Haemophilus
influenzae B IgG
ELISA
Inmunoanálisis de enzima para la determinación de anticuerpos IgG
contra el poliribosil-ribitol-fosfato del Haemophilus influenzae tipo B
en suero humano y plasma humano.
RE56351
96
2-8°C
I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H
Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0)40-53 28 91-0 IBL@IBL-International.com D-22335 Hamburg, Germany Fax: +49 (0)40-53 28 91-11 www.IBL-International.com1. USO
PROPUESTO
Inmunoanálisis de enzima para la determinación de anticuerpos IgG contra el poliribosil-ribitol-fosfato (PRP) del Haemophilus influenzae tipo B en suero humano y plasma humano.
2. IMPLICACIONES
CLÍNICAS
La Haemophilus influenzae tipo B (HiB) es la causa más común de la enfermedad infecciosa invasiva grave
en niños de hasta seis años. Después de la infección, los síntomas de la enfermedad incluyen: Pericarditis, osteomielitis, meningitis, encefalitis, neumonía, sinusitis y otitis. En muchos casos, la enfermedad es mortal o produce daños neurológicos que no siempre pueden evitarse mediante un tratamiento rápido con antibióticos. La causa fundamental de la enfermedad suele ser una inmunodeficiencia latente con una respuesta inmunitaria humoral específicamente reducida al polirribosil-ribitol-fosfato (PRP) en la encapsulación del polisacárido bacteriano. En los niños, otra razón es la falta de madurez del sistema inmunitario. Actualmente, el término “pacientes inmunocomprometidos” se usa muchas veces para referirse a todas las inmunodeficiencias específicas y no específicas adquiridas e innatas.
Como resultado, en niños de 3 meses o más, se recomienda la aplicación de vacunas que contengan diferentes tipos de PRP. Esto puede producir una clara reducción de la cantidad de infecciones por
Haemophilus influenzae tipo B.
El valor cuantitativo de los anticuerpos producidos por la vacunación puede usarse para confirmar si ésta ha surtido efecto. El HiB IgG se usa para medir el nivel de anticuerpos IgG específicos de PRP luego de un período de entre 4 y 6 semanas, después de la inmunización completa, a fin de controlar el estado inmunitario humoral de los niños y de otras personas en riesgo.
Control del estado inmunitario humoral después de la vacunación. Verificación del diagnóstico de infección por Haemophilus influenzae tipo B mediante el control reiterado de las concentraciones de anticuerpos. Evaluación del riesgo en pacientes inmunocomprometidos que tenga como resultado la imposibilidad de aplicar una vacuna que contenga PRP.
Este grupo comprende:
Niños menores de 2 años que han tenido una infección por Haemophilus influenzae tipo B. Niños con infecciones bacterianas crónicas y recurrentes de las vías respiratorias.
Niños con otitis crónica.
Pacientes con inmunodeficiencias humorales confirmadas (deficiencia de IgG-2, deficiencia IgA). Pacientes con deficiencias de granulocitos confirmadas.
Pacientes que reciben tratamiento citostático o quimioterapia. Niños a los que se les realizó una esplenectomía.
Pacientes que padecen de anemia drepanocítica.
Pacientes con trisomía del par 21 (síndrome de Down) y ciertos grupos étnicos.
3.
PRINCIPIO DEL ENSAYO
El HiB-IgG es un análisis ELISA de dos pasos. Los pocillos de las tiras reactivas ELISA están recubiertos con PRP. Durante la incubación de muestras de suero diluido o plasma, los anticuerpos específicos se unen a la fase sólida (incubación de la muestra). Después del procedimiento de lavado, todos los componentes no específicos y no unidos se eliminan. Durante el segundo paso de incubación, la reacción
conjugada, un anticuerpo IgG antihumano conjugado con peroxidasa (IgG-HRP antihumano) marca con
especificidad el IgG unido previamente. En un segundo procedimiento de lavado, se elimina el conjugado no unido. En un tercer paso de incubación, se produce la reacción del sustrato. La parte de peroxidasa del conjugado unido oxida la tetrametilbenzidina (TMB) y la transforma en una sustancia azul. Esta reacción se detiene agregando ácido sulfúrico, y el color cambia a amarillo. La intensidad del color es directamente proporcional a la concentración de los anticuerpos específicos de PRP. La absorbencia se mide con un lector ELISA a 450 nm. La concentración de anticuerpos en la muestra puede determinarse mediante una curva de referencia.
4.
ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES
1. Sólo para uso en diagnóstico in-vitro. Sólo para uso profesional.
2. Antes de comenzar el ensayo lea las instrucciones completa y cuidadosamente. Use la versión válida del prospecto que se ofrece con el juego de reactivos. Asegúrese de entenderlo todo.
3. En caso de daño severo del estuche del juego de reactivos, contacte por favor a IBL o a su suministrador en forma escrita antes de transcurrida una semana de la recepción. No utilice los componentes dañados en los ensayos pero guárdelos en forma segura para la reclamación.
4. Tome en cuenta el número de lote y la fecha de caducidad. No mezcle reactivos de diferentes lotes. No use reactivos vencidos.
5. Cumpla con las buenas prácticas de laboratorio y las pautas de seguridad. Use bata de laboratorio, guantes de látex desechables y gafas de protección cuando sea necesario.
6. Los reactivos de este juego que contienen materiales peligrosos pueden causar irritación ocular y cutánea. Vea MATERIAL SUMINISTRADO y las etiquetas para los detalles. Las Hojas de Datos de Seguridad de los materiales para este producto están disponibles en la página de internet de IBL o mediante solicitud directa a IBL.
7. Los reactivos químicos y los reactivos preparados o usados deben ser tratados como desechos peligrosos de acuerdo con las regulaciones nacionales sobre bioseguridad y pautas de seguridad.
8. El personal de limpieza debe ser capacitado por profesionales para el manejo de residuos peligrosos. 9. Evite el contacto con la Solución de Parada. Puede causar irritaciones y quemaduras en la piel.
10. Todos los reactivos de este juego que contienen suero o plasma humano han sido ensayados y encontrados negativos para anti-HIV I/II, HBsAg and anti-HCV. Sin embargo, la presencia de estos u otros agentes infecciosos no puede ser excluída en forma absoluta, por lo que estos reactivos deben ser tratados como potencialmente biopeligrosos a los efectos de su manipulación y eliminación.
5.
ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD
El juego de reactivos es enviado a temperatura ambiente y debe ser almacenado a 2-8 °C. Manteniéndose alejado del calor o de la luz solar directa. El almacenamiento y estabilidad de muestras y reactivos preparados se detalla en los capítulos correspondientes.
Una vez abierto el estuche, la placa de microtitración es estable hasta 6 meses en su envase roto, pero herméticamente sellado, si se almacena a 2-8°C .
6.
TOMA Y ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS
Suero humano, Citrato-, EDTA- o Heparina-Plasma.
Se deben observar las precauciones usuales para la venipuntura. Es importante preservar la integridad química de la muestra de sangre desde el momento de su toma hasta el ensayo. No emplee muestras fuertemente hemolizadas, lipémicas o ictéricas. Las muestras que presenten turbidez deben centrifugarse antes de ensayar para eliminar cualquier material particulado.
Almacenamiento: 2-8°C -20°C (Alícuotas) Manténgase alejado del calor o de la luz solar directa. Evite congelar y descongelar repetidamente. Estabilidad: 6 semanas 6 meses
7. MATERIALES
SUMINISTRADOS
Cantidad Símbolo Componente
1 x 12 x 8 MTP Placa de Microtitulación Recubierto con PRP del virus de Haemophilus influenzae tipo B. Listo para usar.
1 x 0.3 mL ENZCONJ CONC Conjugado Enzimático, Concentrado Anti IgG humano conjugado con peroxidasa; coloreado en azul. Diluir antes de usar!
5 x 0.35 mL CAL 1-5 Calibradores 1-5, Concentrado Contenido: suero humano, estabilizador, conservante. Las concentraciones son (NISBC code 96/536)
específicas por lote, tal como se indica en los rótulos de los frascos. Diluir antes
de usar!
2 x 0.35 mL POS LL POS HL
Control LL+HL, Concentrado
Control positivo Suero, LL, “Low Level”, HL, “High Level”. Contenido: suero humano, estabilizador, conservante. Las concentraciones son específicas por lote, tal como
se indica en los rótulos de los frascos. Diluir antes de usar!
2 x 0.75 mL DILBUF Solución Buffer de Dilución 0.01 M Tris/HCl; pH 7.4; contiene: detergente, 0.01 % (w/v) thimerosal; coloreado en rojo. Listo para usar..
1 x 100 mL WASHBUF CONC Solución Buffer de Lavado, Concentrado (10x) Contenido: Solución buffer fosfatada 1 x 15 mL TMB SUBS Solución de Substrato TMB Contenido: TMB (tetramethylbenzidine). Listo para usar.
1 x 15 mL TMB STOP Solución de Paro TMB Contenido: 0.5 M H
2SO4. Listo para usar.
2 piezas FOIL Folio Adhesivo
Nota: Solución Buffer de Lavado, Solución de Sustrato, Solución de Paro pueden intercambiarse con los
siguientes productos: TBE / FSME IgG (RE57401), TBE / FSME IgM (RE57411), Ténanos (RE57441), Difteria (RE57431).
8. MATERIALES
REQUIRIDOS PERO NO SUMINISTRADOS
1. Micropipetas (Multipette Eppendorf o dispositivos similares, < 3 % CV). Volúmenes: 20; 100; 500; 1000 µL 2. Vortex
3. Tubos para la dilución de muestras
4. Micropipeta multicanal de 8 canales con reservorio de reactivo
5. Frasco lavador, sistema automatizado o semi-automatizado de lavado de placas de microtitración 6. Fotómetro para placas de microtitulación capaz de leer absorbancias a 450 nm
(longitud de onda de referencia 600-650 nm) 7. Agua bidestilada o desionizada
8. Toallas de papel, puntas para las micropipetas y cronómetro
9.
INDICACIONES PARA EL PROCEDIMIENTO
1. Cualquier manipulación inadecuada de las muestras o modificación del procedimiento de ensayo puede alterar los resultados. Los volúmenes a pipetear, los tiempos de incubación, las temperaturas y etapas de pretratamientos tienen que ser efectuados estrictamente siguiendo las instrucciones. Use sólo pipetas u otros dispositivos calibrados.
2. Una vez comenzado el ensayo, se deben completar todas las etapas sin interrupción. Asegúrese de que los reactivos, materiales y dispositivos necesarios estén listos en el momento adecuado. Permita que todos los reactivos y muestras alcancen la temperatura ambiente (18-25 °C) y agite suavemente por rotación cada vial de reactivo líquido o muestra antes del uso. Evite la formación de espuma.
3. Evite la contaminación de los reactivos, pipetas pocillos y/o tubos. Emplee una punta desechable nueva para cada reactivo, estándar o muestra. No intercambie las tapas. Tape siempre los viales que no estén en uso. No reutilice los pocillos, tubos o reactivos.
4. Se recomienda ensayar las muestras por duplicado para poder identificar errores potenciales de pipeteo.
6. El tiempo de incubación afecta los resultados. Todos los pocillos deben ser manipulados en el mismo orden y secuencia de tiempo. Para el pipeteo de soluciones en los pocillos se recomienda una pipeta de 8 canales.
7. El lavado de la placa de microtitulación es un paso importante. Los pocillos insuficientemente lavados conllevan a resultados erróneos. Se recomienda emplear una pipeta multicanal o un sistema automático de lavado. No deje secar los pocillos entre incubaciones. Cuide de no dañar el recubrimiento de las placas durante el enjuague y/o la aspiración. Enjuague y agregue los reactivos cuidadosamente. Al enjuagar cerciórese que todos los pocillos estén completamente llenos con la Solución Buffer de Lavado y que no haya residuos en ellos.
8. La humedad afecta los pocillos y tubos recubiertos. No abra la bolsa hasta que alcance la temperatura ambiente. Los pocillos o tubos que no se empleen deben guardarse inmediatamente en la bolsa resellada con desecante.
10.
INSTRUCCIONES PARA LA PREPARACIÓN DEL ENSAYO
10.1. Preparación de Componentes
El contenido del kit para 96 determinaciones puede ser dividido en 3 ensayos separados. Los volúmenes declarados más abajo son para un ensayo con 4 tiras (32 determinaciones).
Diluya /
disuelva Componente con Diluyente Relación Notas Almacenamiento Estabilidad
60 µL ENZCONJ CONC 6 mL DILBUF 1:101 Mezclar
cuidadosamente. 2-8°C 1 hora
30 mL WASHBUF CONC 270 mL Aqua
dest. 1:10
Mezclar
cuidadosamente. 2-8°C 8 semanas
10.2. Dilución de Estándares, Controles y Muestras
para ser diluído con Relación Notas
CAL 1-5 CONTROL LL CONTROL HL
generalmente DILBUF 1:26 p.e. 20 µL + 500 µL
Suero / Plasma generalmente DILBUF 1:26 p.e. 20 µL + 500 µL
Para la determinación mediante curva estándar, se necesitan los calibradores 1-5 y sueros de control.
11.
PROCEDIMIENTO DE ENSAYO
1. Pipetee 100 µL de Calibrador diluido, Control diluido y muestra diluída en cada pocillo
respectivo de la placa de microtitulación.
2. Cubra la placa con un folio adhesivo. Incube 1h a TA (18-25°C).
3. Remueva el folio adhesivo. Descargue la solución de incubación. Lave la placa 3 x con 300 µL de Buffer de Lavado diluido. Remueva el exceso de solución golpeando cuidadosamente la placa
invertida sobre una toalla de papel.
4. Pipetee 100 µL de Conjugado Enzimático diluido en cada pocillo. 5. Cubra la placa con un folio adhesivo. Incube 1h a TA (18-25°C).
6. Remueva el folio adhesivo. Descargue la solución de incubación. Lave la placa 3 x con 250 µL de Buffer de Lavado diluido. Remueva el exceso de solución golpeando cuidadosamente la placa
invertida sobre una toalla de papel.
7. Para la adición de la Solución de Substrato y de Paro utilice, de ser posible, una pipeta de 8 canales.
La adición de sustrato y solución de paro debe llevarse a cabo en intervalos de tiempo iguales. Evite la formación de burbujas pipeteando con sobrevolumen.
8. Pipetee 100 µL de Solución de Substrato TMB en cada pocillo. 9. Incube 30 min a TA (18-25°C).
10. Detenga la reacción del substrato añadiendo 100 µL de Solución de Paro en cada pocillo. Mezcle el
12.
CONTROL DE CALIDAD
Los resultados son válidos solamente si el ensayo ha sido realizado de acuerdo a las intrucciones. Además el usuario debe atenerse a las Prácticas de Buen Laboratorio (GLP) u otras normas o leyes comparables. Para la determinación del diagnóstico, el usuario y/o el laboratorio deben de tener un sistema validado de acuerdo con las Buenas Prácticas de Laboratorio (GLP). Los valores de los controles del ensayo deben encontrarse dentro de los rangos de aceptación indicados en las etiquetas y el Certificado QC. Si este criterio no se cumple, el ensayo no es válido y debe repetirse. Cada laboratorio debe emplear muestras conocidas como controles adicionales. Se recomienda participar en los programas de aseguramiento de la calidad adecuados.
En caso de detectarse alguna desviación, se debe verificar lo siguiente: Fecha de vencimiento de los reactivos, condiciones de almacenamiento, pipetas, dispositivos, condiciones de incubación y método de lavado.
13.
CÁLCULO DE RESULTADOS
El DO de los estándares (eje-y, lineal) se plotean contra su concentración (eje-x, logarítmico) ya sea en papel semi-logarítmico o empleando un método automático. Se logra un buen ajuste con cubic spline, 4 Parameter Logistics or Logit-Log.
eje-x (log): Concentración [µg/mL]
eje-y (lin): Absorbancia (densidad óptica)
Se logra un buen ajuste con cubic spline, 4 Parameter Logistics or Logit-Log. (por ejemplo. 4-Parameter ecuación 1)
Ecuación 1: Y = d+(a-d)/(1+(x/c)b)
Para el cálculo de la curva estándar, use las mediciones obtenidas de los estándares (es aconsejable no emplear valores duplicados).
La concentración de las muestras se puede leer directamente de la curva estándar.
Las muestras que se sospecha que contienen concentraciones más altas que el estándar más alto deben diluirse previamente con amortiguador de dilución. Los resultados medidos deben multiplicarse por el factor de dilución para obtener resultados correctos. Los valores de concentración obtenidos del plasma citratado deben multiplicarse por 1.1.
Criterios de validación
Vea certificado de Control de Calidad.
14.
INTERPRETACION DE RESULTADOS
La determinación de los anticuerpos específicos de PRP muestra el nivel de reacción inmunitaria humoral después de una inmunización con una vacuna que contiene PRP o una infección clínica aparente o no aparente por Haemophilus influenzae tipo B. Cuando este análisis es negativo y el paciente pertenece a un grupo de riesgo (ver “Indicaciones”), puede suponerse que existe un riesgo de infección por Haemophilus
influenzae tipo B. Las reacciones inmunitarias humorales después de una infección por Haemophilus influenzae no tipificable no se detectan mediante HiB IgG. La no seroconversión después de una
vacunación indica la capacidad de reaccionar a los antígenos de carbohidratos bacterianos. Puede observarse una inmunodeficiencia específica a polisacáridos en pacientes que padecen bronquitis crónica, neumonía recurrente, asma bronquial intrínseca o bronquiectasias de origen incierto.
Se ha demostrado en las publicaciones [2, 8, 9, 10, 11] que una concentración de anticuerpos por
debajo de 0.15 µg/mL brinda una protección insuficiente contra Haemophilus influenzae tipo B.
Las concentraciones de anticuerpos de entre 0.15 y 1.0 µg/mL indican que el paciente ha sido
inmunizado con PRP o tuvo una infección por HiB.
Pero sólo las concentraciones de anticuerpos de más de 1.0 µg/mL representan una inmunidad natural
15. PRUEBAS
FUNCIONALES
Variabilidad intraanalítica:
Dos muestras en el rango de concentración de los calibradores medidas 20 veces cada una con un lote en determinación doble. La variabilidad interanalítica fue de 10%.
Variabilidad interanalítica:
Controles POS HL y POS LL medidos en 20 pasadas en diferentes días con un lote en determinación doble. La precisión interanalítica fue de entre 9% y 12% respectivamente.
Límite inferior de detección: 0.1 µg/mL (específicas por lote).
16.
REFERENCIAS SOBRE EL PRODUCTO
1. Barra, A. et al.: Measurement of Anti-Haemophilus influenzae type B capsular polysaccharide antibodies by ELISA. J. Immunol. Meth. 115, 111 (1988)
2. Claesson, BA. et al.: Development of serum antibodies of the immuno-globulin G class and subclasses against the capsular polysaccharide of Haemophilus influenzae type B in children and adults with invasive infections. J. Clin. Microbiol. 26, 2549 (1988)
3. Dolan, K.T. et al.: An enzyme-linked immunosorbent assay for quantitation of Haemophilus influenzae type B polysaccharide-specific IgG1 and IgG2 in human and infant rhesus monkey sera. J. Immunoassay 12, 543 (1991)
4. Hetherington, S.V. et al.: Correlation between antibody affinity and serum bactericidal activity in infants. J. Infect. Dis. 165, 753 (1992)
5. Isaacs, D.: Infectious diseases. Editorial overview. Curr. Opin. Pediat. 4, 45 (1992)
6. Kristensen, K., Weis Bentzon, M.: Relation between enzyme-linked immunosorbent assay and radioimmunoassay for the detection of antibodies to the capsular polysaccharide of Haemophilus
influenzae type B. Acta. path. microbiol. immunol. scand. Sect. C 100, 142 (1992)
7. Lagergard, T. et al.: Comparison between radioimmunoassay and direct and indirect enzymelinked immunosorbent assay for determination of antibodies against Haemophilus influenzae type B capsular polysaccharide. J. Clin. Microbiol. 26, 2554 (1988)
8. Käyhty, H. et al.: Antibodies response to capsular polysaccharides of groups A and C Neisseria
meningitis and Haemophilus influenzae type b during bacteremic disease. Infect. Dis. 143, 32 (1981)
9. Anderson, P.: The protective level of serum antibodies to the capsular polysaccharide of Haemophilus
influenzae type B. J. Infect. Dis. 149, 1034 (1984)
10. Zielen, S. et al.: Untersuchung zur Effektivität der Haemophilus-influenzae-B-Diphtherie-Konjugatimpfung bei deutschen Kindern. Monatsschr. Kinderheilkunde 140, 852 (1992)
11. Zielen, S., Ahrens, P.: Haemophilus influenzae Typ B-Impfserologie. Ellipse 11, 15 (1994) 12. Togni, G. u. a.: Präanalytik. Schweiz. Med. Forum. 6, 113-120 (2002)
IBL AFFILIATES WORLDWIDE
IBL International GmbH
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and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer’s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer
Symbols Version 3.5 / 2012-01-20
REF Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N.–Cat.: / Αριθµός-Κατ.:
LOT Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από:
No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων:
CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο
IVD
In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ∆ιάγνωση.
Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης.
Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell’uso. / ∆ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση.
Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l’abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου.
Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους:
Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / ¡Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή!
Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED.
Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit.
Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS.
Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT.
