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CORRELACIÓN ENTRE EL TIPO DE FASES SECUNDARIAS Y

LA ESTRUCTURA DE LAS BIOPELÍCULAS DE LA BACTERIA

SULFUROOXIDANTE ACIDITHIOBACILLUS THIOOXIDANS

DURANTE LA BIOOXIDACIÓN DE PIRITA Y CALCOPIRITA

R.H. LARA1, J.V. GARCÍA-MEZA2, I. GONZÁLEZ3 1

Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Juárez del Estado de Durango, Av. Circuito Universitario S/N, Col. Valle del Sur, Durango, Dgo. 34120.

2

Instituto de Metalurgia, Universidad Autónoma de San Luis Potosí, Av. Sierra Leona no. 550, Lomas 2da Sección, San Luis Potosí, SLP. 78230. 3

Universidad Autónoma Metropolitana-Iztapalapa, Av. Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Iztapalapa, México DF. 09340. Correo electrónico:

lcrh75@ujed.mx.

RESUMEN

Tradicionalmente se han empleado consorcios de bacterias ferrooxidantes y sulfurooxidantes para biolixiviar de pirita (FeS2) y calcopirita (CuFeS2). Sin embargo, aún se desconocen los mecanismos específicos de biooxidación de estos sulfuros, especialmente para las bacterias sulfurooxidantes. Adicionalmente, poco se ha considerado el efecto que tienen las fases secundarias pasivas y activas de azufre (polisulfuros Sn2-, y azufre elemental

S0) durante la formación, organización y evolución de las biopelículas de bacterias sulfurooxidantes, generadas durante la oxidación de pirita y calcopirita. Considerando que la formación de fases secundarias de azufre, hierro y cobre es una función de la magnitud de la oxidación resultante durante la exposición de estos sulfuros a distintos medios; en este trabajo se ha controlado, mediante técnicas electroquímicas, el potencial de oxidación; de tal modo que se ha podido correlacionar la capacidad de oxidación resultante en las fases generadas sobre pirita y calcopirita, con el tipo de especies superficiales y la respuesta en la formación y organización de biopelículas de la bacteria sulfurooxidante A. thiooxidans. Con esta información, se están desarrollando estudios que permitan identificar los factores que influyen en la evolución de biopelículas (cantidad de microorganismos y exopolímeros).

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RELATIONSHIP BETWEEN SECONDARY PHASES AND

BIOFILM STRUCTURE DURING CHALCOPYRITE AND PYRITE

BIOOXIDATION BY THE SULFUROXIDIZER

ACIDITHIOBACILLUS THIOOXIDANS

ABSTRACT

Commonly, the usage of bacterial consortiums (iron- and sulfur-oxidizing microorganisms) for bioleaching of pyrite (FeS2) and chalcopyrite (CuFeS2) has been applied. However, specific mechanisms for bioleaching of these sulfides remain unclear, moreover for sulfur-oxidizing bacteria. Additionally, the effect of passive and active surface sulfur compounds (polysulfides Sn2-,

and sulfur S0) on the biofilm conformation and structure of sulfur-oxidizing bacteria has been unconsidered, during pyrite and chalcopyrite oxidation. Hence, and considering that surface sulfur compounds composition for these sulfides (including iron, sulfur and copper) is a function of oxidation intensity and medium composition; in the present work, the oxidation magnitude (potential) is controlled by means of variable potentiostatic anodic pulse. Consequently, the resultant oxidation capacity is associated with chemical species composition and biofilm conformation, for monospecific sulfur-oxidizing bacteria A. thiooxidans. Further studies for understanding of mineralogical or biological factors influencing biofilms evolution (cells and exopolisacharides) are in progress.

Keywords: Chalcopyrite, pyrite, biofilms, reduced sulfur phases. INTRODUCCIÓN

Los sulfuros minerales (SM) son la fuente principal de metales base en el mundo (p.e., Fe, Ni, Cu, Zn y Pb). La mayoría son semiconductores, por lo que en las estructuras cristalinas los orbitales de cada átomo (azufre y metal) forma bandas de electrones con diferentes niveles de energía; el nivel más alto de energía corresponde a la banda de valencia. Para SM como la pirita, la banda de valencia consiste en orbitales de átomos metálicos, mientras que para otros SM como la calcopirita, la banda de valencia se deriva de orbitales metálicos y azufre (Sand et al. 2001). En medio ácido y en presencia de Fe3+, los protones (H+) pueden remover electrones de la banda de valencia, por lo que SM como la calcopirita es soluble en ácido, mientras que pirita es insoluble, de acuerdo a Schippers y Sand (1999) y Sand et al. (2001). Los mecanismos químicos de oxidación de pirita y calcopirita están determinados principalmente por el tipo de estructura electrónica y capacidad de disolución en medio ácido, lo que puede generar una amplia gama de fases minerales secundarias; la disolución de calcopirita puede resultar hasta en un 90% de transformación de la estructura original a S0; mientras que la pirita hasta en un 10% con fases tipo Sn2- y S0 (Schippers and Sand, 1999; Rohwerder et al.

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2003). Lo anterior señala que dependiendo del tipo de solubilidad que presenten los SM, puede haber importantes diferencias en las fases Sn2- y S0

formadas, con propiedades estructurales y de oxidación diferentes, para su posterior interacción con microorganismos quimiolitótrofos oxidantes del S y Fe, tales como los sulfurooxidantes (SOMs, p.e., A. thiooxidans and A. caldus), los ferrooxidantes (IOMs, p.e., Leptospirillum ferrooxidans) o por Acidithiobacillus ferrooxidans, el cual posee ambas capacidades metabólicas (IOM/SOM) (Rohwerder et al. 2003). Un ejemplo de los mecanismos de oxidación biológica de SM puede ser como sigue:

FeS2 + 8H2O + 14Fe3+→ 15Fe2+ + 2SO42− + 16H+ [1] 14Fe2++ 3.5O2 + 14H+→ 14Fe3+ + 7H2O [2]

S0 + 2O2 → SO42− [3]

Los IOMs pueden entonces aprovechar el ciclo redox de la ec. (2); mientras que los SOMs atacan selectivamente las fases Sn2−/S0 para formar sulfatos,

de acuerdo a la ec. (3). Este proceso es importante, ya que demuestra la importancia de los SOMs en los proceso de biolixiviación de SM, ya que si no están presentes en el consorcio biolixiviador se pueden llegar a pasivar por acumulación de Sn2-/S0, CuS y jarositas sobre la superficie de SM (Sasaki et

al. 1998; Rohwerder y Sand, 2007; Liu et al. 2008). La formación de S0 se considera estable en medios ácidos, lo cual señala la poca efectividad del proceso químico de oxidación para continuar significativamente la lixiviación de SM en tanques de biolixiviación (Sand and Rohwerder, 2007).

Lo hasta aquí descrito es precisamente uno de los problemas actuales y más relevantes en los sistemas de biolixiviación de calcopirita y otros SM refractarios (CuS, Cu2S, etc.), ya que la formación de Sn2- y S0, entre otras

fases, limita la disolución del Cu2+ y otros metales con valor económico. Así mismo, no se conocen adecuadamente los mecanismos de cómo se forman y evolucionan las fases minerales secundarias de S sobre superficies de pirita y calcopirita, ni tampoco la influencia que diferentes mezclas de Sn2- y

S0 pueden tener sobre el proceso de biooxidación de SOMs, particularmente A. thiooxidans. En este trabajo se oxidaron superficies de pirita y calcopirita (sulfuros con diferente solubilidad en medio ácido), a potencial controlado (potenciostáticamente), utilizando electrodos masivos de estos SM con la finalidad de generar diferentes concentraciones y tipo de fases minerales secundarias. Una vez modificadas las superficies de pirita y calcopirita, fueron incubadas con células de A. thiooxidans para evaluar la influencia de las diferentes fases de Sn2-, S0 y covelita (CuS) sobre la estructura de la

biopelículas de A. thiooxidans, resultante del proceso de biooxidación de pirita y calcopirita. Los resultados obtenidos podrían permitir comprender el rol del tipo de fase de S generada sobre la evolución de biopelículas de los SOMs en sistemas con consorcios biolixiviadores.

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METODOLOGÍA EXPERIMENTAL

Las muestras de pirita y calcopirita fueron obtenidas respectivamente de Zacatecas, Zac; y Charcas, San Luis Potosí, México. De acuerdo a resultados combinados de Difracción de Rayos-X (DRX) y Análisis de Absorción Atómica previa digestión total ácida de muestras de SM, se determinó que la pirita tiene una pureza de ∼99.2 % p/p, con contenidos menores de calcopirita y esfalerita (ZnS) (∼0.8 % p/p); mientras que la pureza de calcopirita es del ∼99.5%, siendo el SiO2 la mayor impureza (∼0.5 % p/p). A partir de estos SM, se fabricaron electrodos masivos de pirita (EMP) y calcopirita (EMC) de ∼1.2–1.5 cm2. Las caras expuestas de EMP y EMC fueron pulidas hasta lograr una superficie tipo espejo. Estas superficies fueron oxidadas potenciostáticamente en medio de cultivo ATCC (American Type and Culture Collection)-125 a pH 2, específico para A. thiooxidans, para generar fases de Sn2- y S0 directamente de la superficie de SM. Los EMP y

EMC fueron electrooxidados usando un Autolab PGSTAT 30 acoplado a una celda de vidrio Pyrex (Figura 1), de acuerdo a Lara et al. (2010). Como electrodo de trabajo se usó el EMP y EMC, una barra de grafito de alta pureza como contraelectrodo y como referencia un electrodo de sulfatos saturado (SSE, 0.615 V vs. SHE). Los potenciales utilizados para la oxidación potenciostática variaron en el intervalo de 0.615 a 1.215 V, durante 3600 s. La formación de Sn2- y S0, además de CuS, fue confirmada mediante

espectroscopia Raman para cada superficie de EMP y EMC modificada.

Figura 1. Esquema experimental del equipo empleado para realizar la modificación potenciostática de EMP y EMC.

La cepa de Acidithiobacillus thiooxidans (ATCC-8085) utilizada fue cultivada aeróbicamente (28-30 °C) a 150 r.p.m. en matraces Erlenmeyer con 50 mL del medio ATCC-125 a pH 2, hasta alcanzar la fase exponencial de crecimiento (~108 células/mL). Se tomaron alícuotas de 5 mL para inocular superficies de EMP y EMC modificadas, donde la fuente de S es la superficie

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modificada y enriquecida con Sn2-/S0 (experimentos por triplicado). Además,

se corrieron ensayos control en ausencia de bacterias. Se utilizó un tiempo de incubación de 24 h. Las superficies recuperadas de ambos experimentos fueron secadas bajo corriente de N2 y resguardadas en atmósfera inerte. Las superficies biooxidadas fueron tratadas con gluteraldehido (2-4 % v/v) para conservar las propiedades de las biopelículas. El análisis de biopelículas se llevó a cabo mediante Microscopia de Fuerza Atómica (AFM) y Microscopia Electrónica de Barrido (SEM), según fue considerado necesario. Resultados adicionales se presentan en Lara et al. (2011, 2012).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Las Figuras 2 y 3 (a y a’) muestran los transitorios de corriente obtenida para cada potencial aplicado, Ean, en el rango de 0.615 a 1.215 V vs. SHE para pirita (Fig. 2, a y a’) y calcopirita (Fig. 3, a y a’). Se observaron diferentes velocidades de oxidación que implican la generación de diferentes fases minerales secundarias, principalmente de Sn2- y S0 (Lara et al. 2011). En el

caso de calcopirita, se tiene además un comportamiento cinético de la corriente, que indica la formación de fases secundarias que semipasivan la superficie mineral (Fig. 3, a y a’). Adicionalmente, se realizaron gráficas de Q vs. Ean para estimar la cantidad de superficie mineral transformada a fases secundarias, encontrándose para el caso de pirita 3 regiones de potencial principales (Fig. 2b); mientras que para calcopirita fueron 4 (Fig. 3b). Estas regiones señalan los intervalos de potencial donde se espera la generación de fases minerales secundarias similares y por lo tanto, se puede seleccionar determinados potenciales para realizar las modificaciones potenciostáticas de EMP y EMC. La formación de fases de Sn2- y S0 fue corroborada mediante

espectroscopia Raman (datos no mostrados), encontrándose para pirita la presencia de Sn2- en la zona I, de una mezcla de Sn2-/S0 en la zona II y

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Figura 2. (a y a’) son los transitorios de corriente obtenidos para EMP durante su oxidación potenciostática en ATCC-125 (pH 2). Los pulsos de potencial aplicado, asociados a las zonas I, II y III se describen a continuación: (a) 0.615 V, (b) 0.815 V, (c) 0.915 V, (d) 0.965 V, (e) 1.065 V y (f) 1.115 V vs. SHE.

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Figura 3. (a y a’) son los transitorios de corriente obtenidos para EMC durante su oxidación potenciostática en ATCC-125 (pH 2). Los pulsos de potencial aplicado, asociados a las zonas I, II, III y IV se indican en la figura. Potenciales referidos vs. SHE.

Para el caso de calcopirita, el análisis de espectroscopia Raman indicó la formación de Sn2- para EMC oxidados a potenciales comprendidos en la zona

I, CuS/S0 en la zona II, principalmente S0 en la zona III y S0 en la zona IV (Fig. 3b). Basados en resultados electroquímicos y de espectroscopia Raman, se puede considerar que para pirita se tienen fases pasivas de Sn

2-en zona I, fases semi-activas 2-en zona II (Sn2-/S0) y fases de azufre activas en

zona III (S0). Así mismo, para calcopirita se tienen Sn2- pasivos en zona I, de

actividad oxidativa incipiente en zona II (CuS/S0), y activas en zonas III y IV (principalmente S0).

Se modificaron selectivamente superficies de EMP y EMC abarcando cada una de las zonas descritas en las Figuras 3 y 4. Estas superficies fueron esterilizadas utilizando radiación UV durante 2 h, para posteriormente inocular en matraces Erlenmeyer con A. thiooxidans. Así mismo, se realizaron ensayos control en ausencia de A. thiooxidans. Lo anterior para comparar entre la oxidación química y biológica de las superficies EMP y EMC modificadas electroquímicamente (Figuras 4, 5 y 6).

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La Figura 4 mostró una escasa colonización cuando la superficie EMP contiene inicialmente Sn2- pasivos (Zona I, Fig. 1b). Así mismo, se observó

una moderada colonización cuando la superficie contenía relaciones mixtas de Sn2-/S0 (zona II, Fig. 1b) y una abundante colonización cuando las

superficies contenían fases de S0 (zona III, Fig. 1b). Estos resultados son importantes ya que sugieren que A. thiooxidans tiene preferencia por sustratos enriquecidos con fases activas de S, durante la colonización de pirita.

Figura 4. Imágenes de AFM para superficies de EMP modificadas electroquímicamente. Imágenes de las superficies control, inicialmente generadas mediante la aplicación de un pulso, Ean, en la zona I (0.585≤Ean≤0.915 V) (a), zona II (0.915≤Ean≤1.015 V) (b) y zona III (1.015≤Ean≤1.215 V) (c). Las correspondientes imágenes de las superficies biooxidadas son respectivamente mostradas en (a’, a’’), (b’, b’’) y (c’, c’’). Las imágenes fueron adquiridas en aire mediante el modo “Tapping” (0.5-1 Hz). La altura de los elementos se muestra en la figura.

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Debido a la mayor abundancia de fases de S generadas sobre calcopirita, en comparación con pirita (debido a la naturaleza soluble en medios ácidos), no se logró una adecuada caracterización de las superficies EMC (modificadas) control y biooxidadas de calcopirita por AFM. Por tal motivo, se recurrió al análisis por SEM para poder visualizar adecuadamente las diferentes biopelículas, estratificadas, generadas (Fig. 5).

Figura 5. Imágenes de SEM para superficies de EMC modificadas electroquímicamente. Imágenes de superficies control, inicialmente generadas mediante la aplicación de un pulso, Ean, en la zona I (0.515≤Ean≤0.665 V) (a) y zona II (0.665≤Ean≤0.785 V) (b, c). Las correspondientes imágenes de las superficies biooxidadas son respectivamente mostradas en (a’) y (b’, c’). En la figura se indica los puntos donde se realizaron los análisis mediante EDS y las principales fases minerales secundarias detectadas.

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Figura 6. Imágenes de SEM para superficies de EMC modificadas

electroquímicamente. Imágenes de superficies control, inicialmente generadas mediante la aplicación de un pulso, Ean, en la zona III (0.785≤Ean≤0.965 V) (a, b) y zona IV (0.965≤Ean≤1.215 V) (c). Las correspondientes imágenes de las superficies biooxidadas son respectivamente mostradas en (a’, b’) y (c’). En la figura se indica los puntos donde se realizaron los análisis mediante EDS y las principales fases minerales secundarias detectadas.

Las Figuras 5 y 6 mostraron una escasa colonización cuando la superficie EMC contiene inicialmente Sn2- pasivos (Zona I, Fig. 1b). Se observó una

progresiva y mayor colonización cuando la superficie contenía relaciones mixtas de CuS/S0 (zona II, Fig. 1b) y una abundante colonización cuando las superficies contenían fases de S0 (zona III y IV, Fig. 1b). Se logró identificar incluso, como las bacterias de A. thiooxidans pueden crecer adheridas a

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calcopirita a pesar de estar incrustadas y ser parcialmente recubiertas por fases de CuS (Fig. 6b’, c’). Lo anterior es importante porque pone en evidencia procesos de interacción bacteria-mineral que únicamente se consideraban para Acidithiobacillus ferrooxidans; sin embargo, a diferencia de A. thiooxidans, las células de A. ferrooxidans cesan su actividad metabólica cuando las células son cubiertas parcial o totalmente por fases minerales secundarias tales como S0 y jarositas durante la biolixiviación de calcopirita (Sasaki et al. 1998, 2009).

CONCLUSIONES

En este trabajo se demostró que las células de A. thiooxidans tienen adherencia preferencial por las fases de S activas (susceptibles a oxidación química o biológica), lo cual se logra controlando las condiciones de oxidación en la interfase de pirita y calcopirita. Se observó que las fases tipo CuS son inocuas y las células de A. thiooxidans pueden mantener su actividad metabólica a pesar de estar parcialmente recubiertas por este tipo de fases y S0. Se demostró además que el tipo de fases minerales secundarias y la proporción con que se encuentren en superficies de pirita y calcopirita, influyen notablemente en la formación, estructura y organización de la biopelícula. Con esta información, se están desarrollando estudios para establecer la relación existente entre propiedades electroquímicas y mineralógicas de pirita y calcopirita con la estructura, función y composición (EPS, proteínas, lípidos, etc.) de biopelículas de SOMs, como A. thiooxidans.

REFERENCIAS

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