Establecimiento de una reacción en cadena de la polimerasa para la detección de bacterias y hongos

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ARTÍCULO

ORIGINAL

Establecimiento

de

una

reacción

en

cadena

de

la

polimerasa

para

la

detección

de

bacterias

y

hongos

Héctor

Javier

Pérez-Cano

∗

CentrodeInvestigaciónBiomédica,FundaciónHospitalNuestraSe˜noradelaLuzI.A.P.,MéxicoD.F.,México

Recibidoel20deagostode2013;aceptadoel12dediciembrede2013 DisponibleenInternetel2deabrilde2014

PALABRASCLAVE Reacciónencadena delapolimerasa; Reacciónencadena delapolimerasa anidada; Conjuntivitis bacteriana; Queratitis bacteriana; Queratitisfúngica; Lentesdecontacto

Resumen Losmétodosdelaboratorioutilizadosparaeldiagnósticodeblefaritis,conjuntivitis

y queratitisincluyendesdeexámenes enfrescoparabúsquedadeparásitos,tincioneshasta

cultivosmicrobiológicosquepuedendurarhasta2semanasparaobtenerelresultado.

Objetivo: Implementar una PCR para la detección de hongos y bacterias grampositivas y

gramnegativasutilizandounmétodoreportadopreviamenteyadaptadoalascondicionesdel

laboratoriodebiologíamoleculardelCentrodeInvestigaciónBiomédicadeLaFundación Hos-pitalNuestraSe˜noradelaLuzI.A.P.(CIB-HOL)utilizandoeltermocicladorAxygen/Maxygene.

Métodos: SerealizóunaextraccióndeADNdecultivosmicrobiológicosdebacterias gramposi-tivas,gramnegativasyhongos.Sehicierondilucionesseriadasparadeterminarlasensibilidad delmétodo.SerealizóPCRparahongosybacterias.Sebuscaronlascondicionesencomúnpara realizarlaPCRenunsolopaso.

Resultados: UtilizandolasdilucionesdelADNseobtuvoproductodeamplificaciónutilizando unacantidadde0.12ngdeADNbacterianoyde0.15ngdeADNfúngico.

Conclusiones:LatécnicadelaPCResunaherramientamuyimportanteparaladetecciónde

ADNdebacteriasyhongoscausantesdeinfeccionesoculares.Permiteamplificarelmaterial

genéticodelagenteetiológicoyfacilitasuobservación,obteniéndoselosresultadosenmenor tiempoqueconlastécnicasconvencionales.

©2013SociedadMexicanadeOftalmología.PublicadoporMassonDoymaMéxicoS.A.Todoslos

derechosreservados.

∗_{Autorparacorrespondencia:CentrodeInvestigaciónBiomédica,FundaciónHospitalNuestraSe˜noradelaLuzI.A.P.,EzequielMontesn.}o 135,Col.Tabacalera,Del.Cuauhtémoc,C.P.06030,México,D.F.

Correoelectrónico:[email protected]

0187-4519/$–seefrontmatter©2013SociedadMexicanadeOftalmología.PublicadoporMassonDoymaMéxicoS.A.Todoslosderechosreservados.

KEYWORDS Polymerasechain reaction; Nestpolymerase chainreaction; Bacterial conjunctivitis; Bacterialkeratitis; Fungalkeratitis; Contactlens

Establishmentofapolymerasechainreactionfordetectionofbacteriaandfungi. Importanceforthediagnosisofocularinfectiousdiseases

Abstract Laboratorymethodsusedforthediagnosisofblepharitis,conjunctivitisandkeratitis rangingfromfreshexaminationstosearchforparasites,gramstainandmicrobiologicalcultures, canlastuptotwoweekstogettheresult.

Objective:ToimplementaPCRforthedetectionoffungiandgram-positiveandgram-negative

bacteriausingapreviouslyreportedmethodadaptedtothemolecularbiologylabat

Biome-dicalResearchCenter,FundaciónHospitalNuestraSe˜noradelaLuzI.A.P.(CIB-HOL),usingthe

thermocyclerAxygen/Maxygene.

Methods:DNAfrommicrobialculturesofGrampositive,Gramnegativeandfungiwereobtained forthePCR.Serialdilutionswereperformedtodeterminethesensitivityofthemethod.PCR wasperformedforfungiandbacteria.WesearchedforcommonconditionsforPCRinonestep

Results:WhenweuseddilutionsofDNA,thePCRwassensitiveto0.12ngtoDNAbacterialand 0.15ngtoDNAfungal.

Conclusions:ThePCRtechniqueisaveryimportantmolecularbiologytooltodetectDNAfrom

bacteria and fungiresponsible of theocular infections.This method allows amplifyingthe

geneticmaterial oftheetiologic agentandtheresultsareobtainedinlesstimethanusing conventionaltechniques.

©2013SociedadMexicanadeOftalmología.PublishedbyMassonDoymaMéxicoS.A.Allrights

reserved.

Introducción

Elojo esel órganoresponsable delacaptacióndela luz, que es el proceso inicial de la visión, y por su posición anatómica está constantemente expuesto a una variedad depatógenos.Sinembargo,cuentaconunsistemade pro-duccióndesustancias,entreellasla lágrimaquecontiene unagrancantidaddecompuestosquímicos,comocitocinas, enzimas,lípidosyelectrólitoscapacesdeformarunabarrera inmunológica para detener cualquier microorganismo que pudieragenerarunainfección1_{.Elorigendeunainfección}

ocular puede ser producto de un trauma, cirugía,uso de lentesdecontactoyotrasenfermedadesenlascualesel sis-temainmunológicoseencuentracomprometido,facilitando eldesarrollodelosagentescausales.Lasinfecciones ocula-ressonproducidasporbacterias,hongos,virusoparásitos. Existen muchos tipos de infecciones oculares, yentre las máscomunespodemos mencionarla conjuntivitis,la que-ratitisylablefaritisoinflamacióncrónicadelospárpados, mayoritariamenteproducidaporestafilococos2---4_.

Las infecciones oculares son una causa importante de morbilidadocular entodo el mundo, con potencialriesgo depérdida de la visión e incluso de la integridad ocular. Laseveridad depende tanto delas condiciones subyacen-tes del paciente como de la patogenicidad del agente infeccioso3,5_{.La conjuntivitis bacteriana, porejemplo, se}

caracteriza por hiperemiaconjuntival de inicio unilateral rápidoacompa˜nadodeedemapalpebralysecreción muco-purulenta.Lainfecciónamenudosevuelvebilateralalos2 díasdeliniciodelpadecimiento.Suincidenciaesdifícilde determinar debidoa que lamayor parte delospacientes no acuden a la ayuda profesional y se tratan empírica-mente, lo que en ocasionespuede agravar la dolencia2,5_.

Otropadecimientoimportantequeponeenriesgolasalud visual es la queratitis asociada al uso de lentes de con-tacto.Existenreportesenlosquesese˜nalaquelaincidencia

es de 30 a 60 por 10,000 ojos al a˜no, o 1:200 a 1:500 usuariospora˜no5_{.Las bacteriasqueconmayorfrecuencia}

producen queratitisasociadaaluso delentesdecontacto sonlosbacilosgramnegativos,principalmentePseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) ySerratia marcescens, aunque también puede estar involucrado Proteus vulgaris o Pro-teusmirabillis,asícomobacteriasgrampositivas,entreellas

StaphylococcusaureusyStaphylococcusepidermidis(S. epi-dermidis),inclusolevadurasdelgéneroCandidayamebas delgénero Acanthamoebayenmenor frecuencialos hon-gosfilamentosos.Laincidenciadequeratitisenusuariosde lentes decontacto es muy baja, pero ocasionalmente los microorganismospuedenserhalladosenlas solucionesy/o enlosmismoslentes5---9_.

Lascirugías ocularesque involucrana lacórneatienen unciertoriesgodeinfecciónpormicroorganismosque nor-malmentehabitanenlasuperficieocular.Sehareportado quelosmicroorganismosaisladosconmayorfrecuenciason bacterias grampositivas ocupando el primer lugar en fre-cuencia S. epidermidis, que proviene de la florahabitual delasuperficieocular5,10,11_.

Existenotrasenfermedadesqueestánrelacionadascon el riesgode infecciónocular. Entre las enfermedadesque involucranlaalteracióndelepiteliocornealpodemos men-cionar las enfermedadesautoinmunescomola orbitopatía tiroidea,elsíndromedeSjögrenyelpenfigoide,entreotras. Las enfermedades sistémicas como la diabetes mellitus, las colagenopatías, el síndrome metabólico o los pade-cimientos que involucran un sistema de inmunosupresión también predisponen al desarrollo de queratitis infec-ciosa debido a la disminuciónde la defensa humoral y/o celular5,12---14_.

Engeneral,losmicroorganismosquehansidoimplicados comoagentescausalesdeconjuntivitis,blefaritisy quera-titisinfecciosasondeorigenbacteriano,predominandolos grampositivos5_{.Loshongosrepresentanalrededordel5-30%}

deloscasos,yconrespecto alosparásitos,los porcenta-jesreportadosson menoresyselesatribuye un1-15%.El parásitomáscomúnqueprovocablefaritisesDemodex folli-culorummientrasquelaqueratitisparasitariaestáasociada conAcanthamoebasp5,15,16_.

Los métodos de laboratorio utilizadospara el diagnós-ticodeblefaritis, conjuntivitisyqueratitisincluyen desde exámenes en fresco parabúsqueda de parásitos y tincio-neshastacultivos microbiológicosque puedendurarhasta 2 semanasparaobtener el resultado17,18_{. Lapresencia de}

microorganismospuedeestar encantidadesmuypeque˜nas yestodependedelapresentaciónclínicadelainfección; porejemplo,sepuedenpresentardesdeabscesoscorneales francos hasta formas más indolentes como la queratopa-tía cristalina en la que se puede encontrar un infiltrado intraestromal pero con una mínima respuesta inflamato-ria y muestra insuficiente para realizar la microbiología clásica19---23_{.Debidoaesto,sehandesarrolladométodosde}

biología molecularparael diagnósticomicrobiológico24---26_.

Sehautilizadolareacciónencadenadelapolimerasa(PCR) directaparavirus, bacterias,hongos yparásitos;PCR ani-dadaparaidentificacióndebacterias;yPCRentiemporeal paratodotipodemicroorganismos27---31_.

Enela˜no2000Jaeggeretal.yCarroletal.describieron unmétodoporPCR,paraladeteccióndehongosybacterias respectivamente,enmuestrasdefluidosoculares32,33_.Estos

trabajosreportanunaaltasensibilidaddelmétodo,algomuy importanteeneldiagnósticodemicrobiologíaoculardebido a la escasa cantidad de material biológico que se puede obtenerenunatomademuestraoftálmica,sinembargo,es necesarioquecadalaboratorioestandaricelascondiciones de trabajo parala obtenciónde resultados satisfactorios. El objetivodelpresente trabajo fuereproducirestas téc-nicas parala detección dehongos y bacterias obteniendo lascondicionesadecuadasparahacerloenunsoloprograma utilizandolas mismas condiciones parala deteccióntanto debacterias comodehongos;esto acortaríaeltiempo de obtenciónde resultadosque beneficiaríaal paciente para obtenerunresultado rápidoyconfiable.Eltrabajo se rea-lizó enellaboratorio debiología moleculardelCentro de Investigación Biomédicade LaFundación HospitalNuestra Se˜noradelaLuzI.A.P.(CIB-HOL).

Material

y

métodos

Se obtuvieron muestras de cultivos microbiológicos de bacterias grampositivas (S. epidermidis), gramnegativas (P. aeruginosa) y hongos (Candida sp.) caracterizados previamenteporobservaciónmicroscópica,macroscópicay utilizando el sistemaautomatizado VITEK 2C (Laboratorio BioMerieux, Francia). Se realizó extracción de ADN utili-zando unkit comercial (Puregene, Qiagen. Maryland, EE. UU.).Lacuantificacióndelmaterialgenéticoseobtuvopor espectrofotometría utilizando el equipo NanoDrop 2000, Thermo Scientific. La PCR para hongos se llevó a cabo usandolosoligonucleótidos5 -CAGGGGAGGTAGTGACAATAA-3 y 5-ACAAATCACTCCACCAACTAAG-3 utilizando una temperaturadealineamiento(Tm)de59◦C;paralaPCRde bacterias se utilizaron losoligonucleótidos 5 -TTGGAGAG-TTTGATCCTGGCTC-3 y 5-ACGTCATCCCCACCTTCCTC-3 con una Tm de 56◦C. Para la PCR anidada se emplearon

MPM BG+ BG–

Control negativo

Figura1 Geldeagarosaal1.5%muestraelproductodePCR de bacterias grampositivas (BG+) y gramnegativas (BG−) de aproximadamente1,300pb.MPM:marcadordepesomolecular.

los oligonucleótidos 5-GGCGGCAKGCCTAAYACATGC-3, 5-GACGACAGCCATGCASCACCTG 3 y 5 -GCGRCTCTCTGG-TCTGA-3 con Tm de 61.4◦C. El programa de PCR en el termociclador Axygen/Maxygene para hongos y bacterias fue:95◦C/15min, después35 cicloscon las temperaturas 94◦C/1min Tm/1min,72◦C/1min;finalmenteuna tempe-raturadeelongaciónde72◦C/10min.SerealizóunaPCRen gradientedetemperaturaparaobtenerunaTmencomún, detalformaquefueraposibleobtenerenunsoloprograma las condiciones necesarias para la detección de hongos y bacterias, optimizando el método y acortando el tiempo de obtención de los resultados. Se realizaron diluciones seriadas1:10,1:100,1:1000y1:10000 paradeterminarla sensibilidaddelmétodo.

ParalaPCRanidadaseutilizaronlosproductosde ampli-ficaciónobtenidosdelaPCRparabacterias;lascondiciones fueron:95◦C/10min,después32ciclosconlastemperaturas 94◦C/30s, 61.4/1min, 72◦C/30syfinalmenteuna tempe-raturadeelongaciónde72◦C/3min.Todoslosproductosde PCRseidentificaronmedianteelectroforesisengelde aga-rosaal1.5%utilizandolascondicionesde90Vdurante40min yGelred 10X paravisualizarlo en untransiluminador UVP BioLite,conluzUVa302nm.

Resultados

Delasuspensiónbacteriana,laconcentracióndeADN obte-nidofuede4ng/␮l,mientrasqueparaelADNfúngicofue de 5ng/␮l; para la PCR se utilizaron3␮l (12ng) de ADN bacterianoy3␮l(15ng)deADNfúngico.Seobtuvieron resul-tadossatisfactorios utilizando la Tm reportada para cada PCR.ElproductodePCRparabacteriasfuede aproximada-mente1,300pb,yelprogramaeneltermocicladortuvouna duraciónde3hy20min(fig.1).ParalaPCRdehongosse obtuvounproductodeamplificacióndeaproximadamente 700pbyeltiempodelprogramadecorridadelaPCRenel termocicladorfuede3hy20min(fig.2).EnlaPCRen gra-dientede temperatura, para realizar la PCR de hongos y

MPM

Control negativo

Control positivo

Figura2 Geldeagarosaal1.5%muestraelproductodePCR dehongosdeaproximadamente700pb.MPM:marcadordepeso molecular.

MPM 1,2ng 0,12ng 0,012ng 0,0012ng

Figura3 Geldeagarosaal1.5%muestraelproductodePCR debacteriasutilizandodiferentescantidadesdeADN.La reac-ciónfuepositivahasta0.12ngdeADNbacteriano.

bacterias en una sola ejecución, las mejores condicio-nes fueron: 95◦C/10min, 35 ciclos con las temperaturas 94◦C/1min56◦C/1min,72◦C/1minyfinalmenteuna tem-peraturadeelongaciónde72◦C/7minconunaduraciónde ejecuciónde3hy10min.ConlaTmde56◦Csepudo ampli-ficartantoelADNfúngicocomoelbacteriano.

Utilizandoesteprograma,serealizóPCRdebacteriasy hongos usando diluciones del ADN respectivo yse obtuvo productodeamplificaciónutilizandounacantidaddehasta 0.12ngdeADNbacteriano(fig.3)y0.15ngdeADNfúngico (fig.4).

Finalmente,enlaPCRanidadaseobtuvounasolabanda deaproximadamente1,000pbparabacteriasgramnegativas y2bandasparabacteriasgrampositivas,laprimerade apro-ximadamente1,050pbylasegundadealrededorde400pb (fig.5).

Discusión

e

interpretación

de

resultados

La PCR es un método de biología molecular que per-miteamplificarel materialgenéticodetalformaqueuna peque˜naporcióndeADNessuficienteparadetectarla pre-senciadebacteriasyhongos.Enunamuestraobtenidapor raspadopalpebralseobtieneunacantidadde3a6ng/␮lde ADNcompuestodeunamezcladondeelmayorporcentaje provienedelascélulasdelsujeto,mientrasqueenun ras-padocorneallacantidaddeADNqueseobtieneesmenor,de 1a3ng/␮l.Enunpacienteconinfecciónocularlacantidad deADNobtenidasiguesiendolamisma,peroelporcentaje deADNprovenientedelosmicroorganismosaumentadebido alaproliferacióndelosmismosenelsitiodelalesión,lo que hace posiblesudetección porPCR; utilizandolos oli-gonucleótidosadecuadospodemosamplificareidentificarsi setratadeunhongoounabacteriay,encasodedetectar un amplificado correspondiente a material genético bac-teriano, es posible identificar si se trata de una bacteria grampositiva o gramnegativa usando laPCR anidada. Uti-lizando como base lostrabajosde Jaeggeretal. yCarrol etal.32,33_{hemoslogradoacortareltiempodeduracióndela}

PCR,obteniendoresultadosenunasolaejecuciónutilizando unaTmencomúnparaladeteccióndehongosybacterias; estoesmuyimportanteparaeldiagnósticopuestoqueesun apoyoparalaterapéuticaoportunayelrestablecimientode lasaluddelpaciente.

Conclusiones

Las pruebas demicrobiología comúnmente utilizadas pue-dentardardeunaa2semanasparaobtenerelresultadode apoyoal diagnóstico oftalmológico,encambio, utilizando

MPM 1,5ng 0,15ng 0,015ng 0,0015ng

Figura4 Geldeagarosaal1.5%muestraelproductodePCR dehongosutilizandodiferentescantidadesdeADN.Lareacción fuepositivahasta0.15ngdeADNfúngico.

MPM G+ G– MPM C– G–

Figura5 Gel deagarosaal 1.5%dela PCRanidada. Enelgel1(panelizquierdo)seobservan2bandasde amplificaciónque correspondenabacteriasgrampositivas(G+).Enelgel2(panelderecho)seobservaunasolabandadeamplificaciónquecorresponde abacteriasgramnegativas(G−).LaPCRseejecutóconuncontrolnegativo(C-).

técnicasdebiologíamolecularpodemosacortaresetiempo locualesbenéficoparaelpacientequesufredeunevento clínicoinfecciosopuesparallevaracabountratamiento efi-cazyoportunoesnecesarioencontrarlacausa.Latécnicade PCResunaherramientamuyimportanteparaladetección deADNdebacteriasgrampositivas,gramnegativasyhongos causantes de infecciones oftalmológicas. Permite amplifi-carelmaterialgenéticodelagenteetiológico yfacilitasu observación,obteniéndoselosresultadosenmenortiempo que utilizandolas técnicasconvencionales. Jaeggeret al. yCarroletal. fueronlospionerosenel desarrollodeuna técnicadebiologíamolecularparaladeteccióndehongosy bacteriasenfluidosoculares.Esmuyimportantequecada laboratorioestablezcasuspropiascondicionesdetrabajoy queseverifiquetantolareproducibilidadcomola sensibili-daddelmétodo.EnestetrabajopudimosestablecerlaPCR paraladeteccióndebacteriasyhongos utilizandounaTm encomúnqueevitahacer2ejecucionesyacortareltiempo en la obtención deresultados, optimizando la técnica ya reportada.

Finaciamiento

Losautoresnorecibieronpatrocinioparallevaracaboeste artículo.

Conflicto

de

intereses

Losautoresdeclarannotenerningúnconflictodeintereses.

Agradecimientos

AlDr.VíctorBautistadeLucioporladonacióndematerial biológico.

AlaFundaciónNacionalMontedePiedad.

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