UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA
FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA
EMPREGO DE REAÇÃO DE POLIMERASE EM CADEIA (PCR)
PARA ANALISAR A PRESENÇA DE CYTAUXZOON FELIS EM
GATOS DOMÉSTICOS (FELIS CATUS) RESIDENTES NO
DISTRITO FEDERAL
Liliane Maria do Rosario Batista Orientadora: Profª. Drª.Giane Regina Paludo
BRASÍLIA – DF DEZEMBRO / 2018
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LILIANE MARIA DO ROSARIO BATISTA
EMPREGO DE REAÇÃO DE POLIMERASE EM CADEIA (PCR)
PARA ANALISAR A PRESENÇA DE CYTAUXZOON FELIS EM
GATOS DOMÉSTICOS (FELIS CATUS) RESIDENTES NO
DISTRITO FEDERAL
Trabalho de conclusão de curso de graduação em Medicina Veterinária apresentado junto à Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária da Universidade de Brasília.
Orientadora: Profª. Drª. Giane Regina Paludo
BRASÍLIA – DF DEZEMBRO / 2018
Ficha Catalográfica
Cessão de Direitos
Nome do autor: Liliane Maria do Rosario Batista
Título do Trabalho de Conclusão de Curso: Emprego de Reação de Polimerase em Cadeia (PCR) para analisar a presença de Cytauxzoon felis em gatos domésticos (Felis catus) residentes no Distrito Federal.
Ano: 2018
É concedida à Universidade de Brasília permissão para reproduzir cópias desta monografia e para emprestar ou vender tais cópias somente para propósitos acadêmicos e científicos. O autor reserva-se a outros direitos de publicação e nenhuma parte desta monografia pode ser reproduzida sem a autorização por escrito do autor.
Liliane Maria do Rosario Batista BATISTA, Liliane Maria do Rosario
Emprego de Reação de Polimerase em Cadeia (PCR) para analisar a presença de Cytauxzoon felis em gatos domésticos (Felis catus) residentes no Distrito Federal / Liliane Maria do Rosario Batista; orientadora Profª. Drª. Giane Regina Paludo. – Brasília, 2018. 30p.
Monografia (Graduação – Medicina Veterinária) – Universidade de Brasília, 2018.
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Folha de Aprovação
Nome do autor (a): BATISTA, Liliane Maria do Rosario
Título: Emprego de Reação de Polimerase em Cadeia (PCR) para analisar a presença de Cytauxzoon felis em gatos domésticos (Felis catus) residentes no Distrito Federal
Trabalho de conclusão de curso de graduação em Medicina Veterinária apresentado junto à Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária da Universidade de Brasília.
Aprovado em 04 de dezembro de 2018
Banca Examinadora
Prof. Drª. Giane Regina Paludo Instituição: Universidade de Brasília
Julgamento: _________________________ Assinatura: __________________________
M.V. MSc Marcela Corrêa Scalon Instituição: Universidade de Brasília
Julgamento: _________________________ Assinatura: __________________________
M.V MSc. Daniela Maciel Figueiredo Instituição: Clínica Mundo dos Gatos
Julgamento: _________________________ Assinatura: __________________________
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Dedico este trabalho a minha mãe, Geralda, por ser uma guerreira e por todos os sacrifícios que fez para garantir que eu fosse o que eu sou hoje.
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Agradecimentos
Aos meus pais por me apoiarem e me auxiliarem a conseguir realizar todos os meus sonhos, sou muito grata por apoiarem as minhas escolhas de vida e me dá as ferramentas para eu conseguir realiza-las.
As minhas amigas, Carolynne Arruda e Tássila Lemos, que me acompanharam por esses 5 anos, fazendo com que o curso sempre tivesse momentos incríveis e fossem cheios de alegrias, mesmo nos dias mais difíceis. Muito obrigada por tornarem os semestres mais loucos e corridos em semestres divertidos e suportáveis. Vocês são incríveis!
A Marcela Scalon, técnica do laboratório de Patologia Molecular, pelo carinho e amizade e por todo o apoio e ajudas durante todo este tempo que passei no laboratório, que devo dizer não foram poucos! Obrigada por tudo!
Não posso deixar de agradecer também a todos os professores que contribuíram com a minha formação acadêmica, é muito bom saber que a Faculdade de Medicina Veterinária da UnB tem muitos bons professores. E meu especial agradecimento vai para a minha Orientadora e Professora Dra. Giane Regina Paludo por todas as oportunidades e aprendizados. Muito obrigada por me proporcionar os PIBICs com os quais aprendi muito e gostei de desenvolver e também obrigada pela oportunidade de realizar estre projeto de conclusão de curso. Você é uma das melhores professoras que eu tive o prazer de ter!
E por fim, gostaria de agradecer ao amorzinho, Luna, que entrou na minha vida para me mostrar que eu sou capaz de amar tanto que não cabe dentro de mim. Obrigada minha gatinha da UnB sou muito feliz por ter tido a oportunidade te cria-la deste a sua primeira semana de vida. Graças a você, hoje também tenho o seu irmãozinho, Artêmis, meu lindo “filhote”! E agradeço a todos os meus pets que hoje são estrelinhas, todos vocês foram muito importantes para mim.
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“Com grandes poderes, vêm grandes responsabilidades!”
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SUMÁRIO
PARTE I: Emprego de Reação de Polimerase em Cadeia (PCR) para analisar a presença de Cytauxzoon felis em gatos domésticos (Felis catus) residentes no Distrito Federal
1. Introdução --- 02 2. Revisão de Literatura --- 02 2.1. Etiologia --- 02 2.2. Histórico --- 03 2.3. Transmissão --- 03 2.4. Ciclo do Cytauxzoon sp. --- 04 2.5. Patogenia --- 05 2.6. Sinais Clínicos --- 05 2.7. Diagnóstico --- 06 2.8. Tratamento --- 06 3. Materiais e Métodos --- 07 4. Resultados e Discussão --- 09 5. Conclusão --- 12 6. Referência Bibliográfica --- 13
PARTE II: Relatório de estágio Final 7. Introdução --- 18
8. Estrutura física --- 18
9. Atividades desenvolvidas --- 18
10. Exames realizados --- 19
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Lista de Abreviaturas e Siglas
ALT – Alanina-transaminase C. felis – Cytauxzoon felis
DNA – Ácido Desoxirribonucleico
EDTA – Ácido Etilenodiaminotetracético EUA – Estados Unidos da América FeLV – Leucemia Viral Felina
FIV – Vírus da Imunodeficiência Felina
GAPDH - Gliceraldeído-3-Fosfato Desidrogenase
HVet-UnB – Hospital Veterinário da Universidade de Brasília MT – Mato Grosso
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase PPT – Proteína Plasmática Total
PR – Paraná
RN – Rio Grande do Norte
rRNA – Ácido Ribonucleico Ribossoma sp. – espécie
spp. – espécies
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RESUMO
Carrapatos são importantes vetores de protozoários, como os da classe
Piroplasmasida, dentre estes hemoparasitas o Cytauxzoon felis é responsável por causar a cytauxzoonose em felinos. O presente trabalho tem o objetivo de pesquisar a presença do referido piroplasmídeo na população de gatos domésticos do Distrito Federal. Foram realizados testes de PCR para infecção por Cytauxzoon felis em 85 amostras de sangue de gatos domésticos. As amostras foram separadas em 3 grupos: Grupo I – amostras positivas para piroplasmídeos no teste molecular; Grupo II – gatos positivos para FIV e/ou FeLV no teste rápido e no exame molecular; Grupo III – amostras com diagnósticos por visualização de inclusões com características morfológicas sugestivas de
Cytauxzoon spp. As amostras dos Grupos I e III apresentavam hemograma para avaliação dos parâmetros hematológicos. Todas as amostras testadas deram negativas para Cytauxzoon felis. Na análise dos parâmetros hematológicos observou-se anemia, trombocitopenia, leucopenia, neutrofilia e linfopenia. Apesar deste trabalho demonstrar que não existe infecção por Cytauxzoon felis nos gatos domésticos provenientes do Distrito Federal, não é possível afirmar que este piroplasmídeo esteja ausente nesta região.
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ABSTRACT
Tick-borne are important protozoan vectors, such as the Piroplasmasida class, among these hemoparasites Cytauxzoon felis is responsible for causing cytauxzoonosis in felines. This study investigate the presence of Cytauxzoon felis
in the domestic cat population of the Federal District. 33333333333PCR tests for infection by Cytauxzoon felis were performed on 85 blood samples from domestic cats. The samples were separated into 3 groups: Group I – positive samples for piroplasmids in molecular test; Group II – positive for FIV and/or FeLV in rapid test and molecular exam; Group III – samples with visualization diagnostics of inclusions with morphological characteristics suggestive of Cytauxzoon spp. Groups I and III samples had hemograma for evaluation of haemotological parameters. All tested samples were negative for Cytauxzoon felis. Anemia, thrombocytopenia, leucopenia, neutrophilia and lymphopenia were observed in the analysis of hematological parameters. Although this work demonstrates that there is no infection by Cytauxzoon felis in domestic cats from the Federal District, it isn’t possible to say that this piroplasmid is absent in this region.
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Parte I: Emprego de Reação de Polimerase em Cadeia (PCR)
para analisar a presença de Cytauxzoon felis em gatos
domésticos (Felis catus) residentes no Distrito Federal
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1.
Introdução
As doenças transmitidas por artrópodes vêm tornando-se importantes nas últimas décadas devido às mudanças de clima e a sua ecologia. Hemoparasitas como os pertencentes a classe Piroplasmasida, se tornam importantes patógenos que circulam entre gatos e seus hospedeiros invertebrados (MICELI et. al., 2013). Esta classe é composta por duas famílias de hemoprotozoário,
Babesiidae e Theileridae (KETZ-RILEY et. al, 2003).
A diferenciação estre as espécies de piroplasmídeos é feita baseando-se nas suas características biológicas: hospedeiros, morfologia da forma intraeritrocítica (piroplasma) e existência/ausência de esquizogonias em alguns tipos celulares. São classificados como: grande (≥3μm) ou pequeno (<3μm) piroplasma; redondo, oval, irregular, piriforme ou baciliforme; parasitando eritrócitos, linfócitos, monócitos e macrófagos (REICHARD et. al., 2005; MICELI et. al., 2013; KETZ-RILEY et. al, 2003).
Os piroplasmas vêm sendo relatados parasitando espécies de felinos em diferentes continentes (KETZ-RILEY et. al, 2003). Entre estes relatos estão os casos de cytauxzoonose, uma doença considerada altamente fatal em gatos domésticos e silvestre causada pelo hemoprotozoário Cytauxzoon felis
(Piroplasmorida:Theileriidae), transmitido pela picada de carrapato (BROWN et. al., 2010; BIRKENHEUER et. al., 2006; REICHARD et. al., 2005; REICHARD et. al., 2009). Essa doença pode causar sintomas como febre, pancitopenia, falência múltiplas dos órgãos e pode evoluir para morte do animal (BIRKENHEUER et. al., 2006).
Este trabalho tem como objetivo avaliar por meio de exame molecular (PCR) a presença de Cytauxzoon felis na população de gatos domésticos residentes no Distrito Federal.
2.
Revisão de Literatura
2.1. Etiologia
O gênero Cytauxzoon foi descrito pela primeira vez por Neitz & Thomas em 1948 e recebeu este nome para descrever diminutos corpos circulares regularmente distribuído e que realizam esquizogonia no citoplasma de macrófagos (AMARAL, 2002). Este gênero pertence ao filo Apicomplexa, classe
Piroplasmasida, ordem Piroplasmorida e família Theileriidae (MEIER & MOORE, 2000; MONTEIRO, 2014; BOWMAN, 2016; JERICÓ et. al., 2017; REICHARD et. al., 2005, MAIA, 2007).
A literatura descreve 5 espécies de Cytauxzoon spp., 3 destas espécies foram identificados infectando ungulados – C. silvicaprae em um Duiker comum (Sylvicapra grimmia) por NEITZ & THOMAS em 1948, C.strepsicerosi em Kudu (Tragelaphus strepsiceros) por NEITZ & DE LANGE em 1956, C. taurotragi em elande (Taurotragus oryx pattersonianus) por MARTIN & BROCKLESBY em 1960 – e 2 espécies infectando felinos – C. felis em gato domésticos (Felis catus) por WAGNER et. al., 1976 e C. manul em Gato-de-pallas (Otocolobus manul) por REICHARD et. al. em 2005.
Os protozoários deste gênero apresentam duas fases: fase intraeritrocitária (piroplasma) e fase tecidual com grandes esquizontes parasitando macrófagos e monócitos (MICELI et. al., 2013).
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2.2. Histórico
O primeiro relato de C. felis em gatos domésticos ocorreu em 1976 na região sudoeste de Missouri, Estados Unidos (WAGNER et. al., 1976; RIZZI et. al., 2015; MAIA, 2007). Na Alemanha em 1984, um filhote de tigre-de-bengala (Pantera tigris) morreu após apresentar quadro clínico com sintomas inespecíficos e o exame histopatológico post mortem revelou formas semelhantes a merozoítas de C. felis no citoplasma de macrófagos presentes na luz e circundando nos vasos sanguíneos de linfonodos, baço, pulmões, fígado, rins, coração, intestino cérebro e medula óssea, além de terem sido observados o piroplasmídeos parasitando eritrócitos (JAKOB & WESEMEIER, 1996).
Ao longo dos anos, foram observados Cytauxzoon sp. infectando diversas espécies de felinos silvestres de vida livre e de cativeiros (MAIA, 2007). Apesar de ter mais de 42 anos deste o primeiro relato de C. felis pouco se sabe sobre a epidemiologia deste parasita (WAGNER et. al., 1976; BIRKENHEUER et. al., 2006).
Cytauxzoonose representa um grande problema aos gatos domésticos (Felis catus) dos Estados Unidos, tendo sua prevalência no início e no final do verão coincidindo com as atividades do vetor, Dermacentor variabilis
(MEINKOTH et. al., 2000). Infecções por Cytauxzoon felis também já foram relatadas na Espanha (Luaces et. al., 2005; MILLÁN et. al., 2007).
No Brasil, essa doença é raramente diagnosticada nos felinos domésticos e silvestres, e pouco se sabe sobre os possíveis reservatórios e espécies de carrapatos responsáveis por sua transmissão. A importância clínica e a prevalência do C. felis ainda estão em discussão (MAIA, 2007). O primeiro relato de diagnóstico ocorreu em 1988, em um leão (Panthera leo) do zoológico do Rio de Janeiro, onde o exame histopatológico demonstrou inúmeros esquizontes em macrófagos, ocluindo vasos de diversos órgãos (SOARES, 2001).
MAIA et. al. (2013) realizaram o primeiro diagnóstico molecular de
Cytauxzoon felis em um gato doméstico de 5 anos de idade proveniente do Rio de Janeiro, Brasil. Estes autores realizam a extração do DNA de amostras de sangue e utilizaram oligonucleotídeos específicos para o gene 18S rRNA do C.
felis para a realização da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e posteriormente foi realizado o sequenciamento genético confirmando a infecção do animal por esse hemoprotozoário.
2.3. Transmissão
A transmissão do Cytauxzoon felis ocorre pela da picada do carrapato que se contamina ao ingerir o sangue de um felino infectado, e o transmite a outro saudável durante seu repasto. É descrito por diversos autores que
Dermacentor variabilis (Acari:Ixodidae) é o vetor responsável por causar infecções por este agente (REICHARD et. al., 2009; REICHARD et. al., 2010; RIZZI et. al., 2015; MENDES-DE-ALMEIDA et. al., 2007; MACALUSO et. al., 2002). Contudo, REICHARD et. al (2009) relatam a participação do Amblyomma americanum (Acari:Ixodidae) como vetor nas infecções de gatos domésticos no Estados Unidos.
As espécies sugeridas como vetores do C. felis não são encontradas no território brasileiro, o que indica a participação de outras espécies como
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possíveis vetores para este hemoparasita (MENDES-DE-ALMEIDA et. al., 2007; ANDRADE, 2007). Este agente já foi identificado por técnicas moleculares nas espécies brasileiras de carrapato A. cajennense, A. triste e Boophilus microplus
(ONUMA, 2014).
Ainda não há relatos de transmissão direta de Cytauxzoon felis
(MENDES-DE-ALMEIDA et. al., 2007). Contudo, AMARAL (2002) cita ser possível ocorrer a transmissão iatrogênica dos trofozoítas do Cytauxzoon felis, onde ocorrerá somente a forma eritrocitária.
2.4. Ciclo do Cytauxzoon sp.
O carrapato contaminado com o C. felis inocula os esporozoítas que irão infectar os macrófagos intravasculares, e assim desenvolvem-se dentro dessas células por meio de fissão multinucleada formando esquizontes com vários merozoítas dentro. Cada célula é infectada por apenas um único esporozoíta. Após a completa maturação dos merozoítas ocorre a ruptura da célula hospedeira e estes merozoitas livres então infectam os eritrócitos circulantes (FIGURA 1) (AMARAL, 2002; REICHARD et. al., 2010).
Os merozoítas entram nas hemácias sem causar a ruptura da sua membrana. Durante a entrada dos merozoítas, estes sofrem fissão binária formando trofozoítas, que são capazes de invadir outros eritrócitos (FIGURA 1) (AMARAL, 2002; AMARAL, 2006). Normalmente o eritrócito é parasitado por 1 ou 2 trofozoítas, mas pode acontecer de ser parasitado por até 4, levando a formação de cruz-de-malta (AMARAL, 2006).
Figura 1: Ciclo de vida Cytauxzoon felis.
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O cytauxzoon felis multiplica-se por fissão binária na fase eritrocitária, e por esquizogonia na fase tecidual (AMARAL, 2002; ANDRADE, 2007). O ciclo no carrapato ainda não foi elucidado, mas é possível usar como base o ciclo de outras espécies de piroplasmídeos, como o C. taurotragi, para entender como ocorrer o desenvolvimento do C. felis no vetor (AMARAL, 2006).
2.5. Patogenia
Cytauxzoon felis possui uma fase eritrocitária e uma fase tecidual. A fase tecidual consiste no desenvolvimento de um esquizonte dentro de macrófagos, monócitos e histiócitos (MICELI et. al., 2013; MEINKOTH et. al., 2000; MEIER & MOORE, 2000, MAIA, 2007). Alguns autores, como MEIER & MOORE (2000) denominam a fase tecidual de fase leucocitária. A fase tecidual pode ocorrer em qualquer órgão, geralmente ocorrendo mais em pulmão, baço, fígado e linfonodo (MEINKOTH et. al, 2000).
Na fase eritrocitária os piroplasmas são pleomórficos, podendo apresentar-se de forma oval, arredondada, puntiforme, piriforme, em anel de rubi, alongada ou em tétrades, medindo de 0,5 a 2,5μm. O núcleo possui cor azul escuro a roxo, enquanto o citoplasma é azul pálido (MEIER & MOORE, 2000; AMARAL, 2006). Normalmente a parasitemia ocorre em 1 a 2% das hemácias, contudo, em animais próximos ao óbito a parasitemia pode chegar até 25% dessas células (MEIER & MOORE, 2000).
Na fase leucocitária os fagócitos mononucleares possuem esquizontes em diferentes fases de desenvolvimento. Estes são pleomórficos, mas na sua maioria apresentam-se na forma arredon0dada e possuem dimensões de 15 – 250μm (MEIER & MOORE, 2000; AMARAL, 2002). As células mononucleares parasitadas normalmente são observadas em impressões de tecidos, mas também podem ser visualizadas em esfregaços de sangue periféricos (MEIER & MOORE, 2000).
A fase tecidual é a responsável pela manifestação clínica da cytauxzoonose. A infecção de gatos domésticos com os esquizontes geralmente ocasiona o desenvolvimento de uma doença sistêmica progressiva, rápida e com prognóstico desfavorável. Praticamente todos os animais vem a óbito após a infecção, e a terapia costuma ser ineficaz, devido à isso, a eutanásia costuma comum quando os gatos são diagnosticados. Entretanto, existem alguns relatos de animais que sobreviveram a doença, recebendo algum tipo de terapia e outros sem tratamento (REICHARD et. al., 2010; ANTUNES et. al., 2018; MEINKOTH et. al., 2000).
2.6. Sinais Clínicos
Na fase eritrocitária animal pode apresentar anorexia, depressão, febre alta, desidratação, icterícia, dispneia, sensibilidade à palpação e esplenomegalia. As alterações encontradas no hemograma podem compreender a anemia hemolítica regenerativa e leucopenia por linfopenia (MAIA, 2007; MEIER & MOORE, 2000).
Durante a fase leucocitária, a cytauxzoonose pode apresentar como sintomas: pirexia, anorexia, letargia, depressão, dispneia, desidratação, icterícia, pancitopenia, hepatomegalia, esplenomegalia, tromboembolismos associado a angústia respiratória e a morte pode ocorrer em questão de dias após a infecção
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(REICHARD et. al., 2010; ANTUNES et. al., 2018; MEINKOTH et. al, 2000; ANDRÉ et. al., 2017; BIRKENHEUER et. al., 2006; MEIER & MOORE, 2000; MAIA, 2007). Normalmente são encontradas como alterações anemia normocítica normocrômica, leucopenia, trombocitopenia, aumento de glicose, alanina transaminase (ALT) aumentada, hiperproteinemia e hipoalbuminemia (AMARAL, 2002).
No Brasil as infecções de gatos domésticos pelo C. felis são na sua maioria assintomáticas, sendo mais observados as manifestações clínicas nos felinos silvestres (ANTUNES et. al., 2018).
2.7. Diagnóstico
O diagnóstico pode ser realizado pela identificação do Cytauxzoon felis
em eritrócitos e monócitos durante a avaliação dos esfregaços sanguíneos (MEINKOTH et. al., 2000; MAIA, 2007; BIRKENHEUER et. al., 2006), contudo poucos animais infectados apresentam o parasita circulando no sangue (MAIA, 2007), o que pode corroborar com o fato de haver poucos relatos de identificação por este tipo de técnica no Brasil (ANTUNES et. al., 2018).
Normalmente a infecção é melhor observada na necropsia (BIRKENHEUER et. al., 2006). Já o diagnóstico clínico é difícil, pois os sinais e sintomas costumam ser inespecíficos. O teste de imunofluorescência indireta (IFI) é capaz de detectar hemoparasitas semelhantes ao Cytauxzoon sp. em tecidos esplênicos de gatos infectados experimentalmente (MAIA, 2007). Testes sorológicos para anticorpo anti-Cytauxzoon vem sendo usados experimentalmente, mas ainda não estão disponíveis comercialmente (BIRKENHEUER et. al., 2006).
Devido aos dados obtidos em estudos filogenéticos e ecológicos torna-se possível o emprego de técnicas de diagnóstico molecular para pesquisas de hemoparasitas, como o Cytauxzoon felis, que aliadas ao sequenciamento genético possibilitam o conhecimento da diversidade genética e dos possíveis hospedeiros para os piroplasmas (MAIA, 2007). BIRKENHEUER et. al. (2006) desenvolveram um teste de PCR sensível e específico para Cytauxzoon felis
capaz de facilitar o diagnóstico clínico de felinos com cytauxzoonose, além de auxiliar nos estudos epidemiológicos. O Diagnóstico molecular quando comparado a outros métodos de diagnóstico, como sorologia e imunofluorescência, apresenta maior sensibilidade e especificidade (MONTAÑO, 2014).
2.8. Tratamento
Não existe uma terapia definida, e as tentativas de tratar a cytauxzoonose vem tendo pouco sucesso. Um estudo usou uma combinação de Atovaquona, Azitromicina e tratamento de suporte e observou taxa de sobrevivência de 60% dos gatos sobreviveram (RIZZI et. al., 2015).
MEINKOTH et. al. (2000) citam em seu estudo o emprego de agentes antimicrobianos, como Clindamicina, Penicilina G, Enrofloxacina e Doxiciclina juntamente com tratamento de suporte, e obtiveram uma recuperação clínica de gatos com cytauxzoonose. Eles relatam também o tratamento por dipropionato de imidocarb (duas doses de 6mg/kg IM q13d) em um gato que também obteve
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recuperação clínica, contudo eles também relatam que outros gatos sob este mesmo tratamento vieram a óbito em pouco tempo de doença.
A terapia com Imidocarb é eficaz contra outros protozoários que parasitam hemácias, como Babesia canis, logo é possível que este tenha algum tipo de efeito sob o Cytauxzoon felis, pois existem relatos onde gatos com este tratamento conseguiram sobreviver à doença (MEINKOTH et. al., 2000).
3. Materiais e Métodos
Foram testadas 85 amostras de sangue de gatos domésticos (Felis catus) para infecção por Cytauxzoon felis no Laboratório de Patologia Clínica Veterinária e no Laboratório de Microbiologia e Patologia Molecular da Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária da Universidade de Brasília, Distrito Federal. As amostras foram selecionadas de acordo com a suspeita do diagnóstico laboratorial ou clínico. Foram separadas em 3 grupos: o Grupo I – 51 amostras positivas para piroplasmídeos em teste molecular; Grupo II – 31 amostras positivas para FIV e/ou FeLV no teste rápido e no exame molecular; Grupo III – 3 amostras de gatos que durante a avaliação do esfregaço sanguineo haviam sido visualizados inclusões com características morfológicas sugestivas de piroplasmas.
As amostras do grupo I eram amostras provenientes da rotina do Hospital Veterinário da UnB e da Clínica Mundo dos Gatos, estas amostras já haviam sido testadas para piroplasmídeos e possuíam o resultado do hemograma. As amostras do grupo II foram coletadas em um abrigo de gatos e em um consultório particular e não foram realizados hemograma. As amostras do Grupo III eram amostras da rotina do Laboratório de Patologia Clínica Veterinária da UnB foram selecionadas devido ao diagnóstico por pesquisa de hemoparasita. Essas amostras foram testadas para piroplasmídeos e para Cytauxzoon felis.
As amostras de sangue foram coletadas em tubos com EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético) para a extração de DNA e realização do hemograma. O DNA foi extraído utilizando kits comerciais (Illustra™ Blood GenomicPrep Mini Spin Kit, GE Healthcare®), seguindo as recomendações do fabricante. O DNA extraído foi armazenado a -20ºC até o momento da realização da PCR.
Para a realização do hemograma, utilizou-se um contador automático de células para uso veterinário (ABC Vet-Horiba® ABX diagnostics) para a determinação do número de hemácias, de leucócitos, de plaquetas e a concentração de hemoglobina. O hematócrito foi realizado pela técnica de micro-hematócrito. As proteínas plasmáticas totais (PPT) foram determinadas com o auxílio de um refratômetro portátil (modelo:SZJ-D). Os valores de volume corpuscular médio (VCM) e a concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM) foram determinados por cálculo padrão. Foram preparados também esfregaços de sangue total, sendo corados com panótico (Instant-Prov NEWPROV®) para realizar o diferencial leucocitário, observar a morfologia das células sanguíneas e fazer a pesquisa de hemoparasitas.
Foi realizado uma padronização do protocolo para PCR de Cytauxzoon felis com base no protocolo utilizado por BIRKENHEUER et. al. (2006). Foram utilizadas duas sequências de oligonucleotídeos para amplificar um fragmento de 284pb do gene 18S rRNA do Cytauxzoon felis (Tabela 1). A reação foi composta por 1X de tampão (Invitrogen®), 1,25U de Taq polimerase, 1,5mM
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𝑀𝑔𝐶𝑙2 (Invitrogen®), 10pmol de cada oligonucleotídeo, 25mM de deoxinucleotídeo (Invitrogen®), cerca de 10ng de DNA, para um volume final de 25μl. A amplificação foi realizada seguindo as condições de desnaturação inicial de 95ºC por 5 minutos, 40 ciclos repetidos de desnaturação a 95ºC por 45 segundos, anelamento a 59ºC por 45 segundos e extensão a 72°C por 60 segundos, e extensão final de 72ºC por 5 minutos no Termociclador (Bioplus® Bio2000, Barueti). Como controle positivo foi utilizado DNA de um animal naturalmente infectado por Cytauxzoon felis e confirmado por sequenciamento genético, enquanto o controle negativo foi a água miliQ. Todas as amostras foram testadas em duplicata.
Foi realizado também PCR para a expressão do gene GAPDH (Gliceraldeído-3-Fosfato Desidrogenase). A PCR deste gene permite avaliar a qualidade da extração, a integridade do DNA obtido e verificar se existiam inibidores de PCR nas amostras negativas. Os oligonucleotídeos utilizados estão descritos na tabela 1. A mistura da PCR do GAPDH foi composta de 1X de tampão, 1,5mM 𝑀𝑔𝐶𝑙2 (Invitrogen®), 1,25U de Taq polimerase (Invitrogen®), 10pmol de cada oligonucleotídeo, 25mM de deoxinucleotídeos (Invitrogen®), 10ng de DNA, para um volume final de 25μl. A amplificação teve desnaturação inicial de 95ºC por 5 minutos seguida de 40 ciclos de amplificação (94ºC por 30 segundos, 52ºC por 1 minuto e 72ºC por 1 minuto) e extensão final a 72ºC por 5 minutos. O produto da reação possui tamanho de 400pb.
Para a PCR de piroplasmídeos foi preparado uma mistura com 1X de tampão, 1,5mM 𝑀𝑔𝐶𝑙2 (Invitrogen®), 1U de Taq polimerase (Invitrogen®), 5pmol de cada oligonucleotídeo, 25mM de deoxinucleotídeos (Invitrogen®), 10ng de DNA, para um volume final de 25μl. A amplificação foi realizada seguindo as condições de desnaturação inicial de 94ºC por 5 minutos, 40 ciclos repetidos de desnaturação a 95ºC por 30 segundos, anelamento a 48ºC por 40 segundos, extensão a 72ºC por 45 segundos e extensão final de 72ºC por 5 minutos. Tendo como produto final de aproximadamente 400pb.
Para a PCR de FeLV foi preparado uma mistura com 1X de tampão, 1,5mM 𝑀𝑔𝐶𝑙2 (Invitrogen®), 1,5U de Taq polimerase (Invitrogen®), 10pmol de cada oligonucleotídeo, 25mM de deoxinucleotídeos (Invitrogen®), 10ng de DNA, para um volume final de 25μl. A amplificação foi realizada seguindo as condições de desnaturação inicial de 94ºC por 5 minutos, com 11 ciclos [94ºC por 1 minuto, 64ºC (-1ºC/ciclo) por 1 minuto, 72ºC por 90 segundos] e 23 ciclos (94ºC por 1 minuto, 53ºC por 1 minuto, 72ºC por 1 minuto) e extensão final de 72ºC por 5 minutos. O produto final tem 927pb.
Para o teste de FIV foi realizado uma PCR Nested, onde para a primeira reação foi preparado uma mistura com 1X de tampão, 2mM 𝑀𝑔𝐶𝑙2 (Invitrogen®), 1,5U de Taq polimerase (Invitrogen®), 10pmol de cada oligonucleotídeo, 25mM de deoxinucleotídeos (Invitrogen®), 10ng de DNA, para um volume final de 25μl. A amplificação teve desnaturação inicial de 96ºC por 4 minutos seguida de amplificação com 12 ciclos [94ºC por 1 minuto, 52ºC (-0,5ºC/ciclo) por 1 minuto e 72ºC por 90 segundos] e 28 ciclos (94ºC por 1 minuto, 46ºC por 1 minuto e 72ºC por 90 segundos) e extensão final a 72ºC por 5 minutos. O produto da reação tem 684pb. E a segunda reação foi preparado uma mistura com 1X de tampão, 2mM 𝑀𝑔𝐶𝑙2 (Invitrogen®), 1,5U de Taq polimerase (Invitrogen®), 10pmol de cada oligonucleotídeo, 25mM de deoxinucleotídeos (Invitrogen®), 10ng de DNA, para um volume final de 25μl. A amplificação foi realizada seguindo as condições de desnaturação inicial de 96ºC por 4 minutos, 40 ciclos
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repetidos de desnaturação a 94ºC por 1 minuto, anelamento a 50ºC por 1 minuto, extensão a 72ºC por 90 segundos e extensão final de 72ºC por 5 minutos. E o produto final tem 329pb.
As sequências de oligonucleotídeos utilizadas estão descritas na tabela 1.
Tabela 1: Sequências de oligonucleotídeos usados nas PCRs
Os produtos das reações para Cytauxzoon felis foram analisados por eletroforese em gel de agarose a 1,5% impregnado com brometo de etídio e observados sob transluminador de fluorescência (UV Transilluminator UVP®). Os produtos da PCR do GAPDH e da PCR para piroplasmídeos, para FIV e para o FeLV utilizaram gel a 2%. Foi utilizado um marcador molecular com intervalo de 100pb em todas as eletroforeses como um padrão de comparação para determinação do tamanho do produto amplificado. O aparecimento de bandas na altura dos pares de bases do controle positivo foi o parâmetro considerado como positivo para as amostras.
Cada etapa dos testes moleculares foi realizada em locais específicos e fisicamente isolados de forma a evitar que uma etapa interferisse ou contaminasse a outra.
4. Resultados e Discussão
Todas as 85 amostras foram negativas para Cytauxzoon felis (Figura 2). A sequência de oligonucleotídeos utilizados neste experimento é específico para Oligonucleotídeos Sequência (5' - 3') Agentes
Identificados Fonte
CXF1 GCG.AAT.CGC.ATT.GCT.TTA.TGC.T Cytauxzoon felis BIRKENHEUER et. al., 2006 CXF2 CCA.ATT.GAT.ACT.CCG.GAA.AGA.G Cytauxzoon felis BIRKENHEUER et.
al., 2006 BT1R GCC.TGC.TGC.CTT.CCT.TA Piroplasmorida
CRIADO-FORNELIO et. al.,
2009 BT1F GGT.TGA.TCC.TGC.CAG.TAG.T Piroplasmorida
CRIADO-FORNELIO et. al.,
2009
A2 AAT.ATG.ACT.GTA.TCT.ACT.GC FIV HOHDATSU et. al.,
1998 S2 TTT.TCT.TCT.AGA.GTA.CTT.TCT.GG FIV HOHDATSU et. al.,
1998
NS TAT.TCA.AAC.AGT.AAA.TGG.AG FIV HOHDATSU et. al.,
1998
NA CTG.CTT.GTT.GTT.CTT.GAG.TT FIV HOHDATSU et. al.,
1998 PCR-S AGC.TAC.TGC.AGT.GGT.GYC.ATT.TC FeLV TZAVARAS et. al.,
1990
GR1 GAC.CAG.TGA.TCA.AGG.GTG.AG FeLV MIYAZAWA et. al.,
1997 GAPDHR CCA.AAG.TTG.TCA.TGG.AGT.ACC Inibidores de
PCR
BIRKENHEUER et. al., 2006 GAPDHF CCT.TCA.TTG.ACC.TCA.ACT.ACA.T Inibidores de
PCR
BIRKENHEUER et. al., 2006
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este hemoprotozoário e esta PCR é capaz de detectar o C. felis em amostras com até 0,01 cópias de genes/μl (BIRKENHEUER et. al., 2006).
Figura 2: Eletroforese dos produtos de PCR utilizandos oligonucleotídeos específicos, em gel de agarose a 1,5% corado com brometo de etídeo 0,01% para a detecção de DNA de Cytauxzoon felis, sendo (1) marcador de peso molecular, (2 e 3) controle negativo (água), (4 e 5) controle positivo (DNA extraído de animal naturalmente infectado e confirmado por sequenciamento) e (6 a 15) amostras negativas.
Os achados deste trabalho são iguais aos achados por MONTAÑO (2014) nos seus estudos com 142 amostras de sangues de gatos provenientes de Curitiba/PR, onde foram testadas amostras em PCR em tempo real. E aos achados por MICELI et. al. (2013) que avaliaram 178 gatos provenientes de Cuiabá/MT e também obtiveram resultados negativos nas PCRs dessas amostras. Enquanto, ANDRÉ et. al. (2017) conseguiram 2 positivos entre as 3 amostras provenientes de Mossoró/RN testadas em PCR. MENDES-DE-ALMEIDA et. al. (2007) realizaram estudos com gatos domésticos que moravam no Zoológico do Rio de Janeiro/RJ e observaram que gatos com testes negativos para Cytauxzoon sp. em um determinado ano quando testados novamente no ano seguinte apresentavam-se positivo. O mesmo também ocorreu com os gatos que eram positivos e se tornavam negativos no ano seguinte. Provavelmente estes gatos que se tornaram positivos foram devido à novas infecções, contudo, estes autores não levantaram nenhuma hipótese que pudesse justificar seus achados, deixando uma dúvida do que poderia ter ocorrido com os gatos positivos que se tornaram negativos no ano seguinte, pois alguns autores relatam ser possível observar parasitemia por anos após a resolução do quadro clínico de cytauxzoonose e em gatos subclínicos (BROWN et. al., 2010; RIZZI et. al., 2015;).
Ao fazer um comparativo com pesquisas desenvolvidas no exterior, observa-se poucos relatos de infecção por C. felis, como exemplo temos o estudo de CRIADO-FORNELIO et al. (2004) que realizaram pesquisa com 5 gatos domésticos positivos para piroplasmídeos e que, com o sequenciamento genético, confirmaram a infecção de um gato por Cytauxzoon sp. e com isso, fizeram o primeiro relato de Cytauxzoon felis na Espanha. Em contrapartida, é citado por inúmeros autores que este hemoprotozoário é endêmico nos Estados Unidos, RIZZI et. al. (2015) realizaram o primeiro estudo para determinar a prevalência de Cytauxzoon felis em 4 regiões deste país, este trabalho foi desenvolvido entre 2008 a 2012 e demonstrou uma alta incidência de
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cytauxzoonose, o estudo contou com 902 gatos, onde 56 gatos (6,2% de prevalência) foram positivos para este hemoparasita.
Na análise dos parâmetros hematológicos das amostras do Grupo I e III foram observadas as seguintes alterações (Tabela 2):
Tabela 2: Alterações mais encontradas no hemograma completo.
Alterações Percentagem Anemia 7,41% Trombocitopenia 16,67% Leucopenia 12,67% Neutrofilia 16,67% Linfopenia 24,93% Monocitose 5,50% Eosinofilia 5,50%
Os achados neste trabalho estão próximos aos encontrados por MEINKOTH et. al. (2000) que observaram que 4 dos 18 gatos apresentavam anemia, aos de ANDRÉ et. al. (2017) que observaram como alterações hematológicas neutrofilia e trombocitopenia em 1 dos 3 gatos avaliados enquanto os demais não apresentavam alterações, e ao relato de caso de MAIA et. al. (2013) que observaram no animal neutrofilia com desvio a esquerda, linfopenia e trombocitopenia. Quando comparado com a sintomatologia descrita na literatura, estes achados estão dentro dos padrões da infecção por piroplasmídeos.
A hipótese para testar as amostras do Grupo II, que são FIV e/ou FeLV positivos, era que a possível imunossupressão destes animais por estes vírus poderia favorecer infecções de Cytauxzoon felis, contudo não achamos nenhuma amostra positiva neste grupo para este hemoparasita. MONTAÑO (2014) também obteve resultados negativos para Cytauxzoon felis nos gatos que eram confirmados para FIV e FeLV. MEINKOTH et. al. (2000) testaram para FIV e FeLV alguns dos animais que possuíam Cytauxzoon sp. e obtiveram resultado negativo. CRIADO-FORNELIO et. al. (2004) também testaram para FIV e FeLV os animais nos quais eles diagnosticaram a infecção por Cytauxzoon sp. e obtiveram resultado negativo para estes retrovírus. MAIA et. al. realizaram os testes para estes retrovírus no gato que diagnosticaram com Cytauxzoon felis
tendo resultados negativos nestes testes. Ao comparar os achados deste trabalho com achados de outros autores, é possível supor que infecção por FIV e/ou FeLV não favorece as infecções por Cytauxzoon felis.
As amostras do grupo III foram testadas para o gene GAPDH para garantir que a reação negativa tenha sido devido à ausência de infecção por C. felis e não por ausência de DNA ou presença de inibidores da reação (Figura 3). Como as sequências de oligonucleotídeos usadas eram especificas para Cytauxzoon felis, é possível que nas amostras do Grupo III, em que foram visualizadas inclusões similares a piroplasmídeos, possam estar infectados por outros piroplasmídeos, como Babesia spp. Theileria spp., ou que possuam alguma mutação no gene e que os oligonucleotídeos utilizados não conseguiram anelar durante a amplificação.
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Figura 3: Eletroforese dos produtos de PCR utilizando diferentes oligonucleotídeos, em gel de agarose a 2% corado com brometo de etídeo 0,01% para detecção do Gene GAPDH, sendo (1) controle negativo e (2 a 4) amostras positivas.
No Brasil, aparentemente a infecção por Cytauxzoon felis é mais comum em felinos silvestres do que em gatos domésticos. Acredita-se que os felinos neotropicais selvagens podem agir como reservatórios de piroplasmas da família
Theileriidae na América do Sul (ANDRÉ et. al., 2017).
O Dermacentor variabilis é considerado como vetor responsável pela transmissão de Cytauxzoon felis nos Estados Unidos, e é um carrapato que não pertence ao bioma Brasileiro. Devido a isso, infecções por este hemoprotozoário no Brasil indicam que outra espécie de carrapato possa ser a responsável por sua transmissão (MENDES-DE-ALMEIDA et. al. 2007). MENDES-DE-ALMEIDA et. al. (2007) sugerem em seu trabalho que o Rhipicephalus sanguineus como vetor responsável pela transmissão do Cytauxzoon felis no Rio de Janeiro, pois durante os seus estudos foi o único carrapato encontrado nos gatos. O R.
sanguineus também é apontado como responsável pela transmissão de hemoparasitas, como Babesia canis, Hepatozoon canis e Erlichia canis em cães domésticos no Brasil (RIBEIRO et. al. 1997).
5. Conclusão
Este trabalho demonstrou a não ocorrência de infecção dos gatos domésticos por Cytauxzoon felis no Distrito Federal, contudo não é possível afirmar que não exista a presença deste hemoparasita nesta região, pois seria necessário um estudo com um número maior de animais e voltado a definir a prevalência deste hemoprotozoário.
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6. Introdução
O curso de Medicina Veterinária exige como parte da formação do acadêmico a realização do estágio final. Este tem por finalidade permitir ao estudante conhecer e aprender um pouco da rotina de um Médico Veterinária. Um médico veterinário ao se formar pode atuar em diferentes áreas, pode atuar por exemplo, com a Clínica Veterinária, a Patologia Clínica Veterinária, a Inspeção de alimentos entre outros. E cabe ao estudante, quando na última etapa do curso, escolher uma dessas áreas para vivencia-la e aprender. A Universidade de Brasília – UnB exige uma carga horária mínima de 480 horas de estágio final.
7. Estrutura Física
O Laboratório de Patologia Clínica do HVet tem como estrutura física uma sala de aproximadamente 48𝑚2 dividida em setores para realização do processamento das amostras – Bancada, Bioquímico, Microscopia e Setor de análise de Urinalise/liquor/Derrame. O laboratório conta com 7 microscópios (2 Olympus CX40; Olympus BX41; Olympus CH20; 3 Leica DM500), 5 contadores manuais de células, 2 contadores hematológicos (ABX Micros ESV 60; Vet abc animal blood conter), uma centrifuga de tubos (Hettich Zentrifugen – EBA20), uma centrifuga de Microhematócrito (Quimis®), uma centrifuga citológica (CIENTEC 2000D), uma centrifuga de tubo de falcon, dois Analisadores de bioquímicos semiautomático (Bioplus Bio 2000), um analisador de bioquímico automático (Cobas C111), um hemogasômetro (Cobas B121), uma balança, um ventilador, dois banhos-maria, 2 refratômetros, dois NO Break, 2 geladeiras, um freezer, 1 computador, 1 televisão, um homogeneizador de sangue.
8. Atividades desenvolvidas
As atividades desenvolvidas durante o estágio foram as seguintes conforme a função atribuída durante cada semana:
❖ Bancada: a função das pessoas que se encontram na bancada é receber as amostras e avaliar se estão adequadas para o processamento. É obrigação da bancada fazer lâminas de esfregaço sanguineo, fazer a leitura do VG e das PPT, pesar as amostras de sangue destinadas ao bioquímico, preparar lâminas para a pesquisa de hemoparasitas, fazer lâminas para a contagem de reticulócito, fazer diluições em solução salina de sangue para avaliação de aglutinação, realizar lavagem e secagem de lâminas e tubos. Quando as amostras de sangue total não podem ser processadas no contador semi-automático de células é função da bancada fazer as diluições necessárias para realização do hemograma manualmente.
❖ Bioquímico: tem como função processar as amostras de sangue sem anticoagulante. O manuseio do equipamento utilizado nesta área só é permitido aos Residentes e a Técnica do Laboratório. Contudo, como estagiário é possível acompanhar e aprender como são realizados cada exame de bioquímico.
❖ Microscopia: nesta função, é realizada a leitura das lâminas de esfregaço sanguíneo, de reticulócito, da pesquisa de hemoparasitas,
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de medula e derrame. Realizar a contagem manual de leucócitos, hemácias e plaquetas.
❖ Volante: esta função tem como responsabilidade o processamento da urinálise, de derrames cavitários e do líquor. E a realização dos testes de compatibilidade sanguínea.
É também parte da rotina do laboratório a realização de estudos com os residentes, e durante o período do estágio, todos os estagiários precisam acompanhar estes estudos, onde têm a oportunidade de participar fazendo perguntas, respondendo questionamentos levantados pela professora e ao final do estágio apresentando um caso clínico.
9. Exames Realizados
Durante o período do estágio final, do dia 20 de agosto a 16 de novembro, foram realizados 9.301 exames para um total de 1.356 animais:
Tabela 1: Quantidade de exames realizado durante o período de estágio.
Exames Quantidade Hemograma 1.127 Bioquímico 7.161 Eletrólitos 96 Urinálise 360 Pesquisa de Hemoparasita 202 Contagem de Reticulócitos 225 Fibrinogênio 49 Derrame Cavitário 19 Líquor 11 Teste de Compatibilidade 51
Tabela 2: Quantidade de exames solicitados para cada espécie.
Espécies Quantidade Gato 352 Cão 801 Ruminante 25 Equino 12 Silvestres 166
10.
Conclusão
Durante o estágio foi possível aprender a realizar exames dos quais só havia tido o conhecimento teórico, além de poder praticar as técnicas ensinadas durante o curso. Os estudos desenvolvidos durante o estágio permitiram entender a aplicação e a interpretação destes exames. Servindo como ferramentas para aplicar na profissão e preparar para a residência.
