DIAGNÓSTICO DE LA INFECCIÓN POR EL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA

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DIAGNÓSTICO DE LA INFECCIÓN POR EL VIRUS DE

LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA

Dr. Luis Antonio Sánchez López

Profesor, Investigador y Coordinador del Departamento de Ciencias Clínicas Universidad de Monterrey U.D.E.M.

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CASO CLINICO

• Paciente HGZ masculino de 28 años de edad, el cual

tuvo una relación sexual hace un mes con una

persona que el día de hoy le confiesa ser

seropositivo al VIH desde hace un año y medio.

Dicha persona NO esta en tratamiento antirretroviral

ni ha presentado sintomatología alguna

• HGZ pregunta si el puede estar infectado.

• ¿Qué examen sería el más apropiado?

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El diagnóstico de la infección por VIH sólo se

puede establecer de modo definitivo por

métodos

de

laboratorio,

ya

que

las

manifestaciones clínicas en los estadios

iniciales de la infección, aunque sugestivas, no

son específicas en ningún caso.

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Clasificación de las técnicas de laboratorio para el

diagnóstico de la infección por VIH

1)

Métodos directos:

Detectan el propio virus o alguno de sus

componentes.

 Cultivo viral

 Detección de ácidos nucléicos: PCR, LCR, bDNA, NASBA, etc.

 Antigenemia (p24)

2)

Métodos indirectos:

Reconocen los Ab específicos

producidos por el sistema inmune en respuesta al virus.

 Detección de anticuerpos específicos:

 Pruebas de screening: ELISA, aglutinación, etc.

 Pruebas de confirmación y suplementarias: WB, RIPA, IFI, LIA, etc.

 Investigación de la inmunidad celular específica.

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Pruebas serológicas para el diagnóstico de la infección

por VIH

1)

Pruebas de screening:

 EIA:  Indirecto  Competitivo  Tipo sandwich  De captura  Otros:  Pruebas de aglutinación  Métodos de adherencia

 Análisis por dot-blot

1) Pruebas de confirmación:

 Western blot

 IFI

 RIPA

 LIA y variantes.

EIA, enzimoinmunoanálisis; RIPA, análisis por radioinmunoprecipitación; LIA, inmunoanálisis lineal; IFI, inmunofluorescencia indirecta;

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Diagnóstico de infección por el HIV

La prueba de anticuerpos contra HIV

invariablemente

requiere

que

se

disponga de al menos dos ensayos

diferentes:



Dos pruebas de escrutinio y



Una prueba de confirmación

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La mayoría de las pruebas de escrutinio se basan en el principio

del inmunoensayo ELISA (Enzyme Linked Immuno sorbent

Assay) o en otras pruebas semejantes.

Las pruebas de escrutinio deben ser sensibles para:

 Minimizar la posibilidad de obtener un resultado falso negativo.

 Deben tener la capacidad de detectar los anticuerpos de baja afinidad

que se encuentran al inicio de la infección primaria.

 Deben detectar anticuerpos dirigidos contra todos los subtipos

diferentes de HIV (1, 2) y los subtipos (1-N, 1-O, HIV-1-M) .

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Prueba de escrutinio de VIH

ELISA

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PRUEBA DE ELISA PARA VIH

Se toma sangre venosa periférica en un tubo con tapón rojo Se centrifuga la muestra para separar

el suero

Para el ensayo, se utilizarán placas de micro elisa recubiertas con antígenos

del VIH

Se agrega el suero del paciente a los pocillos de la placa y se incuba

Se lava la placa para eliminar los anticuerpos que no

se unieron

Se agrega un anticuerpo anti IgG humano marcado con

enzima (peroxidasa)

Se lava la placa para eliminar los anticuerpos que no

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Se agrega un sustrato incoloro (peróxido de

hidrógeno)

Este sustrato incoloro desarrolla color cuando

actúa con la enzima,

PRUEBA DE ELISA PARA VIH

El desarrollo de color indica una reacción

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PRUEBA DE ELISA PARA VIH

• Se utilizan muestras de suero

• Las muestras duran hasta 24 horas a temperatura

ambiente (no es lo ideal)

• Si no se pueden enviar al laboratorio se recomienda

centrifugar la muestra y colocarla a 4°C por no mas de 4

días

• Las muestras congeladas a -20°C pueden conservarse

hasta meses.

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Las pruebas de anticuerpos de

4ª. generación

combinan la detección de anticuerpos de HIV con la

detección del antígeno viral p24, a fin de reducir la

"ventana del diagnóstico"

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CASO CLINICO

• A HGZ se le indica se realicé la prueba de

ELISA para VIH y acude nuevamente al día

siguiente con un resultado NEGATIVO.

• Pregunta si puede estar completamente

tranquilo

1 5

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ELISA PARA V.I.H

• Utiliza un pool (Todos) antígenos preparados

por lisis del virus o por medio de péptidos

sintéticos

• Si es positivo, se repite el examen y después

se confirma con una prueba de Western-Blott

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Las pruebas de escrutinio para HIV de las

que se dispone actualmente tienen una

especificidad de al menos el

99.5%;

es

decir, entre 4,000 muestras negativas

para HIV-probadas, un máximo de 20

podrían dar un resultado de reactividad

falsa.

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HIV RNA p24 Ag IgM Anti-HIV

Re

ac

tividad

0 ₁

₂

₃

₄

₅

₆

₇

₈

IgG Anti-HIV Primera Generación Tercera Generación Cuarta Generación Segunda Generación

-VIDAS HIV Duo Quick & Ultra

Depende del kit

Generaciones de ELISA Anti-VIH

Semanas después de la infección

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FALSOS NEGATIVOS

• Se presentan en un 0.3-0.001%

• Es debido a:

– Periodo de ventana

– Infección por VIH tipo 2

– Colapso del sistema inmune

– Agamaglobulinemia

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V.I.H. 2

• Es otro tipo de retrovirus que causa la enfermedad

• Causa el 20 a 30% de los falsos negativos EN CASO DE

QUE NO SEAN DE ÚLTIMA GENERACIÓN

• Se encuentra en el este de África

• Es menos transmisible, su carga viral es baja, la

depleción de CD4 y su progresión clínica es más

lenta.

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COLAPSO DEL SISTEMA INMUNE

• Se presenta cuando el sistema inmune se encuentra

deteriorado

• Se encuentra en pacientes terminales

• Respuesta atípica inmunológica

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FALSOS POSITIVOS

• La frecuencia de presentación es de 0.0007%

• Puede ser causada por:

– Autoanticuerpos

– Vacunación

– Mala técnica

(21)

AUTOANTICUERPOS

• Se presentan en enfermedades como:

– Lupus eritematoso sistémico

– Insuficiencia renal en estadío final

– Enfermedades autoinmunes

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Vacunación

• Es la causa poco común de falsos positivos

• Se presenta en individuos que se encuentran en

estudios de investigación.

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RECIEN NACIDOS DE MADRES SEROPOSITIVAS

• Se presenta cuando existen anticuerpos circulantes

de la madre en niños recién nacidos

• En esta etapa se utiliza para diagnóstico la prueba de

P.C.R. (Carga viral)

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CASO CLINICO

• Se decide, para superar el periodo de ventana

solicitar a HGZ un nuevo ELISA al primer de la

relación de riesgo.

• Acude asintomático al mes con el resultado

nuevamente NEGATIVO y con depresión importante

• ¿Qué hacemos?

• Citarlo a los tres meses

2 9

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CASO CLINICO

• Acude a los tres meses refiriendo que hace una

semana presentó un cuadro clínico caracterizado

por

dolor faríngeo, hipertermia no cuantificada,

adenomegalias en cuello, mialgias, artralgias y un

rash macular no pruriginoso que cedió al 6 día.

• Trae un resultado ELISA Positivo

• ¿Qué sigue?

3 0

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Ensayo confirmatorio de

Western blot

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PRUEBA DE WESTERN BLOT

En esta prueba las proteínas virales se someten

a desnaturalización, esto se logra con la incubación de estas con un detergente

iónico (SDS) A 100°C

Posteriormente estas proteínas se separan por una electroforesis en

gel de

poliacrilamida conforme a su peso molecular

Luego las proteínas se transfieren de modo

electroforético a una pieza de papel filtro (generalmente nylon

o nitrocelulosa) al cual se adherirán a través de interacciones no polares.

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PRUEBA DE WESTERN BLOT

Se cortan las tiras de papel de nitrocelulosa y se procede

a incubar cada una de ellas con el suero del paciente

PX 1 2 3 4

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PX 1 2 3 4

Se agrega un anticuerpo anti IgG humano marcado con enzima

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PRUEBA DE WESTERN BLOT

PX 1 2 3 4

(31)

PRUEBA DE WESTERN BLOT

PX 1 2 3 4

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PRUEBA DE WESTERN BLOT

(33)

CASO CLINICO

• Acude HGZ a los dos días con resultado de Western

Blot INDETERMINADO

• QUE LE DECIMOS?

3 8

(34)

INTERPRETACION

• Negativo:

– No existen bandas de proteínas

• Positivo:

– Al menos 2 de 3 proteínas mayores

• Indetereminado:

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Un resultado indeterminado en el WB del VIH-1:

 Seroconversión para VIH-1, antes de que aparezcan cada una de las

bandas del perfil completo de Ab anti-VIH-1

 Enfermedad avanzada, cuando el deterioro inmunológico grave y la

presencia de inmunocomplejos pueden reducir el título de Ab anti-VIH-1 circulantes.

 _{Niños nacidos de madres seropositivas, tanto si se trata de niños}

verdaderamente infectados como de portadores pasivos de Ab maternos durante el primer año de vida.

 Individuos africanos, probablemente en relación con la mayor

divergencia genética de las cepas africanas del VIH-1 en comparación con las americanas y/o europeas.

 _{Reactividad inespecífica o cruzada con otros anticuerpos, como se ha}

descrito en sujetos con enfermedades autoinmunes, mujeres multíparas o, en menor proporción, donantes de sangre sanos.

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CASO CLINICO

• Acude HGZ, un mes posterior a nuestra consulta con

resultado de ELISA positivo y Western Blot Positivo y

se realiza el diagnóstico de la infección

• RECORDAR

• SI A LOS 6 MESES DEL CONTACTO SEXUAL DE RIESGO

CONTINUA EL WESTERN BLOT NEGATIVO O

INDETERMINADO ABRIR EL DIAGNOSTICO

DIFERENCIAL HACIA LAS CONSIDERACIONES DE

FALSOS POSITIVOS DE VIH

4 1

(37)

Dispositivos de prueba simples /

rápidos

(38)

Incluyen el ELISA y aglutinación.

En

pruebas

rápidas

incluye

la

Inmunocromatografía.

SSA2-2010 (3.1.13)

A las de laboratorio para la detección de anticuerpos anti VIH, en: Plasma Suero sanguíneo Líquido crevicular Sangre total.

Pruebas

de

tamizaje

(39)

2010 (3.1.11, 3.1.12) Aquellas que se realizan en laboratorio y confirman la presencia de

anticuerpos anti VIH en suero sanguíneo; incluyen prueba Western Blot. Prueba confirmatori a Aquéllas de laboratorio que determinan la presencia del VIH o algún componente del mismo (cultivo viral, detección de antígenos, detección cualitativa o cuantitativa de ácidos nucleicos). Prueba complementaria :

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NOM-010-SSA2-2010 (4.4.8 , 4.4.8.1, 4.4.8.2) Western Blot

Prueba Rápida + ELISA ELISA + EIA 2 ELISA o 2 EIA o 2 PR Dos resultados de pruebas de tamizaje, de anticuerpos positivos y prueba suplementaria positiva.

+

ó ó

Diagnóstico

(41)

(42)

(43)

(44)

(45)

(46)

(47)

Bibliografía

• http://www.elsevier.es/es-revista-enfermedades-infecciosas-microbiologia-clinica-28-articulo-diagnostico-laboratorio-infeccion-por-el-S0213005X10004994 • https://www.fda.gov/forconsumers/consumerupdates/consumerupdatesenespano l/ucm312126.htm • http://www.emol.com/noticias/internacional/2004/03/26/142947/fda-aprueba-un-test-oral-rapido-para-detectar-el-virus-vih.html • http://www.diagnosticainternacional.com.mx/admin/tablas/productos/ORG-BRCHIV01%20V1%200313%20Cliente1.pdf • https://www.gob.mx/cms/uploads/attachment/file/286892/Gu_a_de_detecci_n_ de_VIH_Censida_2018_VF.pdf • https://www.fda.gov/forpatients/illness/hivaids/history/ucm151081.htm • https://bio.libretexts.org/TextMaps/Microbiology/Book%3A_Microbiology_(OpenS tax)/20%3A_Laboratory_Analysis_of_the_Immune_Response/20.4%3A_Enzyme_I mmunoassays_(EIA)_and_Enzyme-Linked_Immunosorbent_Assays_(ELISA)

(48)

https://www.dropbox.com/sh/vzpgquyr4vzdo18/AAAmeajYdlTmMVdf6zDaDAP8a?dl=0

(49)

Pruebas de Detección rápidas

Se dispone de varias pruebas rápidas de HIV a las que también se hace referencia como pruebas "point-of-care" (diagnósticos en el sitio de cuidado del

paciente), "de cabecera" o "dispositivos de prueba simples/rápidos". Estas pruebas se basan en uno de cuatro principios inmunodiagnósticos:

 Aglutinación de partículas.

 Inmunodot (tira reactiva) o inmunoadherencia.

 Inmunofiltración.

 Iinmunocromatografía

En la mayoría de los casos los resultados están disponibles en 15 a 30 minutos. Se usa sangre total o de vasos capilares (obtenida de la punta del dedo o del lóbulo de la oreja).

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La FDA ha otorgado la licencia para diversas pruebas

rápidas de HIV:



OraQuick® (OraSure Technologies, Pensilvania, E.U.A.),



Reveal. (MedMira Laboratories, Halifax, Nueva Escocia),



Uni-Gold Recombigen. (Trinity Biotech, Irlanda)



Sistema diagnóstico Murex de un solo uso (SUDS).

Se usan muestras de suero, plasma con EDTA, sangre total, de

manera alternativa, la orina o el fluido oral (trasudado oral, al

que con frecuencia y de manera incorrecta se hace referencia

como "saliva")

(51)

(52)

Enzimoinmunoanalisis indirecto utilizando gp 160 de env HIV-1, detectando la presencia de Ab en orina.

(53)

(54)

(55)

Inmunocromatografía

(56)

(57)

El diagnóstico de la infección por VIH debe realizarse

mediante la detección de Ab anti-VIH utilizando

métodos serológicos.

En los casos:



Hipogammaglobulinemia.



Infección perinatal



Infección por variantes con distinta diversidad genética

que inducen AB atípicos como VIH-2 o VIH-1 grupo O.

Son candidatos a aislamiento en cultivo, detección de Ag p24 o

detección de material genético del virus mediante

amplificaciónpor PCR, tanto de moléculas de RNA de la partícula viral como de DNA pertenecientes al provirus integrado en el genoma celular.

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