INSTRUCCIONES DE USO MEDIOS EN PLACA LISTOS PARA USAR
PA-254104.08 Rev.: April 2013
USO PREVISTO
BBL CHROMagar Salmonella es un medio selectivo y de diferenciación para el aislamiento y
la presunta identificación de especies de Salmonella a partir de muestras fecales clínicas.
BBL CHROMagar Salmonella ha sido validado también por el AOAC Research Institute bajo el
programa de Performance Tested Methods solamente para el análisis de carne bovina picada cruda, pollo crudo, pescado crudo, lechuga y huevos frescos (con cáscara). Se utilizaron métodos ISO, USDA FSIS y FDA BAM para efectuar pruebas de comparación de métodos1-3. El BBL CHROMagar Salmonella resultó ser equivalente a los medios en placa recomendados en los métodos ISO, FDA y USDA.
PRINCIPIOS Y EXPLICACIÓN DEL PROCEDIMIENTO Método microbiológico.
La Salmonella es ubicua en las poblaciones animales y generalmente se aísla del tracto intestinal de los animales y de los hombres. Es uno de los organismos más frecuentemente asociados con las enfermedades alimentarias, que suele relacionarse con un origen animal4. Las enfermedades provocadas por la Salmonella se han asociado a las aves, vacuno,
chocolate, productos lácteos y verduras5. El BBL CHROMagar Salmonella está diseñado para el aislamiento y diferenciación de especies de Salmonella. La adición de sustratos cromógenos al medio facilita la diferenciación de las especies de Salmonella del resto de la flora. El BBL
CHROMagar Salmonella fue desarrollado originalmente por A. Rambach, CHROMagar, París,
Francia. BD, bajo un contrato de licencia, ha optimizado esta formulación utilizando propiedad intelectual patentada para la fabricación del medio preparado en placa BBL CHROMagar Salmonella, usando la formulación del medio de cultivo deshidratado Difco CHROMagar Salmonella.
En el BBL CHROMagar Salmonella, ciertas peptonas seleccionadas especialmente suministran los nutrientes. Los organismos gramnegativos suelen verse inhibidos a consecuencia de la base selectiva del medio. La adición de un agente antifúngico impide el crecimiento de especies de Candida y se utilizan otros agentes antimicrobianos para inhibir el crecimiento de bacterias gramnegativas no fermentadoras de glucosa y especies de Proteus, que podrían
potencialmente superar en crecimiento a las colonias de Salmonella. Se incluye una mezcla cromógena en el medio. Debido a diferencias metabólicas en presencia de ciertos cromógenos, las colonias de especies de Salmonella presentan un color malva (rosado a morado), mientras que las bacterias no deseada se ven inhibidas o producen colonias verdes azuladas o incoloras.
*EL INSTITUTO DE INVESTIGACIÓN AOAC EVALUÓ DE FORMA INDEPENDIENTE MUESTRAS DE ESTE MODELO DE KIT DE ANÁLISIS SUMINISTRADAS POR EL FABRICANTE Y HALLÓ QUE CUMPLÍAN LAS
ESPECIFICACIONES DEL FABRICANTE INDICADAS EN EL PROSPECTO DESCRIPTIVO DEL KIT DE ANÁLISIS. EL FABRICANTE CERTIFICA QUE ESTE KIT SE AJUSTA EN TODOS LOS SENTIDOS A LAS
ESPECIFICACIONES ORIGINALMENTE EVALUADAS POR EL AOAC RESEARCH INSTITUTE INDICADAS EN EL CERTIFICADO DE Performance Tested MethodsSM NÚMERO 020502.
BD BBL
CHROMagar Salmonella
REACTIVOS
Fórmula** por litro de agua purificada
Cromopeptona 22,0 g
Mezcla cromógena 0,34 g
Agentes inhibidores 0,02 g
Agar 15,0 g
pH 7,7 ± 0,2
** Ajustada y/o enriquecida en la medida necesaria para satisfacer los criterios de rendimiento. PRECAUCIONES
. Solamente para uso profesional.
Si se observa humedad excesiva, invertir la parte inferior sobre la tapa desplazada y dejar secar al aire para evitar la estanqueidad entre las partes superior e inferior de la placa durante la incubación.
Proteger de la luz durante el secado. Véase ALMACENAMIENTO Y VIDA UTIL. Para familiarizarse con las reacciones cromógenas previstas (color) producidas por la Salmonella, se recomienda que el usuario inocule cepas representativas comúnmente observadas en su institución. Se recomiendan las siguientes cepas: Salmonella ser. Typhimurium, ATCC 14028; Salmonella ser. Dublin, ATCC 15480; Salmonella ser. Typhi, ATCC 19430; y Salmonella Enterica subsp. Arizonae, ATCC 12323.
En las muestras clínicas puede haber microorganismos patógenos, como los virus de la hepatitis y el virus de la inmunodeficiencia humana. Para la manipulación de todos los elementos contaminados con sangre u otros líquidos corporales deben seguirse las Precauciones estándar6-9 y las directrices del centro.
Para obtener más información, consultar los procedimientos de manipulación aséptica, riesgos biológicos y eliminación del producto usado en el documento INSTRUCCIONES GENERALES
DE USO.
ALMACENAMIENTO Y VIDA UTIL
Al recibir las placas, almacenarlas en un lugar oscuro a una temperatura entre 2 y 8 °C, envueltas en su envase original, hasta justo antes de usarlas. Evitar la congelación y el calentamiento excesivo. Las placas pueden inocularse hasta su fecha de caducidad (ver la etiqueta en el paquete) e incubarse durante los períodos de incubación recomendados. Las placas de grupos de 10 placas ya abiertos pueden usarse durante una semana siempre que se almacenen en un lugar limpio a una temperatura entre 2 y 8 °C.
Deterioro del producto
No utilizar las placas si muestran evidencia de contaminación microbiana, decoloración, deshidratación, grietas o cualquier otro signo de deterioro.
CONTROL DE CALIDAD DEL USUARIO
Examinar las placas en busca de signos de deterioro según se describe en Deterioro del
producto. Evaluar el rendimiento mediante la inoculación de una muestra representativa de
placas con cultivos puros de organismos de control estables que producen reacciones esperadas y conocidas. Para ello se recomienda utilizar las siguientes cepas de prueba:
Cepas Resultados del crecimiento
Salmonella Typhimurium ATCC 14028 Crecimiento mediano a denso de colonias de color malva claro a malva (rosado a morado)
Salmonella Enteritidis ATCC 13076 Crecimiento; colonias de color malva (= rosado a morado)
Citrobacter freundii ATCC 8090 Crecimiento mediano a denso de colonias de color verde azulado claro a verde azulado.
Escherichia coli ATCC 25922 Inhibición parcial a completa; colonias de color verde azulado
Klebsiella pneumoniae ATCC 33495 Inhibición parcial; colonias de color verde azulado
Enterococcus faecalis ATCC 29212 Inhibición parcial a completa; colonias pequeñas de color verde azulado
Staphylococcus aureus ATCC 25923 Inhibición (parcial a completa) Aspecto del medio sin inocular: Incoloro a ámbar claro, transparente
Nota: El control de calidad debe llevarse a cabo conforme a la normativa local y/o nacional, a los requisitos de los organismos de acreditación y a los procedimientos estándar de control de calidad del laboratorio.
PROCEDIMIENTO Materiales suministrados
BBL CHROMagar Salmonella (placas Stacker de 90 mm). Con control microbiológico. Materiales necesarios pero no suministrados
Medios de cultivo auxiliares, reactivos, organismos de control de calidad y demás equipo de laboratorio necesario para el procedimiento específico en uso en el laboratorio, tal como ISO 7218, USDA FSIS MLG, FDA BAM o el procedimiento específico de su laboratorio.
Recogida de las muestras
Consultar los textos correspondientes para obtener detalles acerca de los procedimientos de recogida y manipulación de las muestras1-5.
Tipos de muestras
Este medio se puede utilizar con muestras fecales clínicas y con diversas muestras de alimentos (carne picada cruda, pollo crudo, pescado crudo, lechuga y huevos frescos).
Procedimiento de análisis
Emplear técnicas asépticas. La superficie del agar debe estar lisa y húmeda, pero sin humedad en exceso. Permitir que el medio se caliente a temperatura ambiente antes de la inoculación. Para muestras clínicas: Tan pronto como sea posible después de recibir la muestra en el laboratorio, inocularla en una placa con BBL CHROMagar Salmonella y extenderla para su aislamiento. Si la muestra se cultiva de una torunda, hacerla girar sobre una zona pequeña de la superficie cercana al borde, para luego extenderla a partir de dicha zona con un asa. En función de los procedimientos locales, la inoculación de medios adicionales para el aislamiento de Salmonella y para la detección de otros patógenos entéricos puede ser obligatoria. Incubar las placas de forma aerobia a 35 ± 2 °C en posición invertida (con el agar hacia arriba) durante 24 h. En caso de resultado negativo a las 24 h, incubar nuevamente durante 24 h más para registrar los resultados finales. Una vez que los colores de las colonias se hayan desarrollado, el BBL CHROMagar Salmonella se puede exponer a la luz. Hay que someter colonias
características de Salmonella a pruebas bioquímicas o serológicas de confirmación.
El BBL CHROMagar Salmonella también puede utilizarse para subcultivo a partir de medios de enriquecimiento previo tales como el caldo selenita o el caldo de tetrationato.
Para muestras de alimentos: Seguir la metodología de preparación de muestras indicada en la Microbiology Laboratory Guidebook del USDA FSIS: Isolation and Identification of
Salmonella from Meat, Poultry, and Egg Products (Aislamiento e identificación de Salmonella a partir de carne, aves y productos con huevo), el capítulo del FDA BAM sobre Salmonella, las directrices ISO o las directrices de procedimiento adecuadas para el tipo de muestra y la ubicación geográfica. Inocular la muestra de caldo de enriquecimiento incubada en una placa con BBL CHROMagar Salmonella. Extender para su aislamiento, incubar las placas de forma aerobia a 35 ± 2 °C en posición invertida (con el agar hacia arriba) durante 24 h. En caso de resultado negativo a las 24 h, incubar nuevamente durante 24 h más para registrar los resultados finales. Hay que someter colonias características de Salmonella que crecen en el
BBL CHROMagar Salmonella a pruebas de confirmación del modo indicado en los
procedimientos ISO, USDA FSIS y FDA BAM1-3.
Resultados
Tras la incubación oportuna, leer las placas contra un fondo blanco. La Salmonella Typhimurium y otras especies de Salmonella presentarán colonias de color malva claro a malva, con la
excepción de Salmonella enterica subespecie arizonae y otras especies de Salmonella positivas para la lactosa y la betaglucosidasa. Estos aislados presentarán colonias de color violeta
azulado o moradas. Citrobacter y otros coliformes presentarán colonias de color verde azulado claro a verde azulado. Algunos organismos que no hidrolizan ninguno de los compuestos cromógenos puede presentar colonias incoloras.
CARACTERÍSTICAS DE RENDIMIENTO Y LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO El BBL CHROMagar Salmonella es un medio selectivo y diferencial para el aislamiento e identificación presuntiva de especies de Salmonella en muestras fecales clínicas y en diversas muestras de alimentos.
Resultados previstos
Las especies de Salmonella presentarán colonias de color malva claro a malva (= rosado a morado) en este medio, con la excepción de las especies de Salmonella positivas para la lactosa y la betaglucosidasa. Estos aislados presentarán colonias de color violeta azulado o moradas.
Los siguientes organismos se aislaron en BBL CHROMagar Salmonella durante evaluaciones internas y externas de muestras clínicas e industriales:
Salmonella 8, (20):-:26 Salmonella ser. Javiana Salmonella enterica subsp. arizonae Salmonella ser. Johannesburg Salmonella enterica subsp. diarizonae Salmonella ser. Kentucky
Salmonella ser. Abony Salmonella ser. London
Salmonella ser. Adelaide Salmonella ser. Mbandaka
Salmonella ser. Agona Salmonella ser. Michigan
Salmonella ser. Anatum Salmonella ser. Minnesota
Salmonella ser. Bareilly Salmonella ser. Montevideo
Salmonella ser. Berta Salmonella ser. Muenster
Salmonella ser. Brandenburg Salmonella ser. Newport Salmonella ser. California Salmonella ser. Oranienburg
Salmonella ser. Cerro Salmonella ser. Panama
Salmonella ser. Choleraesuis Salmonella ser. Paratyphi A Salmonella ser. Cubana Salmonella ser. Paratyphi B
Salmonella ser. Derby Salmonella ser. Pomona
Salmonella ser. DT 104 Salmonella ser. Poona
Salmonella ser. Dublin Salmonella ser. Potsdam
Salmonella ser. Enteritidis Salmonella ser. Pullorum
Salmonella ser. Essen Salmonella ser. Rubislaw
Salmonella ser. Gallinarum Salmonella ser. Schwarzengrund Salmonella ser. Gaminara Salmonella ser. Senftenberg
Salmonella ser. Hadar Salmonella ser. St. Paul
Salmonella ser. Hartford Salmonella ser. Thompson Salmonella ser. Heidelberg Salmonella ser. Typhi Salmonella ser. Illinois Salmonella ser. Typhimurium
Salmonella ser. Infantis Salmonella ser. Typhimurium (positiva para la
lactosa)
Salmonella ser. Iverness Salmonella ser. Weltevreden
Características de rendimiento10
Análisis clínico:
El BBL CHROMagar Salmonella fue analizado en un gran laboratorio diagnóstico. Se analizaron un total de 150 muestras fecales negativas conocidas y 110 muestras fecales positivas conocidas en BBL CHROMagar Salmonella y se compararon con el rendimiento de los medios XDL y Hektoen Entérico. La sensibilidad y especificidad del medio BBL
CHROMagar Salmonella al cabo de 18-24 h de incubación fueron del 76% y 99%,
respectivamente, y del 90% y 94% al cabo de 48 h de incubación, respectivamente. La sensibilidad y especificidad aumentaron al 99% y 97%, respectivamente, cuando se subcultivó a partir de caldo de selenita F. Los resultados comparativos de sensibilidad y especificidad para el medio XDL fueron del 71% y 97% a las 18-24 h de incubación, y del
78% y 95% a las 48 h de incubación; los resultados de sensibilidad y especificidad para el medio Hektoen Entérico fueron del 71% y 94% a las 18-24 h, y del 79% y 93% a las 48 h de incubación.
Análisis agroalimentario:
Métodos del USDA y de la FDA
El BBL CHROMagar Salmonella fue evaluado para la recuperación de Salmonella en pollo crudo, carne picada cruda, pescado crudo, lechuga y huevos frescos en laboratorios internos y externos aprobados por el AOAC. El pollo crudo y la carne picada fueron procesados según los métodos de referencia del USDA FSIS. El pescado crudo, la lechuga y los huevos frescos fueron procesados según los procedimientos de la FDA BAM. El BBL CHROMagar Salmonella fue comparado con el método de referencia para la recuperación selectiva de Salmonella. Se obtuvieron un total de 16 cultivos positivos del pollo crudo, 17 en las muestras de carne picada cruda, 18 en las de pescado crudo y lechuga y 11 en las de huevos frescos. El BBL CHROMagar Salmonella produjo resultados comparables con los métodos de referencia en todas las matrices dando lugar a una concordancia de métodos del 100%.
Se analizaron veinte muestras salpicadas de pollo crudo según el método de referencia de la USDA FSIS. El pollo fue sembrado con un inóculo de bajo nivel de 8 UFC/25 g de muestra y uno de alto nivel de 50 UFC/25 g. El BBL CHROMagar Salmonella recuperó el 100% (20/20) de la Salmonella inoculada a alto y bajo nivel. A niveles de inóculo inferiores a 1 UFC/25 g se obtuvo una recuperación fraccionaria. Se analizó pollo contaminado de forma natural. La recuperación de Salmonella fue del 100% y el número más probable (NMP)/g era de 0,23.
Se cultivaron ciento dieciocho (118) aislados de Salmonella de origen alimentario, incluyendo diversos serotipos, en caldo de lactosa durante 24 h y después se subcultivaron a caldo de tetrationato durante 24 h. Los caldos de tetrationato se subcultivaron en BBL CHROMagar Salmonella y se incubaron a 35 ºC. Si no se recuperaban colonias de color malva a las 24 h, las placas se incubaban durante 24 h más. El BBL CHROMagar Salmonella recuperó 111 aislados. Cuatro cepas fueron inhibidas por el caldo de tetrationato y no fueron recuperadas en BBL CHROMagar Salmonella ni en una placa de control no selectiva. Otros aislados del mismo serotipo que los cuatro negativos sí produjeron colonias características, así que la falta de reacción positiva era específica de la cepa, no del serotipo. La sensibilidad general para el BBL CHROMagar Salmonella fue del 94% (111 de 118 aislados).
Se cultivaron sesenta y cinco (65) aislados sin Salmonella en caldo de infusión de cerebro y corazón a 35 ºC durante 24 h y se subcultivaron en BBL CHROMagar Salmonella a 35 ºC durante 24 h. Las placas negativas fueron incubadas durante un total de 48 h. Sesenta y uno (61) de los 65 aislados no presentaron coloración malva en el BBL CHROMagar Salmonella para una especificidad del 94%. Las cuatro cepas sin Salmonella que presentaron coloración malva fueron inoculadas en caldo de tetrationato (caldo de enriquecimiento recomendado para los métodos del USDA y de la FDA). Tras 24 h de incubación, los caldos de tetrationato fueron subcultivados a BBL CHROMagar Salmonella. Tras 48 h de incubación, una cepa crió colonias malva y tres cepas fueron inhibidas. Con base en el uso del enriquecimiento en caldo de tetrationato, la especificidad general del BBL CHROMagar Salmonella en este estudio fue del 98%.
Método ISO
Se comparó el BBL CHROMagar Salmonella con los medios del método de referencia para la recuperación selectiva de Salmonella en pollo crudo, carne picada cruda, pescado crudo, lechuga y huevos frescos. Todas las matrices fueron procesadas según el método de cultivo ISO. Se obtuvieron un total de 16 cultivos positivos del pollo crudo, 17 en las muestras de carne picada cruda, 9 en las de pescado crudo y 19 en las de lechuga y huevos frescos. El
BBL CHROMagar Salmonella produjo resultados comparables con los métodos de
Se salpicaron veinte (20) muestras de carne picada cruda, pescado crudo, lechuga y huevos frescos con un inóculo de bajo nivel de Salmonella y se analizaron según el procedimiento de cultivo ISO.
Se analizaron veinte (20) muestras de pollo crudo contaminado de forma natural según el procedimiento de cultivo ISO. Se añadió BBL CHROMagar Salmonella a la batería de medios de referencia para cada matriz alimentaria analizada. La concordancia de métodos del BBL CHROMagar Salmonella y los demás medios de referencia analizados fue del 100%. Los niveles bajos de inóculo variaban entre 0,0036 y 0,23 NMP/g.
Se cultivaron ciento veintisiete (127) aislados de Salmonella de origen alimentario en agua de peptona tamponada durante 18 h y después se subcultivaron a medio Rappaport-Vassiliades con soja (RVS) durante 24 h. Los caldos RVS se subcultivaron en BBL
CHROMagar Salmonella y se incubaron a 35 ºC durante 24 h. Si no se recuperaban colonias
de color malva a las 24 h, las placas se incubaban durante 24 h más. El BBL CHROMagar Salmonella recuperó 123 aislados. La recuperación de las 4 cepas que no crecieron en BBL
CHROMagar Salmonella fue pobre en los medios de control no selectivos. La sensibilidad
general para el BBL CHROMagar Salmonella fue del 96,8% (123 de 127 aislados).
Limitaciones del procedimiento
Ocasionalmente, ciertas cepas de Aeromonas hydrophila, Hafnia alvei, Pseudomonas
aeruginosa, P. putida, Stenotrophomonas maltophilia, Acinobacter sp. o Candida sp. pueden no inhibirse por completo y las colonias pueden presentar una pigmentación de color malva claro a malva.
Las pruebas de confirmación que utilizan el malva o el morado como reacción de color indicadora pueden ser difíciles de interpretar debido al propio color de las colonias.
Ciertas cepas raras de los siguientes organismos: S. Typhi, S. Paratyphi A, S. Typhimurium, S. Choleraesuis, S. Minnesota, S. enterica subsp. arizonae y S. Pullorum pueden presentar un crecimiento reducido o nulo en este medio. Esto es específico de la cepa y la mayoría de las cepas analizadas de cada uno de estos serotipos fueron recuperadas.
El BBL CHROMagar Salmonella no está diseñado para el aislamiento de patógenos intestinales diferentes de la Salmonella.
Al analizar algunas muestras, se puede observar una decoloración morada del medio, sin crecimiento detectable de colonias. Esto debe considerarse un resultado negativo.
Reducir al mínimo la exposición del BBL CHROMagar Salmonella a la luz antes y durante la incubación, ya que la luz puede destruir los cromógenos. Conservar las placas en su envase y caja de cartón originales durante todo el período de almacenamiento. No se recomienda la incubación en CO2.
REFERENCIAS
1. Rose, Bonnie E. 2001. Isolation and identification of Salmonella from meat, poultry and egg products. In: Microbiology laboratory guidebook, 3 rd ed., Food Safety and Inspection Service, U.S. Department of Agriculture, Washington, D.C.
2. U.S. Food and Drug Administration. 2003. Bacteriological analytical manual (online), AOAC International, Gaithersburg, MD.
3. International Organization for Standards (ISO). Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the detection of Salmonella spp., 4 th Edition, ISO 6579:2002.
4. Bopp, Brenner, Fields, Wells and Strockbine. 2003. Escherichia, Shigella, and Salmonella. In Murray, Baron, Jorgensen, Pfaller, and Yolken (ed.), Manual of clinical microbiology, 8 th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C.
5. D‘Aoust, Mauer and Bailey. 2001. Salmonella species. In: Doyle, Beuchat and Montville (ed.), Food microbiology: fundamentals and frontiers, 2 nd ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C.
6. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2001. Approved Guideline M29-A2. Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections, 2 nd ed. NCCLS, Wayne, Pa.
7. Garner, J.S. 1996. Hospital Infection Control Practices Advisory Committee, U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention. Guideline for isolation precautions in hospitals. Infect. Control Hospital Epidemiol. 17:53-80.
8. U.S. Department of Health and Human Services. 1999. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories, HHS Publication (CDC), 4 th ed. U.S. Government Printing Office, Washington, D.C. 9. Directive 2000/54/EC of the European Parliament and of the Council of 18 September 2000 on the
protection of workers from risks related to exposure to biological agents at work (seventh individual directive within the meaning of Article 16(1) of Directive 89/391/EEC). Official Journal L262, 17/10/2000, p. 0021-0045.
10. Datos disponibles en los archivos de BD Diagnostic Systems. ENVASE/DISPONIBILIDAD
BBL CHROMagar Salmonella
REF 254104 Medios en placa listos para usar, 20 placas INFORMACION ADICIONAL
Para obtener más información, diríjase a su representante local de BD.
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