ESTUDIO DE LA CONTRIBUCION
/ /DE LA PROTEINA LOXL3
/A LA PROGRESION TUNORAL Y PLASTICIDAD CELULAR EN NELANONA
Tesis doctoral. Madrid 2022
Programa de Doctorado en Biociencias Moleculares
Estudio de la contribución de la proteína LOXL3 a la progresión tumoral y plasticidad celular en
melanoma
Alberto Vázquez Naharro TESIS DOCTORAL
Madrid, 2022
FACULTAD DE MEDICINA
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID
Estudio de la contribución de la proteína LOXL3 a la progresión tumoral y plasticidad celular en melanoma
Alberto Vázquez Naharro Graduado en Bioquímica
presenta esta memoria para optar al título de Doctor por la Universidad Autónoma de Madrid
Directoras:
Dra. Amparo Cano García, Catedrática de la Universidad Autónoma de Madrid Dra. Patricia González Santamaría, Doctora de la Universidad Autónoma de Madrid
Tutora:
Dra. María Isabel Sánchez Pérez, Profesora Titular de la Universidad Autónoma de Madrid
La presente tesis ha sido realizada en el Departamento de Bioquímica de la Facultad de Medicina de la Universidad Autónoma de Madrid y en el Instituto de Investigaciones Biomédicas “Alberto Sols” de Madrid (CSIC-UAM), financiada por una Beca de Formación de Personal Investigador (FPI) del Ministerio de Economía y Competitividad.
Catedrática de la Universidad Autónoma de Madrid Dra. Patricia González Santamaría
Doctora de la Universidad Autónoma de Madrid
CERTIFICAN:
Que Alberto Vázquez Naharro, graduado en Bioquímica por la Universidad de Sevilla y de Málaga, ha realizado bajo nuestra dirección en el Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina – Instituto de Investigaciones Biomédicas “Alberto Sols” (CSIC-UAM) de Madrid, el trabajo titulado
“Estudio de la contribución de la proteína LOXL3 a la progresión tumoral y plasticidad celular en melanoma”.
El presente trabajo cumple, a nuestro juicio, con los requisitos necesarios para ser presentado y defendido como Tesis Doctoral.
Madrid, 14 julio de 2022
Fdo. Amparo Cano García Fdo. Patricia González Santamaría
sessile lobulated black mass, somewhat smaller in size than and of the same shape as a grain of wheat … Externally the colour of the tumour was that of a dark grape, while the skin stretched over it was shiny and somewhat transparent … The tumour was growing progressively… It was decided, therefore, to make an incision into it under an anaesthetic and to remove a fragment for microscopical examination. The cut surface presented an intensely black appearance suggestive of wet indian ink, while the scalpel was smeared with a granular black exudate. Floating among a few red blood corpuscles were isolated large round cells completely filled with a fine granular brown pigment, while everywhere in the field there was much free pigment suspended in a fine granular form.
Except for the red cells, every cell present contained this pigment. It was at once evident that we were dealing with a melanoma”
Extraído de (H. E. Harding & Passey, 1930).
Y aquí estamos, escribiendo los agradecimientos de la tesis. Recuerdo al llegar a Madrid y comenzar el máster, las decenas de entrevistas que hice en centros de investigación y hospitales para realizar el TFM. En la penúltima de ellas en el Hospital de la Princesa, un investigador me dijo: si quieres investigar sobre la EMT, vete con la que sabe más del tema. Y ahí que me fui.
Así, que lo primero de todo, agradecer a mis directoras de tesis, Amparo y Patricia la oportunidad que me disteis de comenzar a trabajar en el laboratorio haciendo el TFM. Gracias por todo lo que me enseñasteis en un principio y a lo largo de estos años. Ha sido un orgullo formar parte de la familia lisil-oxidasas y aportar mi granito de arena a conocer mejor a la hermana pequeña y cada vez menos desconocida, Loxl3. Gracias Paco y al resto del B26 por estar siempre disponibles para lo que necesitara.
Gracias a los compis del departamento, Sergio, Laura, Adri, Sonia, por hacer ese pasillo un poco menos inhóspito. Gracias a Lala y Sandra, por vuestra ayuda en el microtomo y las tinciones. Gracias a los diferentes servicios del IIB, en especial a Diego, Mónica y Lucía, por tantas horas en el confocal y a Rakel por toda tu ayuda en el animalario. Gracias a Eva del MD por los escáneres de las IHQ.
Gracias Weses, Alberto (siempre líder), Sergio, Jesús, Carmen y Laura, por recibirme cada vez que voy como si no me hubiera ido nunca de Triana. Carmina, gracias por esas videollamadas UK-Spain llenas de good vibes, por estar siempre ahí.
Gracias al B16, mi familia científica durante 7 años. Os lo he dicho muchas veces, sin vosotros nada de esto hubiera sido posible. A todos los que se fueron por el camino: Jara, gracias por traer un rinconcito de Andalucía al labo, por toda la ciencia que me has enseñado, porque contigo aprendí la rigurosidad científica. Vanesa, gracias por tu amabilidad, tu ayuda sin preguntar, por enseñarme el funcionamiento del labo, eres la mejor técnico del mundo. José, gracias por todas las risas, consejos y buenos momentos entre tamoxifeno y melanomas. Gracias Lidia, por toda tu ayuda y entrega, por hacerlo todo un poco más fácil. Celia, marcaste una etapa de mi tesis, he aprendido muchísimo de ciencia gracias a ti y a E2A. Y a todos los que siguen en él: Sara, gracias por acercarme a la terreta y a las ómicas, porque esta tesi (con ese o sin ese) no hubiera sido la misma sin tu ayuda. Carmen, gracias por tu luz, por ser la más maja de las majas.
Saleta, Sara C, Laura y Bárbara, gracias por haberme hecho sentir parte de la familia Moreno.
piques, por estar 25/8, con todo lo que eso implica. Eres el mayor regalo que me llevo de esta aventura. Que sigamos pa´rriba y sin freno. Nos queda mucho por vivir y perrear maik.
A mis bioquímicas. Gracias Anakinra, Ana y Sara, por haber comenzado esta vida madrileña juntos, por haber hecho de Cañaveral 93 el inicio de una gran etapa. Gracias por seguir siendo casa después de tantos años. Estrella, gracias por este “matrimonio” tan especial y fructífero, lo que una la cuarentena que no lo separe nadie jamás. Nora, gracias por estar ahí siempre, por hacerme comprender que no hay distancia que esté lejos, por darme vida. Tabú, Valverde no nos invadió, pero nosotros seguiremos conquistando el mundo a base de brindis.
A mi familia. Papá y mamá, muchas gracias, sin vosotros esta aventura madrileña no hubiera sido posible. Gracias por apoyarme desde el primer momento en el que os dije que me iba a la capital, por sentiros cerca siempre. Hermanos, gracias por acompañarme todos estos años, por enseñarme otros puntos de vista de la vida. Gracias Francisco, por esta conexión gemelier en la que no hay distancias, porque muy pocos tenemos la suerte de tener un hermano de camada. Marina, gracias por regalarme estos sobrinos. Con ellos, las vueltas se hacen más duras pero las idas a Sevilla se hacen con una felicidad inmensurable, es un orgullo ser vuestro tito, Candela y Guillermo. Paco, gracias por todo tu arte en la vida y por el diseño de esta portada.
Abuelas, gracias por todo lo que me habéis enseñado.
Os quiero mi gente
El melanoma cutáneo es un tipo de cáncer de piel muy agresivo, poco común y muy letal, cuya incidencia ha ido aumentando en las últimas décadas. Los avances recientes en terapias dirigidas y en inmunoterapia han contribuido a mejorar la supervivencia de los pacientes diagnosticados en estadios tempranos, pero es habitual la adquisición de resistencia a dichas terapias.
Loxl3 (Lisil oxidasa-like 3) pertenece a la familia de enzimas lisil oxidasas, formada por cinco miembros, que se caracterizan por ser secretadas al medio extracelular donde participan en procesos de remodelación de la matriz extracelular. Además de su función canónica, la evidencia acumulada ha puesto de manifiesto la participación de algunos miembros de la familia en la progresión tumoral y metástasis de diversos tipos de cáncer, ejerciendo funciones intracelulares e intranucleares.
Resultados previos del grupo han establecido que LOXL3 es esencial para la supervivencia de células de melanoma humano y que participa en la correcta progresión del ciclo celular y en el mantenimiento de la estabilidad genómica. Además, la generación y caracterización de un modelo murino de melanoma con deleción condicional de Loxl3, confirmó la implicación de Loxl3 en la melanomagénesis de ratón y en la diseminación metastásica.
En la presente tesis doctoral, se ha realizado la caracterización de líneas primarias de melanoma derivadas del modelo murino mencionado, así como análisis en otras líneas celulares de melanoma murino ya establecidas, para esclarecer el papel de Loxl3 en la melanomagénesis y en la progresión tumoral. Para ello, se han llevado a cabo diferentes experimentos in vitro, así como experimentos de tumorogénesis y metástasis experimental, determinando que Loxl3 es necesaria para la viabilidad celular en condiciones de crecimiento en dos dimensiones, para la progresión tumoral y para el mantenimiento de la estabilidad genómica en el contexto del melanoma murino.
Por último, hemos evaluado la posible implicación de Loxl3 en la plasticidad celular del melanoma, determinando que Loxl3 podría estar controlando la expresión de Mitf y de varios EMT-TFs (Snail1, Prrx1 y Twist1). Además, mediante el uso de líneas de melanoma humano y murino, así como datos de pacientes de melanoma cutáneo, obtenidos de la base de datos TCGA, hemos establecido una correlación positiva entre LOXL3, SNAIL1 y PRRX1, específicamente en muestras que presentan la mutación BRAFV600E. Por tanto, proponemos que el eje LOXL3-SNAIL1- PRRX1 favorece la plasticidad celular en melanoma asociada a la progresión tumoral y representa
Cutaneous melanoma is a very aggressive, rare and lethal type of skin cancer, whose incidence has been increasing in the last decades. Recent advances in targeted therapies and immunotherapy have improved patient survival when diagnosed in early stages, being the acquisition of resistance to these therapies very common in most cases.
Loxl3 (Lysyl oxidase-like 3) belongs to the lysyl oxidase family, constituted by five members that are secreted to the extracellular medium where they are involved in the remodelling of the extracellular matrix. Besides this canonical function, their involvement in tumor progression and metastasis of various types of cancer, through intracellular and intranuclear functions, is increasingly evident.
Previous results from the group determined that LOXL3 is essential for the survival of human melanoma cells, contributing to the correct progression of the cell cycle and maintenance of genomic stability. In addition, the generation and characterization of a mouse model of melanoma with conditional deletion of Loxl3, has confirmed the involvement of Loxl3 in mouse melanomagenesis and metastatic dissemination.
In the present thesis, we have characterized primary melanoma lines derived from the mentioned mouse model, as well as studied other established mouse melanoma cell lines, to clarify the role of Loxl3 in melanomagenesis and tumor progression. To that end, in vitro experiments, tumorigenesis, and metastasis assays have been performed, determining that Loxl3 is required for cell viability under two-dimensional growth conditions, tumor progression, and genomic stability maintenance in the context of mouse melanoma.
Finally, we have evaluated the possible involvement of Loxl3 in melanoma cell plasticity, determining that Loxl3 could be controlling the expression of Mitf and several EMT-TFs (Snail1, Prrx1, and Twist1). Furthermore, by using human and mouse melanoma cell lines, as well as data from cutaneous melanoma patients, obtained from the TCGA database, a positive correlation has been established between LOXL3, SNAIL1 and PRRX1, specifically in the samples harbouring BRAFV600E mutation. Therefore, we propose that the LOXL3-SNAIL1-PRRX1 axis favours the phenotypic plasticity of melanoma associated with tumor progression and represents a potential therapeutic target in melanoma.
Índice ... 1
Índice de tablas ... 5
Índice de figuras ... 7
Abreviaturas ... 9
Introducción ... 15
1. Melanoma ... 15
1.1 Origen y epidemiología ... 15
1.2 Biología del melanoma ... 16
1.3 Modelos genéticos murinos de melanoma ... 19
1.4 Modelos celulares murinos de melanoma ... 20
2. Transición epitelio mesénquima en cáncer ... 21
2.1 Papel de los EMT-TFs Snail1 y Prrx1 en cáncer ... 22
3. Plasticidad fenotípica en melanoma ... 24
3.1 MITF y el cambio de fenotipo en melanoma ... 25
3.2 EMT-TFs asociados a la plasticidad del melanoma ... 27
4. La familia de proteínas lisil oxidasas ... 28
4.1 Miembros, estructura y función canónica ... 28
4.2 Regulación génica de la familia LOX ... 30
4.3 Localización subcelular y modificaciones postraduccionales de los miembros de la familia LOX ... 31
4.4 Función fisiológica de los miembros de la familia LOX ... 32
4.4.1 Modelos genéticos de ratón de los miembros de la familia LOX ... 32
4.4.2 Estudios de la función de los miembros de la familia LOX en modelos celulares ... 33
4.5 Papel de los miembros de la familia LOX en patologías no tumorales ... 34
4.6 Implicación de los miembros de la familia LOX en patologías tumorales ... 36
4.6.1 LOXL3 en cáncer ... 38
Objetivos ... 43
Materiales y Métodos ... 47
1. Modelo murino ... 47
1.1 Generación del modelo de melanoma murino con deleción condicional de Loxl3 ... 47
1.2 Genotipado de ratones ... 49
1.3 Tratamiento con tamoxifeno ... 51
1.4 Generación de líneas celulares primarias de melanoma derivadas del modelo murino 51 2. Ensayos celulares in vivo ... 52
2.3 Sacrificio de los animales ... 52
3. Procesamiento de tejidos y tumores ... 52
3.1 Preparación de bloques de parafina ... 52
3.2 Tinción de hematoxilina-eosina ... 53
4. Ensayos celulares in vitro ... 53
4.1 Otras líneas celulares utilizadas ... 53
4.2 Vectores virales, producción de lentivirus e infecciones lentivirales ... 54
4.3 Silenciamiento de la expresión de Loxl3 en células de melanoma murino ... 54
4.4 Ensayo de proliferación por contaje ... 55
4.5 Ensayos de migración e invasión ... 55
4.6 Tinción de Anexina V ... 55
4.7 Inmunofluorescencia ... 56
4.8 Adquisición de imágenes de cultivos celulares ... 56
5. Detección de proteínas ... 56
5.1 Análisis de proteínas mediante western blot (WB) ... 56
5.2 Análisis de proteínas mediante inmunohistoquímica (IHQ) ... 58
6. Análisis de RNA ... 59
6.1 Extracción de RNA total de células y síntesis de cDNA ... 59
6.2 Análisis de expresión génica mediante PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) ... 59
7. Análisis in silico ... 60
8. Análisis estadísticos ... 61
Resultados ... 65
1. Derivación de cultivos primarios a partir de los melanomas generados en el modelo murino y caracterización molecular y celular de los mismos ... 65
1.1 Derivación y caracterización de cultivos primarios a partir del modelo murino de melanoma ... 65
1.2 Silenciamiento de Loxl3 en la línea MeL3 ... 67
2. Caracterización de la función de Loxl3 en líneas celulares de melanoma murino... 68
2.1 Efecto del silenciamiento de Loxl3 en líneas de melanoma murino: estudios in vitro ... 68
2.1.1 Análisis de la proliferación y muerte celular ... 68
2.1.2 Análisis del daño en el DNA ... 70
2.1.3 Análisis de las capacidades migratorias e invasivas ... 72
2.2 Efecto del silenciamiento de Loxl3 en la línea de melanoma MeL3: estudios in vivo .... 73
2.2.1 Ensayos de tumorogenicidad ... 73
2.2.2 Ensayos de metástasis experimental ... 76
3.1 Cambios transcriptómicos asociados a la expresión de LOXL3 ... 78
3.1.1 Análisis in silico de la expresión de PRRX1 en líneas celulares de cáncer ... 79
3.2 Estudio de la expresión de LOXL3, SNAIL1 y PRRX1 en líneas de melanoma humano ... 80
3.3 Análisis de la expresión de Mitf y de diferentes EMT-TFs en líneas de melanoma murino ... 82
3.4 Estudios in silico de la expresión de LOXL3, SNAIL1 y PRRX1 en muestras de melanoma humano ... 85
Discusión ... 89
1. Loxl3 contribuye a la viabilidad y a la estabilidad genómica de células de melanoma murino ... 89
2. Loxl3 contribuye a la melanomagénesis de ratón ... 92
3. Loxl3 contribuye a la plasticidad celular del melanoma... 95
4. El eje LOXL3-SNAIL1-PRRX1 como nueva diana terapéutica en melanoma ... 98
Conclusiones ... 103
Bibliografía ... 107
Anexo ... 127
Introducción
Tabla 1. Modelos murinos de melanoma cutáneo con modificaciones genéticas en Braf y/o Pten (página 19).
Tabla 2. Resumen de la localización subcelular de las proteínas lisil oxidasas (página 31).
Tabla 3. Resumen de los modelos murinos disponibles de las proteínas lisil oxidasas (página 32).
Tabla 4. Resumen de las patologías no tumorales asociadas a las proteínas lisil oxidasas (página 35).
Tabla 5. Resumen de los modelos murinos de la familia lisil oxidasa en cáncer (página 36).
Tabla 6. Resumen de las funciones mediadas por las proteínas lisil oxidasas en cáncer (página 37).
Materiales y Métodos
Tabla 7. Oligonucleótidos utilizados para el genotipado de los alelos de los modelos genéticos de ratón (página 51).
Tabla 8. Mutaciones presentes en las principales líneas celulares murinas utilizadas (página 53).
Tabla 9. Secuencia diana de los diferentes shRNAs utilizados para el silenciamiento de Loxl3 (página 55).
Tabla 10. Anticuerpos primarios utilizados para el análisis de proteínas (página 57 y 58).
Tabla 11. Anticuerpos secundarios utilizados para el análisis de proteínas (página 58).
Tabla 12. Secuencia de los oligonucleótidos usados para en el análisis mediante RT-qPCR de los genes murinos indicados (página 60).
Introducción
Figura 1. Vías de señalización celular en los melanocitos y contribución de sus modificaciones a la tumorogénesis (página 18).
Figura 2. Resumen de los estados fenotípicos del melanoma en relación con la expresión de MITF identificados en los estudios indicados (página 27).
Figura 3. Representación esquemática de los miembros de la familia lisil oxidasa y de sus dominios estructurales (página 29).
Materiales y Métodos
Figura 4. Representación de los alelos necesarios para generar el modelo de melanoma murino con deleción condicional de Loxl3 (página 48).
Figura 5. Esquema de los cruces de líneas de ratón utilizados para generar animales experimentales y controles de la línea de melanoma murino condicional para el gen Loxl3 (página 49).
Figura 6. Comprobación mediante PCR de los cambios genéticos producidos por la recombinasa Cre en DNA genómico (página 50).
Resultados
Figura 7. Derivación de cultivos primarios del modelo murino (página 65).
Figura 8. Caracterización de los cultivos primarios establecidos (página 66).
Figura 9. Silenciamiento de Loxl3 en la línea MeL3 (página 67).
Figura 10. Análisis de la proliferación celular por contaje tras el silenciamiento de Loxl3 en líneas de melanoma murino (página 69).
Figura 11. Estudio de la muerte celular en la línea MeL3 tras el silenciamiento de Loxl3 (página 70).
Figura 12. Análisis de marcadores de respuesta al daño en el DNA tras el silenciamiento de Loxl3 en líneas de melanoma murino (página 71).
Figura 13. Análisis de la migración e invasión de la línea MeL3 en presencia o ausencia de Loxl3 (página 72).
Figura 14. Ensayos de tumorogenicidad de la línea MeL3 (página 74).
Figura 15. Caracterización de los tumores generados por la línea MeL3 en ratones inmunodeprimidos (página 75).
Figura 16. Caracterización de los tumores del modelo genético de melanoma para marcadores de daño al DNA y proliferación (página 76).
Figura 17. Análisis de los pulmones de los ratones tras el ensayo de metástasis experimental (página 77).
Figura 18. Resultados de los datos obtenidos tras análisis transcriptómicos en la línea A375P (página 79).
Figura 19. Niveles de expresión de PRRX1 en la colección de líneas celulares de cáncer de la base de datos CCLE (Broad Institute, cBioPortal) determinados mediante análisis masivo de expresión de mRNA (página 80).
Figura 20. Análisis de los niveles de expresión de LOXL3, SNAIL1 y PRRX1 en un panel de líneas celulares de melanoma humano (página 81).
Figura 22. Análisis de la expresión de genes y proteínas relacionadas con el proceso EMT en la línea Yumm 1.7 y B16-F10 (página 84).
Figura 23. Análisis de expresión de LOXL3, SNAI1 y PRRX1 en 469 tumores humanos de melanoma cutáneo (página 86).
Discusión
Figura 24. Esquema sobre posibles mecanismos implicados en la regulación y acción de LOXL3 en melanoma (página 97).
Figura 25. Implicación de LOXL3 en la melanomagénesis y en la plasticidad celular del melanoma (página 99).
aa: aminoácido/s
AKT: proteína quinasa B (PKB) (AKT serine/threonine kinase 1)
ATCC: colección americana de cultivos (American Type Culture Collection) A-V: Anexina V
BCA: ensayo de ácido bicinconínico Bcat-STA: Beta catenina estabilizada
BMDCs: células derivadas de la médula ósea (bone marrow derived cells) BMP1: proteína morfogenética de hueso 1 (bone morphogenetic protein 1) BRAF: proto-oncogén B-Raf (B-Raf proto-oncogene)
53BP1: Proteína 1 de unión a p53 (p53 binding protein 1) BSA: albúmina de suero bovino (bovine serum albumin)
CAFs: fibroblastos asociados al tumor (cancer-associated fibroblasts)
CCLE: Enciclopedia de líneas celulares de cáncer (Cancer Cell Line Encyclopedia) CDK4/CDK6: quinasa dependiente de ciclina 4/6 (cyclin dependent kinase 4/6)
Cdkn2a (Ink4a/Arf): inhibidor de quinasa dependiente de ciclina 2A (cyclin dependent kinase inhibitor 2A) cDNA: ácido desoxirribonucleico complementario
ChIP-Seq: Secuenciación de la Inmunoprecipitación de la cromatina (Chromatin Immunoprecipitation Sequencing).
Cre: recombinasa Cre.
CreERT2: recombinasa Cre dependiente de tamoxifeno (versión T2) CRL: secuencia homóloga al receptor de citoquinas (cytokine receptor like) CTCs: células circulantes de tumores (circulating tumor cells)
CTLA-4: proteína asociada al linfocito T-citotóxico 4 (cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4) DAPI: 4',6-diamidino-2-fenilindol
DCIS: carcinoma ductal in situ (ductal carcinoma in situ) DDR: respuesta al daño en el ADN (DNA damage response)
DMEM: medio esencial mínimo Dulbecco (Dulbecco's Modified Eagle Medium) DNA: ácido desoxirribonucleico
dNTPs: deoxirribonucleótidos trifosfato
DSBs: roturas de doble cadena (double-strand breaks)
EMT: transición epitelio-mesénquima (Epithelial to mesenchymal transition) EMT-TF: factor de transcripción asociado a la EMT (EMT transcription factor) FBS: suero fetal bovino (fetal bovine serum)
FRT: secuencia reconocida por la recombinasa flipasa Fw: secuencia en dirección 5’-3’ (forward)
GAPDH: gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)
Gnaq/Gna11: subunidad α de la proteína de unión a nucleótidos de guanina Gq/G11 (G protein subunit alpha q/ alpha 11)
GSEA: análisis de enriquecimiento de conjunto de genes (Gene Set Enrichment Analysis) γH2AX: variante de histona H2AX fosforilada en el residuo Serina 139
HEK: células humanas de riñón embrionario (human embryonic kidney cells)
HGF/SF: factor de crecimiento de hepatocitos/factor de disociación (hepatocyte growth factor/scatter factor)
HIF1α/HIF2α: subunidad α del factor inducible por hipoxia 1/2 (hipoxia inducible factor 1/2 subunit alpha) HSPA5: miembro 5 de la familia A de proteínas de choque térmico (heat shock protein family A member 5) 4-HT: 4-hidroxitamoxifeno
IDC: carcinoma ductal invasivo (invasive/infiltrative ductal carcinoma) IHQ: inmunohistoquímica
Ink4a/Arf (Cdkn2a): inhibidor 2A de quinasa dependiente de ciclina (cyclin dependent kinase inhibitor 2A) IRE1: enzima dependiente de inositol 1, activada por estrés de retículo (inositol-requiring enzyme 1) IP: Ioduro de Propidio
KI: knock-in, modelo genético de ganancia de función KO: knock-out, modelo genético de pérdida de función L3: Loxl3
LKB1: quinasa hepática B1 (liver kinase B1) loxP: secuencia reconocida por Cre LOX: lisil oxidasa (lysyl oxidase)
LOXL1-4: proteína similar a la proteína lisil oxidasa tipo 1-4 (Lysyl Oxidase-like 1-4) LTQ: lisil-tirosil-quinona
MAPK: proteína quinasa activada por mitógenos (mitogen-activated protein kisane) MDM2: E3 ubiquitina-ligasa MDM2 (murine double minute 2)
MEC: matriz extracelular
MEK: proteína quinasa quinasa activada por mitógenos (mitogen-activated protein kinase kinase) MET: transición mesénquima epitelio (mesenchymal to epithelial transition)
MITF: factor de transcripción asociado a la microftalmia (microphthalmia-associated transcription factor) MLV: virus de la leucemia de Moloney (Moloney leukemia virus)
MMTV: virus del tumor mamario de ratón (mouse mammary tumor virus)
miRNA: micro RNA
mTOR: diana de mamíferos de la rapamicina (mammalian target of rapamycin) NCSC: células troncales de la cresta neural (neural crest stem-like cell)
NeoR: resistencia a neomicina
NF1: neurofibromina 1 (neurofibromin 1)
NLS: señal de localización nuclear (nuclear localization signal) NRas: oncogén ras de neuroblastoma
NTC: oligonucleótido shRNA control no dirigido (non-targeting control) o.n.: durante la noche (over-night)
p14Arf: isoforma p14 de Cdkn2a p16Ink4: isoforma p16 de Cdkn2a p19Arf: isoforma p19 de Cdkn2a
PACE4: proteína con actividad proteasa denominada sistema de corte de aminoácidos básico emparejado 4 (paired basic amino acid cleaving system 4)
PBS: tampón salino fosfato (Phosphate-Buffered Saline)
PCR: reacción en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction)
PD-1: proteína de muerte celular programada 1 (programmed cell death protein 1) PD-L1: ligando de muerte celular programada 1 (programmed cell death ligand 1)
PDK1: proteína quinasa 1 dependiente de 3-fosfoinosítido (3-phosphoinositide dependent protein kinase 1) PDXs; xenoinjertos derivados de tumores de pacientes (patient derived xenografts)
pHH3: fosfo Histona H3 PKD1: proteína quinasa D1 PFA: paraformaldehído
PI3K: fosfatidilinositol-3 quinasa (phosphatidylinositol 3-kinase) PIP2: fosfatidilinositol-(4,5)-bifosfato
PIP3: fosfatidilinositol-(3,4,5)-trifosfato PP: propéptido
PRR: región rica en residuos de prolina (proline rich region) PRRX1: Paired Related Homeobox 1
PS: péptido señal
PTEN: fosfatidilinositol-(3,4,5)-trifosfato 3-fosfatasa (phosphatase and tensin homolog) PyMT: antígeno tumoral medio del poliomavirus (polyoma middle tumor-antigen) RAF: serina/treonina proteína quinasa RAF
Ret: proto-oncogén ret RNA: ácido ribonucleico
RNA-seq: Secuenciación del RNA (RNA-sequencing) rpm: revoluciones por minuto
RT: transcripción reversa (reverse transcription) / temperatura ambiente (room temperature) RTK: receptor tirosín-quinasa
RT-qPCR: PCR cuantitativa en tiempo real Rv: secuencia en dirección 3’-5’ (reverse)
SCID: inmunodeficiencia combinada severa (severe combined immunodeficiency) scRNA-seq: secuenciación del RNA de célula única (single-cell RNA-sequencing) SDS: dodecilsulfato sódico
SDS-PAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida conteniendo dodecilsulfato sódico shRNA: horquilla corta de RNA (short hairpin RNA)
SNAIL1/2: represor transcripcional de la familia Snail 1/2 (snail family transcriptional repressor 1/2) SNPs: polimorfismos de un nucleótido (single nucleotide polymorphisms)
Sox10: factor de transcripción con caja SRY 10 (SRY-box transcription factor 10)
SRCR: dominio tipo scavenger rico en residuos cisteína (scavenger receptor cysteine-rich domain)
STAT3: transductor y activador de señal de la transcripción 3 (signal transducer and activator of transcription 3)
TAF10: factor 10 asociado a la proteína de unión a la caja TATA (TATA-box binding protein associated factor 10)
TBS: tampón salino tris
TCGA: atlas del genoma del cáncer (The Cancer Genome Atlas)
TGF-β: factor de crecimiento transformante β (transforming growth factor β) TNFα: factor de necrosis tumoral α (tumor necrosis factor α)
TTBS: tampón salino tris conteniendo tween
TWIST1/2: factor de transcripción de la familia bHLH 1/2 (twist family bHLH transcription factor 1/2) TYR: tirosinasa (tyrosinase)
TYRP1/2: proteína relacionada con la tirosinasa 1/2 (tyrosine-related protein 1/2) UV: radiación ultravioleta
WT: alelo/fenotipo silvestre (wild type allele/phenotype) XBP1: proteína de unión a la caja X 1 (X-box binding protein 1)
YUMM: melanoma murino de la Universidad de Yale (Yale University Mouse Melanoma)
ZEB1/2: factores de transcripción de unión a cajas E de la familia ZEB (zinc finger E-box binding homeobox 1/2)
INTRODUCCIÓN
Introducción 1. Melanoma
1.1 Origen y epidemiología
El melanoma es un tumor originado en los melanocitos, células de origen neuroectodérmico productoras de melanina. Los melanocitos son células dendríticas pigmentadas que en adultos residen en la piel, oído interno, úvea ocular o folículos pilosos, generalmente en la capa basal de la epidermis. Según su localización dan lugar a los principales tipos de melanoma: cutáneo (piel), uveal (ojo), acral (palmas de manos, plantas de pies o debajo de las uñas) y mucoso (boca, nariz) (Schadendorf et al., 2015).
El melanoma cutáneo es un tipo de cáncer de piel poco común (menos del 10% de los tumores de piel) y, sin embargo, es la neoplasia de piel más letal, causando el 75% de las muertes asociadas a este tipo de tumores (Carr et al., 2020). La incidencia del melanoma varía entre poblaciones de diferente etnia y localización geográfica, además de con la edad y el sexo. Aunque los adultos hombres mayores de 75 años son los que tienen mayor riesgo, el melanoma cutáneo es el cáncer más común en adultos jóvenes de 25 a 29 años y el segundo cáncer más común en personas de 15 a 29 años (NIH, 2022a). La incidencia ha aumentado entre un 4% y un 6% en muchas poblaciones de piel clara que predominan en regiones como América del Norte, el norte de Europa, Australia y Nueva Zelanda. Así, los valores más altos los encontramos en Australia o Nueva Zelanda con 35 casos por cada 100.000 individuos (Carr et al., 2020; Matthews et al., 2017). Esto demuestra que la exposición solar, en concreto la radiación ultravioleta (UV), es uno de los factores de riesgo más claros para padecer melanoma cutáneo, por lo que limitar la exposición a la radiación UV es la única medida preventiva para evitar su desarrollo. El melanoma es el cáncer con mayor tasa de mutaciones por megabase (Alexandrov et al., 2013). El análisis de la secuenciación masiva de muestras de pacientes de melanoma ha mostrado evidencias de una contribución muy importante de la luz UV, responsable de una firma genética asociada a este tipo tumoral (Hodis et al., 2012; Lawrence et al., 2013). Otra característica asociada al melanoma, debido entre otros factores a esta alta tasa de mutaciones, es su elevada heterogeneidad tumoral. Es decir, la coexistencia en el mismo tumor de poblaciones con diferentes fenotipos y perfiles de expresión génica (revisado en (Grzywa et al., 2017)).
El melanoma cutáneo se inicia como una lesión local que afecta a la epidermis y crece de manera radial o en profundidad, pudiendo invadir tejido subcutáneo y diseminarse localmente a través de los ganglios linfáticos y/o por rutas hematógenas a sitios distantes. El melanoma es
capaz de generar metástasis en cualquier órgano, siendo pulmón e hígado los más frecuentes (Miller & Mihm, 2006).
Durante el diagnóstico clínico, las lesiones de melanoma cutáneo se estratifican dependiendo de si el tumor se ha propagado a los ganglios linfáticos locales o a sitios distantes.
Las terapias y el pronóstico del paciente varían en función del estadio al diagnóstico. Así, según datos de pacientes de Estados Unidos, si el melanoma se diagnostica como localizado, la supervivencia a 5 años es del 99,5%, mientras que si es regional (diseminación a ganglios linfáticos), la supervivencia disminuye al 70,6% y, si la diseminación metastática es a distancia, la supervivencia a 5 años es de tan solo el 31,9% (NIH, 2022b). El tratamiento estándar del melanoma es la resección del tumor y de los ganglios linfáticos según su afectación por la diseminación del tumor primario. En el caso del melanoma metastático, el tratamiento convencional ha consistido fundamentalmente en la administración de quimioterapia (dacarbacina, temozolomida, fotemustina) (Luke & Schwartz, 2013). Recientemente se han introducido terapias dirigidas para el tratamiento del melanoma cutáneo, que consisten en el uso de inhibidores de BRAF (vemurafenib, dabrafenib) y de MEK (trametinib, cobimetinib) (Figura 1).
Tratamientos combinados con estos inhibidores han dado buenos resultados en el 70% de los pacientes con la mutación BRAFV600E. Sin embargo, la mayoría de ellos generan mecanismos de resistencia al tratamiento (Merlino et al., 2016; Schadendorf et al., 2015). En la actualidad, el uso de inhibidores de puntos de control del sistema inmune (CTLA-4, PD-1/PD-L1), la denominada inmunoterapia, ha revolucionado el tratamiento del melanoma cutáneo avanzado, lo que ha contribuido a un incremento notable en la supervivencia de los pacientes (Newell et al., 2022;
Queirolo et al., 2019; Yun et al., 2016).
1.2 Biología del melanoma
Para la generación de un melanoma es necesaria la transformación de los melanocitos mediante una serie de eventos genéticos. Los melanocitos pueden agregarse y formar un nevus o lunar; por ello, en el modelo clásico de progresión del melanoma de Clark, se propone que el melanoma cutáneo se genera a partir de un nevus (Clark et al., 1984; Miller & Mihm, 2006). Sin embargo, en la mayoría de los casos no hay evidencia de un nevus preexistente (Crucioli & Stilwell, 1982; Sagebiel, 1993; Shain & Bastian, 2016), lo que indica que la progresión del melanoma es más compleja y menos lineal.
La melanomagénesis se basa fundamentalmente en la hiperactivación de vías de señalización promotoras de supervivencia y proliferación; en concreto, la vía de las proteínas
en la inactivación de vías de control negativo del ciclo celular, como las reguladas por p14ARF y p16INK4A y p53 (Figura 1) (revisado en (Griewank et al., 2014)). El locus CDKN2A codifica dos proteínas moduladoras del ciclo celular (p14ARF y p16INK4A) reguladas por dos promotores independientes (Chin et al., 1998). p16INK4A impide la fosforilación de la proteína del retinoblastoma (RB) mediada por CDK4 o CDK6 (quinasas dependientes de ciclinas 4 o 6, respectivamente), mientras que p14ARF previene la ubiquitinación y degradación de p53 mediada por la E3 ubiquitina ligasa MDM2 (Chin et al., 1998). Por otro lado, las vías de MAPK y PI3K son activadas por la pérdida de función de neurofibromina 1 (NF1), proteína inhibidora de la señalización mediada por NRAS.
Distintos miembros de la vía de señalización de MAPK presentan mutaciones en melanoma cutáneo. La mutación más frecuente es la mutación BRAFV600E que se presenta en un 50% de los casos y que activa al proto-oncogén BRAF constitutivamente. Un 15-20% de los pacientes presentan las mutaciones NRASQ61L o NRASQ61R, siendo excluyentes entre sí las mutaciones activadoras en BRAF y NRAS (Jakob et al., 2012). Un 10-20% de los melanomas mucosos y acrales, que representan menos del 1% del total de melanomas, tienen mutaciones en el receptor c-KIT (KITV559A), activador de las vías MAPK/PI3K (Griewank et al., 2014). Por último, se han descrito mutaciones en efectores de la señalización mediada por receptores acoplados a proteínas G, como GNAQ/GNA11Q209L (codifican las proteínas G Gαq y Gα11, respectivamente) en el 85% de los melanomas uveales (Van Raamsdonk et al., 2010).
Las mutaciones en genes de la vía de MAPK permiten la señalización independiente de la unión de factores de crecimiento, de manera que la vía se encuentra activa de forma constitutiva (Figura 1). Por ejemplo, la mutación BRAFV600E permite la señalización de BRAF como monómero, frente a la forma salvaje que actúa como dímero y es dependiente de activación por RAS (Lito et al., 2012). La mutación BRAFV600E se detecta habitualmente en los lunares (>80% de los nevi) y es considerada un evento somático temprano (Kumar et al., 2004). La mutación BRAFV600E en melanoblastos es letal durante el desarrollo embrionario (Dhomen et al., 2010) y, expresada en piel adulta, provoca lesiones melanocíticas benignas en las que se detecta senescencia (Bosenberg et al., 2006; Goel et al., 2009), lo que sugiere que son necesarias mutaciones secundarias adicionales para dar lugar a la transformación maligna de los melanocitos.
Otra vía frecuentemente activada en melanoma cutáneo es la vía PI3K/AKT/mTOR, que promueve supervivencia y proliferación, y cuyo principal modulador negativo es la proteína fosfatidilinositol-(3,4,5)-trifosfato 3-fosfatasa (PTEN) (Figura 1). La combinación de la mutación en BRAF con mutaciones o deleciones en PTEN se observa en un 40% de los melanomas humanos
(Dankort et al., 2009; Hodis et al., 2012; Tsao et al., 2004), mientras que la combinación de mutaciones en NRAS y PTEN es menos frecuente (en torno al 4%) (Hodis et al., 2012). Otras mutaciones en melanoma se han detectado en PI3KCA (subunidad catalítica α de PI3K, presente en el 2-6% de los melanomas), AKT1 (1-2%), AKT3 (1-2%), así como en mTOR (3%) y otros miembros de esta vía de señalización (Shull et al., 2012).
Figura 1. Vías de señalización celular en los melanocitos y contribución de sus modificaciones a la tumorogénesis. (A) Las vías de señalización de MAPK y PI3K-AKT en melanocitos promueven la proliferación celular de forma controlada mediante la regulación por p14/p16 y p53. Los reguladores negativos se indican delineados en rojo. (B) La hiperactivación de las vías de MAPK y PI3K-AKT debido a la combinación de diversas alteraciones génicas, promueven la transformación maligna. La ausencia o la mutación inactivante de reguladores negativos se indican delineados con líneas discontinuas. CDK: ciclina dependiente de quinasa; MDM2: E3 ubiquitin-proteína ligasa MDM2; MEK: MAP/ERK quinasa; P: grupo fosfato; p14ARF y p16INK4A: variantes de splicing codificadas por el gen inhibidor de quinasas dependientes de ciclina 2A (CDKN2A); PDK1: proteína quinasa dependiente de 3-fosfoinositido 1; PIP2: fosfatidilinositol- (4,5)-bifosfato; PIP3: fosfatidilinositol-(3,4,5)-trifosfato; PTEN: fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato 3-fosfatasa;
RB: proteína asociada a retinoblastoma: RAF: serina/treonina proteína quinasa RAF; RAS: GTPasa RAS.
Modificado a partir de (Schadendorf et al., 2015).
Por otra parte, se han descrito mutaciones germinales en el locus CDKN2A que se corresponden con un mayor riesgo de padecer melanoma familiar (aproximadamente un 5-10%
de los casos de melanoma) (Goldstein et al., 2006). Además, el locus CDKN2A se encuentra delecionado (total o parcialmente) o mutado en el 44% de los melanomas cutáneos (TCGA) (The Cancer Genome Atlas Network, 2015). Mutaciones en CDK4, también asociadas a melanoma familiar, impiden su inactivación por p16INK4 (Sheppard & McArthur, 2013; Zuo et al., 1996).
Finalmente, el gen TP53 también se encuentra mutado en melanomas con CDKN2A silvestre, lo cual sugiere que la frecuente alteración del locus CDKN2A en melanoma disminuye la presión
genética para mutar TP53 (Hodis et al., 2012) (Figura 1). Otros eventos que contribuyen a la formación y progresión del melanoma son la inactivación de vías de apoptosis, las alteraciones en el tráfico vesicular y la desregulación del proceso de transición epitelio mesénquima (EMT, epithelial to mesenchymal transition) (Bennett, 2008) o de la plasticidad fenotípica (Rambow et al., 2019).
1.3 Modelos genéticos murinos de melanoma
El desarrollo de modelos genéticos ha resultado muy útil para describir las funciones de diferentes oncogenes y genes supresores de tumores en la etiología del melanoma, además de servir como modelos preclínicos (revisado en (Patton et al., 2021; Pérez-Guijarro et al., 2017)).
Estos modelos, en su mayoría condicionales y algunos inducibles, están basados en modificaciones genéticas dirigidas a la expresión de versiones activadas de oncogenes, en ocasiones junto a la deleción de uno o más genes supresores (Tabla 1), y se pueden combinar o no con carcinógenos químicos y ambientales. Los distintos modelos murinos difieren según el gen manipulado para inducir o incrementar la melanomagénesis: Cdkn2a, Ras, Braf, Pten, Hgf/Sf, Cdk4, Ret y Gnaq (Pérez-Guijarro et al., 2017). Los modelos de melanoma con modificaciones genéticas en Braf y/o Pten, junto a alteraciones en otros genes, se resumen en la Tabla 1. El período de latencia hasta desarrollar el melanoma primario, la penetrancia y las características específicas como la diseminación metastática varían en función de la combinación de la/s modificación/es génica/s (Tabla 1).
Tabla 1. Modelos murinos de melanoma cutáneo con modificaciones genéticas en Braf y/o Pten
Modificación genética Promotor (1)
Latencia (semanas)
Penetrancia (%)
Metástasis
(2) Referencia
BrafV600E; Ink4a/Arf-/-
BrafV600E; p53-/- Tyr ≈14
≈21
≈95
≈80
No Sí (G, P)
(Goel et al., 2009)
BrafV600E; p16ink4a-/- Tyr::CreERT2 28 80 No (Dhomen et al.,
2009) BrafV600E; Cdkn2alox/lox
BrafV600E; Cdkn2alox/lox; Lkb1lox/lox
Tyr::CreERT2 14
9 100 Sí (G)
Sí (G, H, B)
(Damsky et al., 2015) Cdkn2alox/lox; Ptenlox/lox
Tyr::CreERT2 36 100 No (Held et al.,
2010) BrafV600E
BrafV600E; Trp53R172H Tyr::CreERT2 21
14 100 No (Viros et al.,
2014)
BrafV600E; Ptenlox/lox Tyr::CreERT2 5 100 Sí (G, P) /
Sí (G)
(Dankort et al., 2009) / (Hooijkaas et al.,
2012) BrafV600E; Ptenlox/lox,
Bcat-STA Tyr::CreERT2 3 100 Sí (G, P, I,
B)
(Damsky et al., 2011)
(1) Tyr: promotor del gen Tirosinasa (expresión restringida a melanocitos); Tyr::CreERT2: recombinasa Cre inducible por 4-HT bajo el control del promotor de Tirosinasa; (2) Metástasis: G (ganglios linfáticos), P (pulmón), H (hígado), B (bazo), I (intestino). Lkb1: quinasa hepática b1. Bcat-STA: Beta catenina estabilizada.
El modelo de melanoma elegido en nuestro grupo para la generación de un modelo con deleción condicional de Loxl3 fue el generado por Dankort y colaboradores, basado en la activación de Braf (BrafV600E) y la deleción de Pten (Ptenlox/lox) de forma condicional e inducible (señalado en negrita en la Tabla 1; (Dankort et al., 2009)). Los ratones de este modelo (Tyr::CreERT2; BrafV600E/+; Ptenlox/lox) presentan las modificaciones genéticas de forma inducible, de manera que la administración tópica de 4-hidroxitamoxifeno (4-HT) induce la activación de la recombinasa Cre expresada exclusivamente en melanocitos, lo que a su vez promueve los reordenamientos génicos que permiten la expresión del alelo BrafV600E y la deleción de Pten (ver Materiales y Métodos, Figura 4). Este modelo reproduce el desarrollo del melanoma cutáneo humano, generando lesiones primarias con una penetrancia del 100% en 4 o 5 semanas, que progresan a lo largo del tiempo, y presenta metástasis en nódulos linfáticos y órganos distantes (Dankort et al., 2009). La penetrancia total y la baja latencia características de este modelo, junto con su capacidad de generar metástasis a ganglios linfáticos y pulmón (Tabla 1), fue determinante para utilizarlo en nuestro grupo con el fin de estudiar la función de Loxl3 en el desarrollo del melanoma in vivo así como su implicación en la diseminación metastática (Bustos-Tauler, 2019;
Vázquez-Naharro et al., 2022).
1.4 Modelos celulares murinos de melanoma
El uso de modelos celulares ha sido clave para el estudio de la biología del melanoma.
Una de las primeras líneas establecidas y más utilizadas es la línea murina B16. Es una línea pigmentada y de rápido crecimiento que se derivó de un melanoma espontáneo aparecido en la oreja de un ratón de la cepa C57BL/6 (Harding & Passey, 1930) y se ha usado principalmente para el estudio de la tumorogénesis y la metástasis del melanoma, así como para evaluar la respuesta inmune tumoral (revisado en (Alvarez, 2002)). Esta línea tumoral fue mantenida por continuos pases in vivo por los laboratorios Jackson. En 1970 se cultivó por primera vez in vitro para marcarla radioactivamente y determinar, tras una inyección intravenosa en ratón, que su localización preferente es el pulmón (Fidler, 1970). Años más tarde, el mismo autor derivó 11 líneas (F1-F11) a partir de la línea B16, siendo una de ellas la denominada B16-F10 (utilizada en la presente tesis, Materiales y Métodos, sección 4.1), con una alta preferencia para metastatizar en el pulmón. En concreto, se generaron las 11 líneas tras 10 rondas consecutivas de inyecciones subcutáneas
tras la inyección de la línea previa (Fidler, 1973, 1975). Tras este estudio, se publicaron numerosos artículos derivando otras líneas con preferencia por otros órganos, a partir de la línea B16 para estudiar la metástasis del melanoma así como para evaluar la respuesta inmune tumoral (Alvarez, 2002).
Una de las principales limitaciones del modelo celular B16 (Cdkn2a-/-) (Melnikova et al., 2004) es que es difícilmente extrapolable a la complejidad genética del melanoma humano. Unos años más tarde, Meeth y colaboradores establecieron una serie de líneas celulares de melanoma a partir de tumores generados en modelos murinos que contenían alteraciones genéticas en alelos relevantes en la biología del melanoma humano (Braf, Pten, Cdkn2a, Nras) (Meeth et al., 2016). A estas líneas se las denominó líneas YUMM (Yale University Mouse Melanoma). Dado que las líneas YUMM derivan de ratones C57BL/6, el trasplante a estos animales inmunocompetentes permite estudiar el crecimiento tumoral en presencia de un sistema inmunitario funcional (Meeth et al., 2016). Una de las líneas derivadas de este estudio que se utiliza en la presente tesis es la línea Yumm 1.7 (ver Materiales y Métodos, sección 4.1).
2. Transición epitelio mesénquima en cáncer
El programa genético y molecular que permite a las células epiteliales adquirir propiedades mesenquimales se conoce como transición epitelio mesénquima (EMT). La EMT es un proceso esencial en etapas tempranas del desarrollo embrionario, y puede tener lugar en diversos contextos patológicos como la fibrosis y el cáncer, entre otros. Durante el desarrollo embrionario, la EMT permite a las células epiteliales dar lugar a los diferentes órganos y estructuras funcionales. Así, la EMT es un proceso crucial durante la morfogénesis, ya que, con excepción de una parte del sistema nervioso central y de la epidermis, todos los tejidos y órganos provienen de células que originalmente sufrieron al menos un proceso de EMT. Por otra parte, cuando las células migratorias mesenquimales llegan a su destino, sufren el proceso inverso conocido como transición mesénquima epitelio (MET, mesenchymal to epithelial transition), para después diferenciarse en los distintos tipos celulares (Nieto et al., 2016; Thiery et al., 2009).
Además, la EMT es un evento clave en patologías como el cáncer y la fibrosis en las que se activa de manera aberrante. Más del 80% de los tumores tienen un origen epitelial y se denominan carcinomas, teniendo la mayoría de ellos la capacidad de dar lugar a metástasis. Las metástasis son tumores secundarios originados tras la diseminación de células tumorales del tumor primario a otros órganos. Sin embargo, para que ocurra la colonización metastática, la EMT debe revertirse a través del proceso MET, permitiendo a las células tumorales recuperar su fenotipo epitelial en los órganos distantes (Ocaña et al., 2012; Tsai et al., 2012).
La EMT conlleva diferentes procesos celulares que comienzan con señales extracelulares inductoras, como las llevadas a cabo por los factores TGF-β (revisado en (Hao et al., 2019; Xu et al., 2009)). Las células inician un complejo programa de señalización que permite la activación de factores de transcripción asociados a la EMT (EMT-TFs) (revisado en (De Craene & Berx, 2013;
Peinado et al., 2007; Stemmler et al., 2019)). Alguno de estos EMT-TFs son SNAI1/2, ZEB1/2, TWIST1/2 y PRRX1, cuya activación permite la pérdida de propiedades epiteliales, entre otros motivos por la pérdida de expresión de proteínas de uniones adherentes y estrechas (E- cadherina, claudinas, ocludinas), la ganancia de propiedades mesenquimales, la expresión de proteínas que modifican el citoesqueleto celular, así como la producción de componentes de la matriz extracelular (vimentina, fibronectina, colágeno). Esta plasticidad celular es necesaria para el establecimiento de las macrometástasis (revisado en (Acloque et al., 2009; Bakir et al., 2020;
Nieto & Cano, 2012; Peinado et al., 2007; Thiery et al., 2009)).
Aunque el término EMT implica transiciones entre dos estados fenotípicos, en los últimos años se ha propuesto que el proceso de EMT es más complejo que un simple proceso binario, ya que podría ocurrir a través de estados intermedios. En diferentes carcinomas se han identificado una variedad de subpoblaciones tumorales que exhiben características tanto epiteliales (E) como mesenquimales (M) (Aiello et al., 2018; Pastushenko et al., 2018; Puram et al., 2017; Sarrió et al., 2008). Es decir, presentan un fenotipo híbrido E/M en un proceso conocido como EMT parcial.
Se cree que esta EMT parcial favorece la invasión, la troncalidad celular (stemness), la metástasis y la resistencia a terapias (revisado en (Gupta et al., 2019; Jolly et al., 2019; Pastushenko &
Blanpain, 2019; Santamaría et al., 2019)). Estos cambios fenotípicos están además regulados por componentes de la matriz extracelular, exosomas y factores solubles, que regulan a los diferentes EMT-TFs (revisado en (Saitoh, 2018)).
2.1 Papel de los EMT-TFs Snail1 y Prrx1 en cáncer
Los genes SNAI codifican factores de transcripción conservados en la evolución (Manzanares et al., 2001). La familia Snail está formada en vertebrados por tres miembros: Snail1 (Snail), Snail2 (Slug) y Snail3 (Smuc) (Nieto, 2002). La EMT inducida por Snail1 contribuye a la formación de numerosos tejidos durante el desarrollo embrionario (revisado en (Barrallo-Gimeno
& Nieto, 2005)). Snail1 y Snail2 reprimen la expresión de muchas proteínas dianas asociadas con la EMT, teniendo un papel esencial en este proceso. La más importante es E-cadherina (Batlle et al., 2000; Bolós et al., 2003; Cano et al., 2000; Hajra et al., 2002). En numerosos contextos tumorales humanos, la expresión de SNAIL1 está asociada a un fenotipo maligno y a un mal pronóstico, especialmente en cáncer de mama (Barrallo-Gimeno & Nieto, 2005; Blanco et al.,
Snail1 controla numerosos procesos celulares, fundamentalmente regulando la transcripción génica, estando a su vez su expresión regulada por diversas rutas de señalización (Barrallo-Gimeno & Nieto, 2005; De Craene & Berx, 2013; Peinado et al., 2007). De manera específica, la expresión de Snail1 induce la migración e invasión en múltiples modelos celulares.
Por ejemplo, estudios previos de nuestro laboratorio, determinaron que, tras el silenciamiento de Snail1 las células tumorales ven suprimidas sus capacidades invasivas y de crecimiento tumoral (Olmeda et al., 2007a). Además, en líneas humanas de mama y melanoma se ha visto que la expresión de Snail1 es necesaria para la migración e invasión celular y la metástasis (Olmeda et al., 2007b; Wu et al., 2009), así como en otros contextos tumorales (revisado en (Kaufhold &
Bonavida, 2014). Por otra parte, la expresión de Snail1 podría conferir resistencia a la muerte celular provocada por diversos factores y agentes quimioterapéuticos (Kajita et al., 2004; Vega et al., 2004).
También se ha descrito en cáncer de mama el papel de Snail1 para mantener las propiedades de troncalidad celular y en la adquisición de propiedades tumorogénicas en cáncer de mama tanto in vitro de manera similar a Twist1 (Mani et al., 2008; Morel et al., 2008) como in vivo (Ni et al., 2016; Ye et al., 2015). La contribución de SNAIL1 a la troncalidad se ha determinado también en otros tipos tumorales (Hojo et al., 2018; Hwang et al., 2011). Por otra parte, Snail1 participaría en la regulación del sistema inmune. En el contexto del melanoma, se ha descrito que el proceso de EMT inducido por Snail1 facilita la metástasis, no solo mediante un aumento de las capacidades invasivas, sino también induciendo diversos mecanismos de inmunosupresión e inmunorresistencia (Kudo-Saito et al., 2009). Esta función de Snail1 en la metástasis y en la evasión del sistema inmune se ha descrito asimismo para otros contextos tumorales (revisado en (Tang et al., 2021)).
PRRX1 (Paired-related homeobox 1) es un factor de transcripción estrechamente relacionado con la tumorogénesis mediante su función en la regulación de la EMT (revisado en (Du et al., 2021)). El gen PRRX1 da lugar a dos isoformas muy conservadas: PRRX1A (245 aa) y PRRX1B (217 aa) (Kern et al., 1992, 1994). En 2012, Ocaña y colaboradores propusieron, por primera vez, la función de PRRX1 como un inductor de la EMT en modelos celulares de carcinoma de mama. Sin embargo, en muestras de carcinoma de mama humano su expresión se asoció con un buen pronóstico y con enfermedad libre de metástasis ya que, junto con TWIST1, induce un fenotipo mesenquimal (Ocaña et al., 2012). Esta aparente discrepancia no es tal, ya que la expresión de ambos genes es reprimida para que células tumorales de mama sean capaces de colonizar los pulmones, permitiendo que tenga lugar el proceso de MET. Además, la expresión de PRRX1 en células de carcinoma de mama se acompañaba de una pérdida de las propiedades de
troncalidad (Ocaña et al., 2012). Posteriormente, se publicó que PRRX1 está involucrado en la metástasis del cáncer colorrectal, donde su expresión está asociada a mal pronóstico (Takahashi et al., 2013). En modelos murinos se ha descrito que Prrx1, mediante la activación de Sox9, participa en la regeneración y carcinogénesis pancreática (Reichert et al., 2013). Por otra parte, mediante la activación de la vía de NOTCH, se ha asociado a PRRX1 con propiedades de invasión de células de glioblastoma (Sugiyama et al., 2015).
Estudios más recientes indican que PRRX1 está implicado en la tumorogénesis en numerosos contextos tumorales, siendo esta relación en ocasiones específica de isoforma. Así, en muestras humanas de cáncer gástrico niveles altos de PRRX1 se han correlacionado de manera positiva con marcadores de metástasis y EMT (Guo et al., 2015; Yao et al., 2021). Además, PRRX1B induce la EMT a través de la vía Wnt/β-catenina, permitiendo la invasión y la metástasis en cáncer de mama triple negativo (Lv et al., 2016). Por otra parte, en cáncer de páncreas, PRRX1 regula la respuesta al daño en el DNA cooperando con FOXM1 (Marchand et al., 2019). Recientemente, se ha demostrado la implicación de PRRX1A en la regulación de la troncalidad y metástasis en cáncer de pulmón de células no pequeñas (Sun et al., 2020). En este mismo contexto y mediante análisis de muestras tumorales, se han correlacionado niveles bajos de expresión de PRRX1 junto con niveles altos de ZEB1 con la EMT y la angiogénesis (Yang et al., 2021). Cabe destacar que estas diferencias entre los modelos estudiados asociando a PRRX1 un papel pro o anti- tumoral/metastático podrían deberse a que PRRX1 lleva a cabo funciones dependientes del contexto tumoral y/o del microambiente.
Existen muy pocos estudios acerca de la posible función de PRRX1 en melanoma.
Recientemente se ha descrito su regulación en melanoma cutáneo mediante el microRNA miR- 485-5p, lo que tiene consecuencias sobre la EMT, afectando a la viabilidad celular, migración e invasión, y promoviendo la apoptosis (Wu & Bao, 2021). Además, en melanoma uveal, se ha descrito que PRRX1 facilita la progresión tumoral favoreciendo la EMT, sirviendo su expresión como marcador de mal pronóstico (Meng et al., 2022).
3. Plasticidad fenotípica en melanoma
En melanoma, a diferencia de otros tumores, se han identificado marcadores génicos y/o proteicos asociados a diferentes estados fenotípicos celulares, lo que ha proporcionado información sobre los mecanismos moleculares subyacentes al estado fenotípico. Estos cambios están influenciados por el microambiente y por mecanismos intrínsecos a la célula tumoral, y se
al., 2019)). Cabe destacar que, aunque en ocasiones se ha utilizado el término EMT, es inapropiado para el caso del melanoma, ya que los melanocitos no son células epiteliales y por tanto el fenotipo invasivo desdiferenciado no se debe estrictamente a una transición fenotípica de epitelio a mesénquima (revisado en (Li et al., 2015)). Estos estados fenotípicos intermedios en melanoma podrían reflejar la transición de las células tumorales entre diferentes estados, o representar una situación en la cual las células podrían mantenerse antes de adquirir un estado u otro dependiendo, por ejemplo, de la influencia del microambiente (Rambow et al., 2019).
El término “cambio de fenotipo” (phenotype switching), introducido por primera vez por Keith S. Hoek (Hoek et al., 2008), está siendo cada vez más utilizado en melanoma para describir las transiciones entre estados fenotípicos (Hoek & Goding, 2010; Kemper et al., 2014). Este
“cambio de fenotipo” sería el responsable de la heterogeneidad asociada al melanoma. En lugar de implicar un cambio direccional entre dos estados previamente definidos (por ejemplo, de epitelial a mesenquimal), el “cambio de fenotipo” es un término neutro que puede ser utilizado para describir transiciones entre cualquier estado fenotípico sin ninguna preconcepción respecto a la influencia de los cambios en las propiedades biológicas de las células (Rambow et al., 2019).
Aunque la diversidad fenotípica y la plasticidad en las líneas celulares de melanoma murino fueron descritas hace más de 30 años (Bennett, 1983; Fidler, 1975), la caracterización molecular de los estados fenotípicos fue redefinida por primera vez a partir de la clonación del gen MITF que codifica el factor de transcripción asociado a la microftalmia (Hodgkinson et al., 1993; Hughes et al., 1994). En concreto, en estos estudios se definieron los estados fenotípicos específicos impuestos por las señales del microambiente.
3.1 MITF y el cambio de fenotipo en melanoma
En un principio, se describió que la inactivación del gen MITF ocasionaba defectos en la pigmentación, entre otros, durante el desarrollo embrionario (Hodgkinson et al., 1993; Hughes et al., 1994). Sin embargo, la isoforma MITF-M (denominada en este trabajo MITF) fue posteriormente identificada como un regulador de la expresión de genes implicados en la síntesis de melanina (revisado en (Cheli et al., 2010; Goding, 2000)), la función principal de los melanocitos asociada a la diferenciación melanocítica. De manera específica, MITF regula la expresión de las tres enzimas principales de la pigmentación: Tirosinasa, Tyrp1 y Dct (Tyrp2), así como otros factores de la pigmentación (revisado en (Widlund & Fisher, 2003)). El papel de MITF en los melanocitos y en melanoma incluye la regulación de genes implicados en diversos procesos biológicos más allá de la diferenciación, como la supervivencia (McGill et al., 2002), el control del ciclo celular (Carreira et al., 2006; Garraway et al., 2005; Widlund et al., 2002), la invasión
