CONJUGACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE NANOPARTICULAS DE ORO UNIDAS A SU SUPERFICIE CON PROTEINA A.

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Clave: CIA73ANT20120110

CONJUGACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE

NANOPARTICULAS DE ORO UNIDAS A SU SUPERFICIE

CON PROTEINA A.

AUTORES: María Antonieta, Ríos Corripio; Marlon, Rojas López.

DIRECCIÓN DE LOS AUTORES

Centro de Investigación en Biotecnología Aplicada CIBA-IPN Tlaxcala Dirección. Exhacienda San Juan Molino Carretera Estatal Tecuexcomac-Tepetitla Km. 1.5 Lardizabal, Tlaxcala C.P. 90700.

CORREO ELECTRÓNICO anto200784@yahoo.com.mx

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INTRODUCCIÓN

Las nanopartículas de oro han mostrado tener un número importante de aplicaciones biológicas, pues sirven como marcadores de afinidad en diagnostico de campo y para la elaboración de biosensores. La proteína A es una proteína de superficie que se encuentra en la pared celular de Staphylococcus aureus.Es ampliamente usada en bioquímica por su capacidad de reconocimiento de anticuerpos, especialmente IgGs de un largo número de especies. Interacciona con la cadena pesada y se une a la región Fc. Por lo que la inmovilización de esta proteína fundamental sobre la superficie de nanopartículas ha aumentado su importancia para el desarrollo de bioaplicaciones (Hainfield J. y Powell R, 2002). En este trabajo se ha utilizado la proteína A como agente estabilizador y como capa biofuncionalizada sobre nanopartículas de oro.

OBJETIVOS

-Elaborar nanopartículas de oro mediante el método de reducción química.

-Obtener la mínima cantidad de proteína necesaria para garantizar la estabilidad de las nanoparticulas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Las nanopartículas de oro fueron sintetizadas utilizando acido cloruro aúrico HAuCl4, como agente reductor se utilizo citrato de sodio, proteína A como agente estabilizador, para la obtención de las nanoparticulas de oro de tamaños cercanos a 30 nm, se siguió el protocolo desarrollado por Hermanson. La conjugación de las nanoparticulas de oro con proteína A se llevo a cabo siguiendo el protocolo de Slot and Geuze. La caracterización de las nanoparticulas de oro conjugadas con la proteína A y sin conjugar se realizo mediante técnicas de espectroscopia UV-Visible y Microscopia Electrónica de Transmisión.

DESARROLLO

Se busca desarrollar una metodología alternativa a las existentes para la detección de microorganismos patógenos en alimentos mediante la utilización de biosensores basados en nanoparticulas de oro.

Un método práctico, para sintetizar nanopartículas metálicas en líquidos, es la reducción de iones de las correspondientes sales metálicas.

El método de Turkevich ha sido ya un procedimiento estándar para preparar nanopartículas de oro en agua. Involucra la reducción de los iones metálicos con citrato de sodio a átomos con valencia cero (Thobhani et al., 2010), como se muestra en la figura 1.

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Figura 1: Diagrama esquemático del proceso de síntesis de nanopartículas metálicas. En esta figura se muestra de manera detallada el proceso de síntesis de nanoparticulas de oro mediante el método de reducción química.

Para la caracterización de las nanoparticulas de oro se utilizaron técnicas como espectroscopia UV-Visible y Microscopia Electrónica de Transmisión.

Las partículas de tamaño nanométrico tienen una fuerte tendencia a la aglomeración, debido a las interacciones de Van der Waals y a la ausencia de fuerzas electrostáticas repulsivas entre partículas. Es por lo tanto importante desarrollar modos sintéticos por los cuales las partículas puedan ser estabilizadas, esto es, donde las fuerzas repulsivas puedan proporcionar un equilibrio de atracción entre las partículas. Para la estabilidad de la nanopartículas diferentes agentes protectores son utilizados en este trabajo se utilizo la proteína A, la cual presenta características importantes para llevar a cabo la funcionalización de la superficie de la nanopartícula de oro, todo esto con el objetivo de obtener una superficie

compatible al elemento de reconocimiento (anticuerpo) que se utilizara para la bioconjugacion.

RESULTADOS

Síntesis de nanoparticulas de oro. Para la preparación de las nanoparticulas de oro se utilizo el método de reducción química usando al citrato de sodio como agente reductor, este método de síntesis nos permitió obtener nanoparticulas de oro monodispersas de un tamaño promedio aproximado de 30 nm.

Caracterización de nanoparticulas de oro (UV-Visible)

Cuando una molécula determinada absorbe radiación UV-visible, la energía absorbida excita electrones de orbitales de más baja energía a orbitales de más alta energía en la molécula. La máxima absorción UV-visible ocurre en una longitud de onda característica de la estructura molecular y se puede determinar a partir de una gráfica de intensidad de absorción (absorbancia) contra longitud de onda de la radiación absorbida Las nanoparticulas de oro presentan una banda de absorción del plasmon superficial en el espectro UV-Visible y en el rango de longitud de onda de 510-550 nm (Qin Dilan et al., 2007). La figura 2 muestra un espectro típico de absorción UV-Vis obtenido para un sistema coloidal de nanopartícula de oro. Los espectros UV-Vis analizados presentaron una sola banda simétrica de resonancia de plasmón superficial a 517 nm atribuido a la oscilación colectiva de los electrones de conducción del oro en las nanoparticulas de oro y esta absorción es característica para nanoparticulas de HAuCl4 Citrato de Sodio “N u c le a c n Átomos con valencia cero Núcleo “Crecimiento” Nanopartìcula Metàlica

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tamaño entre 20 y 30 nm. Cuanto mayor es el tamaño de la misma, el pico del plasmón se desplaza a longitudes de onda mayores y además se ensancha.

Figura 2: Espectro típico de absorción UV-Vis de un sistema coloidal de nanopartículas de oro. En esta figura se muestra de manera detallada un espectro UV-Vis de nanoparticulas de oro presentando una única banda de absorción centrada en 517 nm característica de un tamaño de nanoparticula aproximado a 30 nm.

Para determinar el tamaño y forma de las partículas de oro, se realizaron medidas de TEM. Una imagen típica de estas partículas se muestra en la figura 3 presentando formas en su mayoría quasi-esféricas modispersas con tamaño aproximado de 30 nm. En microscopia electrónica las nanoparticulas aparecen como entidades solidas, oscuras de material denso.

Figura 3: Micrografía de TEM de nanoparticulas de oro sintetizadas por el método de reducción química. En esta figura se muestra una micrografía de TEM para un sistema coloidal de nanoparticulas de oro de tamaño aproximado a 30 nm.

Funcionalización de las nanoparticulas de oro con proteína A

La prevención de la agregación durante la bioconjugación y almacenamiento de los coloides es muy conveniente, ya que la presencia de agregados y/o conjugados pobres se traducirá en una reducción de inmunoactividad y los malos resultados de las pruebas en que las nanoparticulas de oro se van a utilizar.

Sin un proceso de funcionalización las nanoparticulas de oro no son estables en comparación cuando se lleva a cabo su funcionalización. La funcionalización de proteínas con nanoparticulas de oro no sólo permite la estabilización del sistema, algo más importante es que también introduce funcionalidades biocompatibles en estas nanoparticulas para más interacciones biológicas.

La agregación puede ser inducida por la adición de electrolitos, por ejemplo NaCl. Las nanoparticulas son mantenidas en suspensión por fuerzas electrostáticas repulsivas entre las partículas con carga negativa debido al citrato reductor

200 300 400 500 600 700 800 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 517 nm A b s o rc ió n ( u .a .) Longitud de onda (nm)

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adsorbido. NaCl apantalla las cargas negativas de las nanoparticulas causando un desequilibrio entre las fuerzas repulsivas y atractivas permitiendo que las nanopartículas formen agregados. Este fenómeno se puede visualizar a través del cambio de color de las nanopartículas de oro, pasando de rojo a azul. En caso de agregación, el espectro visible presenta un nuevo pico a longitudes de onda mayores (~525 nm) con una disminución en la intensidad de la absorbancia del plasmón (figura 4). Las nanopartículas de oro se pueden estabilizar empleando un modificador superficial, la presencia de proteínas ayuda a prevenir este evento.

Figura 4: Espectro UV-Vis de un sistema coloidal de nanopartículas de oro (rojo), sistema coloidal de nanopartículas de oro precipitadas con NaCl (azul). En esta figura se muestran los espectros UV-Vis de un sistema de nanoparticulas de oro estabilizadas y de otro que ha sufrido precipitación.

Sobre las nanoparticulas de oro en forma de solución coloidal se agregaron diferentes concentraciones conocidas de proteína A en un rango de 10-300 µg/ml.

Espectrofotometría UV-visible, además de determinar la concentración y homogeneidad de tamaño, en el caso de los conjugados proteína-nanoparticulas de oro, permite observar un desplazamiento en la longitud de onda, el cual podría atribuirse a una modificación en el plasmón superficial de la partícula, indicando que la nanoparticulas se encuentra recubierta por la proteína en este caso para proteína A. En la Figura 5 se observa claramente este desplazamiento pasando de 517 nm que es la longitud de onda máxima de absorción de las nanoparticulas de oro pasando a 526 nm lo cual nos indica que la proteína A se ha adherido a la superficie de las nanoparticulas de oro.

Figura 5: Espectro UV-Visible de nanopartícula de oro (rojo) funcionalización de la superficie de la nanopartícula de oro con proteína A(azul). En esta figura se observa claramente la adherencia de la proteína A a la superficie de la nanoparticula de oro. El proceso de funcionalización de la proteína A sobre la superficie de las nanopartículas de oro para varias concentraciones se evaluó mediante espectroscopia UV-visible.La cantidad mínima de proteína necesaria para estabilizar las nanoparticulas de oro se determina de la fase estable de la curva de

300 400 500 600 700 800 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 526 nm 517 nm AuNp aprox 30 nm AuNP-PROTEINA A A b s o rc io n ( u .a .) Longitud de onda (nm) 300 450 600 750 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 560 nm 520 nm

Precipitación AuNP 30 nm con NaCl

AuNP 30nm Ab s o rc ió n ( u .a .) Longitud de onda (nm)

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absorbancia-concentración, (Figura 6 (b). En este caso, la cantidad mínima de proteína A necesaria para estabilizar las nanoparticulas de oro fue de 50 µg/ml. Como se puede observar en la figura 6 inciso (a) se muestras las diferentes concentraciones de proteína A agregada a las nanoparticulas de oro, la concentración de 10 µg/ml causo la precipitación de las nanoparticulas y esto vino acompañado por un cambio de color de rojo a azul, además que su plasmon disminuyo de intensidad drásticamente y se corrió hacia longitudes de onda mayores a los 550 nm, todo esto se produjo debido a que no se logro cubrir completamente a la superficie de las nanoparticulas lo que causo su precipitación. A partir de la concentración de 50 µg/ml las nanopartículas ya no presentaron un cambio de color y su plasmon aumento de intensidad así como se vio un ligero corrimiento en su longitud de onda a 530 nm y para las demás concentraciones la absorción se volvió constante, lo que nos indica que esta es la mínima cantidad para cubrir completamente la superficie de las nanoparticulas y de esta manera evitar la su precipitación. 300 400 500 600 700 800 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 530 nm 520 nm AuNP 30 nm AuNP 30 nm prot. A 10 µg/ml AuNP 30 nm prot. A 30 µg/ml AuNP 30 nm prot. A 50 µg/ml AuNP 30 nm prot. A 100 µg/ml AuNP 30 nm prot. A 150 µg/ml AuNP 30 nm prot. A 200 µg/ml AuNP 30 nm prot. A 250 µg/ml AuNP 30 nm prot. A 300 µg/ml A b s o rc io n ( u .a .) Longitud de onda (nm) 0 50 100 150 200 250 300 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Buffer PBS pH=7.4 1X A bs orb a n cia Proteina A concentració n (mg /ml) (a) (b)

Figura 6: (a) Espectros de absorción UV-Visible a diferentes concentraciones de proteína A funcionalizadas a la superficie de nanoparticulas de oro (AuNP) y (b)

absorción de (AuNP) contra concentración de proteína A. En esta figura se observa claramente la mínima cantidad de proteína necesaria para estabilizar a las nanoparticulas de oro mediante la curva de absorción-concentración.

CONCLUSIONES

Se realizo la conjugación de la proteína A sobre la superficie de nanopartículas de oro de 30 nm. Dicho proceso fue evaluado mediante UV-visible, observándose corrimiento del pasmón asociado a la conjugación.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Hainfield J. and Powell R. (2002): New frontiers in gold labeling, Journal of Histochemistry and Cytochemistry,48, 471-479.

2. Thobhani Smita, Attree Simon, Boyd Robert, Kumarswami Neelam, Noble James, Szymanski Mateusz, Porter A. Robert (2010): Bioconjugation and characterisation of gold colloid-labelled proteins, Journal of immunological methods,356,60-69. 3. Qin Dilan, He Xiaoxiao,Wang

Kemin,Zhao Julia Xiaojun,Tan

Weihong and Chen

Jiyun.(2007):Fluorescent

Nanoparticle-Based Indirect Immunofluorescence Microscopy for Detection of Mycobacterium Tuberculosis, Journal of Biomedicine and Biotechnology,2007,1-9.

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