Implementación de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para la detección de
Chlamydophila pneumoniae en pacientes con Neumonía Adquirida en Comunidad
Ulloa, C.P.
1, Delgado, M. P.
1, Jaramillo, C.A.
1
1Laboratorio de Diagnóstico Molecular y Bioinformática, Departamento de Ciencias Biológicas, Universidad de Los Andes, Bogotá,
Colombia.
Resumen
Chlamydophila (Chlamydia) pneumoniae es un patógeno intracelular causante de enfermedades del tracto respiratorio. Entre las afecciones más severas que causa está la Neumonía Adquirida en la Comunidad (NAC) con una incidencia en pacientes adultos del 10-‐20% aproximadamente. Los métodos de diagnóstico que existen en la actualidad, tales como el cultivo, las pruebas serológicas e inmunohistioquímicas presentan varias limitaciones en cuanto a la baja sensibilidad, la complejidad de la prueba, la subjetividad de la interpretación de los resultados y el tiempo y experticia para su consecución. Razón por la cual es necesario implementar métodos que muestren una mayor exactitud, precisión y sensibilidad, como lo es la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Sin embargo, no hay una prueba de PCR estándar para la detección de este agente, ya que se cuenta con varios tipos de pruebas con genes de amplificaciones distintos. En este estudio se evaluó la estandarización de una PCR convencional y una touchdown,
amplificando el segmento Pst1 utilizando los primers CpF y CpR. La PCR touchdown generó un
bandeo mucho más definido y con mayor resolución, y debido a la falta de reproducibilidad del PCR convencional solo se utilizó el touchdown para las siguientes pruebas. La sensibilidad analítica de la PCR fue determinada con diluciones del ADN del control, con diferentes tiempos y voltajes en el corrido electroforético. El límite de sensibilidad de la prueba fue de
±
67.9 copias/uL (considerado como adecuado para una prueba diagnóstica) y las condiciones electroforéticas óptimas fueron a 100 V por 60 min, siendo éstas seleccionadas por presentar el porcentaje de error más bajo y el R2 mas alto (8.210% y 0.9963, respectivamente). Tras la estandarización, la PCR touchdown fue aplicada empleando aspirados nasofaríngeos procedentes de pacientes con NAC útiles para establecer la posible presencia del agente. Tras la prueba realización de la PCR se detectaron algunas muestras que debido a la intensidad de las bandas fueron clasificadas como dudosas, en presencia de controles adecuados. Las 3 muestrasfueron secuenciadas obteniéndose resultados negativos para C. pneumoniae. Una posible
explicación a este hecho podría ser que debido a la periodicidad epidemiológica del agente estuviéramos en un período de no circulación del mismo. Finalmente, para evaluar la presencia
de posibles inhibidores de la PCR especie–específica para C. pneumoniae se realizó amplificación
de un fragmento de β-‐ globina humana, obteniendo resultados positivos para todas las muestras con excepción de la muestra 15. En conclusión, se implementó una prueba molecular (PCR) útil en la detección de C. pneumoniae usando un perfil tipo touchdown. En vista de los resultados negativos hasta ahora, se debe realizar a futuro más pruebas usando aspirados nasofaríngeos idealmente provenientes de pacientes con NAC, o bien usando muestras preparadas sobre negativos a los que se le adicione diferentes cantidades del controles. Este tipo de eventos deben ser hechos como estudios ciegos para evitar el sesgo de la persona al procesar las muestras.
1. Introducción
La neumonía es una enfermedad infecciosa aguda, causada por gran variedad de patógenos que afecta los pulmones, generando una respiración dolorosa y una limitación de la absorción del oxigeno debido a la inflamación de los espacios alveolares (Organización Mundial de la Salud, 2012). Esta se caracteriza por presentar una respiración rápida o con dificultad, tos, fiebre, escalofríos, pérdida de apetito y sibilancia (7); presentando una mortalidad mayor en la población infantil y anciana (24). Las neumonías agudas son aquellas que son recientes y se manifiestan de manera repentina, dentro de estas se encuentran las Neumonías Adquiridas en la Comunidad (NAC) y la Neumonía Nosocomial (NN) (7). La NAC se caracteriza por ser una inflamación de la parénquima pulmonar causado por un agente de tipo infeccioso, pues los espacios alveolares se llenan de exudados, células inflamatorias y fibrina (1,7,24). Esta enfermedad es una de las razones más frecuentes de consultas en hospitales, por lo cual es importante tener un conocimiento amplio acerca de su etiología y epidemiologia (2). El agente etiológico mas frecuentemente asociado a
esta enfermedad es Streptococcus
pneumoniae, seguido de Haemophilus influenza, los cuales son considerados los principales causales de la neumonía típica
(7,27). Sin embargo, debido al
mejoramiento de las técnicas de detección se han encontrado casos frecuentes de infecciones respiratorias asociadas a la presencia de bacterias atípicas, entre ellas,
Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila (Chlamydia) pneumoniae y Legionella pneumophila (3,27). Algunos reportes describen que un tercio de los casos de NAC
en niños son causados por, M. pneumoniae
y C. pneumoniae (3), a pesar de todo esto,
todavía se encuentra que
aproximadamente solo el 65% de los pacientes con NAC se les identifica el
agente etiológico. Lo anterior constituye, un gran problema para lograr dar un tratamiento pertinente y de esta manera evitar una infección posterior o resistencia antimicrobiana debido al uso incorrecto de antibióticos (12), ya que estas bacterias
atípicas no responden a terapias
antimicrobianas con beta lactámicos que son un uso común para el tratamiento de las NAC (16).
C. pneumoniae es un patógeno intracelular que fue reconocido por primera vez como agente infeccioso del tracto respiratorio en 1965 (25). Este puede llegar a causar tanto enfermedades respiratorias severas en niños, como en personas inmunosuprimidas y de la tercera edad (4). Este puede llegar a causar desde sinusitis y faringitis, con una incidencia del 5% (25), hasta bronquitis y neumonía. Se ha sugerido que la infección por este patógeno puede llegar a jugar un papel determinante en el asma, y en otras patologías como la enfermedad pulmonar crónica obstructiva, faringitis crónica, la
aterosclerosis, lesiones vasculares,
enfermedades del sistema nervioso central entre otras (4,13,20,25). Además se ha asociado la presencia de esta bacteria atípica en pacientes con diabetes mielitus,
esclerosis múltiple y Alzheimer.
Principalmente se ha reportado en niños en edades escolares que se encuentran en comunidades cerradas como colegios, de las cuales se encuentra en frecuencias elevadas o bases militares (5,6,14). Se ha estimado que aproximadamente del 10-‐ 20% de pacientes adultos con NAC son
causadas por C. pneumoniae (8,10,11,24).
Sin embargo, es importante tener una compresión más detallada de la situación en Colombia en especial teniendo en cuenta que esta bacteria puede persistir en el tracto respiratorio incluso cuando ya se ha dado lugar a la resolución de los síntomas generando un posible foco de diseminación importante de la enfermedad (8). Pues, según evidencia serología de un 50%-‐60%
de los adultos han una infección durante su vida (7).
Otra de la dificultades a la hora del diagnóstico es que para discernir entre cual es el agente etiológico de una NAC basado solamente en el examen físico del paciente (los signos y los síntomas), aún con las radiografías de tórax es extremadamente complicado, lo cual hace necesaria su adecuada identificación en el laboratorio (11). Entre los procedimientos de detección comunes para este microorganismo se encuentran el cultivo, las pruebas inmunohistioquímicas, los test serológicas (inadecuado para discriminar una infección reciente de una crónica) (23), entre las cuales se encuentran: el test de fijación del complemento (19) y los ensayos de Inmunoflorescencia
(Microinmunofluorescencia, MIF) en los cuales el título de anticuerpos del tipo inmunoglobulinas G y M (IgG e IgM
respectivamente) permite tener un
acercamiento al diagnostico. Sin embargo, debido a que algunos de estos procedimientos son laboriosas, o bien requieren personal especializado y en general carecen de sensibilidad y especificidad, no se consideran lo
suficientemente adecuados
(2,4,11,13,16,25). A pesar de esto, se considera la MIF como el estándar de oro (gold standard) para la diagnóstico de una neumonía aguda, aunque se conocen sus limitaciones en cuanto a su nivel de
complejidad y subjetividad en la
interpretación de los resultados (25). En razón a lo anterior ya que la epidemiologia actual se basa en los resultados generados
por las pruebas anteriormente
mencionadas, lo cual puede estar subestimado la prevalencia real de este agente, por lo tanto se hace necesario implementar métodos que muestre una mayor exactitud y precisión y que por ende permitan llevar a cabo una mejora en la detección, así como el manejo y
seguimiento efectivo de los pacientes infectados por esta bacteria (9,10).
Ya que la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una técnica molecular que ha sido usada para la detección rápida,
sensible, especifica y simple de C.
pneumoniae, que no solo ayuda al diagnóstico y tratamiento, sino a conocer mas sobre su epidemiologia (2,4,8,9,10). Esta se ha determinado como una opción
para determinar la presencia de C.
pneumoniae de muestras respiratorias de pacientes con NAC. Basados en lo anterior se plantea la presente investigación cuyo propósito es implementar una prueba de
PCR útil en la identificación de C.
pneumoniae en muestras respiratorias. La prueba sugerida se basa en la amplificación de un fragmento (Pst1) que se encuentra en el gen rpoB que codifica para la cadena β de la RNA polimerasa (22), la cual por ser una región conservada intra-‐especie, no amplifica para otro tipo de Chlamydophila. La estandarización de la prueba molecular
mencionada permitirá la detección de C.
pneumoniae, así como un primer acercamiento a la determinación de su prevalencia en la nuestra población.
La investigación a realizar es de vital importancia pues en Colombia no se tienen estadísticas verídicas acerca de la
epidemiologia y prevalencia de C.
pneumoniae. Ya que, como se mencionó anteriormente, su identificación se basa en pruebas que presentan reactividad cruzada y baja sensibilidad, por lo cual es necesario usar una técnica mas rápida sensible y simple como PCR para realizar una identificación correcta. De esta forma al conocer su prevalencia exacta se podría llegar generar mejores programas de salud dirigidos a lograr establecer un tratamiento mas adecuado de la enfermedad basado en el patógeno particular que la esta causando.
El objetivo de este estudio fue implementar una prueba de PCR útil en la identificación
de C. pneumoniae. Se determinaron las
condiciones óptimas de la prueba mediante la utilización de diferentes condiciones del corrido electroforético y protocolos térmicos. Además, se estableció el límite de sensibilidad de la PCR mediante la utilización de diluciones seriadas del control. De forma colateral, se aplicó la
prueba en aspirados nasofaríngeos
provenientes de pacientes con diagnóstico de NAC. Finalmente, la presencia de posibles inhibidores de la PCR especie–
específica para C. pneumoniae fue
evaluada, mediante la amplificación de un fragmento de β-‐ globina humana.
2. Materiales y Métodos
2.1. Búsqueda y análisis de la información:
Usando los criterios de búsqueda “Chlamydia pneumoniae AND Molecular
diagnosis AND PCR” o “Chlamydophila
pneumoniae AND Molecular diagnosis AND PCR”, en la base de datos del NCBI, PubMed se revisó la literatura científica relacionada
con el diagnóstico molecular de C.
pneumoniae entre 1992 hasta el presente. Para determinar que pareja de iniciadores podría ser indicada para su uso en una PCR, todas las posibles parejas encontradas fueron analizadas mediante un PCR in silico A partir de estos se determinó el uso de los primers CpR y CpF.
Se llevó a cabo un análisis bioinformático usando Primer-‐Blast y Blastn, con el fin de determinar la región amplificada por las parejas de primers y comparar entre el genoma de C. pneumoniae, para lo cual se utilizaron las secuencia NC_005043.1 que aparece en la base de datos del GenBank.
2.2. PCR
Controles de la Reacción C. pneumoniae. Se utilizó como control positivo una cepa ATCC de C. pneumoniae MBC011 (Vircell) para la estandarización de la prueba. Asimismo, para el control negativo se utilizo agua como un blanco de reacción.
Implementación del El PCR C. pneumoniae.
La reacciones se llevaron a cabo usando GoTaq® Green Master Mix (Promega, Madison, WI) al 1X, primers a 25mM, 2µL de ADN (del control o de las extracciones) y se fueron completadas con agua estéril el volumen por reacción hasta llegar a 20µL. Para la estandarización de la reacción se llevaron a cabo ensayos teniendo en cuenta las condiciones descritas por Madico y colaboradores en 2000 (21), las cuales fueron modificadas por Ulloa et al en el 2013.
El ADN, tanto del control; como de la extracción de ADN de cada una de las muestras, fueron sometidos a un ciclo térmico por el método de touchdown a tiempo de ciclos de 75s a 95°C (para activar la fracción pequeña de la DNA polimerasa activada por calor), luego le siguen 40 ciclos de denaturación a 94°C por 45 s, anillaje a 62°C al inicio y 51°C al final por 45 s, y extensión 72°C por 1 min, usando un termociclador C1000 Touch™ (BioRad). La Tabla 1 muestra los primers descritos en la literatura, los cuales fueron utilizados para llevar a cabo la reacción mencionada.
Se realizó un ciclo térmico alterno con 75s a 95°C, luego 40 ciclos constituidos por una denaturación a 94°C por 75 s, seguido por un anillamiento a 58°C por 45 s y una extensión de 72°C por 1 min, usando un termociclador C1000 Touch™ (BioRad). La temperatura de anillamiento se determinó por medio de la realización de un perfil térmico usando las siguientes temperaturas de anillaje en °C: 50, 59.9, 52.3, 54, 56.3, 58.1, 59.3, 60. Para determinar la cantidad óptima de primers se realizó una titulación
de primers utilizando 0.5 µL, 0.75 µL, 1 µL, 1.5µL de cada uno.
Tabla 1. Secuencias de los primers de C. pneumoniae. Se listan los marcadores usados en los ensayos para en la detección de C. Pneumoniae.
Primer Secuencia (5'-‐3') Gen amplifica Tamaño del Producto Referencias
CpF CGGCTAGAAATCAATTATAAGACTG
PstI
283pb 7
CpR GGTGTGTTTCTAATACCTGTCC
Electroforesis. Se tomaron 10µl de los productos de la PCR, los cuales fueron separados por medio de un corrido electroforético en un gel de agarosa al 1,5% a un voltaje de 100V a 400 mA por 1 hora.
Implementación del El PCR β-‐globina. La reacciones se llevaron a un volumen total de 20µL, las cuales contenía Gotaq al 1X, primers a 12.5mM, 2µL de ADN (del control
o de las extracciones) y se completó con agua estéril el volumen por reacción hasta llegar al volumen deseado. Las muestras que presentaron un resultado negativo para
C. pneumoniae fueron sometidas a un ciclo térmico a tiempo de ciclos de 5 min a 95°c, luego le siguen 35 ciclos de denaturación a 94°C por 30 s, anillamiento a 57.5°C por 45 s, y extensión 72°C por 45 s, usando un termociclador C1000 Touch™ (BioRad).
Tabla 2. Secuencias de los primers de β-‐globina. Se listan los marcadores usados en los ensayos.
Primer Secuencia (5'-‐3') Gen amplifica Tamaño del Producto Referencias
PCO3 ACACAACTGTGTTCACTAGC
β-‐globina
110pb 28
PCO4 CAACTTCATCCACGTTCACC
Electroforesis. Se tomaron 10µl de los productos de la PCR, los cuales fueron separados por medio de un corrido electroforético en un gel de agarosa al 2% a un voltaje de 100v a 400mA por 50 min.
Visualización de los productos de reacción. Los productos de PCR, fueron visualizados tras la electroforesis. Los fragmentos presentes en los geles de agarosa serán visualizados mediante la tinción del gel con el colorante GelRed. La proporción usada será de 1ul de GelRed por cada 50ml de
Trisbase Acetato ácido
etilendiaminotetraacético, EDTA, (TAE).
2.3. Muestreo
La recolección de pacientes se realizó durante un periodo de 3 meses de Marzo a inicios de Mayo del 2013. Partiendo de la
alianza existente entre la Fundación Neumológica Colombiana (FNC) y la Universidad de los Andes, el proyecto piloto fue realizado en el Laboratorio de Diagnóstico Molecular y Bioinformática (LDMB).
2.4. Recolección de las muestras
Teniendo como objetivo colateral,
identificar la presencia de Chlamydophila
pneumoniae en pacientes con NAC, los aspirados nasofaríngeos procedentes de pacientes fueron utilizados para la detección e identificación del agente mencionado.
Previa obtención del consentimiento del acudiente del paciente, con la debida asepsia y teniendo en cuenta los protocolos establecidos, las muestras (aspirados
nasofaríngeos) fueron tomadas por personal capacitado, vinculado a la
Fundación Neumológica Colombiana.
2.5. Conservación y Transporte de muestras
Tras obtener la muestra, esta debe ser colocada en un tubo plástico (vial), diseñado para su transporte, el cual contendrá un medio apropiado para su mantenimiento (v.gr, PBS pH 7.2 estéril. La muestra será conservada en nevera entre 4°C y 8°C y debe estar en refrigeración durante y hasta su transporte al laboratorio (LDMB; UniAndes), preferiblemente dentro de las 48 horas posteriores a la toma de muestra. POR NINGÚN MOTIVO LA MUESTRA DEBE SER CONGELADA. Al momento de su obtención, cada muestra será rotulada con el código del paciente.
2.5.1. Descripción del procedimiento de cadena custodia de muestras faríngeas
Previo consentimiento del paciente, se tomó con la debida asepsia y de acuerdo con el protocolo las muestras de tracto respiratorio superior (aspirado faríngeo). La toma de muestras faríngeas fue realizada en las instalaciones de la Fundación Neumológica Colombiana, a aquellos pacientes que cumplieron con los criterios de inclusión del estudio. Este procedimiento fue realizado por personal capacitado, vinculado a la Fundación Neumológica Colombiana.
Cada muestra se depositó en un tubo plástico, con tapa rosca, diseñado para su transporte (vial). Las muestras debidamente identificadas, fueron almacenadas de 4°C a 8°C hasta el momento de su envío al Laboratorio de Diagnóstico Molecular y Bioinformática de la Universidad de los Andes, preferiblemente dentro de las 48 horas posteriores a la toma de la misma.
Los viales que contienen los especímenes
fueron organizados utilizando guantes, en un recipiente tipo nevera de icopor y serán transportados en cadena fría -‐ asegurados con "pilas de hielo-‐ bolsas herméticas-‐un sustituto sintético a 4°C". La persona que organizó las muestras para su transporte se aseguró de que las tapas se encuentraban bien aseguradas y adicionalmente los cubrió con parafilm. Los recipientes usados en el transporte fueron usados de forma exclusiva para este fin. Los contenedores en que se transportan las muestras serán embalados con cuidado para evitar derrames o fugas. Al llegar la laboratorio las muestras serán desempacadas utilizando guantes y serán procesadas de forma inmediata. En caso de que esto no sea posible, se guardarán máximo durante 24 horas hasta su procesamiento. En cada caso el tiempo de recepción y procesamiento de cada muestra será anotado en un libro de registro utilizado para tal fin.
Las muestras obtenidas, se consideran potencialmente infecciosas y fueron
manipuladas por personal idóneo
(investigadores y asistentes de investigación con experiencia en el manejo de este tipo de muestras), teniendo en cuenta las
normas científicas, técnicas y
administrativas establecidas para la investigación en salud en la resolución No 008430 de 1993 de Ministerio de Salud: Título IV (De la bioseguridad de las investigaciones). Capítulo I (De la
investigación con microorganismos
patógenos o material biológico que pueda contenerlos).
Ya que los procedimientos fueron llevados a cabo por personal con alto sentido de la ética, la integridad de los participantes en el estudio (en relación con la obtención de muestras, procedimientos de laboratorio y confidencialidad de los resultados), se
encuentra garantizada.
Los residuos que se produzcan a lo largo del proceso, serán desechados siguiendo la
clasificación de los desechos hospitalarios según su naturaleza y destino final tanto en la entidad hospitalaria y de acuerdo a las normas estipuladas para el manejo de desechos de laboratorio, en la institución docente.
Nota: De acuerdo con el parágrafo primero del artículo 16; capitulo 1; título II; de la resolución 008430 del Ministerio de Salud, se pretende obtener el consentimiento escrito de los individuos participantes en el estudio.
2.6. Procesamiento de muestras respiratorias
2.6.1 Extracción ADN
En primer lugar se aplica vortex durante 30s a las muestras de aspirados nasofaríngeos y se completa a 1.5mL con PBS al 1X, si es necesario. A continuación se vuelve a aplicar vortex durante 30s y se centrifuga (1900 rpm por 10 min a 4°C). A partir de lo anterior se extrajo de ADN con el Wizard® DNA Clean-‐Up System (Promega, Madison, WI), siguiendo las instrucciones del fabricante y guardado a -‐20°C.
2.7. Secuenciación
La confirmar el estatus de las muestras que en presencia de controles adecuados resultaron dudosas en la reacción de PCR para C. pneumoniae, se realizó de nuevo la amplificación para el segmento Pst1 del agente y se enviaron 20uL tanto de las muestras como del control a Macrogen (Corea) donde se realizó la secuenciación a partir de los primers CpR y CpF.
2.7. Manejo de datos y análisis estadístico
Tamaño Molecular de las bandas. Para el cálculo del tamaño de las bandas esperadas se utilizó una regresión lineal en base a las distancias del pozo de sembrado en base
logarítmica de cada banda del marcador de peso con su tamaño respectivo. A partir de esto se generó una ecuación de la recta y se realizaron los cálculos del R2 para así con la distancia medida de la banda generada por el control se calculó su peso y se obtuvo el porcentaje de error con respecto al tamaño esperado de la banda de 283pb.
3. Resultados
3.1 Estandarización
Se realizó una prueba para determinar el ciclo térmico adecuado utilizando una por método touchdown y una segunda prueba que incluía un perfil térmico con un rango de 8 temperaturas entre 50°C-‐60°C de anillaje para así poder determinar cuál sería la temperatura adecuada en un protocolo. A partir de los resultados anteriores (figura 1) se seleccionó la temperatura de 58°C, como la óptima debido a que ésta generó una banda con mayor resolución en comparación con las demás temperaturas. Sin embargo, cabe notar que en la temperatura de 56.3°C se genera un tipo de inhibición de la reacción y no se genera banda. Por otro lado se realizó una titulación de primers en la cual se agregaron 4 diferentes cantidades de cada uno de los primers por duplicado (datos no mostrados). Según los resultados obtenidos (Figura 2) se seleccionó utilizar 1µL de cada uno de los primers pues presentaban las bandas mas definidas y de mayor resolución. En cuanto a la comparación de los tipos de PCR (Figura 3) se puede observar que hay una mejora considerable en cuanto a la resolución y visualización de los productos de la prueba. Pues en las bandas generadas por la PCR touchdown (Figura 3b) se ven con mucha mayor claridad e intensidad en comparación con el otro método que presenta bandas bastante débiles y tenues (Figura 3a). A pesar de realizar varias réplicas de la reacción de PCR convencional no se mostró ninguna mejora
en la reacción por lo cual se decidió utilizar el método de touchdown, aunque el tiempo
total del protocolo fuera
considerablemente mayor. En todos los casos se presentó que la detección de la
banda esperada se presentaba solo hasta la dilución 1:200 del control positivo puro, la cual corresponde aproximadamente 67.9 copias/µL.
Luego de determinar el ciclo térmico adecuado se realizaron serie de pruebas de las condiciones electroforéticas a diferentes voltajes y tiempos de corrido (Figura 4). Este proceso se realizó por triplicado, teniendo una baja reproducibilidad en los resultados de las primeras replicas hasta obtener lo que se observa en la Figura 4. A partir de los resultados, se obtuvo una
transformación logarítmica a la distancias de cada banda y con estos se generó una regresión lineal con su R2 para determinar el tamaño de las bandas observadas y de esta manera lograr hacer una comparación del peso esperado (283pb) mediante el cálculo del porcentaje de error (Tabla 3).
1 2 3 4 5
6
7
8
Figura 1. Resultados del perfil térmico con diferentes temperaturas anillamiento. 1)
Marcador de peso O´GeneRuler de 100 pb
(2uL). 2) Vacío. 3) Control negativo 60°C. 4) Control positivo 60°C. 5) Control negativo 59.3 °C. 6) Control positivo 59.3 °C. 7) Control negativo 58.1°C. 8) Control positivo 58.1°C. 9) Control negativo 56.3°C. 10) Control positivo 56.3°C. 11) Control negativo 54°C. 12) Control positivo 54°C. 13) Control negativo 52.3°C. 14) Control positivo 52.3°C. 15) Control negativo 50.9°C. 16) Control positivo 50.9°C. 17) Control negativo 50°C. 18) Control positivo 50°C.
Figura 2. Resultados Titulación de Primers. 1) Marcador de peso O´GeneRuler de 100 pb (1.5uL). 2) Vacío. 3) Control positivo 1:100 con 2µL de cada primer. 4) Control negativo. 5) Control positivo 1:100 con 0.5µL de cada primer. 6) Control positivo 1:100 con 0.75µL de cada primer. 7) Control positivo 1:100 con 1µL de cada primer. 8) Control positivo 1:100 con 1.5µL de cada primer.
Como se puede observar, las reacciones que se realizaron a 80 V generaban una distorsión en comparación con las de 100 V, generando una complicación a la hora de la medida de las distancias. Por otro lado, cabe notar que los tiempos de corrido de 60 min presentaban R2 más altos (de 0.99693 y 0.9392, para 100 V y 80 V, respectivamente) y porcentajes de error más bajos (de
8.2104% y 19.175%, para 100 V y 80 V, respectivamente) que los calculados para 80 min. De acuerdo a lo anterior se determinó que el voltaje y tiempo adecuados seria a 100 V y a 60 min, respectivamente ya que poseían el R2 mas alto (0.99693) y el porcentaje de error más bajo (8.2104%).
Gel Ecuación Línea R2 x Peso (pb)=log(x) % Error
100V 60 min y = -‐0.2529x + 4.1343 0.99693 2.4146 259.76 8.2104
100V 80 min y = -‐0.1819x + 4.0546 0.9931 2.3993 250.79 11.382
80V 60 min y = -‐0.2857x + 4.3878 0.99392 2.3593 228.73 19.175
80V 80 min y = -‐0.1789x + 3.9689 0.96875 2.3588 228.45 19.274
Figura 3. Resultados de dos tipos de PCR. a) PCR anidada. 1) Control negativo. 2) Replica control negativo. 3) Vacío. 4) Vacío. 5) Marcador de peso O´GeneRuler de 100 pb (1.5uL). 6) Control positivo. 7) Replica Control positivo 1:100. 8) Replica Control positivo 1:100. b) PCR touchdown 1) Control negativo. 2) Marcador de peso O´GeneRuler de 100 pb (1.5uL). 3) Control positivo 1:100. 4) Replica Control positivo 1:100. 5) Replica Control positivo 1:100. 6) Vacío. 7) Vacío. 8) Vacío.
Tabla 3. Resultados de la regresión lineal a partir de cada condición evaluada. x: corresponde al valor de la distancia de la banda esperada en logaritmo. Las distancias medidas (cm) se utilizaron con una transformación logarítmica para poder realizar la regresión lineal.
3.2 Aplicación del PCR a muestras clínicas en busca de C. pneumoniae
A partir de la estandarización de la prueba se evaluaron las muestras clínicas (n=19), cuyos resultados pueden observarse en las Figuras 5 y 6, de las cuales no se obtuvo ningún resultado positivo. A pesar de que en las muestras 6, 7 y 11 (Figura 5 y 6) parecían tener unas bandas bastante
tenues al repetir varias veces la prueba no se generaba ninguna banda (Datos no mostrados). La secuenciación del control género los resultados esperados mientras que en las muestras no se observó ningún pico definido con los primers CpF y CpR, comprobando efectivamente se trataban de resultados negativos. Obteniéndose una detección del 0% en todas las muestras evaluadas.
1 2 3 4 5 6 7 8
1 2 3 4 5 6
7 8
1 2 3 4 5 6 7 8
1 2 3 4 5 6 7 8
a)
b)
c)
d)
Figura 4. Resultados con diferentes condiciones electroforéticas. a) 100v 60min. b) 100V 80 min. c) 80V 60 min. d) 80V 80 min. 1) Marcador de peso O´GeneRuler de 100 pb (1.5uL). 2) Control negativo 3) Vacio. 4) Dilución control positivo 1:100. 5) Dilución control positivo 1:200 6) Dilución control positivo 1:500. 7) Dilución control positivo 1:1000. 8) Dilución control positivo 1:2000.
Figura 5 Resultados amplificación gen pst1 de muestras 1-‐9. 1)
Control Negativo. 2) Replica Control Negativo. 3) Vacío. 4) Marcador de peso O´GeneRuler de 100 pb (1.5uL). 5) Muestra 1. 6) Muestra 2. 7) Muestra 3. 8) Muestra 4. 9) Muestra 5. 10) Muestra 6. 11) Muestra 7. 12) Muestra 8. 13) Muestra 9. 14) Control positivo. 15) Marcador de peso O´GeneRuler de 100 pb (1.5uL).
Figura 6 Resultados amplificación gen pst1 de muestras 6, 7, 10-‐19.1) Control Negativo. 2) Marcador de peso O´GeneRuler de 100 pb (1.5uL). 3) Muestra 6. 4) Muestra 7. 5) Muestra 8. 6) Muestra 9. 7) Muestra 10. 8) Muestra 11. 9) Muestra 12. 10) Muestra 13. 11) Muestra 14. 14) Control positivo.
3.3 Amplificación gen β-‐globina en Muestras
En primer lugar, se realizó la
estandarización de la prueba (Figura 7) mediante la utilización de GoTaq. En esta prueba se logró amplificar unas muestras obtenidas de la extracción de ADN total a partir de biopsias gástricas, que ya habían sido evaluadas previamente. Luego, se pasó a la revisión de la presencia de inhibidores con las 19 muestras (Figura 8 y 9) de las cuales todas amplificaron para el gen de β-‐ globina. En la primeras pruebas (Figura 8a y
9a) se generaron resultados inconclusos de la muestras 3,4,5,7,8, 11, 13, 15, 17 y 18 por lo cual se repitieron en la segunda prueba (Figura 8b y 9b). De acuerdo a esta se confirmó la presencia del gen de β-‐globina
para las muestras con resultados dudosos, a excepción de la muestra 15. A pesar de que se realizó nuevamente la extracción de ADN para esta muestra y se repitió varias veces la prueba de PCR nunca se generó un resultado positivo.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Figura 7 Resultados estandarización gen β-‐globina con muestras extracción ADN de biopsias gástricas .1)
Marcador de peso O´GeneRuler de 100 pb (1.5uL). 2) Control Negativo. 3) Vacío 4) Muestra 48. 5) Muestra 65. 6) Muestra 73. 7) Muestra 75. 8) Muestra 78.
1 2 3 4 5 6 7 8
1
2 3 4
5 6 7 8 9 10 11 12 13
14
a) b)
1
2 3 4 5 6 7 8
9
Figura 8 Resultados amplificación gen β-‐globina de muestras a) Muestras 1-‐12 1)
Control Negativo. 2) Marcador de peso O´GeneRuler de 100 pb (1.5uL). 3) Muestra 1. 4) Muestra 2. 5) Muestra 3. 6) Muestra 4. 7) Muestra 5. 8) Muestra 6. 9) Muestra 7. 10) Muestra 8. 11) Muestra 9. 12) Muestra 10. 13) Muestra 11. 14) Muestra 12. b) Repetición varias muestras 1) Control Negativo. 2) Replica Control Negativo. 3) Marcador de peso O´GeneRuler de 100 pb (1.5uL). 4) Muestra 3. 5) Muestra 4. 6) Muestra 5. 7) Muestra 7. 8) Muestra 8. 9) Muestra 11.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 2 3 4 5 6 7 8
a)
b)
Figura 9 Resultados amplificación gen β-‐globina de muestras a) Muestras 13-‐19 1)
Control Negativo. 2) Marcador de peso O´GeneRuler de 100 pb (1.5uL). 3) Muestra 13. 4) Muestra 14. 5) Muestra 15. 6) Muestra 16. 7) Muestra 17. 8) Muestra 18. 9) Muestra 19. b) Repetición varias muestras 1) Control Negativo. 2) Replica Control Negativo. 3) Marcador de peso O´GeneRuler de 100 pb (1.5uL). 4) Muestra 13. 5) Muestra 15. 6) Muestra 17. 7) Muestra 18. 8) Vacío. 9) Vacío.
4. Discusión
El PCR en touchdown es método efectivo, fácil e útil (21) para la detección C. pneumoniae usando la un segmento pst1 del gen ropβ que codifica para cadena β del
RNA polimerasa. El segmento de
amplificación utilizado es especie especifico para C. pneumoniae, y no amplifica para otras especies de Chlamydophila ni para patógenos asociados a la misma patología
como S. pneumoniae, H. Influenza, M.
pneumoniae o L. pneumophila, lo cual fue
comprobado mediante un PCR in silico con
los primers CpR y CpF.
Al realizar un protocolo térmico de forma touchdown, con diferentes temperaturas de anillaje se lograba tener una mayor sensibilidad pues el anillamiento de los primers se optimiza (21). Además, con los 60 ciclos de amplificación se aumento la sensibilidad de la prueba comparado con el protocolo de 40 ciclos, que en un inicio se lograron resultados favorables, sin embargo no se obtuvo reproducibilidad de estos. En la utilización de PCR touchdown de liberación de enzimas (TETR-‐PCR) multiplex donde se calcula la sensibilidad de manera cuantitativa mediante el conteo de unidades formadoras de inclusiones (IFU) de C. pneumoniae, de la cual había una aumento en mas de dos ordenes de magnitud de las IFU detectadas por el PCR touchdown (0.004-‐0.063 IFU) comparado con el convencional (35 ciclos, 0.1-‐4 IFU) (21). Además, estos resultados eran comparables con los ensayos de PCR convencional (0.063 IFU) y presentaba mayor sensibilidad que los inmunoensayos (21) y las pruebas serológicas (26,9). Estos límites de detección que se han encontrado en especial de la PCR touchdown presentan bastante relevancia en la detección clínica en muestras respiratorias usando líneas celulares HEp-‐2 a partir del asilamiento de
secreciones nasofaríngeas pues se ha reportado desde 10 a > 500 IFU/mL (29) hasta 5 a 30 IFU/mL (30). El límite de detección de la para pruebas de PCR convencional puede variar, determinándose como excelente sensibilidad aquella entre 0.0001-‐0.001 copias/µL (32), sin embargo se ha determinaron que para concentraciones mayores a 1 copia/µL habría mayor reproducibilidad y sensibilidad de la prueba al ser probada en diferentes laboratorios (15). Lo anterior difiere considerablemente con el limite de sensibilidad encontrado (67.9 copias/µL) lo cual puede deber a que el control usado fue un control comercial en lugar de una extracción a partir de cultivo que es la forma usualmente usada para el cálculo.
Por otro lado se evaluaron muestras clínicas de aspirados nasofaríngeos provenientes de pacientes con NAC, de las cuales no se presentó ningún resultado positivo. Sin embargo, no se generó bandeo inespecífico, tanto en las muestras con los controles positivos y negativos, lo cual indica la alta especificidad de la prueba evaluada (7). Al comprobar la falta de inhibidores de la PCR mediante la amplificación del gen de la β-‐ globina,a excepción de una muestra, se comprobaba la efectividad de la pruebas en las muestras respiratorias evaluadas, pues se generaron verdaderos resultados negativos. En la muestra que no generó amplificación se encontró que esta presentaba valores altos de proteínas que pudieron haber inhibido el funcionamiento de la PCR. A partir de lo anterior, ya que no parecía haber concordancia con los valores de detección reportados en la literatura que son entre 10 y 20%, (8,10,11,24), se estableció que algunos estudios se salen del rango esperado (4,10,13,18,24,26, 31) y que esto puede ocurrir dependiendo de acuerdo la región y tiempo de muestreo en cada estudio, el gen a amplificar y protocolo
de PCR utilizado, y tipo de muestra empleado y en especial de la circulación del agente. Algunas posible explicaciones incluirían como posibilidades, que el valor de 0% en las muestras se diera por: el bajo tamaño muestral utilizado en comparación con otros estudios (12,14,16,24,29,31), ya que la probabilidad de llegar a tener resultados positivos aumentaría. Así mismo, se tiene un sesgo en la población ya que solo te tenían en cuenta los pacientes de la FNC, los cuales no son una muestra representativa de la población total. Otra posible explicación sería la cantidad de ADN presente en las muestras (31). Pues de acuerdo a la reacción de la β-‐globina habían algunas muestras que presentaban menor intensidad de la banda (muestras 3,4,5,7,8,11,13,17), lo cual se ve reflejado en menor cantidad de ADN, que resulta en una menor probabilidad de encontrar ADN de C. pneumoniae generando un resultado negativo en la PCR debido a la insuficiencia de éste ácido nucleíco. Además, cabe notar que esta bacteria se presenta en periodos epidemiológicos de 2 o 3 años de alta incidencia seguidos de 4 a 5 años de baja (25). Por lo cual, es posible que el período muestreo de este estudio haya sido entre los tiempos de baja incidencia. Luego se esperaría que no se encontrara la detección de C. pneumoniae en pacientes con NAC.
Debido a que la PCR presenta una mayor sensibilidad que otros métodos usados para
la detección de C. pneumoniae
(4,8,9,10,22,26,31), esta debería ser usado en estudios epidemiológicos futuros y el brotes de neumonías en los cuales no se conoce el agente etiológico. Además, es importante recalcar que en cualquier estudio sobre este agente se deberían tener en cuenta controles de pacientes sanos, y
pacientes con infecciones pasadas de C.
pneumoniae y un seguimiento estricto del protocolo de inclusión de pacientes. Para que de esta manera se pueda determinar el significado clínico de las muestras positivas
y saber con certeza el estado de portadores asintomáticos de la población y la persistencia del organismo después de la infección (7). Es importante, no solo hacer
estudios sobre la asociación de C.
pneumoniae en pacientes con NAC, sino documentar la cantidad de portadores pasivos ya que no ha sido altamente reportado. Si se conoce con certeza la cantidad de portadores e infectados se pueden generar una respuesta más efectiva de la salud pública y un tratamiento y medidas apropiadas para la erradicación de la misma.
Así mismo se debería tener un cálculo de la especificidad y sensibilidad de la prueba. La especificidad mediante el uso de bacterias que causan neumonía atípica, típica y con
baterías similares como Chlamydia
trachomatis y Chlamydophila psittaci, pues se realizó un ensayo de PCR in silico de los primers utilizados, el cual solo amplificaba para las distintas cepas de C. pneumoniae.
La sensibilidad mediante comparación con el método de MIF y el cultivo. De esta forma el protocolo podrá ser comparado contra otros estudios para determinar si su funcionamiento es viable. Por otro lado, se podría generar un método más fiable mediante la inclusión de más tipos de PCR como la TETR-‐PCR y PCR cuantitativo en tiempo real (qRT-‐PCR) usando sondas ‘‘Light Upon eXtension’’ (LUX) y TaqMan para su detección (2).
En conclusión, se logro implementar una prueba molecular (PCR) útil en la detección de C. pneumoniae usando un perfil tipo touchdown, para llevar a cabo la detección del agente. Paralelamente, se aplico la prueba estandarizada usando aspirados nasofaríngeos provenientes de pacientes con NAC, dando como resultado una no detección del agente en las mismas. A continuación, mediante una segunda PCR para la amplificación del gen de la B-‐globina humana, fue posible evaluar la presencia
de posibles inhibidores de la PCR especie–
específica para C. pneumoniae.
Al ser una bacteria de difícil cultivo y con pruebas de baja sensibilidad y precisión, es importante tener métodos como estos para lograr determinar el impacto que causando en pacientes con NAC además de sus características epidemiológicas. Así mismo, es necesario calcular la sensibilidad y especificidad de la prueba para lograr tener un punto de comparación con las demás pruebas existentes. Luego, para evaluar la funcionalidad de ella en estudios futuros es importante tener un cubrimiento amplio de tiempo, ya que es una bacteria que presenta años epidémicos y no epidémicos.
5. Referencias
[1] Tórax, S. C. d. N. y. C. d. (1995). Recomendaciones para el diagnóstico, tratamiento y prevención de la neumonía adquirida en la comunidad. Revista Colombiana Neumologica. 7: 104-‐113.
[2] Kerdsin, A., R. Uchida, et al. (2010). "Development of Triplex SYBR Green Real-‐Time PCR for Detecting
Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila
pneumoniae, and Legionella spp. without Extraction
of DNA." Japanesse Journal of Infectious Disease 63(3): 173-‐180.
[3] File, T. M. (2003). "Community-‐acquired pneumonia." The Lancet 362(9400): 1991-‐2001.
[4] Mitchell, S. L., S. Budhiraja, et al. (2009). "Evaluation of two real-‐time PCR chemistries for the detection of Chlamydophila pneumoniae in clinical specimens." Molecular and Cellular Probes 23(6): 309-‐311.
[5] Pether, J. V. S., S.-‐P. Wang, et al. (1989). "Chlamydia pneumoniae, strain TWAR, as the cause of an outbreak in a boys' school previously called psittacosis." Epidemiology & Infection 103(02): 395-‐ 400.
[6] Ekman, M.-‐R., J. T. Grayston, et al. (1993). "An Epidemic of Infections Due to Chlamydia pneumoniae in Military Conscripts." Clinical Infectious Diseases 17(3): 420-‐425.
[7] McDonough, E. A., C. P. Barrozo, et al. (2005). "A
multiplex PCR for detection of Mycoplasma
pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae, Legionella
pneumophila, and Bordetella pertussis in clinical
specimens." Molecular and Cellular Probes 19(5): 314-‐322.
[8] Diaz, M. H. and J. M. Winchell (2012). "Detection
of Mycoplasma pneumoniae and Chlamydophila
pneumoniae directly from respiratory clinical
specimens using a rapid real-‐time polymerase chain reaction assay." Diagnostic microbiology and infectious disease 73(3): 278-‐280.
[9] Loens, K., W. G. MacKay, et al. (2010). "A multicenter pilot external quality assessment program to assess the quality of molecular detection
of Chlamydophila pneumoniae and Mycoplasma
pneumoniae." Journal of Microbiological Methods
82(2): 131-‐135.
[10] Loens, K., T. Beck, et al. (2008). "Evaluation of different nucleic acid amplification techniques for the detection of M. pneumoniae, C. pneumoniae and
Legionella spp. in respiratory specimens from patients
with community-‐acquired pneumonia." Journal of Microbiological Methods 73(3): 257-‐262.
[11] Thurman, K. A., A. K. Warner, et al. (2011). "Detection of Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia
pneumoniae, and Legionella spp. in clinical specimens
using a single-‐tube multiplex real-‐time PCR assay." Diagnostic microbiology and infectious disease 70(1): 1-‐9.
[12] Loens, K., T. Beck, et al. (2008). "Development of Real-‐Time Multiplex Nucleic Acid Sequence-‐Based
Amplification for Detection of Mycoplasma
pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae, and
Legionella spp. in Respiratory Specimens." Journal of
Clinical Microbiology 46(1): 185-‐191.
[13] Loens, K., T. Beck, et al. (2006). "Development of Conventional and Real-‐Time Nucleic Acid Sequence-‐ Based Amplification Assays for Detection of
Chlamydophila pneumoniae in Respiratory
Specimens." Journal of Clinical Microbiology 44(4): 1241-‐1244.
[14] Gullsby, K., M. Storm, et al. (2008).
"Simultaneous Detection of Chlamydophila
pneumoniae and Mycoplasma pneumoniae by Use of
Molecular Beacons in a Duplex Real-‐Time PCR." Journal of Clinical Microbiology 46(2): 727-‐731.
[15] Chernesky, M., M. Smieja, et al. (2002). "Comparison of an Industry-‐Derived LCx Chlamydia
pneumoniae PCR Research Kit to In-‐House Assays
Performed in Five Laboratories." Journal of Clinical Microbiology 40(7): 2357-‐2362.