Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d Hebron. Desarrollo de un método

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Institut de Recerca

Hospital Universitari Vall d’Hebron

Curs de Proteòmica i

Metabolòmica

25 Marzo 2014

Mª Ángeles Artaza (UAT)

Institut d’Investigació Sanitària de l’Instituto de Salud Carlos III (ISCIII)

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• ¿Que queremos medir?

• ¿Como lo vamos a medir?

• ¿Cómo vamos a comprobar que medimos lo que

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Huella

metabólica

Análisis espectral de todos los

metabolitos pero sin saber

que es cada compuesto

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Perfil

metabólico

Detección, identificación y

cuantificación aproximada de

un conjunto de compuestos

diana.

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Análisis diana

Detección y cuantificación

precisa de un metabolito o,

frecuentemente, un pequeño

grupo de metabolitos

quimicamente similares.

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Diseño de un experimento

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Diseño de un experimento

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• ¿Que queremos medir?

• ¿Como lo vamos a medir?

• ¿Cómo vamos a comprobar que medimos lo que

decimos que estamos midiendo?

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Desarrollo de un método

Información del analito/s

Estructura

Propiedades químicas

Optimización del método

Detección (UV,Fluorometría, MS/MS)

Separación (cromatografía)

Preparación de un rango apropiado, QC

Evaluación de las estrategias de extracción (PP, LLE/SLE, SPE)

Recuperación

Estabilidad de la matriz

Estabilidad del extracto

Evaluación inicial de carryover

Validación del método

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Técnicas

Técnicas que utilizamos en la UCT

Cromatografía líquida de alta resolución

UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatography)

Espectrometría de masas

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Técnicas.- Cromatografía Líquida

Waste Bomba Inyector Detector Mezclador fase móvil Fase móvil C Fase móvil D Horno

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Técnicas.- Cromatografía Líquida

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Técnicas.- Cromatografía Líquida

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Técnicas.- Cromatografía Líquida

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03-Feb-2010 12:26:43 XEVO-TQMS#VBA071 Mix 4 compuestos 1ppm 10_20_30_40_50 Time 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 % 5

Mix 4 compuestos 1ppm 10_20_30_40_50 3: MS2 ES- TIC 2.05e9 1.57 1.02 1.80 7.28 2.90

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Mix 4 compuestos 1ppm 10_20_30_40_50 m/z 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 % 0 100

Mix 4 compuestos 1ppm 10_20_30_40_50 1 (0.008) 3: MS2 ES- 2.07e6 174.85 174.52 131.06 112.70 112.50 112.37 113.04 113.30 114.51 130.33 119.05 147.15 141.41 174.39 158.43 147.35 163.10 164.44 178.99 179.73 249.27 206.62 190.87 180.39 206.29 191.07 205.36 191.41 248.73 235.45 226.51 226.31 216.70 221.31 280.16 259.21 264.35 284.50 289.64 297.05 298.38

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Espectro

TIC (SCAN)

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Cuantificación absoluta :MRM (Multiple Reaction Monitoring)

El método más simple de cuantificar analitos con LC-MS es Total Ion Chromatograms (TIC). Los datos se obtienen con el MS en modo barrido y se procesan los datos una vez adquiridos para reconstruir el perfil de elución de los iones de interés. Las áreas o las alturas de los picos dan una idea de la abundancia de un analito.

Podemos limitar el rango de adquisición de m/z a los iones de interés (SIM Selected Ion Monitoring), cuanto más estrecho sea el rango mayor será la sensibilidad pero no se podrá discriminar entre los iones con la misma m/z.

Mix 4 compuestos 1ppm 10_20_30_40_50 m/z 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 % 0 100

Mix 4 compuestos 1ppm 10_20_30_40_50 1 (0.008) 3: MS2 ES- 2.07e6 174.85 174.52 131.06 112.70 112.50 112.37 113.04 113.30 114.51 130.33 119.05 147.15 141.41 174.39 158.43 147.35 163.10 164.44 178.99 179.73 249.27 206.62 190.87 180.39 206.29 191.07 205.36 191.41 248.73 235.45 226.51 226.31 216.70 221.31 280.16 259.21 264.35 284.50 289.64 297.05 298.38 03-Feb-2010 12:26:43 XEVO-TQMS#VBA071 Mix 4 compuestos 1ppm 10_20_30_40_50 Time 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 % 5

Mix 4 compuestos 1ppm 10_20_30_40_50 3: MS2 ES- TIC 2.05e9 1.57 1.02 1.80 7.28 2.90

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Cuantificación absoluta :MRM (Multiple Reaction Monitoring)

El modo MRM (Multiple Reaction Monitoring) no es una técnica de barrido. Se utiliza un triple cuadrupolo, el 1º y 3º se utilizan como filtros de masas estáticos mientras que el 2º cuadrupolo es la celda de colisión que fragmenta el ion seleccionado en el 1er_cuadrupolo_.

El par específico de valores m/z del ion precursor y del fragmento seleccionados es lo se llama “transición” 263< 145

Solo deja pasar el ion de m/z 263 Solo deja pasar el ion “hijo” de m/z 145

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Q1 : Selección masa q2 : Colisión Q3 : Selección fragmento Introduccion de la muestra Ionización

x

x x

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• ¿Que queremos medir?

• ¿Como lo vamos a medir?

• ¿Cómo vamos a comprobar que medimos lo que

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Validación de un método de HPLC

Validación

Proceso para verificar que un método es adecuado para resolver un problema

analítico particular

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Validación de un método de HPLC

La validación proporciona una idea de las capacidades y limitaciones que posee un

método analítico

¿Porqué es necesario validar un método?

Es necesario para tener confiaza en los resultados obtenidos

¿Quien establece los requisitos?

Food and Drug Administration (FDA), European Medicines Agency

(EMA)...

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Validación de un método de HPLC

Validación del método

•Exactitud, Trazabilidad

•Precisión, Incertidumbre

•Sensibilidad

•Selectividad

•Límites

•Robustez

Carryover

Estabilidad en varias series Congelado/descongelado

Estabilidad durante pre y procesado

Estabilidad de larga duración

Recuperación

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Validación de un método de HPLC

Punto de mayor concentración 200 μg/ml

Punto de menor concentración 1 μg/ml

área

área nombre

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Validación de un método de HPLC : LOD y LQD

Muestra concentración 0 μg/ml

Método de comparación de Señal / Ruido Determinación:

Se preparan muestras de concentración conocida a bajos niveles, de acuerdo al método en estudio. Se prepara un blanco, y se mide la señal de las soluciones

preparadas.

El límite de cuantificación es la concentración de analito en la que se pueden darcualquiera de las

siguientes situaciones: •Relación señal / ruido es 10:1.

•Relación señal / ruido es al menos 10 y la precisión de menos de 10% (Desviación estándar relativa) •Relación señal / ruido es mayor de 20 y la precisión

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Validación de un método de HPLC: linealidad, LOD y LOQ

Límite de detección LOD

XLOD=-(YLOD-a)/b

XLOD= 3sa/b

Límite de cuantificación LQD

XLQD= 10sa/b

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El desarrollo de un método incluye la optimización de cada uno de los

pasos

• Separación cromatográfica

• Ionización

• Detección espectrometrica

• Preparación de la muestra

Desarrollo de un método

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Preparación de las muestras

Extracción fase sólida

Precipitación

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Métodos de extracción

Extracción Líquido-Liquido: Partición en una de dos fases líquidas

Es un clásico.

Suele ser el método de elección para tejidos.

Agitación o vortex con solventes orgánicos.

Los metabolitos polares se extraen con isopropanol, etanol, metanol, acetonitrilo…

Los metabolitos más lipofílicos con cloroformo o etil acetato.

Se modifica el pH para forzar el paso a una u otra fase

Extracción en fase sólida (SPE): Adsorción/partición en un sorbente sólido

Uno de los más utilizados en la extracción de analitos de fluidos biológicos

Gran variedad de fases estacionarias, p.ej. mixtos utilizan múltiples mecanismos de

retención incorporando diferentes ligandos al sorbente, lo que permite, cambiando el

pH, extraer de la misma columna de modo sucesivo las fracciones acidas, básicas y

neutras.

Gran variedad de soportes; columnas discos, placas, extracción online

I

nyección directa

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3 Ejemplo práctico

Detección y cuantificación de

Fenilacetilglutamina y Fenilacetato

en orina de ratas

Tratamiento de la

hiperamonemia y la

encepalopatia hepática con

L-ornitina y fenilacetato.

Grup Malalties Hepàtiques:

Marc Oria, Joan Córdoba

Servei de Metabolopaties

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Ejemplo: Detección y cuantificación de Fenilacetilglutamina (FAG) y Fenilacetato (FA) en orina de ratas

04-Feb-2010 14:59:48 Mix 4 compuestos 1ppm SIR grad2 2coma5 ppm_2

Time 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40

%

4

Mix 4 compuestos 1ppm SIR grad2 2coma5 ppm_3 SIR of 4 Channels ES- TIC 2.43e6 0.93 0.56 1.10 2.22 1.55 FAG 263<145 263<127 FA 135<91 FB 163<91 IS 165<121

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Ejemplo: Detección y cuantificación de Fenilacetilglutamina (FAG) y Fenilacetato (FA) en orina de ratas

Time 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40

%

4

Mix 4 compuestos 1ppm SIR grad2 2coma5 ppm_3 SIR of 4 Channels ES- TIC 2.43e6 0.93 0.56 1.10 2.22 1.55 FAG 263<145 263<127 FA 135<91 FB 163<91 IS 165<121

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Ejemplo: Detección y cuantificación de Fenilacetilglutamina y Fenilacetato en orina de ratas

Voltaje de

cono

04-Feb-2010 16:47:18 XEVO-TQMS#VBA071 Fenilacetilglutamina Daugthers 10 to 50 Time 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 % 1 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 % 1

Fenilacetilglutamina Daugthers 10 to 50 2: Daughters of 263ES-

TIC 3.00e7

0.93

0.72 1.04

Fenilacetilglutamina Daugthers 10 to 50 1: Daughters of 263ES-

TIC 3.00e7 0.93

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Ejemplo: Detección y cuantificación de Fenilacetilglutamina y Fenilacetato en orina de ratas

Energía de colisión

transición 263 <145

Fenilacetilglutamina Daugthers 10 to 50 m/z 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 % 0 100 % 0 100

Fenilacetilglutamina Daugthers 10 to 50 73 (0.929) Cm (69:77) 2: Daughters of 263ES-

3.00e5 144.95 126.99 126.39 108.96 116.31 127.26 128.12 145.08 145.28 145.41

Fenilacetilglutamina Daugthers 10 to 50 73 (0.927) Cm (66:84) 1: Daughters of 263ES-

3.00e5 263.21 144.88 144.75 144.41 108.90 _127.26 262.41 145.15 145.35 262.28 244.86 218.57 263.48

(40)

YtrebøLM. Hepatology. 2009 Jul;50(1):165-74. En un tubo de 4,5 ml de polipropileno poner

50 µl de orina ultrafiltrada

50 µl de tampón fosfato 0,1 mM (pH2,4) 50 µl de IS 60M (3-(4-hidroxifenil)propionico) 1 mL tert-butil metil eter

Agitar 1 min

Centrifugar 1700xg 180 seg

Transferir 750 µl del sobrenadante a un tubo de polipropileno Evaporar con nitrogeno en un baño de 40°C.

Reconstituir en 100µl de fase móvil.

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Ejemplo: Detección y cuantificación de Fenilacetilglutamina (FAG) y Fenilacetato (FA) en orina de ratas

Time 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40

%

4

Mix 4 compuestos 1ppm SIR grad2 2coma5 ppm_3 SIR of 4 Channels ES- TIC 2.43e6 0.93 0.56 1.10 2.22 1.55 FAG 263<145 263<127 FA 135<91 IS 165<121

(42)

Ejemplo: Detección y cuantificación de Fenilacetilglutamina (FAG) y Fenilacetato (FA) en orina de ratas

Time 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40

%

4

Mix 4 compuestos 1ppm SIR grad2 2coma5 ppm_3 SIR of 4 Channels ES- TIC 2.43e6 0.93 0.56 1.10 2.22 1.55 FAG 263<145 263<127 FA 135<91 IS (FAG-d) 268<145

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YtrebøLM. Hepatology. 2009 Jul;50(1):165-74. En un tubo de 4,5 ml de polipropileno poner

50 µl de orina ultrafiltrada

50 µl de tampón fosfato 0,1 mM (pH2,4) 50 µl de IS 60M (3-(4-hidroxifenil)propionico) 1 mL tert-butil metil eter

Agitar 1 min

Centrifugar 1700xg 180 seg

Transferir 750 µl del sobrenadante a un tubo de polipropileno Evaporar con nitrogeno en un baño de 40°C.

Reconstituir en 100µl de fase móvil.

Ejemplo: Detección y cuantificación de Fenilacetilglutamina (FAG) y Fenilacetato (FA) en orina de ratas

Larvea MD. J Inherit Metab Dis. 2010 Aug 7 En un tubo de 1,5 ml de polipropileno poner

100 µl de orina ultrafiltrada y diluida 1:10 100 µl de IS (FAG-d) en metanol

100 µl de metanol para precipitar las proteínas Vortex 30”

Centrifugar a 1000xg 5min

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Ejemplo: Detección y cuantificación de Fenilacetilglutamina (FAG) y Fenilacetato (FA) en orina de ratas

Compound name: Fenilacetilglutamina 145 Correlation coefficient: r = 0.998920, r^2 = 0.997841 Calibration curve: 1.94349 * x + 1.48257

Response type: Internal Std ( Ref 4 ), Area * ( IS Conc. / IS Area ) Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None

uM 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 R e sp o n se 0 100 200 300 400 500 600 700

Compound name: Fenilacetato

Correlation coefficient: r = 0.995499, r^2 = 0.991019 Calibration curve: 0.141022 * x + -0.161316

Response type: Internal Std ( Ref 4 ), Area * ( IS Conc. / IS Area ) Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None

Conc 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 R e sp o n se 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0