácidos aromáticos. As plantas tratadas com glifosato morrem lentamente, em poucos dias ou semanas, e devido ao transporte por todo o sistema, nenhuma parte da planta sobrevive (COUTINHO e MAZO, 2005). A toxicidade relativamente baixa pode ser atribuída à modalidade bioquímica de ação do glifosato em um caminho metabólico nas plantas (chamado mecanismo GR iFLGR ³VKLNLPLFR´ VLPLODU DR H[LVWHQWH HP DOJXQV PLFURRUJDQLVPRV PDLV complexos, não existindo, entretanto, em animais (AMARANTE JUNIOR et al., 2002). A inibição competitiva da EPSPS pelo glifosato resulta no acúmulo de chiquimato nos tecidos afetados. Este acúmulo pode ser uma alternativa para a detecção de populações resistentes a este herbicida (BRESNAHAN et al., 2003). No Brasil constata-se o crescente aumento no consumo de agrotóxicos em razão, principalmente, da expansão da fronteira agrícola e do aumento de terras onde é praticado o plantio direto. Dentre os agrotóxicos consumidos, o glifosato é o ingrediente ativo situado em primeiro lugar no ranking de comercialização no país, representando 76% da comercialização da classe de uso de herbicidas, sendo reportada a comercialização de 71 marcas comerciais de produtos formulados à base de glifosato, por 20 diferentes empresas registrantes (REBELO et al., 2010). De modo geral, existem poucas informações sobre o efeito de absorção e translocação de herbicidas ervas daninhas. A avaliação da absorção de herbicidas pela planta a fim de comparar as diferentes formulações é uma alternativa para minimizar a resistência desta aos agrotóxicos e minimizar o uso exagerado desses compostos. Além disso, em função da ampla utilização do glifosato em todo o mundo, o desenvolvimento de métodos de extração e análise que permitam a detecção e quantificação do herbicida em amostras naturais são de suma importância. Portanto, o presente trabalho tem por objetivo fazer um levantamento através da revisão da literatura dos parâmetros cromatográficos para análise de glifosato, AMPA e ácido chiquímico, para posterior determinação destes analitos por.

(3) cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com detecção ultravioleta (UV) ou por fluorescência (FC). 2. METODOLOGIA O processo metodológico consistiu em pesquisa nos sites Periódico Capes, Science Direct e Google Acadêmico artigos sobre as técnicas utilizadas para extração e análise do glifosato, AMPA e chiquimato. Utilizou-se das palavras-chave: cromatografia líquida, glifosato, AMPA e ácido chiquímico ou chiquimato (em português ou inglês). Foram selecionados os artigos com método de separação por cromatografia líquida e detecção por UV (Detector de arranjo de diodos-DAD) ou FC, pois são as técnicas disponíveis para análise em nosso campus ou que aplicassem o preparo da amostra em matrizes semelhantes ao capim annoni, o qual será analisado neste trabalho posteriormente. 3. RESULTADOS e DISCUSSÃO A pesquisa gerou um elevado número de trabalhos, destes foram selecionados aqueles que traziam preparo de amostras de tecido foliar ou detecção dos analitos pelas técnicas de interesse. A tabela 1 nos demonstra alguns dos métodos e reagentes mais utilizados para extração e determinação do glifosato, seu metabólito AMPA e chiquimato. Nesta tabela, observa-se o método de separação e detecção utilizado, a amostra analisada, como esta amostra foi preparada com os reagentes de extração e purificação, os parâmetros cromatográficos (coluna e fase móvel (FM)), o derivatizante, o limite de detecção (LD) e a referência utilizada. Tabela 1: Extração e determinação de glifosato, AMPA e chiquimato por cromatografia líquida (LC) com detecção UV ou fluorescente Método Amostra Preparo da Parâmetros Derivati LD Ref. /analito amostra Cromatográficos zante LC-UV/ Água GLY. LC-UV/ Água GLY solo. Extração CH3OH/ filtração. e Extração água: H3PO4/ filtração extração solo: KH2PO4 em água LC-UV Sucos de Membrana /Gly e frutas líquida AMPA suportada. Coluna: C18 CNBF FM: A- ACN 0,01 M Btampão fosfato mM 50 e pH 2,5 com ácido fosfórico Coluna: troca iônica FM: KH2PO4 com adição de H3PO4 (85%). -. Coluna: C18, FM: tampão KH2PO4 0,06 M e ACN. TsCl. 0,009 QIAN et mg/L al., 2009. 9,93 µg/L. DA SILVA, 2009. 0,025 KHROLEN mg/L KO e WIECZOR EK, 2005.

(4) LCDAD/ Chiqui mato.. Conyza bonariensi s (buva). LCDAD/ Chiqui mato. Eichhornia crassipes (aguapé). LCMadeira DAD/G de LY e Eucalipto AMPA. Extração com HCl 1 M/ agitação e filtração Extração: CH3OH ou Água/ maceração. Coluna: NH2, FM: água acidificada - 1% H2PO4 e ACN. -. -. CARDINA LI et al., 2015. Coluna: OSD FM: A- ACN B- 0,1% H3PO4 em água. -. 2,65 JP L. CARDOS O, 2013. 0,3 mg/L. PIMENTA, 2016. Extração sólidolíquido/ Centrifuga ção Extração Cloreto de metileno/ centrifugaç ão. Coluna: C8 FMOCFM: A- H3PO4 Cl 0,2% e B- ACN FMOCCl. 0,16 µg/L. NEDELKO SKA e LOW, 2004. LC-FC/ Diferentes GLY e culturas AMPA (frutas, grãos, sementes, etc) LCÁgua FC/GL Y, AMPA e Glufosi nato LCCana-deExtração: MS/MS açúcar e água /GLY, acidificada Eucalipto AMPA, Chiqui mato. OPA/M ERC. 7,5 µg/L. ABAKERLI e FAY, 2003. OPA/ MERC. 0,1 µg/L. PIRES, 2015. LC-FC/ Água/vege GLY e tação AMPA. Coluna: Amino poliméricas FM: A-ACNtampão fosfato 50 mM B- ACN-água Extração Coluna: Aminex Clorofórmi A-9 o e HCl FM: 0,0005 M 0,1M/ KH2PO4 e 4% Centrifuga de CH3OH em ção água Filtração Coluna: troca iônica FM: 92% KH2PO4 0,010M e 8% CH3OH Coluna: C18 FM: A- Acetato de amônio (5 Mm) em água B- Acetato de amônio (5 Mm) em CH3OH. -. -. GOMES et al., 2015. LC-Liquid Chromatography FMOC-Cl: 9-fluorenylmethyl chloroformate OPA: oftalaldeído MERC: 2-mercaptoetanol CNBF: 4-chloro-3,5-dinitrobenzotrifluoride GLY: Glifosato TsCl: p-toluenesulphonyl chloride. Através das referências consultadas, verificou-se que para amostras de tecido foliar ou plantas o solvente de extração mais frequentemente utilizado é água.

(5) (acidificada ou não) e/ou metanol, portanto estes serão os reagentes selecionados para os testes preliminares com as amostras de capim annoni. Após, estas serão centrifugadas ou filtradas. Para a detecção por fluorescência, observa-se que o principal derivatizante utilizado nos trabalhos atuais é o FMOC-Cl e este leva a limites de detecção mais baixos quando comparado com OPA/MERC em amostras diferentes da água. Já para a detecção por UV/DAD este derivatizante pode ser utilizado, assim como o CNFB ou TsCl. Tanto fase normal como fase reversa podem ser usadas para a separação dos analitos. Primeiramente será selecionada a fase reversa (C18) para os testes, por ser a mais comumente utilizada e disponível em nosso laboratório. A maioria dos estudos utiliza como fase móvel tampão fosfato e acetonitrila ou metanol, conseguindo-se separações eficientes e com boas recuperações. 4. CONSIDERAÇÕES FINAIS A literatura consultada apresenta variados tipos de preparo de amostras e detecção para os analitos. Selecionou-se técnicas simples de extração, ou seja, com poucas etapas e solventes, com boas recuperações, a fim de evitar perdas e contaminação. Foi encontrada somente a detecção de chiquimato por DAD ou MS, portanto para tentar a detecção simultânea dos três analitos os testes serão realizados com LC-DAD utilizando CNFB e FMOC-Cl como derivatizantes e coluna C18. Após esta primeira etapa de revisão e definição dos parâmetros de extração e separação a serem testados, serão realizados os ensaios para escolha dos que levam a uma maior eficiência e resolução na separação, além de melhor seletividade. Também serão avaliados os efeitos da matriz e recuperação através de testes com as amostras de capim annoni fortificadas. 5. REFERÊNCIAS ABAKERLI, R.B.; FAY, E.F. Validação de métodos para análise de N(FOSFONOMETIL) glicina (glifosato) e ácido aminometilfosfônico (ampa) por HPLC e detecção por fluorescência em culturas. In: Congreso Virtual Iberoamericano sobre Gestión de Calidad en Laboratorios; 2003; Valladolid. Congreso Virtual Iberolab; 2003. AMARANTE Jr., O. P.; DOS SANTOS, T. C.R; BRITO, N.M.; RIBEIRO, M. L. Métodos de Extração e Determinação do Herbicida Glifosato: Breve Revisão. Química Nova, V. 25, N. 3, p. 420-428, 2002. BRESNAHAN, G.A.; MANTHEY, F.A.; HOWATT, K.A.; CHAKRABORTY, M. Glyphosate applied pre harvest induces shikimic acid accumulation in hard red spring wheat (Triticum aestivum). Journal of Agricultural and Food Chemistry, V. 51, N. 14, p. 4004- 4007, 2003. CARDINALI, V.C.B.; DIAS, A.C.R.; MUELLER, T.C.; ABERCROMBIE, L.; STEWART Jr., C.N.; TORNISIELO, V.L.; CHRISTOFOLETTI, P.J. Shikimate accumulation, glyphosate absorption and translocation in horseweed biotypes. Planta Daninha, v. 33, n. 1, p. 109-118, 2015..

(6) CARDOSO, S.F. Avaliação de Eichhornia crassipes como fonte de ácido chiquímico. Dissertação (Monografia em Farmácia- Bioquímica), Faculdade de Ciências )DUPDFrXWLFDV GH $UDUDTXDUD 8QLYHUVLGDGH (VWDGXDO 3DXOLVWD ³-~OLR GH 0HVTXLWD )LOKR´ $UDUDTXDUD COUTINHO, C. F. B.; MAZO, L. H. Complexos metálicos com o herbicida glifosato: revisão. Química Nova, V. 28, N. 6, p. 1038-1045, 2005. DA SILVA, B.M. Desenvolvimento de metodologia simples, rápida e sem etapa de clean- up para determinação de glifosato em amostras ambientais de água e solo por HPLC/UV- VIS. Dissertação (Mestrado em Ciência- Química Analítica), Instituto de Química de São Carlos, Universidade de São Paulo, São Carlos, 2009. DICK, R.E.; QUINN, J.P. Glyphosate-degrading isolates from environmental samples: occurrence and pathways of degradation. Applied Microbiology and Biotechnology, V. 43, N.3, p. 545-550, 1995. GOMES, G.L.G.C.; CARBONARI, C.A.; VELINI, E.D.; TRINDADE, M.L.B.; and SILVA, J.R.M. Extraction and simultaneous determination of glyphosate, AMPA and compounds of the shikimic acid pathway in plants. Planta Daninha, Viçosa-MG, v. 33, n. 2, p. 295-304, 2015. KHROLENKO, M.V.; WIECZOREK, P.P. Determination of glyphosate and its metabolite aminomethylphosphonic acid in fruit juices using supported-liquid membrane preconcentration method with high-performance liquid chromatography and UV detection after derivatization with p-toluenesulphonyl chloride. Journal of Chromatography A, v. 1093, p. 111-117, 2005. PIMENTA, E.M. Extração de glifosato e ácido aminometilfosfônico da madeira de eucalipto e quantificação por HPLC-ICP-MS/. Dissertação (Mestrado em Produção Vegetal), Instituto de Ciência Agrárias da Universidade Federal de Minas Gerais, Universidade Federal de Minas Gerais, Montes Claros, 2016. PIRES, N.L. Expansão da fronteira agrícola e presença de glifosato e AMPA em amostras de água da região de Santarém (PA): Desafios analíticos para o monitoramento. Dissertação (Mestrado em Meio Ambiente e Desenvolvimento Rural), Faculdade Universidade de Brasília Planaltina, Universidade de Brasília, Brasília, 2015. QUIAN, K.; TANG,T.; SHI, T.; FANG, W.; LI, J.; CAO, Y. Residue determination of glyphosate in environmental water samples with high-performance liquid chromatography and UV detection after derivatization with 4-chloro-3,5dinitrobenzotrifluoride. Analytica Chimica Acta, v. 635, p. 222-226, 2009. REBELO, R. M.; VASCONCELOS, R. A.; BUYS, B. D. M. C.; REZENDE, J.A.; MORAES, K. O. C.; OLIVEIRA, R. P.; Produtos agrotóxicos e afins comercializados em 2009 no Brasil: uma abordagem ambiental. Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis ± Brasília: IBAMA, 2010..

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