Curso teórico-práctico de HPLC y UHPLC

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Curso teórico-práctico de HPLC y UHPLC

Agilent,

WTC-Barcelona

Sergio Catalá Agilent Technologies Agilent FSE LC-MS

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Agilent, WTC-Barcelona

Sergio Catalá Agilent Technologies

Agilent FSE LC-MS

Objetivos:

• Introducción parámetros Test Idoneidad (”System Suitability”).

• Buenas Prácticas para evitar problemas en U/HPLC.

Idea / Recomendación práctica.

TS “Troubleshooting”

Introducción y Consideraciones Prácticas en

HPLC/UHPLC

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Introducción: el

Objetivo

de la Cromatografia

Conseguir separar todos los componentes de la muestra con la mínima dispersión de la banda cromatográfica, para conseguir la máxima eficacia

y capacidad de separación de picos cromatográficos.

Detector Inyector

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Recomendaciones generales

Utilizar disolventes de alta pureza.

Filtrar fases móviles y muestras a través

de filtros de 0,22µm.

Considerar la miscibilidad, la solubilidad y

el pH (2.3-9.5) de las fases móviles.

Realizar una etapa de lavado entre

muestra y muestra.

Después de un análisis realizar una etapa

de lavado de columna y otra de lavado de

instrumento.

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Tareas Diarias (Antes de empezar)

1100/1200/1260 Series:

· Cambiar las fases móviles.

· Revisar la cantidad de solución de lavado de sellos y de

lavado de aguja (si están instaladas).

· Purgar todos los canales del sistema a un flujo de 5ml/min

durante 15 min.

· Instalar la columna y acondicionar todo el sistema durante

15-20 min.

· Encender la lámpara.

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Tareas Diarias (Antes de empezar) 1290:

· Opción Prime:

Ésta opción realiza durante un tiempo estipulado la inyección de un cierto volumen de fase móvil a una elevada velocidad por todos los canales del equipo.

· Opción Purge:

La opción de purga en éstos instrumentos es automática; no hay que abrir ninguna válvula, se puede escoger el volumen del flujo y el tiempo que se quiere realizar.

·Opción Conditioning:

Permite eliminar microburbujas de aire que hayan podido quedar y acondiciona el sistema en las condiciones iniciales que se desee.

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Parámetros a monitorizar durante el análisis:

· Presión.

· Rizado de la Presión (Ripple).

· Ruido de la linia de base.

· Tiempos de retención.

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Vista frontal y esquema sistema HPLC 1200

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Código de Colores Agilent.

Color I.D. Red 0.12 mm (0.005 inches) Green 0.17 mm (0.007 inches) Blue 0.25 mm (0.01 inches) Orange 0.50 mm (0.02 inches)

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1220 Infinity

1260 Infinity

1290 Infinity

Agilent, WTC-Barcelona

Sergio Catalá Agilent Technologies

Agilent FSE LC-MS

Estrategia para la resolución de problemas en HPLC

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Problemas más comunes en HPLC:

·Presión - Sobrepresión. - Fuga. - Fluctuaciones de presión. · Reproducibilidad - Tiempos de retención. - Área. · Linearidad.

· Ruido en la línea de base.

· Sensibilidad.

· Picos.

- Forma no Gaussiana. - Desdoblamiento.

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Pregunta: ¿ El problema es del método (columna, disolvente…)

o del instrumento?

·

Pág.:

Resolución de problemas:

Instrumento o método · Sobrepresión · Reproducibilidad · Sensibilidad · Picos

· Ruido línia de base

Método

· Picos fantasma

Instrumento · Fuga.

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Resolución de problemas Agilent

1100/1200 HPLC

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Problemas más comunes en HPLC:

·Presión

- Sobrepresión.

- Fuga. - Fluctuaciones de presión. · Reproducibilidad - Tiempos de retención. - Área. · Linearidad.

· Sensibilidad.

· Picos.

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Sobrepresión:

.

Causas:

· Columna contaminada.

· Frita válvula de purga contaminada.

· Atasco en el mezclador.

· Atasco en la válvula de inyección.

· Atasco en el asiento.

· Atasco en la aguja.

· Atasco en el horno de columnas.

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Problemas más comunes en HPLC:

· Sensibilidad.

· Picos.

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Fuga

17

· Revisar todas las conexiones.

· Fuga en los cabezales de la bomba.

· Fuga en la válvula de inyección.

· Fuga en la válvula de entrada.

· Fuga en la válvula de purga.

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Problemas más comunes en HPLC:

· Sensibilidad.

· Picos.

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Fluctuaciones de presión:

19

Posibles causas:

· Aire en el sistema.

· Válvula de entrada defectuosa.

· Filtros obturados.

· Válvula de salida defectuosa.

· Desgasificador defectuoso.

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Problemas más comunes en HPLC:

· Sensibilidad.

· Picos.

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Reproducibilidad en tiempos de retención:

21 Causas: · Bomba · Válvula de entradadefectuosa. · Columna · Fluctuaciones de temperatura. · Columna defectuosa.

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Problemas más comunes en HPLC:

· Sensibilidad.

· Picos.

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Reproducibilidad en altura y/o área de pico:

23 Rotor seal. Metering device seal. Pump. Column.

· Aguja defectuosa.

· Asiento defectuoso.

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Problemas más comunes en HPLC:

· Sensibilidad.

· Picos.

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Linearidad

Área de los picos no es linear.

Inyector:

• Rotor seal.

• Aguja parcialmente obturada.

Detector:

• Saturación.

Meteing device seal.

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Problemas más comunes en HPLC:

· Ruido en la línea de base. · Sensibilidad.

· Picos.

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Ruido en la línia de base:

Noise. Time . mAU Signal height. Causas: · Aire en el sistema · Desgasificador defectuoso. · Pulsos de la bomba.

·Fase móvil en mal estado.

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Bomba/desgasificador Parar flujo

¿Ruido?

yes no Detector Ruido en línea de base

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Problemas más comunes en HPLC:

· Sensibilidad.

· Picos.

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Sensibilidad

Respuesta del detector es pequeña.

• Insuficiente cantidad de muestra inyectada.

• Detector:

• Lámpara agotada.

• Celda de flujo sucia.

• Absorción disolvente elevada.

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Problemas más comunes en HPLC:

· Sensibilidad.

· Picos.

- Forma no Gaussiana.

- Desdoblamiento. - Picos fantasma.

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Desdoblamiento de picos:

Pág.:

Coelución de compuestos debido a que la fase estacionaria de la columna no está bien

acondicionada y/o está

desgastada. Los compuestos no interaccionan bien y no se pueden separar.

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Ensanchamiento de picos:

Pág.: Initial (SilGel Silica; Single Endcap) Time, min. 0 2 4 6 8 10 12 14 Detec tor Res pons e COLUMN A After 1826 Column Volumes 1. URACIL 2. NORTRIPTYLINE 3. DOXEPIN 4. AMITRIPTYLINE 5. TRIMIPRAMINE 1 2 3 4

5 COLUMN A Todos los picos anchos

· Perdida de la eficiencia de la fase estacionaria de la columna

· Volumen de inyección elevado.

· Elevada viscosidad de la fase móvil.

Ensanchamiento de un solo pico:

· Elución tardía de un compuesto.

· compuesto de elevado peso molecular (proteína o polímero)

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Colas de pico:

Pág.: Normal. Tailing. 2000 1500 1000 500 0 0 5 10 15 20 25 Time (min) ·

· Interacciones residuales de la fase

estacionaria con alguno de los compuestos.

· Compuesto coeluyendo junto con otro.

· Pérdida de eficacia de la fase estacionaria.

· Contaminación de la pre-columna.

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Picos negativos

Pág.:

Normal. Negative.

Causas:

• La absorbancia de la muestra es inferior a la de la fase móvil.

• Más común en RID..

• En DAD, la absorción de la referencia es superior a la absorción de la muestra.

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20% to 100% MeOH Gradient. No Sample Injected.

Picos fantasma – Picos que aparecen al inyectar un blanco.

Problema – Fase móvil.

60 15 30 15 0 3 7 15 17

Picos Fantasma

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Resumen resolución de problemas

• Excluir errores del método.

• Localizar el problema en el instrumento.

• Realizar la reparación.

• Realizar los tests de comprobación.

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38 Agilent, WTC-Barcelona Sergio Catalá Agilent Technologies Agilent FSE LC-MS

Mantenimiento HPLC

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Áreas de Mantenimiento de un Sistema

HPLC 1200

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Maintenance Overview

Solvent inlet Pump Autosampler Detector

Limpiar los filtros. PTFE frita. Sellos. Sello de oro (OBV) Cambiar sellos si la opción de lavado de sellos está instalada. Limpiar: Pistones. . Aguja. Asiento. Rotor seal. Lámpara. Limpiar celda de flujo Tests. Column Compartment Cambiar el sello del rotor si la válvula de selección de columnas está instalada.

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Tests a Realizar en un sistema HPLC 1200

Bomba Inyector Detector

Test de presión. Test de fugas. Inyección de un standard. Horno de Columnas

Test del horno. Test de intensidad. Test de ruido de fondo

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Bomba binária

Cabezales de la bomba

Válvula de selección de disolventes (Opcional). Mantenimiento: Sellos, Válvula de entrada Válvula de salida, Válvula de purga, Pistones.

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Cabezal de la bomba

Plunger housing.

Pump head.

Outlet ball valve.

Active inlet valve. Purge valve. Pist ons. Active inlet valve. Se als . Support rings. Purge valve. Outlet ball valve. Lock screw.

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Cabezales con lavado de sellos

Seal support ring. Gaske t. Wash Seal. Gasket. Wash seals. Seal support ring.

Seal keeper. Tubing.

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Válvula de purga

PTFE frit. Gold Seal.

Plastic cap.

1. Separar la válvula de purga del cabezal.

2. Sacar el sello de oro. 3. Sacar la frita antigua. 1. Instalar la nueva frita.

2. Instalar el sello de oro nuevo. 3. Reinstalar la válvula de purga.

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Limpiar o intercambiar la válvula de salida

Valve housing.

Gold Seal. Plastic cap.

1. Desconectar el capilar de la válvular de salida.

2. Desconectar la válvula de salida del cabezal.

3. Sacar el sello de oro.

a. En las bombas binarias, cambiar el filtro.

• Sonicar la válvula durante 15 min.

• Cambiar el sello de oro.

• Reinstalar la válvula de salida. Binary pump OBV.

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Válvula de entrada

Cartridge. 1. Desenchufar el cable de la válvula.

2. Separar la válvula del cabezal. 3. Cambiar el cartucho.

4. Instalar la válvula en el cabezal. 6. Conectar el cable.

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Cabezal de la bomba

1. Desconectar todos los

capilares.

2. Desenchufar el cable

de la válvula de

entrada.

3. Sacar los dos tornillos.

4. Extraer el cabezal del

modulo..

4 mm screw. 4 mm screw. Pist ons. Active inlet valve. Se als . Suppor t rings. Purge valve. Outlet ball valve. Lock screw.

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¿La bomba está bien?

Pump Ripple estable.

Test de presión.

Inyección de un estándar:

· Tiempo de retención acceptable.

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Vista frontal del inyector

Cambiar el sello del rotor.

Cambiar la aguja.

Cambiar el asiento.

Limpiar las guías.

Realizar el test de presión.

Válvula de inyección Aguja/asiento

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Válvula de inyección

Tools: Hexagonal key...9/64 inch Wrench...1/4 inch Injecton Valve 7 6 5 3 2 1 4 1. Stator screws 2. Stator head 3. Stator face 4. Stator ring

5. Rotor seal (Vespel or Tefzel)

6. Isolation seal 7. Valve body

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Isolation seal

Rotor seal

Cambiar el sello del rotor

1. Desconectar todos los capilares y los tres tornillos.

2. Separar el cabezal de la válvula y el filtro del soporte.

3. Sacar el sello del rotor. 4. Instalar el aislante.

5. Instalar el nuevo sello.

Stator head Stator face

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Replacing the Rotor Seal – Part Two

6. Instalar el soporte.

8. Poner los tornillos en el cabezal. 1.Bomba 6. Columna Asiento 4.Waste 3.Bloqueado 2. Meetering Device

9.Reconectar los capilares.

7. Instalar el filtro en el cabezal de la válvula.

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Cambio de aguja y asiento

Antes de empezar se ha de seleccionar en el software la opción de cambio de aguja (ChemStation/ Lab Advisor):

Lab Advisor: Instant Pilot:

Service and Diagnostics Maintenance

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Cambiar la aguja

1. Seleccionar la opción Needle down en el software. 2. Desconectar el loop de inyección.

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Cambio de asiento

1. Desconectar el

capilar del asiento en la válvula de inyección.(port 5). 2. Con un destornillador plano sacar el asiento.

Antes de empezar se ha de seleccionar en el software la opción de cambio de aguja (ChemStation/ Lab Advisor):

3. Insertar el nuevo asiento.

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Detectores Diode Array y

Longitud de onda variable.

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Cambio de lámpara

Paso 1: Sacar los dos tornillos que sujetan la lámpara.

Paso 2: Instalar la lámpara nueva.

Paso 3: Realizar tests específicos del detector. Deuteriu m lamp Detector cell Tungste n lamp