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VIRUS EPSTEINBARR
Y
LINFOMAS PEDIÁTRICOS
NATALIA MARIN HUARTE
R1 PEDIATRÍA HOSPITAL LA PAZ
TRABAJO PARA EL CURSO DE DOCTORADO: “ PECULIARIDADES
ANATOMOPATOLÓGICAS DE LAS NEOPLASIAS EN LA EDAD PEDIÁTRICA”
CONTRIBUTION OF EBV GENES TO THE
PATHOGENESIS OF EBV-POSITIVE HODGKIN
LYMPHOMA
EBV-positive HRS cells exhibit a type II form of virus latency, virus gene expression being limited to the EBERs, Epstein–Barr nuclear antigen-1 (EBNA1),78 latent membrane protein 1
(LMP1),43 44 79 LMP2,79 80 (fig 2), and the Bam H1A rightward
transcripts (BARTs).79 EBV may contribute to the pathogenesis
of HL before the HRS cell progenitor leaves the GC because it has been shown to rescue BCR-negative human tonsillar GC cells from apoptosis, and because HRS cells with crippling IGH mutations are almost exclusively found in EBV-positive patients.81–85
LMP1 induces many of the phenotypic changes observed in EBV-infected B cells, including expression of the B-cell activation markers, CD23 and CD40, interleukin (IL)-10 production and up-regulation of cell adhesion molecules such as ICAM1, LFA1 and LFA3. LMP1 also protects B cells from cell death by the up-regulation of several anti-apoptosis genes including BCL2, MCL1 and A20.86–89 LMP1 functions as a
constitutively activated member of the tumour necrosis factor
in a ligand-independent manner. LMP1 can engage the MAP kinase cascade resulting in the activation of ERK, JNK and p38 and can stimulate the JAK/STAT pathway.90–94 Two distinct
functional domains referred to as C-terminal activation regions 1 and 2 (CTAR1 and CTAR2) have been identified on the basis of their ability to activate these signalling pathways. CTAR1 activates NF-kB mainly through the non-canonical pathway (TRAF3/NIK/IKK-alpha). In contrast, CTAR2 activates the canonical pathway by utilising TRAF6 and TAK1 to activate IKK-beta.95Although NF-kB activation can be induced by LMP1
in EBV-positive HRS cells, other routes to its activation must exist in EBV-negative cases. IkBa mutations have been reported in HL and might be more frequent in EBV-negative cases.96–99
Amplification of the NF-kB/RelA locus at 2p13-16 is also frequent in HL.100 101
LMP1 can induce expression of DNA methyltransferases and mediate hypermethylation of the E-cadherin promoter in epithelial cells.102 103 We have recently shown that LMP1 can
up-regulate the Polycomb gene, BMI1, in HL cells.104Bmi-1 is a
component of the polycomb repressive complex, PRC1; it is required for the initiation of gene silencing and induces lymphoid proliferation and the development of lymphomas in transgenic mice.105 We showed that BMI1 and LMP1 can
regulate a shared subgroup of HL-associated genes, including the ATM tumour suppressor.104 Therefore, it is likely that EBV
mediates some its transforming effects through Bmi-1.
The identification that a virus strain carrying a 30 bp deletion in the LMP1 gene was more tumourigenic than the prototype B95.8 LMP1106led to numerous studies of the prevalence of this
virus strain within EBV-associated cancers, including HL. In general, virus strains carrying this 30 bp deletion occur with a similar frequency in virus-positive tumour patients and in healthy donors from the same geographical region.107 The
exception to this is HL,108 where some studies have shown an
increased incidence of this deletion variant in HIV-positive HL compared to HIV-negative HL,109and in paediatric HL compared
to normal controls.110
LMP2A is also highly expressed in EBV-positive HRS cells.79
LMP2A was shown to compete for the binding of the Src and Syk protein tyrosine kinases, thereby blocking BCR signalling and induction of lytic cycle in B cells.111 Paradoxically,
expression of LMP2A in the B cells of transgenic mice abrogates normal B-cell development, allowing immunoglobulin-negative cells to colonise peripheral lymphoid organs,112suggesting that
LMP2A can provide a BCR-like signal. LMP2A expression in transgenic mouse B cells down-regulates expression of many of the B-cell lineage genes that are absent or expressed at low levels in HRS cells (eg early B cell factor, PU.1, CD19, CD20).113
In addition, LMP2A expression induces the up-regulation of genes involved in proliferation (eg MKI67, PCNA), protection from apoptosis (BCLXL, BIRC5 (survivin)) and suppression of cell-mediated immunity (eg IL13R, EBI3).113
We recently showed that EBV infection of HL cells up-regulates autotaxin, a secreted tumour-associated factor with lysophospholipase-D activity. Up-regulation of autotaxin increased the generation of lysophosphatidic acid (LPA) and led to the enhanced growth and survival of Hodgkin lymphoma cells.114This is the first demonstration that virus infection leads
directly to the synthesis of the growth-promoting lipid LPA and could represent a more general pathway utilised by herpes-viruses during their normal life cycle or during the initiation and maintenance of virus-associated tumours. At this time it is unknown which EBV gene is responsible for this effect.
Studies of B cell subsets from healthy carriers have revealed that EBV persists in the peripheral blood in IgD-negative memory B cells (CD19+, CD232, CD80/B72) where viral Figure 2 Gene expression in Epstein–Barr virus (EBV) associated Hodgkin
lymphoma. (A) EBER expression (brown staining) in the nuclei of Hodgkin/ Reed–Sternberg (HRS) cells. In situ hybridisation for EBER expression is the most reliable and sensitive method to detect the presence of latent EBV infection in clinical samples. (B) The latent membrane protein-1 (LMP1) and (C) LMP2 are both highly expressed in EBV-positive HRS cells. Not shown is the consistent expression of the EBV maintenance protein, EBNA1.
VIRUS EPSTEINBARR Y LINFOMAS PEDIÁTRICOS
1. Virus EpsteinBarr
Introducción
El virus de Epstein‐Barr (VEB) es un herpes virus ubicuo. La infección por VEB es común y de distribución mundial. Suele tener lugar de forma subclínica en la infancia temprana. La primoinfección clínicamente aparente es la mononucleosis infecciosa, afectando a individuos cuyo primer contacto es en la adolescencia y siendo autolimitada la mayor parte de las veces. La puerta de entrada del virus es la orofaringe.
Además, el VEB se asocia con el desarrollo de otras enfermedades como el linfoma de Burkitt, el linfoma de Hodgkin, carcinoma nasofaríngeo, linfoma cerebral primario (generalmente en síndromes de inmunodeficiencia adquirida), trastornos linfoproliferativos y se ha encontrado en algunos casos de linfoma de células T y carcinomas gástricos.
Estructura
El VEB (o virus herpes humano tipo 4), pertenece a la familia Herpesviridae. Es un virus con una doble cadena de ADN de aproximadamente 184kb que codifican casi 100 proteínas. El ADN está contenido en una cápside icosaédrica a su vez rodeada por una cubierta lipídica donde se alojan las glicoproteínas del virus. Además, los virus herpes poseen una capa amorfa de proteínas entre la cápside y la cubierta.Ciclo vital de VEB
La primoinfección es consecuencia del contacto con las secreciones orales de pacientes seropositivos. In vitro, el VEB ha demostrado no sólo infectar los linfocitos B sino además transformarlos en blastos proliferativos; este mecanismo depende de la expresión de proteínas virales bajo el control del EBNA‐2. In vivo, el modelo actualmente aceptado, defiende que el programa de crecimiento del VEB activa linfocitos B que se convierten en blastos proliferativos y éstos se diferencian en células B de memoria en reposo. En las células B de memoria en reposo el virus encuentra un lugar idóneo para permanecer sin ser detectado por el sistema inmune. Este proceso tiene lugar en el centro germinal de los ganglios linfáticos.
Infección y respuesta inmune frente al VEB
Para comprender el papel patogénico que puede tener el VEB en diferentes neoplasias hay que saber que después de la infección primaria el VEB nunca es eliminado completamente del organismo, permaneciendo en los linfocitos B en un estado conocido como infección latente. Una de las características del VEB es su capacidad de transformar in vitro los linfocitos B estableciendo las llamadas líneas celulares linfoblastoides. De los muchos genes codificados por el virus sólo 11 se expresan en estas líneas celulares infectadas de forma latente. Se trata de seis antígenos nucleares denominados EBNA‐1, ‐2, ‐3A, ‐3B. ‐3C, ‐LP, tres antígenos de membrana llamados LMP‐1, ‐2A y ‐2B y dos ARNs de pequeño tamaño que se localizan en el núcleo en un
Existen tres estados de latencia diferentes:
La forma de latencia I se observa en el linfoma Burkitt (LB) y en los linfocitos B infectados que circulan en la sangre periférica. En esta forma de infección la expresión del genoma viral queda limitada a los EBERs y a la proteína EBNA‐1 cuya función es indispensable para mantener el episoma, pero que carece de capacidad inmunógena. Este patrón tan restringido de expresión génica permitiría a las células infectadas escapar a la vigilancia inmune por linfocitos T citotóxicos (CTL), favoreciendo así la persistencia de la infección latente. La forma de latencia tipo II se asocia fundamentalmente a neoplasias (carcinoma nasofaríngeo, carcinoma gástrico asociado a VEB y linfoma de Hodgkin VEB positivo). En esta forma se expresan la proteínas EBNA‐1 y LMP‐1, LMP‐2A y 2B y los EBERs. Es la que caracteriza a la enfermedad de Hodgkin (EH) y al carcinoma nasofaríngeo (CNF). La forma de latencia tipo III es la que caracteriza a las líneas linfoblastoides y se observa también en la mononucleosis infecciosa y en la gran mayoría de los trastornos linfoproliferativos B asociados a inmunodeficiencia. La inmunosupresión actuaría permitiendo que los linfocitos B infectados expresen todas las proteínas asociadas a la infección latente sin que sean reconocidos y eliminados por los CTL.
2. Enfermedades en las que el VEB podría tener un papel causal:
3. VEB y Linfomas.
i. Linfoma de Burkitt
El linfoma de Burkitt (LB) es una neoplasia de linfocitos B que afecta sobre todo niños de África central y Nueva Guinea. En el resto del mundo se encuentra de forma esporádica un linfoma morfológicamente idéntico. La asociación entre el LB africano y VEB es muy fuerte: ‐ Más del 90% de los tumores africanos son portadores del genoma del VEB ‐ El 100% de los pacientes tienen títulos elevados de anticuerpos frente a los antígenos de la cápside viral ‐ Los títulos séricos de anticuerpos frente a la cápside viral son proporcionales al riesgo de desarrollar el tumor. Aunque estos datos apoyan fuertemente la idea de que existe una íntima relación causal entre el VEB y LB, existen otras observaciones según las cuales podrían existir otros factores implicados: 1. La infección por VEB no se limita a las regiones geográficas en las que ocurre el LB; el VEB es ubicuo e infecta de manera asintomática a casi todos los adultos de la población mundial. 2. El genoma del VEB sólo se encuentra en el 15‐20% de los casos de LB extraafricano, pero tanto la forma endémica (africana) como los casos esporádicos de esta enfermedad tienen una translocación t(8;14) o, con menos frecuencia, varias translocaciones que provocan la expresión no regulada del oncogén c‐myc.
Parece, por tanto, que el VEB es sólo un factor en el desarrollo escalonado del LB; las personas normales controlan fácilmente la infección por el VEB gracias a sus respuestas inmunitarias eficaces dirigidas contra los AG’s virales expresados sobre las membranas celulares; por lo que la mayoría de los pacientes infectados permanecen asintomáticos. En las regiones de África donde el LB es endémico, existirían otros cofactores mal conocidos (paludismo crónico) que favorecerían la proliferación mantenida de las células B inmortalizadas por el VEB. La población de células B en división activa corre un riesgo mayor de sufrir mutaciones, como la t(8;14), que yuxtapone a c‐ myc con uno de los locus de los genes de las inmunoglobulinas. La consiguiente activación de c‐ myc confiere a la célula afectada una ventaja para el crecimiento. Una de las proteínas codificada
probabilidad, es uno de los múltiples pasos del proceso de la génesis del linfoma. En las células inmortalizadas por el VEB se producen otras mutaciones adicionales que posiblemente afectan al encogen N‐ras. El conjunto de estos cambios determina la aparición de una neoplasia monoclonal de células B.
Según esta hipótesis el VEB no tiene una capacidad oncogénica directa pero, al actuar como un mitógeno policlonal para las células B, establece el escenario que facilita la adquisición de la translocación t(8;14) y de otras mutaciones, que en conjunto liberan a las células del control del crecimiento normal. Junto a estos cambios también se produce una alteración de la expresión del gen viral, como una reducción en la exposición de antígenos que pueden ser reconocidos por las células T citotóxicas.
ii. Linfoma de Hodgkin
EL LH, tiene una incidencia de 1‐10/100.000 y una curva bimodal en cuanto a la incidencia, con un primer pico entre los 15‐35 años y otro en mayores de 50 años. La relación varón:mujer es de 3:1. Se observa un mayor número de casos entre hermanos y familiares consanguíneos. Además se observa una asociación con alteraciones inmunológicas: lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, ataxia‐teleangiectasia y agammaglobulinemia.
Durante años se ha sospechado que el VEB era el agente etiológico del LH. Los pacientes con antecedentes de Mononucleosis infecciosa o con títulos de anticuerpos elevados contra los antígenos del VEB tienen un riesgo algo mayor de EH. Las pruebas seroepidémicas han sido reforzadas por los estudios moleculares.
En las células RS se pueden reconocer los genomas del VEB y las transcripciones del RNA específicas del VEB, en un 40% de los casos de esclerosis nodular y en un 60‐70% de las formas de celularidad mixta.
La configuración del ADN es la misma en todas las células tumorales de un determinado caso, indicando que la infección se produjo antes de la transformación maligna de las células. Además, las células tumorales VEB‐positivas expresan la proteína‐1 latente de la membrana, que es codificada por el genoma del VEB, y se ha comprobado que posee capacidad de transformación neoplásica. Por eso, la infección por el VEB quizá sea uno de los diversos pasos que intervienen en la patogenia del LH.
Sigue existiendo la posibilidad de que otros agentes infecciosos todavía desconocidos estén involucrados en esta enfermedad, especialmente en los casos que son VEB negativos.
iii. Linfoma en pacientes inmunodeprimidos
El desarrollo de linfomas de células B en pacientes inmunodeprimidos ilustra de manera espectacular el papel que desempeña la repuesta inmunitaria del huésped en el control de las células B transformadas por el VEB.
Algunos pacientes con SIDA y los que reciben un tratamiento inmunosupresor a largo plazo pueden presentar tumores multifocales de células B en los tejidos linfoides o en el SNC. Estos tumores comienzan por ser policlonales, aunque pueden acabar siendo monoclonales. La expresión de antígenos virales como LMP‐1 permanece elevada en estas células por lo que parece que los tumores representan contrapartidas in vivo de las líneas de células B inmortalizadas in
vitro por la infección por el VEB. La observación de que, en algunos casos, los tumores regresan
cuando se reduce el tratamiento inmunosupresor demuestra que el crecimiento de las células, dirigido por el VEB, es sensible a la regulación inmunitaria.
4. VEB y carcinomas epiteliales:
i. Carcinoma Nasofaríngeo
La Organización Mundial de la Salud (OMS) ha clasificado el carcinoma nasofaríngeo (CNF) en tres tipos diferentes: queratinizante (tipo 1), no queratinizante diferenciado (tipo 2) y no queratinizante no diferenciado (tipo 3). Estos dos últimos están fuertemente relacionados con la infección por VEB y son mucho más frecuentes que el queratinizante (80% frente al 20%).
El CNF es un tumor de la superficie del epitelio, que normalmente se presenta como una masa a nivel cervical, síntomas de obstrucción nasal y pérdida de audición. Así como el linfoma de Burkitt (LB), el CNF presenta una distribución geográfica característica. Es muy frecuente en el sur de China (representa el 20% de los cánceres en adultos) y muy poco frecuente en Europa y América del Norte (< de 1 por cada 100.000 habitantes).
La asociación entre VEB y CNF fue sugerida ante el hallazgo, mediante estudios serológicos del VEB en el tejido del CNF. Más tarde fue confirmado con técnicas de hibridación in situ, en las que se vio el ADN del VEB en tumores indiferenciados o poco diferenciados. Muchos estudios epidemiológicos advierten que hay tres factores etiológicos ligados al desarrollo del CNF: susceptibilidad genética (sobre todo HLA), exposición temprana a agentes carcinógenos (pescado salado Cantonés) y la infección latente por VEB. El análisis del DNA de las células tumorales ha revelado ADN clonal de VEB, lo cual sugiere que los carcinomas derivan de la expansión clonal de una única célula progenitora infectada con VEB. Como señalamos anteriormente, el CNF obedece a un programa de latencia tipo II, parecido al que se observa al Linfoma Hodgkin asociado a VEB. Estudios han confirmado la presencia de ARNm que transcribe para LMP2 en muchos casos, lo cual ha sido corroborado mediante la observación de la expresión de proteína LMP2 por inmunohistoquímica en el 50% de los casos de CNF. La presencia de LMP1, sin embargo, es variable, asociándose a un mejor pronóstico, fruto de la habilidad del LMP1 para inducir una respuesta inmune. Aunque los tumores adopten una forma latente de infección, se ha detectado la expresión de proteínas tempranas, indicadoras de replicación lítica, lo que sugiere que un pequeño nivel de replicación lítica puede tener lugar en el CNF. Estudios que han medido la PCR a tiempo real para medir los niveles de ADN de VEB en la sangre de los pacientes co CNF revelando que tanto el nivel pre‐tratamiento como el nivel post‐ tratamiento de DNA de VEB están asociados a una mayor supervivencia global. Por otro lado, amplios análisis del genoma de los individuos con CNF han revelado alteraciones genéticas de forma frecuente en brazos cromosómicos, incluyendo pérdidas de material en 3p, 9p, 9q, 11q, 14q y 16q y adición de material genético en 1q, 2q, 8q, 12p y 12q. El cambio genético más frecuente es la pérdida de regiones cromosómicas en 9p21 y 3p, lo cual se piensa que ocurre de forma temprana en la patogénesis del CNF. Estudios han demostrado que en las poblaciones de China con más riesgo de desarrollar el CNF hay mayor frecuencia de pérdida de 3p y 9p en el epitelio nasofaríngeo normal que en aquéllas con un riesgo más bajo. Por todo ello, se cree que la pérdida de material genético en las regiones 3p y 9p pueda predisponer a las células del epitelio nasofaríngeo a padecer una infección latente por VEB, siendo éste un evento crucial hacia el desarrollo del CNF.
Aunque el papel que estas alteraciones juegan en la patogénesis del CNF todavía no está identificado, parece cierto que algunos genes han sido confirmados. La introducción tanto del p16 o RASSFIA (los cuales son importantes en la regulación del crecimiento celular y se encuentran las regiones 3p y 9p) en líneas celulares de CNF, indujeron la inhibición del crecimiento celular y una disminución del potencial tumoral de la línea.
ii.
Carcinoma gástrico
El carcinoma gástrico es el segundo tumor más frecuente a nivel mundial. Se divide en dos grandes grupos: aquéllos que afectan al cardias, y el carcinoma gástrico que no afecta al cardias en su origen. La incidencia de cáncer gástrico está disminuyendo. Esta disminución es a expensas de un descenso de la incidencia de los carcinomas que no afectan al cardias. Sin embargo, la incidencia de los carcinomas del cardias, está aumentando.
Igual que el CNF, el ADG obedece al tipo de latencia II y presenta variaciones geográficas, atribuibles a diferencias genéticas y étnicas. Estudios epidemiológicos han sugerido la asociación con la ingesta de sal, exposición a polvo metálico y el orden de nacimiento. El ADG es uno de los más frecuentes en Japón.
El VEB está asociado aproximadamente con un 10% de los adenocarcinomas gástricos (ACG). Existen alrededor de 90.000 nuevos casos/año. El ACG asociado a VEB se presenta con dos formas histológicas diferentes: ADG típico (glandular) y carcinoma linfoepitelial‐like (una variante rara, en la que se ha hallado hasta un 90% de presencia de VEB). El ratio entre ambos es 4:1. La infección por VEB en estómago generalmente tiene lugar en la mitad superior. Existen diferencias clínicas y fenotípicas entre los el ADG asociado a VEB y los no asociados a VEB. Estas diferencias incluyen la pérdida de expresión de p16, la metilación del promotor p73, tipo salvaje p53, un patrón diferente de pérdida alélicas y una mejor supervivencia de los pacientes. iii. Conclusión La asociación del VEB con carcinomas epiteliales es poco clara. Se cree que la relación VEB‐cáncer en las células epiteliales podría ser consecuencia del tipo de latencia que tiene el virus (tipo II) y de la existencia de cambios genéticos pre‐malignos previos.
