EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE CINCO EXTRACTOS VEGETALES DE ESPECIES ALTOANDINAS FRENTE A
DISTINTOS MICROORGANISMOS DE IMPORTANCIA CLÍNICA
CAMILO ANDRES HUERFANO RODRIGUEZ
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
Bogotá D.C., Colombia Junio 7 de 2018
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE CINCO EXTRACTOS VEGETALES DE ESPECIES ALTOANDINAS FRENTE A
DISTINTOS MICROORGANISMOS DE IMPORTANCIA CLÍNICA
CAMILO ANDRES HUERFANO RODRIGUEZ TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para optar por el título de MICROBIOLOGO INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
Bogotá D.C., Colombia Junio 7 de 2018
DEDICATORIA
Dedico este trabajo a todas las personas que me acompañaron en el transcurso de mi carrera, en especial a mis padres y hermano, por ser el apoyo incondicional en los momentos en que más necesite su ayuda.
Aquellas personas quienes me acompañaron durante este largo proceso y contribuyeron en mi formación como persona íntegra.
A las buenas amistades que contribuyeron con sus consejos y buenos deseos para culminar con gran satisfacción.
Camilo Andres Huerfano Rodriguez.
AGRADECIMIENTOS
En primer lugar, quiero agradecer a la Universidad Pontificia Universidad Javeriana donde adquirí conocimientos y viví experiencias las cuales me han servido para formarme como profesional integral. Han sido varias las personas que han contribuido durante el proceso de este proyecto, ante todo quiero agradecer a Marcela Franco Correa directora y Martha liliana Pinzón codirectora de esta tesis quienes me apoyaron de manera personal y profesional para lograr la conclusión de esta investigación; al Jardín Botánico de Bogotá José Celestino Mutis por suministrar los materiales y equipos para el progreso de este escrito; a mis docentes, tutores y compañeros que ya sea de manera directa e indirecta me acompañaron con pequeños aportes durante el desarrollo de esta tesis.
CONTENIDO RESUMEN ... 10 ABSTRACT ... 11 1. INTRODUCCIÓN ... 12 2. MARCO TEÓRICO ... 14 2.1.MICROORGANISMOS ... 14 2.1.1. Escherichia coli ... 14 2.1.2. Klebsiella pneumoniae ... 15 2.1.3. Pseudomonas aeruginosa ... 16 2.1.4. Staphylococcus aureus... 17 2.1.5. Candida albicans ... 17 2.2.ESPECIES VEGETALES ... 18 2.2.1. Berberis goudotti ... 18 2.2.2. Clethra fimbriata ... 19 2.2.3. Espeletia argentea ... 20 2.2.4. Espeletiopsys corymbosa ... 21 2.2.5 Tibouchina grossa ... 22
2.3.ENSAYOS DE ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA ... 23
2.3.1. DIFUSIÓN EN AGAR... 23
2.3.2. DILUCIÓN Y MICRODILUCIÓN EN CALDO ... 24
2.4.EXTRACTOS VEGETALES ... 24
2.4.1. MÉTODOS DE EXTRACCIÓN ... 25
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN ... 25
3.1. Planteamiento del problema ... 25
4. OBJETIVOS ... 27
4.1 Objetivo general ... 27
4.2.Objetivos específicos ... 27
5. MATERIALES Y MÉTODOS ... 27
5.1.Muestreo ... 27
5.2.Preparación del material vegetal ... 28
5.3.Obtención del extracto vegetal ... 28
5.4.Concentración del extracto vegetal ... 29
5.5.Reactivación y caracterización de microorganismos ... 29
5.6.Prueba de actividad antimicrobiana ... 30
5.7.Concentración Mínima Inhibitoria ... 31
5.8.Diseño experimental y análisis estadístico ... 32
6. Resultados y Discusión ... 32
6.2 Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) ... 35
7. CONCLUSIÓN ... 38
8. RECOMENDACIONES ... 39
9. BIBLIOGRAFÍA ... 40
10. Anexos. ... 45
Figura 1. Berberis goudotti. Fuente: Instituto de Investigación de Recursos Biológicos Alexander von Humboldt. ... ¡Error! Marcador no definido. Figura 2. Clethra fimbriata. Fuente: Plantas de Colombia ... ¡Error! Marcador no definido. Figura 3. Espeletia argentea. Fuente: Plantas de Colombia ... ¡Error! Marcador no definido. Figura 4. Espeletiopsis corymbosa. Fuente: Naturalista ... ¡Error! Marcador no definido. Figura 5. Tibouchina grossa. Fuente: Naturalista ... ¡Error! Marcador no definido. Figura 6. Metodología utilizada para el ensayo de CMI. Fuente: Elaboración propia ... ¡Error! Marcador no definido.
Figura 7. A.) Porcentaje de inhibición de la actividad antimicrobiana obtenida del extracto de Tibouchina grossa frente a Staphylococcus aureus y Candida albicans, ………..35
TABLAS
Tabla 1. Taxonomía, nombre común y ubicación de recolección del material ... 28 Tabla 2. Peso (g) del material vegetal a utilizado para la extracción y cantidad (ml) de solvente utilizado ... 29 Tabla 3. Porcentaje de rendimiento total de los extractos etanólicos de las cinco especies
vegetales ... 33 Tabla 4. Porcentajes de inhibición del crecimiento obtenido en la prueba realizada para evaluar la actividad antimicrobiana de los extractos (30mg/ml) frente a cinco microorganismos... 34 Tabla 5. Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de los extractos vegetales frente a los
microorganismos de prueba. ... 36 Tabla 6. Densidades ópticas a 625 nm de los controles y de los tubos con la concentración del extracto vegetal frente a Staphylococcus aureus. ... 37
Anexo 1. ………45 Anexo 2. ………49 Anexo 3. ………50 Anexo 4. ………51 RESUMEN
Este trabajo se realizó en los laboratorios de la Subdirección Científica del Jardín Botánico de Bogotá José Celestino Mutis, con el fin de observar y evaluar la actividad antimicrobiana
in vitro y la Concentración Mínima Inhibitoria de los extractos etanólicos vegetales de Berberis goudotti, Clethra fimbriata, Espeletia argentea, Espeletiopsys corymbosa y Tibouchina grossa; especies priorizadas dentro del proyecto “Investigación para la conservación de los ecosistemas y la flora de Bogotá D.C. y la región” sobre cinco microorganismos de importancia clínica como Candida albicans, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae y Pseudomonas aeroginosa.
A partir de las hojas secas, trituradas y maceradas en frío, se obtuvieron y concentraron los extractos etanólicos vegetales. En estos se evaluó la actividad antimicrobiana mediante la técnica de difusión en agar, midiendo halos de inhibición en cajas de petri que contenían el microorganismo a probar sobre agar Mueller Hinton (MH). Además, se llevó a cabo el ensayo y cálculo de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) mediante el método de diluciones seriadas en caldo nutritivo.
Como resultado se evidenció que el extracto etanólico de Tiobuchina grossa fue el único que presentó actividad antimicrobiana frente a Staphylococcus aureus y Candida albicans, en una concentración de 30 mg/ml.
De este trabajo se concluyó que el extracto de las hojas de Tibouchina grossa presenta actividad antimicrobiana sobre microorganismos de importancia clínica. Lo que tiene grandes implicaciones si se tiene en cuenta que en la actualidad no se reportan estudios enfocados sobre la evaluación de la actividad antimicrobiana de esta especie.
ABSTRACT
This work was carried out in the laboratories of the Scientific Subdirection of the Botanical Garden of Bogotá José Celestino Mutis, in order to observe and evaluate the in vitro antimicrobial activity and the Minimum Inhibitory Concentration of the plant ethanolic extracts of Berberis goudotti, Clethra fimbriata, Espeletia argentea, Espeletiopsys corymbosa
and Tibouchina grossa; prioritized species within the project "Research for the conservation of the ecosystems and flora of Bogotá D.C. and the region "on five microorganisms of clinical importance such as Candida albicans, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae and Pseudomonas aeroginosa.
From the dried leaves, crushed and cold macerated, the vegetal ethanolic extracts were obtained and concentrated. In these, the antimicrobial activity was evaluated by the agar diffusion technique, measuring inhibition halos in petri dishes containing the microorganism to be tested on Mueller Hinton agar (MH). In addition, the assay and calculation of the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) was carried out using the serial dilution method in nutrient broth.
As a result it was evidenced that the ethanolic extract of Thiobuchina grossa was the only one that presented antimicrobial activity against Staphylococcus aureus and Candida albicans, at a concentration of 30 mg / ml.
From this work it was concluded that the extract of the leaves of Tibouchina grossa presents an antimicrobial activity on microorganisms of clinical importance. What has great implications if you have at present no studies focused on the evaluation of the antimicrobial activity of the species.
1. INTRODUCCIÓN
La resistencia antimicrobiana de la mano con el incremento de nuevas especies bacterianas y el surgimiento de mecanismos de resistencia, constituyen una amenaza constante para la salud pública. Igualmente, el uso excesivo y frecuente de los antimicrobianos en los tratamientos clínicos de diversas enfermedades, provocan modificaciones en la ecología bacteriana así como el incremento de microorganismos resistentes (Camulombo, 2017). En
las bacterias, los genes que codifican para los mecanismos de resistencia surgen como consecuencia del uso específico de antibióticos o de resistencia cruzada, afectando el uso de otros antibióticos de la misma clase, con el mismo mecanismo de acción o incluso de compuestos de familias diferentes. En ocasiones, estos genes se encuentran asociados en una misma estructura genética – integrones- dando lugar a la coselección de resistencia; fenómeno que consiste en mantener genes en la bacteria con la capacidad de conferir resistencia a un antimicrobiano, mediante el uso de un agente antimicrobiano no emparentado (Mosquito, 2011). Staphylococcus aureus ofrece una muestra de la evolución por parte de los microorganismos para generar resistencia contra antimicrobianos, ya que en la actualidad casi todas sus cepas hospitalarias son resistentes a la penicilina, bencilpenicilina y algunas lo son a la meticilina y gentaminicina (Cabrera, 2007).
El conocimiento de las propiedades medicinales de las plantas se ha transmitido entre las comunidades humanas para diversos fines, incluyendo el tratamiento de enfermedades infecciosas. Los compuestos activos producidos durante el metabolismo secundario vegetal son generalmente responsables de diversas actividades biológicas. Actualmente, los datos sobre la actividad antimicrobiana de productos de numerosas plantas se han confirmado científicamente, algunas de estas bien conocidas y seguramente otra gran cantidad por conocer. Es por esto que realizar bioprospección enfocándose en las plantas, como fuente potencial de moléculas con actividad antimicrobiana, es una opción que debe ser tenida en cuenta como recurso principal en la búsqueda de antibióticos (Ramírez, 2017).
Berberis goudotti o uña de gato es una especie endémica de Colombia que se encuentra presente en la región Andina, especialmente en los páramos de los departamentos de Antioquia, Boyacá y Cundinamarca. Clethra fimbriata o manzano se distribuye a lo largo de las cordilleras Central y Oriental, entre Colombia y Ecuador. Tibouchina grossa, conocida coloquialmente como siete cueros, se distribuye en la región de los Andes, desde Venezuela hasta Ecuador. En cuanto a los frailejones, distribuidos a lo largo de la Cordillera Oriental, Espeletia argéntea es endémica del país mientras que Espeletiopsys corymbosa es nativa de Colombia y Venezuela (Bernal, 2015).
Hoy en día, no se tiene suficiente información sobre el uso de los extractos de estas especies altoandinas como agentes antimicrobianos. Debido a esto y con el propósito de promover la conservación a través de la generación del conocimiento, el Jardín Botánico de Bogotá está desarrollando investigaciones enfocadas al respecto.
2. MARCO TEÓRICO
2.1. MICROORGANISMOS 2.1.1. Escherichia coli
Bacilo Gram negativo de 1 – 3 µm por 0.5 µm perteneciente a la familia
Enterobacteriaceae. Se presenta de forma individual, en pares, cadenas cortas o agrupadas; es móvil debido a la presencia de flagelos peritricos; no forma esporas y generalmente es no capsulado. Adicionalmente, crece a una temperatura óptima de 37°C y se desarrolla mejor en un pH de 7. Produce ácido y gas; fermenta grandes números de carbohidratos, entre ellos, lactosa; produce ácido sulfhídrico en algunos medios; es indol positivo, rojo de metilo positivo, Voges Proskauer (VP) negativo y no utiliza el citrato (Chasin et al., 2017). Escherichia coli es una especie predominante de la microbiota normal del aparato digestivo en el hombre y animales de sangre caliente, y desempeña un papel importante en la fisiología del intestino (Méndez et al., 2008). No obstante, hay cepas que pueden ser patógenas y ocasionar daño produciendo diferentes cuadros clínicos, entre ellos diarrea (Rodríguez et al. , 2002).
Las cepas patógenas de Escherichia coli se clasifican en diferentes grupos, con mecanismos de virulencia determinados que potencian su patogenicidad y en consecuencia dan origen múltiples infecciones y síntomas. Dentro de los mecanismos de virulencia de las cepas toxigénicas de Escherichia coli se encuentra la producción de proteínas – enterotoxinas- como la termolábil (TL), termoestable (TS) o ambas. La primera de estas toxinas es una proteína de alto peso molecular, bioquímicamente similar a la toxina de Vibrio cholerae (Lizcano et al, 2008). Debido a estas características, este microorganismo es considerado uno
de los principales patógenos involucrados en enfermedades de transmisión alimentaria, generando no solo altos costos económicos para el sector público sino en muchos casos hasta la muerte (Reuben et al., 2003).
2.1.2. Klebsiella pneumoniae
El género Klebsiella pertenece a la familia de Enterobacteriaceae. Este género se caracteriza por ser un bacilo Gram negativo inmóvil y no esporulado; que se presenta de forma individual, en pares o cadenas cortas (Podschun et al., 1998). Son anaerobias facultativas, su temperatura óptima de crecimiento está entre los 37 - 40°C, son catalasa y ureasa positiva, oxidasa negativa, fermentan lactosa, pueden utilizar el citrato como fuente de carbono y se diferencian del resto de enterobacterias por la capacidad que tiene la mayoría de sus cepas para fijar el N2 (Martínez, 2014).
Las especies del género Klebsiella se pueden encontrar en diversos ambientes como suelos, plantas, aguas residuales e incluso colonizando el tracto intestinal de mamíferos. K. pneumoniae es un microorganismo patógeno oportunista causante de infecciones del tracto urinario y neumonías adquiridas por el hombre (Carpenter et al., 1990).
Dentro de los principales factores de patogenicidad que presenta este género se encuentra la cápsula y la endotoxina; factor antifagocitario y lipopolisacárido presente en la pared celular del microorganismo respectivamente (Sureda et al., 2011). Adicionalmente, entre estos mecanismos se destaca la producción de betalactamasas junto con la pérdida o modificación de porinas en la membrana externa, lo que disminuye la permeabilidad del microorganismo y le confiere resistencia a los antibióticos betalactámicos. Estas enzimas hidrolizan el anillo betalactámico uniéndose a él mediante un enlace no covalente y adicionando una molécula de agua, de manera que el antibiótico betalactámico pierde sus propiedades y no se une a las proteínas captadoras de penicilina (Echeverri et al.,2010).
La facilidad con la que K. pneumoniae se transmite en el ambiente hospitalario, el incremento de cepas multirresistentes que dificultan el tratamiento de las infecciones causadas, las estancias hospitalarias prolongadas y una tasa de mortalidad que, según algunos autores, es de 27.3% convierten a este microorganismo en un agente de gran importancia clínica (Martínez et al., 2014; Echeverri et al., 2010).
2.1.3. Pseudomonas aeruginosa
El género Pseudomonas pertenece a la familia Pseudomonadaceae. Es un bacilo Gram negativo aerobio de 1.5 a 5 µm por 0.5 µm. Se caracteriza por ser un microorganismo no esporulado; móvil por presencia de uno o más flagelos polares; oxidasa y catalasa positiva; fermentador de lactosa; con temperatura óptima de crecimiento entre los 30 - 37°C y un pH de 4 – 8. No obstante, pueden sobrevivir y multiplicarse en casi cualquier ambiente
(Pellaroni et al.,1992).
Se considera que este microorganismo es un patógeno multifactorial puesto que su virulencia no se atribuye a un único determinante sino a la presencia de distintos factores como adhesinas, exotoxinas, proteasas, hemolisinas y el sistema de secreción tipo III; principal factor de virulencia que transporta toxinas directamente desde la bacteria adherida a la célula infectada (Ruiz et al., 2007). Pseudomonas aeruginosa presenta colonias color azul-verdoso debido a la producción de pigmentos como la piocianina; compuesto que produce múltiples efectos citopáticos en las células de los mamíferos. Esta especie se considera como uno de los patógenos humanos más importantes debido al tipo de infecciones causadas (piel, tracto urinario y respiratorio) y a su mortalidad asociada (Ruiz et al.,2007).
Las infecciones originadas por esta especie están vinculadas al ambiente hospitalario y comprometen las defensas del hospedero, estableciendo un gran problema de orden clínico. La tasa de mortalidad causada por este microorganismo es elevada y varía entre 17 y 50%. Por ejemplo, en pacientes adultos con bronquiectasias se reporta una tasa del 38% mientras que en pacientes con enfermedades como la fibrosis quistica P. aeruginosa infecta a más del 90%, incrementando el deterioro pulmonar y la mortalidad (Lujan et al.,2014). Cabe resaltar
que los individuos más susceptibles a las infecciones por este microorganismo son los que presentan inmunodeficiencia (Ruiz et al., 2007).
2.1.4. Staphylococcus aureus
Dentro de la familia Micrococcaceae, el género Staphylococcus está conformado por 32 especies, de las cuales, 12 tienen como huésped al ser humano. De estas, Staphylococcus aureus se caracteriza por ser un coco Gram positivo de 0.5 a 1µm, aerobio estricto, que se presenta en parejas, tétradas, cadenas cortas o racimos irregulares. Es inmóvil y no esporulado, B-hemolítico, productor de coagulasa y desoxirribonucleasa termoestable, reductor de nitratos y urea, y resistente a la polimixina (Bareño et al., 2010). Su temperatura óptima de crecimiento es de 37°C y se desarrolla a un pH ligeramente alcalino de 7.6 (Peñaranda et al., 2003).
Este microorganismo es de gran importancia médica ya que desde hace muchos años se le considera como uno de los primeros patógenos para el humano. Es responsable de varias enfermedades como lesiones de la piel e infecciones del sistema nervioso, respiratorio, tracto urinario y nosocomiales. S aureus produce una variedad de enzimas y citotoxinas como hemolisinas, nucleasas, proteasas, lipasas, hialuronidasas y colagenasas. La función principal de estas proteínas es contribuir con la capacidad colonizadora de los tejidos del huésped, causando enfermedad (Bustos et al., 2006).
2.1.5. Candida albicans
El género candida forma parte de la familia Cryptococcaceae, presenta células ovoides de 3-5 µm por 612 µm. Se reproducen por blastimo conidios, crecen generalmente en medios aerobios a una temperatura óptima entre 25 - 37°C y a un pH entre 2.5 - 7.5 (Liebana et al.,2002). Son comensales habituales del ser humano y suelen aparecer en la piel, el aparato digestivo, el tracto genital femenino y la orina de los pacientes con sonda (Espinosa et al., 2005). Existen más de 150 especies de Candida sp., aproximadamente 17 de ellas se consideran patógenas para el ser humano y solo 5 producen más del 90% de infecciones
invasivas (Espinosa et al., 2005). Candida albicans esun hongo que forma parte de la flora normal de la boca, el tubo digestivo y la vagina, y está considerada como la especie patógena más frecuente en el hombre y la más agresiva de las cándidas (Lizcano et al., 2008). Las infecciones causadas por hongos o micosis han aumentado gradualmente a través del tiempo siendo un suceso de preocupación a nivel mundial, debido a la aparición de enfermedades que debilitan el sistema inmune como el VIH, las enfermedades autoinmunes y la desnutrición, entre otros. En estos casos, las micosis son consideradas una de las principales causas de morbilidad y mortalidad, siendo Candida albicans frecuentemente la más aislada (Lobaina et al., 2010).
Aunque la invasión inicial y el aumento de la patogenicidad de esta levadura dependen de las condiciones y los mecanismos inmunes de los hospederos inmunocomprometidos, C. albicans posee factores de virulencia que promueven su habilidad de causar enfermedad (Panizo et al., 2001). Los principales factores de virulencia con los que cuenta este microorganismo son su capacidad de transformar su morfología (polimorfismo), la producción de proteínas especializadas como las adhesinas e invasinas, la secreción de enzimas hidrolíticas como proteasas que facilitan la penetración en las células y la formación de biopelículas sobre la superficie celular en mucosas (Vialas et al., 2016).
2.2.ESPECIES VEGETALES 2.2.1. Berberis goudotti
Orden: Ranunculales Familia: Berberidaceae Especie: Berberis goudotii
Nombre común: Uña de gato, tachuelo, espino
Figura 1. Berberis goudotti. Fuente: Instituto de Investigación de Recursos Biológicos Alexander von Humboldt.
Descripción:
Arbusto que llega a medir 3 m de altura, presenta hojas con pequeñas espinas por los lados de la margen agrupadas en pequeños brotes, con inflorescencias de color amarillo o naranja, frutos en baya y de color morado al madurar.
Distribución geográfica:
Planta nativa (endémica) de Colombia que se encuentra distribuida a lo largo de los departamentos de Antioquia, Meta, Cundinamarca y Boyacá entre los 1900-3960 metros de altura al nivel del mar (Bernal et al., 2017). En Bogotá se ha coleccionado en los páramos de Curubital, la Lechuza, Pasquilla y Sumapaz (JBB, 2017).
Usos:
El género Berberis se caracteriza por ser una fuente importante de diversos tipos de fitoquímicos, entre los que se destacan ácidos orgánicos, compuestos fenólicos y, principalmente, alcaloides como la berberina; compuesto presente en tallos y raíces, al que se le atribuyen propiedades medicinales (Alarcón et al., 2014). Por otro lado, también se destaca la producción de flavonoides como las antocianinas; compuestos de gran interés debido a sus beneficios para la salud y uso potencial como colorantes naturales (Del carpio et al., 2009).
2.2.2. Clethra fimbriata
Orden: Ericales Familia: Clethraceae Especie: Clethra fimbriata
Figura 2. Clethra fimbriata. Fuente: Plantas de Colombia Descripción:
Planta que alcanza entre los 2 y 15 m de altura; sus hojas son simples de color ocráceo, de 3 a 7 cm de longitud; inflorescencia en racimos; espigas terminales o panículas de 1.5 a 2 cm; pétalos en forma ovalada y de color crema a blanco. Las flores exhalan un olor muy perfumado y los frutos se encuentran en cápsulas (Naturalista, 2017).
Distribución geográfica:
Planta nativa de Colombia que se encuentra distribuida a lo largo de los departamentos de Santander, Norte de Santander, Quindío, Boyacá, Caldas, Cesar, Magdalena y Cundinamarca entre los 1830 a 3700 m de altitud sobre el nivel del mar (Bernal et al., 2017). En Bogotá, se encuentra en los cerros Orientales; en los páramos de Curubital, la Lechuza, Pasquilla y Sumapaz; y en las quebradas de Honda, Rosales y la Vieja (JBB, 2017).
Usos:
El género Clethra es cultivado para uso ornamental, su madera es utilizada para carpintería y ebanistería y sus semillas son de alimento para animales silvestres. Adicionalmente, este género tiene propiedades medicinales, por ejemplo, su corteza pulverizada sirve como febrífugo. También, se usa como cerca viva y para la protección de cuencas hidrográficas (Mahecha et al.,2004). 2.2.3. Espeletia argentea Orden: Asterales Familia: Asteraceae
Especie: Espeletia argentea Nombre común: frailejón
Figura 3. Espeletia argentea. Fuente: Plantas de Colombia Descripción:
Planta de 1 a 1.5 m de altura. Las hojas son intrusas en ambas caras, alternas, raramente opuestas, enteras, finamente lanceoladas, o lineales. Sus inflorescencias son amarillas con un diámetro de 3 cm, corimbosas, subtendidas por una escama ligulada, membranacea (Naturalista, 2017).
Distribución geográfica:
Planta nativa de Colombia que se encuentra distribuida a lo largo de los departamentos de Boyacá, Caldas, Cesar, Cundinamarca, Meta y Santander entre los 2600 - 3800 m de altitud a nivel de mar (Bernal et al., 2017). En Bogotá, se ha coleccionado en los páramos de Cruz Verde, San Francisco y Sumapaz (JBB, 2017).
Usos:
Se han reportado estudios de especies del género Espeletia con propiedades medicinales. Estas son usadas en infusiones o cocciones de las hojas, flores y los tallos con el fin de tratar enfermedades de la piel y de la vía respiratoria, como el asma. Además se usa como antitusivo, para el dolor de oído, entre otros (Galvis et al.,2017).
2.2.4. Espeletiopsys corymbosa
Orden:Asterales Familia: Asteraceae
Especie: Espeletiopsis corymbosa
Nombre común: frailejón
Figura 4. Espeletiopsis corymbosa. Fuente: Naturalista Descripción:
Planta que llega a medir hasta 2 m de altura. Presenta hojas simples alargadas con bordes rectos y más anchas hacia las puntas, las hojas basales están dirigidas hacia el suelo separadas por una especie de cintura formando una falda. Es similar al frailejón pero no cuenta con tronco y es de tono amarillento (Camargo et al., 2002).
Distribución geográfica:
Planta nativa de Colombia que se encuentra distribuida a lo largo de los departamentos de Cundinamarca, Boyacá, Meta y Santander entre los 2120 - 4500 m de altitud sobre el nivel del mar (Bernal et al., 2017). En Bogotá, se ha encontrado en el cerro de Monserrate, la quebrada del Chico y los páramos de Chisaca, Cruz Verde, el Retiro, Sumapáz y el Verjon (JBB, 2017).
Usos:
A Espeletiopsis corymbosa se le atribuyen propiedades medicinales similares a Espeletia argéntea porpertenecera la misma familia. En tanto, esta especie se usa en infusiones como antitusivo, para tratar afecciones de artritis y contra enfermedades respiratorias como la bronquitis, entre otros (Galvis et al., 2017).
2.2.5 Tibouchina grossa
Orden: Myrtales
Familia: Melastomataceae Especie: Tibouchina grossa
Nombre común: doradilla, siete cueros rojo-enano. Figura 5. Tibouchina grossa. Fuente: Naturalista
Arbusto que puede crecer hasta los 3 m de alto y presenta una corteza externa exfoliable. Las ramas y hojas son densamente pubescentes, con presencia de pelos ásperos, largos y dorados. Las hojas son simples, opuestas, de forma ovada con margen entera y con indumento café - dorado. Las inflorescencias son panículas terminales o axilares. Las flores son de color rojo, vistosas, grandes, con pubescencia dorada y olor desagradable. El fruto es una cápsula con semillas diminutas (Naturalista, 2018).
Distribución geográfica:
Planta nativa de Colombia que se encuentra distribuida a lo largo de los departamentos de Antioquia, Boyacá, Caldas, Casanare, Cauca, Cundinamarca, Huila, Nariño, Norte de Santander, Putumayo, Quindío, Risaralda, Santander, Tolima y Valle del Cauca entre los 1850 - 4500 metros de altitud al nivel del mar (Bernal et al., 2017). En Bogotá, se ha coleccionado en los páramos del Curubital, Pasquilla, Sumapaz, Verjones; y en las quebradas de las Delicias y la Vieja (JBB, 2017).
Usos:
Tibouchina grossa está constituida por grandes flores de colores vistosos, utilizadas con frecuencia como ornamentales; además esta especie es utilizada para tratar cataratas, dolores de muela y extraer sarcoma de los ojos (Freire et al., 2002). También es empleada en reforestación ecológica por ser una planta nativa (Camargo et al., 2002).
2.3. ENSAYOS DE ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA 2.3.1. DIFUSIÓN EN AGAR
El método de difusión en agar se considera uno de los procedimientos más utilizados para determinar la actividad antimicrobiana de los extractos vegetales sobre microorganismos aerobios (Reyes et al., 2014).
El principio de esta prueba es la difusión del antimicrobiano al medio, generando una zona de inhibición del crecimiento bacteriano o lo que se conoce como formación de halos de inhibición; zona en la que una concentración crítica del antimicrobiano inhibe el crecimiento bacteriano. Los resultados obtenidos se consideran cualitativos, a que la susceptibilidad del
microorganismo está relacionada con el tamaño del halo de inhibición en milímetros. (Reyes et al., 2014).
A nivel metodológico, existen dos formas de realizar la difusión: impregnando un papel filtro con una solución de concentración conocida del extracto y colocándolo sobre la superficie del agar o perforando el agar, con un sacabocados, y vertiendo en el orificio una solución de concentración conocida del antimicrobiano a evaluar (Reyes et al., 2014).
2.3.2. DILUCIÓN Y MICRODILUCIÓN EN CALDO
La prueba de dilución y microdilución en caldo se basa en la exposición de los microorganismos a distintas concentraciones de los antimicrobianos, en diluciones a la mitad, con el objetivo de observar su crecimiento y, con base en este, definir la mínima concentración en la que no se observa turbidez (Cavalieri et al., 2005).
la prueba de dilución y microdilución seriada se realiza en tubos o placas de pocillos con medios líquidos, que contienen concentraciones seriadas crecientes extracto diluidas en caldo, inoculado con una concentración definida de células bacterianas. Posterior a la incubación a temperatura y tiempo óptimo. La presencia de turbidez o sedimentación indican crecimiento visible del microorganismo (Reyes et al., 2014).
2.4. EXTRACTOS VEGETALES
Los extractos vegetales son productos derivados de las plantas o de sus partes, obtenidos a través de procesos de concentración mediante tratamientos con solventes como etanol, éter o agua. Estas sustancias están constituidas por una mezcla de compuestos de interés y principios activos. Dependiendo de la consistencia de los extractos, éstos se clasifican en cuatro grupos: blandos, firmes, secos y fluidos (Lizcano et al., 2008).
Los extractos blandos se caracterizan por tener una consistencia similar a la miel o menos densa dependiendo de la humedad atmosférica; los extractos firmes tienen la particularidad de no adherirse a los dedos; los extractos secos ,conocidos anteriormente como ¨sales esenciales¨, solo contienen del 5 al 8% de agua y se caracterizan porque en ellos el solvente se ha eliminado casi completamente; y los extractos fluidos son preparados de tal forma que el peso del extracto es exactamente igual al peso de la sustancia usada como medicamento (Lizcano et al., 2008).
Por otra parte, la conservación de los extractos es primordial para evitar la cualquier alteración que modifique o varíe la naturaleza del producto y sus principios activos. Entre estas alteraciones se destacan el crecimiento de hongos y microorganismos bacterianos. De ahí que, la conservación resulte indispensable y procure garantizar condiciones de conservación en un ambiente seco, ausencia de luz y los envases deben estar siempre bien tapados (Lizcano et al., 2008).
2.4.1. MÉTODOS DE EXTRACCIÓN
Los métodos de extracción dependen tanto de los compuestos químicos presentes dentro de las plantas como del objeto de la investigación. Mientras que el alcohol es el solvente más utilizado para recuperar metabolitos secundarios, el agua o la solución isotónica (0.9 % NaCl) se emplean en la búsqueda de sustancias para la comprobación de actividad biológica (Alvarado et al., 1996).
Las extracciones se pueden hacer por extracción continua en soxhlet; método que consiste en poner el material seco en una cámara central y el solvente se hace evaporar, mediante calor, en un recipiente en la parte inferior, el vapor del solvente asciende al condensador y gotea sobre el material vegetal. Por reflujo, el material vegetal y el solvente se colocan en un balón al cual se acopla a un refrigerante, este se calienta y el solvente evaporado se condensa y vuelve a mezclarse con el material vegetal y por maceración en frío, el material es triturado continuamente y se mezcla con el solvente (Lizcano et al., 2008).
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN
3.1. Planteamiento del problema
Hipótesis nula: los extractos vegetales de las especies altoandinas evaluadas poseen actividad antimicrobiana sobre Candida sp., Klebsiella sp., Escherichia coli,Staphylococcus aureus y Pseudomonas sp.
Hipótesis alternativa: los extractos vegetales de las especies altoandinas evaluadas no poseen actividad antimicrobiana alguna sobre Candida sp., Klebsiella sp., Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Pseudomonas sp.
3.2. Justificación
Las infecciones causadas por microorganismos multirresistentes se han convertido en un problema para la salud pública. El aumento en la tasa de mortalidad, la baja eficiencia de los tratamientos, entre otros, incrementan el alojamiento hospitalario y los costos de atención clínica, amenazando gravemente el sistema de salud (Hernández, 2014). De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud (OMS) la resistencia a los antimicrobianos genera un gasto anual de 100 billones de dólares a la economía mundial y amenaza la sostenibilidad de la producción de alimentos (Eloit et al., 2016).
La evolución y el surgimiento de microorganismos resistentes a diversos fármacos ha dado paso a la búsqueda de nuevas fuentes de antimicrobianos como las plantas; cuyo contenido de fitoquímicos y su poco o nulo efecto tóxico permiten considerarlas como fuente potencial para la creación de nuevas drogas quimioterapéuticas (Derakhshan et al., 2010). Actualmente, los datos sobre la actividad antimicrobiana de productos de numerosas plantas se han confirmado científicamente, algunos de estos bien conocidos y seguramente otra gran cantidad por conocer; es por esto que realizar bioprospección enfocándose en las plantas como fuente potencial de moléculas con actividad antimicrobiana, es una opción que debe ser tenida en cuenta como recurso principal en la búsqueda de posibles sustancias que eliminen o inhiban el crecimiento de los microorganismos (Ramírez, 2015). A nivel hospitalario, por ejemplo, el uso restringido de extractos vegetales ha impedido el desarrollo de mecanismos de resistencia en los microorganismos. De manera que es posible que estas sustancias pueden inhibir el crecimiento de cepas con resistencia múltiple (Lowy, 2003). Con base en lo anterior, el Jardín Botánico de Bogotá José Celestino Mutis, como centro de investigación y desarrollo científico, busca dentro del proyecto “Investigación para la conservación de los ecosistemas y la flora de Bogotá D.C. y la región” generar conocimiento sobre las propiedades farmacológicas de Berberis goudotii, Clethra fimbriata, Espeletia argentea, Espeletiopsis corymbosa y Tibouchina grossa; evaluando la actividad antimicrobiana de sus extractos frente a distintos microorganismos de importancia clínica. Lo anterior como una primera aproximación a nuevas sustancias con características terapéuticas, a partir de las que se pretende promover el aprovechamiento y la conservación de estas especies.
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo general
Evaluar la actividad antimicrobiana de extractos vegetales de cinco especies altoandinas frente a microorganismos de importancia clínica
4.2.Objetivos específicos
- Realizar la extracción de las hojas de las cinco especies altoandinas evaluadas mediante el método de maceración fría
- Determinar el efecto de los extractos de las cinco especies altoandinas sobre el crecimiento de los microorganismos evaluados
- Establecer la concentración mínima inhibitoria del extracto de las cinco especies altoandinas sobre los microorganismos de estudio
5. MATERIALES Y MÉTODOS 5.1.Muestreo
A partir de los lineamientos dados por la Subdirección Científica del Jardín Botánico de Bogotá (JBB), se seleccionaron cinco especies nativas, que tienen un uso potencial y se encuentran registradas en el área de influencia del JBB. El material vegetal se recolectó en diferentes municipios del departamento de Cundinamarca y en algunas zonas rurales de Bogotá D.C (Tabla 1).
Tabla 1. Taxonomía, nombre común y ubicación de recolección del material
5.2.Preparación del material vegetal
Las hojas de las diferentes especies vegetales se separaron y se secaron utilizando un horno con circulación de aire caliente ajustado a una temperatura entre 30 a 40°C aproximadamente de 48 a 72 horas. Posteriormente, el material se trituró en la licuadora, con el fin de obtener partículas uniformes, y se pesó para conocer la cantidad exacta a utilizar (Tabla 2).
5.3.Obtención del extracto vegetal
El material vegetal seco y triturado se colocó en un frasco de vidrio, al que se le adicionó una cantidad considerable de etanol al 96%, como solvente de extracción, durante 3 días. Luego, el residuo sólido se separó de la parte líquida o extracto etanólico mediante un proceso de filtración. El exceso de etanol se removió a través de destilación a presión reducida usando un rotavapor. Una vez removido todo el solvente, el extracto se dejó secando en una cabina de extracción por 5 días (Tabla 2).
Este procedimiento se realizó dos veces con el fin de obtener una concentración más alta de cada uno de los extractos.
Tabla 2. Peso (g) del material vegetal a utilizado para la extracción y cantidad (ml) de solvente utilizado
*En algunas especies no se registró información respecto al peso inicial del material vegetal
5.4.Concentración del extracto vegetal
La actividad biológica de los extractos se trabajó a una concentración inicial de 30000 ppm. Para lo anterior, 30mg de cada uno de los extractos se disolvieron en 1 ml de
Dimetilsulfóxido (DMSO). Finalmente, se calculó el porcentaje de rendimiento del proceso de extracción para cada una de las especies vegetales de acuerdo a la siguiente fórmula (Ecuación 1).
% Rendimientopesodpelesmoadteerlieaxltvraegcteot(agl )seco(g)x100
Ecuación 1. Fórmula para calcular el porcentaje de rendimiento de los extractos obtenidos
5.5.Reactivación y caracterización de microorganismos
Los microorganismos con los que se trabajó correspondieron a tres cepas Gram negativas ( Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 300053 y Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027), una cepa Gram positiva (Staphylococcus aureus ATCC 25923) y
una levadura, (Candida albicans). Todos procedentes del cepario de la sublínea de Sanidad Vegetal del Jardín Botánico de Bogotá.
El aislamiento de los microorganismos se realizó en cajas de Agar Nutritivo que se incubaron en aerobiosis entre 18 y 24 horas a 37ºC. Posteriormente, su pureza se validó mediante la técnica de tinción de Gram y caracterización macro y microscópica. Por otro lado, se realizaron resiembras periódicas de cada uno de los microorganismos para mantener los cultivos frescos.
5.6.Prueba de actividad antimicrobiana
La evaluación del efecto de los extractos sobre los microorganismos se realizó siguiendo el método de Difusión en Agar (Mesa et al., 2017). En cajas Petri que contenían Agar Müller Hinton (MH) se inoculó la suspensión estandarizada de cada uno de los microorganismos según el patrón 0.5 de McFarland. Luego, las cajas se dejaron incubando dentro de la cámara de flujo laminar durante 15 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, sobre el MH se elaboraron pozos de 0.5 mm que se llenaron con 20 µL de la dilución de cada uno de los extractos o de los controles según fuera el caso. Como control positivo para la mayoría de cepas se utilizó Cloranfenicol a excepción de Candida sp. para la que se usó
Clotrimazol. En cuando al control negativo se empleó DMSO al 100%. Después del servido en los pozos, las cajas se sellaron e incubaron por 24 horas a 37°C. La prueba se realizó por cuadruplicado y los resultados se reportaron como halo de inhibición en milímetros (Ecuación 2).
C = A - B C = Tamaño del halo de inhibición (mm).
A= Tamaño del halo + Tamaño del pozo.
B= Tamaño del pozo.
Ecuación 2. Fórmula para calcular el halo de inhibición observado
Adicionalmente, se estableció el porcentaje de inhibición para cada caso utilizando la siguiente fórmula (Ecuación 3).
% inhibiciónddmc x100
dm = Promedio del halo de inhibición de la muestra. dc = Diámetro
promedio del halo de inhibición del control positivo.
Ecuación 3. Fórmula para calcular el porcentaje de inhibición obtenido
5.7.Concentración Mínima Inhibitoria
El ensayo de Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) permite determinar la mínima concentración exacta de antimicrobiano (en µg/mL) que inhibe el crecimiento visible de un microorganismo después de 24 horas de incubación (Ríos, 2016).
La técnica empleada para hallar la CMI fue la prueba de diluciones seriadas (Moreno et al, 2016); con modificaciones en las concentraciones y volúmenes utilizados. Este prueba consistió en realizar una disolución en base dos de los extractos para obtener concentraciones entre 30 y 0,9 mg /ml de los extractos, posteriormente se tomaron 6 tubos de ensayo con 5 ml de caldo nutritivo en los que se inoculó 5 uL de cada dilución y 5 uL de solución bacteriana a una escala de turbidez de Mc. Farland No.0,5. Para este estudio se incluyeron dos controles uno negativo que consistió en 5ml de caldo nutritivo,0,5 uL de solvente (DMSO) y de solución bacteriana y otro positivo que contenía 5 mL de caldo nutritivo, 0,5 ul de cloranfenicol y de solución bacteriana. Luego de este proceso, se incubó por 24 horas a 37ºC. Pasado este lapso de tiempo se hace lectura observando la turbidez de los tubos comparándolos con los controles. Este proceso se realizó por duplicado (Figura 6) (Moreno et al., 2016).
Figura 6. Metodología utilizada para el ensayo de CMI. Fuente: Elaboración propia
5.8.Diseño experimental y análisis estadístico
Se siguió un estudio experimental cuantitativo que buscó determinar la actividad antimicrobiana, medida en los halos de inhibición, así como, la mínima concentración que inhibe el crecimiento de los microorganismos objeto de estudio. De manera que el diseño contempló 5 tratamientos, correspondientes a los extractos obtenidos de las especies vegetales nativas, cada uno con 4 réplicas por microorganismo. El análisis estadístico se realizó a través de la prueba de ANOVA (Análisis de Varianza) (Lizcano et al., 2008). 6. Resultados y Discusión
A partir del extracto etanólico concentrado, se pudo determinar el porcentaje de rendimiento de las extracciones correspondientes a cada una de las especies nativas evaluadas (Tabla 3). En cuanto a los porcentajes de rendimiento, se obtuvieron diferentes porcentajes para cada una de las especies, siendo el más alto el de Espeletia argentea y el más bajo el de Berberis goudotti con un porcentaje de 20.2 y 10.1% respectivamente.
Tabla 3. Porcentaje de rendimiento total de los extractos etanólicos de las cinco especies vegetales Especie Vegetal Peso seco de material vegetal (gr) Peso de extracto total (gr) % de Rendimiento (mL) Berberis goudotii 39 3,9 10,1 Espeletia argéntea 16 3,2 20,2 Espeletiopsis corymbosa 12 2,1 17,7 Tibouchina grossa 65 12,4 19,1 Clethra fimbriata 34 6,3 18,4
Al respecto, se considera que los principales factores que pudieron intervenir y por ende afectar el rendimiento de la extracción fueron tanto las partes del material vegetal como el tiempo de extracción para las mismas. Por otro lado, el porcentaje de rendimiento está relacionado con la cantidad de compuestos secundarios presentes en las plantas y además solubles en etanol, teniendo en cuenta que los demás componentes (lignina, celulosa, fibra, entre otros) no tienen esa propiedad. De ahí que, a pesar de que el material seco utilizado para la obtención del extracto etanólico de Espeletia argentea fue uno de los menores, su rendimiento de extracción evidencia una mayor presencia de metabolitos secundarios en comparación con las demás. No obstante, cabe resaltar que el material vegetal utilizado no fue el mismo para todas las extracciones.
Los resultados del método de difusión en agar para la evaluación de actividad antimicrobiana de los extractos se muestran en la Tabla 4 y Figura 7.
De todos los extractos evaluados, se evidenció actividad antimicrobiana, únicamente, en el extracto de Tibouchina grossa frente a Staphylococcus aureus y Candida albicans; dos de los cinco microorganismos patógenos probados. Siendo S. aureus en el que se encontró el mayor halo (mm) y porcentaje de inhibición, seguida de la levadura C. albicans. Tabla 4. Porcentajes de inhibición del crecimiento obtenido en la prueba realizada para evaluar la actividad antimicrobiana de los extractos (30mg/ml) frente a cinco microorganismos
Extractos vegetales Cepas microbianas Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Klebsiella pneumoniae Escherichia coli Candida albicans Prom (mm) % inhibic ión Pro m (mm ) % inhibi ción Prom (mm) % inhibi ción Prom (mm) % inhi bició n Prom (mm) % inhibi ción Control* 26 ± 0,068 100 25 ± 0,055 100 25 ± 0,055 100 29 ± 0,142 100 33 ± 0,068 100 Berberis goudotii 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Espeletia argentea 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Espeletiopsis corymbosa 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Clethra fimbriata 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Tibouchina grossa 0,75 ± 0,2 29,3 ± 8,1 0 0 0 0 0 0 0,5 ± 0,00 15± 0,00 *control positivo cloranfenicol para las bacterias y clotrimazol para Candida albicans
Figura 7. A.) Porcentaje de inhibición de la actividad antimicrobiana obtenida del extracto de Tibouchina grossa frente a Staphylococcus aureus y Candida albicans, B.) Crecimiento de Staphylococcus aureus, y C.) Crecimiento de Candida albicans. En estas, (+) es el control positivo
y (E) el extracto vegetal. 6.2 Concentración Mínima Inhibitoria (CMI)
En las tablas 5 y 6 se encuentran los resultados obtenidos de la prueba de dilución en caldo, realizada para la determinación de la CMI del extracto de Tibouchina grossa frente a Staphylococcus aureus. Las absorbancias fueron medidas a 265 nm debido a que la suspensión bacteriana se ajustó al patrón 0.5 de McFarland.
A partir de estos, se evidenció inhibición sólo en la concentración de 30 mg/ml; resultado que confirma lo encontrado en la prueba de difusión en agar.
Tabla 5. Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de los extractos vegetales frente a los microorganismos de prueba.
Extractos vegetales
Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) (30mg/ml)
Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Klebsiella pneumoniae Escherichia coli Candida albicans Berberis goudotii N.P* N.P N.P N.P N.P Espeletia argentea N.P N.P N.P N.P N.P Espeletiopsis corymbosa N.P N.P N.P N.P N.P Clethra fimbriata N.P N.P N.P N.P N.P Tibouchina grossa 30 N.P N.P N.P 30 *No presenta (N.P)
Tabla 6. Densidades ópticas a 625 nm de los controles y de los tubos con la concentración del extracto vegetal frente a Staphylococcus aureus.
Concentración de
extracto (mg/ml) Densidad óptica (DO 625nm) Staphylococcus aureus Control + 0,62 ±0,001 Control - 0,257 ±0,0007 30 0,232 ±0,0007 15 0,262 ±0,0212 7,5 0,272 ±0,0056 3,75 0,253 ±0,0070 1,88 0,275 ±0,0007 0,94 0,289 ±0,0070
Los resultados obtenidos para la actividad antimicrobiana presentada por las hojas de Tibouchina grossa sobre Staphylococcus aureus y Candida albicans; y la prueba de CMI para Staphylococcus aureus, microorganismos involucrados en causar enfermedades infecciosas a seres humanos y generar impacto clínico.
Dicho esto, se puede sugerir que esta especie presenta metabolitos secundarios que pueden estar involucrados en la inhibición del crecimiento de los dos microorganismos. De acuerdo con los resultados reportados por Niño (2007), en donde expone que las especies pertenecientes a la familia Melastomataceae presentan actividad sobre cepas de Saccharomyces cerevisiae, se podría pensar que Tibouchina grossa, al pertenecer a esta, comparte esa capacidad antimicrobiana, afectando el crecimiento de ciertos microorganismos.
En consecuencia, a lo anterior, se sugiere realizar un análisis fitoquímico de las hojas de esta especie, así como, un fraccionamiento del extracto total para identificar y purificar la molécula responsable de generar actividad antimicrobiana frente a Staphylococcus aureus y Candida albicans. Lo anterior, con el fin de contribuir con el conocimiento científico e inducir nuevas investigaciones sobre el uso de esta planta nativa, ya que en la actualidad no se reportan estudios enfocados sobre la evaluación de la actividad antimicrobiana de la especie T. grossa.
Por otro lado, este estudio permitió ver la capacidad de respuesta del extracto frente a microorganismos gram positivos y levaduras con mecanismos de resistencia. Según Lizcano et al (2008), la respuesta de los microorganismos está dada por los mecanismos de resistencia como lo son la bicapa lipídica, conformada por lipopolisacáridos ricos en fosfolípidos, y proteínas la pared celular compleja, compuesta por peptidoglicano en el caso de Gram positivas por lo que presentan menos sensibilidad que las Gram negativas frente a los extractos.
Por último, cabe resaltar que este estudio contribuyó a la generación de conocimiento, ya que en la actualidad no se cuenta con suficiente información veraz y actualizada sobre estas cinco cinco especies y menos en relación con su potencial actividad antimicrobiana.
7. CONCLUSIÓN
● El extracto etanólico de las hojas de Tibouchina grossa fue el único que reveló actividad antimicrobiana frente a microorganismos de importancia clínica, siendo Staphylococcus aureus el microorganismo Gram positivo más sensible a la actividad del compuesto de esta especie vegetal.
● Los microorganismos Gram negativos evaluados no mostraron sensibilidad a ningún extracto.
● El extracto etanólico obtenido de Tibouchina grossa puede servir como base para futuros estudios sobre los compuestos activos que contribuyan al descubrimiento de antimicrobianos de origen vegetal.
● El estudio realizado permitió conocer algunas de las potencialidades de uso de la especie Tibouchina grossa, presente en los ecosistemas altoandinos y de páramo de Bogotá región, contribuyendo al aumento del conocimiento de la misma y por lo tanto a su conservación.
8. RECOMENDACIONES
● Realizar estudios más profundos como lo son la identificación y separación del metabolito secundario, presente en el extracto etanólico de Tibouchina grossa,, responsable de la actividad antimicrobiana reportada en el presente trabajo; con el objetivo de generar alternativas para la obtención de antimicrobianos de origen natural.
● Efectuar estudios in vivo del extracto obtenido, con el fin de verificar su estabilidad frente a factores medio ambientales que puedan interferir en la actividad antimicrobiana descrita en el presente trabajo.
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10. Anexos.
anexo 1 :tablas de las medidas de los halos de inhibicon de los microorganismos evaluadon frente a los cinco extractos en
Eschericha coli Espeletiopsi s corymbosa Espeletia argentea Berberis goudotii Tibouchina grossa Chletra fimbriata R1 3 3 2,5 3 3 - - - - - - - - - - R2 2,5 3 2,5 3 2,5 - - - - - - - - - - R3 2,5 3,5 3,5 3 3 - - - - - - - - - -
R4
3 3 3 3 3
- - - - -
- - - - -
*(-): no presento halo de inhibicon ,(R) numero de replica Staphilococc us aureus Espeletiop sis corymbosa Espeletia argentea Berberis goudotii Tibouchina grossa Chletra fimbriata R1 3 2,5 2,5 2,5 2,5 - - - - - - - 0 0,5 0 R2 2,5 3 2,5 2,5 2,5 - - - - - - - - 0,7 - R3 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 - - - - - 0 0 0 0,8 0 R4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 - - - - - 0 0 0 1 0 speudomonas auroginosa Espeletiopsi s corymbosa Espeletia argentea Berberis goudotii Tibouchina grossa Chletra fimbriata
