TECNOLÓGICO DE MONTERREY
Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud
Programa Multicéntrico de Especialidades Médicas de la Secretaría de Salud
“Capacidad Predictiva de la PCR en saliva para diagnóstico de infección por Mycoplasma pneumoniae en Población Pediátrica: Estudio Prospectivo”
Tesis que para obtener el grado de:
Especialista en Pediatría
Presenta:
Dra. María Guadalupe García Lima
Director de Tesis: Codirector de tesis:
Dra. Julieta Rodríguez de Ita Dr. Jesús Santos Guzmán
Monterrey, Nuevo León, México Octubre 2021
Dedicatoria
A mis padres, mi principal motor, ya que sin ellos, nada de esto sería posible.
A mis hermanos, por siempre apoyarme sin importar las circunstancias.
Y finalmente, a mis compañeros residentes, con quienes compartí muchos aprendizajes y experiencias durante estos 4 años de aventura.
Agradecimientos
Agradezco al equipo de Investigación y Enfoque Estratégico de Bioingeniería, en especial a Alejandro Robles Zamora, quien me enseñó pacientemente los pasos a seguir en el laboratorio y estuvo disponible en todo momento. A las químicas de los distintos hospitales, que me apoyaron con mis dudas y el resguardo de las muestras.
A mis asesores, la Dra. Julieta Rodríguez y el Dr. Jesús Santos, por su apoyo durante este trabajo. A Bárbara Rivera, quien inició este proyecto hace 3 años y quien me ha guiado durante el mismo. A Andrés Martínez, por su apoyo con la toma de muestras en su pasantía.
Finalmente, agradezco a mis maestros, por su tiempo, sus enseñanzas y a todas las personas con las que compartí estos 4 años y que de alguna u otra manera me ayudaron a llegar a este lugar.
Glosario
Abreviatura Explicación
OMS Organización Mundial de la Salud
GAPP Global Action Plan for Prevention and Control of Pneumonia
UNICEF Fondo de las Naciones unidas para la Infancia
M. pneumoniae Mycoplasma pneumoniae
PCR Reacción en cadena de la polimerasa
ADN Ácido desoxirribonucleico
FC Fijación del Complemento
FDA Food and Drug Administration
TEF Días de tos, edad y fiebre
SARS-CoV-2 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2
LNA Locked nucleic acid
Contenido
Tabla de contenido
Dedicatoria 3
Agradecimientos 4
Glosario 5
Contenido 7
Resumen 9
Capítulo 1. Planteamiento del Problema 10
1.1 Antecedentes 10
1.1.2. Definición 10
1.1.3. Epidemiología 11
1.1.4. Etiología 12
1.1.5. Mycoplasma pneumoniae 13
Tabla 1. Métodos diagnósticos más utilizados 16
1.2 Planteamiento del Problema 19
1.3 Justificación 21
1.4 Objetivos de la Investigación 22
Objetivo Principal: 22
Objetivos Secundarios: 22
1.5 Hipótesis 22
Hipótesis Nula 22
Hipótesis Alterna 22
Capítulo 2. Marco Teórico 23
Capítulo 3. Metodología 35
Diseño del estudio 35
Descripción del estudio 35
Fundamentos para el diseño del estudio 35
Fundamentos para la población de pacientes 36
Materiales y métodos 37
Criterios de inclusión y exclusión 37
Criterios de Inclusión: 37
Criterios de Exclusión: 37
Criterios de Suspensión: 37
Evaluaciones del Estudio 38
Formas de consentimiento informado y registro de selección: 38
Historia clínica y datos demográficos: 38
Exploración física: 38
Estudios de laboratorio y gabinete: 39
Metodología de la investigación 39
Procedimiento en Laboratorio: 40
Variables 42
Tabla 2. Variables 44
Técnicas de Análisis Estadístico 45
Programas a utilizar para análisis de datos 46
Capítulo 4. Resultados 47
Tabla 3. Características basales de los pacientes. 47
Tabla 4. Antecedentes personales patológicos de los pacientes. 48 Tabla 5. Características de la evolución y estudios de laboratorio. 49
Tabla 6. Cuadro clínico de los pacientes. 50
Tabla 7. Comparación de las características clínicas con el resultado del panel respiratorio 52 Tabla 8. Cuadro clínico por tipo de patógeno identificado en el panel respiratorio. 54
Tabla 9. Tabla tetracórica de resultados de PCR 56
Tabla 10. Rendimiento diagnóstico de la PCR de saliva. 57
Capítulo 5. Análisis y Discusión de Resultados 58
Gráfica 1. Patógenos detectados en el panel respiratorio 61 Gráfica 2. Número de patógenos codetectados en el panel respiratorio 62
Capítulo 6. Conclusión 66
Capítulo 7. Referencias 67
Resumen
Introducción y objetivos: La neumonía adquirida en la comunidad es un problema de salud pública, ya que se trata de las principales causas de mortalidad en niños menores de 5 años. El diagnóstico etiológico es esencial para optimizar el tratamiento y así también disminuir la resistencia a antibióticos. Las neumonías por Mycoplasma pneumoniae abarcan del 10-30% de las neumonías adquiridas en la comunidad. Este agente es muy difícil de diagnosticar, ya que no existe un estándar de oro. El objetivo principal fue comparar la capacidad predictiva de la PCR en saliva contra la PCR en exudado nasofaríngeo para el diagnóstico de Mycoplasma pneumoniae en la población pediátrica.
Metodología: Se trata de un estudio multicéntrico, replicativo, observacional, de prueba diagnóstica, transversal, analítico y prospectivo en el que se busca obtener el rendimiento de la PCR para M. pneumoniae en saliva, contra el estándar de oro que se eligió: la PCR en exudado nasofaríngeo. Estas pruebas fueron estandarizadas por el grupo de Biotecnología del Instituto Tecnológico de Monterrey.
Resultados: De los 200 pacientes analizados con PCR puntual, no se obtuvo ninguna PCR en saliva o en exudado nasofaríngeo positiva. Sin embargo, 79 de los 200 pacientes contaban con panel respiratorio (PCR en tiempo real) , de los cuales 4 fueron positivos para M. pneumoniae en exudado nasofaríngeo.
Conclusión: No se logró detectar M. Pneumoniae en ninguna de las muestras de saliva analizadas con PCR puntual a pesar de haberse detectado un 5% positivas por PCR en hisopado nasofaríngeo, mostrando un 0% sensibilidad y 0 % de especificidad. Esto probablemente debido a que la técnica que se utilizó para la PCR en saliva (PCR puntual) debería de modificarse a una PCR en tiempo real.
Capítulo 1. Planteamiento del Problema
1.1 Antecedentes
1.1.2. DefiniciónLa neumonía es una entidad clínica muy frecuente, que se puede definir considerando diferentes aspectos. Clínicamente, se define como una infección aguda del tracto respiratorio inferior que se asocia a fiebre, síntomas respiratorios y evidencia de afección del parénquima pulmonar. Esta afección se caracteriza por hallazgos que encontramos en la exploración física, o la presencia de infiltrados en estudios de gabinete.
Dentro de los estudios de gabinete, la radiografía de tórax continúa siendo la más utilizada.
En patología, se define como un proceso inflamatorio que involucra a los pulmones, la vía aérea, los alvéolos, el tejido conectivo, la pleura visceral y estructuras vasculares.
Radiológicamente, se define como el hallazgo de infiltrados en una radiografías de tórax de un paciente con síntomas de infección respiratoria (1).
En cuanto al ámbito de adquisición, se clasifica en neumonía adquirida en la comunidad o neumonía intrahospitalaria. La neumonía adquirida en la comunidad se refiere a una infección del parénquima pulmonar en un niño previamente sano, a diferencia de la neumonía intrahospitalaria o nosocomial, la cual se presenta en un paciente que presenta síntomas a las 48 horas de su ingreso hospitalario, en aquellos que presentan esta enfermedad en los primeros 7 días de su egreso hospitalario o en pacientes que viven en instituciones de cuidados crónicos. (1)
La “neumonía caminante” o atípica es un término que se utiliza para definir una infección que se presenta de manera no clásica, que puede cursar con fiebre, sintomatología respiratoria leve y ocasionalmente manifestaciones extrapulmonares, así como en pacientes de edad escolar y adolescentes con síntomas leves que no interfieren con su actividad normal. Típicamente se ha asociado este tipo de neumonía a Mycoplasma pneumoniae (1).
1.1.3. Epidemiología
Según la OMS (2019), la neumonía es la causante del 15% de las muertes en niños menores de 5 años (2) causando en el 2017 la muerte de 808, 694 niños en este rango de edad. Es la principal causa individual de mortalidad infantil de esta población.
Se ha visto que es más prevalente en países en desarrollo, ya que se asocia a diferentes factores de riesgo como desnutrición, prematurez, inmunosupresión, hacinamiento y tabaquismo pasivo o exposición a los humos de la combustión de biomasa.
En el año 2000, India, China, Indonesia, Nigeria y Bangladesh contribuyeron a más del 50% de los casos clínicos de neumonía en menores de 5 años a nivel mundial. (3)
En el 2018, se publicó en The Lancet un análisis sistemático que se realizó entre el año 2000 y 2015 abarcando el Período de los Objetivos de Desarrollo del Milenio, en donde se estimó la morbimortalidad y se identificaron los principales factores de riesgo asociados a neumonía en los niños menores a 5 años. Se estimó que la incidencia anual de neumonía en este grupo de edad en países en desarrollo disminuyó de 329 casos por mil niños en el año 2000 a 231 casos por mil niños en el 2015. Asimismo los casos disminuyeron de 178 millones en el año 2000 a 138 millones en el 2015, lo que corresponde a una disminución
del 30% en la incidencia y del 22% en el número anual de casos en este periodo analizado de 15 años. (3)
El objetivo del Plan de Acción Mundial para la Prevención y el Control de la Neumonía (GAPP) de la OMS y UNICEF es acelerar el control de la neumonía combinando diversas intervenciones de prevención y tratamiento de la enfermedad en los niños. En cuanto a la protección se incluyen la lactancia materna exclusiva, el lavado de manos, la reducción de la contaminación del aire en interiores, la vacunación, la prevención del VIH y la profilaxis en niños que viven con VIH. (2). Además de la prevención, debe asegurarse un tratamiento para todos los niños con esta enfermedad, el cual debe ser oportuno.
En México, los datos aportados por el INEGI en el 2013 (INEGI, 2013) revelan que en ese año las enfermedades respiratorias bajas ocuparon el tercer lugar como causa de muerte en menores de un año, la cuarta causa en menores de 5 años, la octava en menores de 14 años y la onceava causa en menores de 24 años. (4)
1.1.4. Etiología
Los diversos agentes infecciosos causantes de este padecimiento engloban virus, bacterias y hongos. Dentro de estos, las causas más frecuentes son las virales, siendo el principal agente etiológico el virus sincitial respiratorio. En cuanto a la etiología de neumonías bacterianas, el patógeno más común es Streptococcus pneumoniae, seguido de Haemophilus influenzae, Mycoplasma pneumoniae y Chlamydophila pneumoniae. (5)
Múltiples estudios han sido realizados para identificar a los patógenos que se han asociado más a esta patología. En más del 50% de los casos se han aislado agentes virales como los agentes etiológicos causales. Se ha encontrado también, que en más del 50% de los casos, las neumonías bacterianas se asocian a coinfecciones virales (6).
1.1.5. Mycoplasma pneumoniae
Mycoplasma pneumoniae es un patógeno exclusivamente humano y de distribución universal. Causa del 10 al 30% de las neumonías adquiridas en la comunidad, lo cual supone una frecuencia de 2/1000 personas por año y la tasa varía en función de la edad.
Las infecciones se producen sin variaciones estacionales importantes, pero se han descrito cada 3 a 7 años ciclos epidémicos que se relacionan con el otoño y primavera. Es una bacteria perteneciente a la familia Mycoplasmataceae de la clase Mollicutes caracterizada especialmente por carecer de pared celular. Fue aislada por primera vez de esputo en un paciente con neumonía atípica en 1944 (Eaton et al., 1944). Inicialmente se le llamo el Agente Eaton y desde su descubrimiento, se ha reconocido como una de las causas más importantes de infecciones del tracto respiratorio. Sin embargo, hasta 1960, se probó que no se trataba de un virus y se reconoció como el principal agente causal de las neumonías atípicas. Hace aproximadamente 50 años, en 1965, se describió un brote de este agente en un centro de cuidados pediátricos. Veinte años previos, se había ya identificado a este agente por Eaton y desde principios de 1960, se había asociado esta bacteria a infecciones del tracto respiratorio en niños y en adultos. Es importante resaltar que además de su capacidad para causar sintomatología respiratoria, se han encontrado también manifestaciones extrapulmonares (7).
M. pneumoniae es la bacteria más pequeña que existe. Sus células en forma de huso, miden aproximadamente 1-2 micrómetros de longitud y 0.1 a 0.2 micrómetros de diámetro, lo cual representa apenas el 5% de una bacteria típica (Escherichia coli). Las colonias rara vez exceden los 100 micrómetros de diámetro y requieren ser visualizadas en un microscopio estereoscópico. Su genoma consiste en 816,394 pares de bases, las cuales son aproximadamente 1/6 del genoma de Escherichia coli. Este genoma tan pequeño, aunado a sus cualidades biosintéticas limitadas, son responsables de lo complejo que resulta cultivar in vitro a este microorganismo. (7)
La falta de pared celular condiciona muchas de las características de M.
pneumoniae. Entre ellas, su polimorfismo, que no se tiñan con la tinción de Gram, su resistencia a los antibióticos betalactámicos y su elevada sensibilidad a las variaciones de pH, temperatura, tensión osmótica y detergentes. En la membrana celular se encuentran los principales determinantes antigénicos tanto proteínicos como glucolipídicos. La proteína P1 es una adhesina de especial importancia en la patogenia del microorganismo y también es la diana de los principales anticuerpos que produce la respuesta inmunitaria del hospedador. (8)
No se encuentra de forma libre en la naturaleza debido a su total dependencia de un huésped que suplemente los nutrientes esenciales. (9)
Dada la gran variabilidad de datos y la falta de estandarización de métodos diagnósticos, se sabe que sigue siendo un reto diagnóstico el papel que juega esta bacteria en las infecciones del tracto respiratorio (10) .
Patogenia e Inmunidad
M. pneumoniae es un patógeno extracelular que posee una capacidad para adherirse a las células del epitelio respiratorio, para lo cual desarrolló un organelo consistente en una estructura que acumula un conjunto de proteínas y adhesinas, especialmente la P1. Ésta es una proteína que se encarga de la adhesividad de la bacteria y cuya pérdida conlleva a la pérdida de la patogenicidad. Los principales efectos citopáticos que se observan, consisten en la pérdida de la actividad de los cilios y la respuesta inflamatoria, la cual consiste en la producción de un infiltrado inflamatorio peribronquial y perivascular. La respuesta inmune, se manifiesta por la producción de anticuerpos contra los antígenos proteínicos y glucolipídicos del microorganismo. En la primoinfección, la dinámica de producción de anticuerpos se inicia como un aumento en la IgM que se acompaña de IgG al cabo de dos semanas. (8)
Se ha descrito que es una causa significativa y tratable de infecciones en el tracto respiratorio de niños y adolescentes. Según múltiples estudios, es la responsable de hasta el 40% de neumonías adquiridas en la comunidad en niños mayores de 5 años, encontrando la incidencia más alta en pacientes de 5 a 9 años de edad (4 de 100 niños por año). (11)
Al momento de realizar este estudio, no existe un estándar de oro para el diagnóstico de M. pneumoniae. El diagnóstico serológico se basa en títulos de anticuerpos contra este agente en una ocasión o seriados tomados con dos a cuatro semanas de diferencia. Otros estudios de laboratorio incluyen cultivos y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La PCR de exudado nasofaríngeo es el método diagnóstico actual más rápido y más sensible. (11)
En la siguiente tabla, se mencionan brevemente los principales estudios diagnósticos que se utilizan en la actualidad (la PCR en exudado nasofaríngeo y la Prueba de Anticuerpos).
Tabla 1. Métodos diagnósticos más utilizados Sensibilidad y
especificidad Ventajas y Desventajas
PCR Exudado nasofaríngeo
Sensibilidad: 75-90%
Especificidad: de hasta el 100% en condiciones
ideales (19)
* Ventajas: Sólo requiere una toma de muestra.
Resultado rápido (hasta en 1 hora).
* Desventajas:
- Portadores asintomáticos del 0.1-13.5%. Posterior a infección, tarda un promedio de 50 días en disminuir la carga bacteriana.
- La obtención de la muestra es invasiva, así como dolorosa y difícil en pacientes pediátricos.
ELISA (prueba de anticuerpos)
Sensibilidad de valor único es de 31.8% (7)
2 valores seriados:
Sensibilidad: 88.6% (7) Especificidad: 85% (41)
*Ventajas: Facilidad de obtención de la muestra.
* Desventajas:
- IgM puede permanecer detectable meses después de la infección.
- Falsos negativos si es tomada en las primera semana de la infección.
- Requiere dos muestras separadas por 1-2 semanas para aumentar su sensibilidad.
Saliva PCR
No estandarizada. Se refiere en algunos estudios que es igual que la del exudado nasofaríngeo (20).
* Ventajas: Fácil obtención de la muestra, no invasiva e indolora.
*Desventajas: No ha sido estudiada lo suficiente.
Cuadro Clínico
Mycoplasma pneumoniae produce infecciones del aparato respiratorio, principalmente en forma de neumonía que, por sus peculiares características de presentación clinicorradiológica, se suele denominar neumonía atípica primaria. Tras un periodo de incubación de 2-3 semanas (6), los síntomas se presentan de manera gradual o insidiosa.
Principalmente consisten en fiebre, tos no productiva, cefalea y mialgias. A menudo se acompaña de faringitis, rinitis, otitis y traqueo-bronquitis. (8)
Se han intentado en diversas ocasiones, identificar signos y síntomas de pacientes con diagnóstico de Neumonía adquirida en la comunidad (NAC), como factores con valor estadístico significativo para diagnosticar NAC por M. pneumoniae, concluyendo que no es posible realizarlo. (11)
En la revisión publicada por Cochrane en el año 2012, se incluyeron 7 estudios con 1491 pacientes con diagnóstico de NAC, en donde la prevalencia de M. pneumoniae se reportaba en un rango entre 10-36%. (11)
Se incluyeron pacientes con serología positiva contra M. pneumoniae con o sin estudios diagnósticos complementarios. Posteriormente se evaluaron síntomas y signos clínicos como tos, sibilancias, congestión nasal, rinorrea, estornudos, crepitantes, fiebre, roncantes, disnea, dolor torácico, diarrea, mialgias y cefalea. Este conjunto de signos y síntomas, han sido reportados en algunas series de casos con diagnóstico confirmado de infección por M. pneumoniae en niños y adolescentes. Se evalúo de manera aislada el valor
diagnóstico de cada signo y síntoma en pacientes con diagnóstico confirmado por NAC por este agente. (11)
Concluyeron que no es posible hacer un diagnóstico confiable de neumonía adquirida en la comunidad por M. pneumoniae en niños y adolescentes basándonos en el cuadro clínico, a pesar de encontrar ciertos hallazgos interesantes. Encontraron que la ausencia de sibilancias es un indicador con significancia estadística que pudiera sugerir a M. pneumoniae como agente etiológico, pero no lo suficiente para iniciar tratamiento con macrólidos. Asimismo, datos de dos estudios sugirieron que la presencia de dolor torácico duplica las posibilidades de tratarse de NAC por M. pneumoniae; sin embargo se requieren más estudios para apoyar este resultado. Se concluyó en este metanálisis que se necesita hacer más investigación que respalde estos hallazgos. (11)
En cuanto a las manifestaciones extrapulmonares, esta bacteria puede presentar manifestaciones en casi todos los órganos, incluyendo a la piel, el sistema hematológico, cardiovascular, musculoesquelético y el sistema nervioso. Estas manifestaciones pueden ser causadas por efecto local directo tras la diseminación de la bacteria o por reacciones autoinmunes a la misma. Los órganos más frecuentemente afectados son la piel y el sistema nervioso. Las manifestaciones cutáneas ocurren en hasta el 25% de las infecciones por M.
pneumoniae, presentándose clínicamente como exantemas, eritema nodoso, urticaria, Síndrome de Stevens-Johnson y en raras ocasiones Mucositis asociada a Mycoplasma pneumoniae (MPAM) con una media de edad de 13.5 años. Con respecto a la afección neurológica, se ha asociado en hasta el 10% de los casos a encefalitis y en el 15% de los casos a Síndrome de Guillain-Barré. (12)
1.2 Planteamiento del Problema
Debido a la morbimortalidad de la neumonía en pacientes pediátricos, es importante optimizar los métodos diagnósticos, para de esta manera, dar tratamientos dirigidos y específicos para cada paciente. De los casos adquiridos en la comunidad, del 7 al 13% son graves; es decir, que requieren de hospitalización y pueden poner en riesgo la vida. Del estimado de 120 millones de casos anuales, 1.3 millones llevan a la muerte. La tasa de fatalidad es aproximadamente del 8.7%. La mayoría de los casos de mortalidad ocurre en los más pequeños, específicamente el 81% de las muertes ocurre en menores de dos años de edad. (13)
Dentro del abordaje para identificar a los patógenos causantes de la neumonía adquirida en la comunidad en pediatría, existen diferentes métodos, incluyendo cultivos, métodos moleculares como la PCR y pruebas serológicas. A pesar de todos los avances en los diferentes métodos diagnósticos disponibles, determinar el agente etiológico en los niños cursando con neumonía, sigue siendo un reto. Cuando se sospecha de NAC de etiología bacteriana, las guías actuales, generalmente recomiendan el uso de antibioticoterapia empírica cuando se desconoce el agente etiológico. Sin embargo, los cambios en la epidemiología, la emergencia de nuevos patógenos y el incremento en la resistencia de estos patógenos, destacan la importancia de identificar al agente causal. (14)
En cuanto a la etiología, se ha reportado que en el 10-30% de las neumonías adquiridas en la comunidad, se ha identificado a Mycoplasma pneumoniae, como el agente causal (15). El diagnóstico de esta bacteria es muy complejo y siempre ha sido un reto, ya que es muy difícil de aislar en cultivos. Asimismo, la serología, que ha sido usada como
estándar de oro por muchos años, debe de contar con una segunda toma de muestra de dos a cuatro semanas posteriores a la primera prueba para confirmar el diagnóstico, ya que de esta manera aumenta la sensibilidad de un 31.8% a un 88.6% (7). La amplificación genómica mediante PCR, ha proporcionado excelentes resultados, por su alta sensibilidad de hasta 90% (19). Sin embargo, el procedimiento del hisopado nasofaríngeo es un procedimiento invasivo, doloroso y difícil de obtener en pacientes pediátricos.
La PCR en saliva es un método que ha sido evaluado en la detección de múltiples virus, (sin tratarse del estándar de oro en ninguna patología). Sin duda, es una alternativa que vale la pena estudiar, ante los hisopados nasales o nasofaríngeos por tratarse de un fluido de fácil obtención, una toma de muestra menos dolorosa y que no requiere invadir a los pacientes.
Lo anterior, nos lleva a la siguiente pregunta de investigación:
¿La capacidad predictiva de la PCR en saliva es mayor que la capacidad predictiva de la PCR en moco en la búsqueda del diagnóstico de Mycoplasma pneumoniae?
1.3 Justificación
Un diagnóstico etiológico específico de las neumonías adquiridas en la comunidad es esencial para decidir la necesidad de antibiótico y elegir el antibiótico más dirigido a cada paciente. El diagnóstico etiológico de neumonía basado en el cuadro clínico es muy difícil, a pesar de que hay ciertos signos y síntomas o datos en la evolución del cuadro que nos pueden orientar más hacia ciertos patógenos, ya se ha demostrado que no es posible.
Esto da pie a la prescripción inapropiada de antibióticos y nos lleva a aumentar la resistencia de los mismos, así como a un tratamiento inadecuado para los pacientes.
En el caso específico de Mycoplasma pneumoniae, de acuerdo a la revisión que se realizó en la literatura, no existe ningún método que se use como estándar de oro.
Actualmente lo que se ha demostrado tiene mayor sensibilidad es la toma de exudado nasofaríngeo por PCR asociada a la toma de IgM para M. pneumoniae.
Esta muestra se obtiene por medio de hisopado de nasofaringe, lo cual es molesto, doloroso y difícil de obtener en los niños, así como tratarse de un procedimiento invasivo.
Por lo anterior, se pretende evaluar la efectividad de la PCR en saliva. El objetivo es demostrar que su sensibilidad es igual o mayor que la PCR en exudado nasofaríngeo. Sin duda, la toma de muestra de saliva es más sencilla, económica y un método no doloroso de obtención de muestra para PCR.
1.4 Objetivos de la Investigación
Objetivo Principal:
Determinar la capacidad predictiva de la prueba PCR en saliva para el diagnóstico de Mycoplasma pneumoniae en la población pediátrica.
Objetivos Secundarios:
Calcular la sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y valor predictivo negativo de la PCR en saliva para Mycoplasma pneumoniae.
1.5 Hipótesis
Hipótesis Nula
La capacidad predictiva de la PCR en saliva para diagnóstico de infección por M.
pneumoniae en población pediátrica no es mayor a la capacidad predictiva de la PCR en moco.
Hipótesis Alterna
La capacidad predictiva de la PCR en saliva para diagnóstico de infección por Mycoplasma pneumoniae en población pediátrica es mayor a la capacidad predictiva de la PCR en moco.
Capítulo 2. Marco Teórico
Existen diferentes métodos para tratar de aislar el agente etiológico causal de las neumonías adquiridas en la comunidad. Dentro de estos, se incluyen el diagnóstico sindromático por medio de signos y síntomas, los cultivos, las pruebas moleculares como la PCR (reacción en cadena de polimerasa) y las pruebas serológicas.
A pesar de todos los avances en los diferentes métodos diagnósticos disponibles, determinar el agente etiológico en los pacientes pediátricos cursando con neumonía, sigue siendo un reto.
Idealmente el diagnóstico etiológico, debe basarse en el aislamiento del patógeno causal. Sin embargo, la toma de muestras del tracto respiratorio inferior, muy frecuentemente es imposible, por lo que se toman muestras del tracto respiratorio superior (nasofaríngeas u orofaríngeas). Estas pueden ser difíciles de interpretar, porque en muchas ocasiones pueden tratarse de portadores asintomáticos. La nasofaringe se trata de un ambiente complejo y dinámico, ya que los microorganismos pueden ser los causantes de la neumonía o pueden ser colonizadores, dentro de los que se incluyen principalmente Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus y Moraxella catarrhalis. Los portadores asintomáticos pueden ser responsables de la transmisión de estos agentes. Klebsiella pneumoniae es una bacteria gram negativa que puede colonizar la nasofaringe, aunque es más común que colonice el tracto gastrointestinal. En niños, se ha encontrado en menor prevalencia que en adultos, en un rango de 1.4-7% y en adultos de un
20 a 32.5%. Sin embargo, si se aísla K. pneumoniae en un paciente pediátrico con síntomas, siempre se debe considerar como el patógeno causal del cuadro. (14)
De igual manera, en los paneles virales durante enfermedades respiratorias agudas, pueden tratarse de sólo espectadores inocentes sin tener un rol causal en el cuadro del paciente. La presencia de virus respiratorios como el Bocavirus (hBoV), Adenovirus (AdV), non-SARS human Coronavirus (hCoV), Enterovirus (EV) y Rhinovirus (RV) se ha documentado en el tracto respiratorio superior de niños sanos. Algunos virus respiratorios como el Coronavirus (hCoV), se pueden excretar por meses posteriores a la enfermedad (14)
Las secreciones del tracto respiratorio inferior son útiles en el diagnóstico; sin embargo, los pacientes pediátricos tienen dificultad para expectorar. Por lo anterior, para obtener estas muestras, se utilizan nebulizaciones hipertónicas, seguidas de percusión torácica para movilizarlas. El análisis microbiológico del esputo, por medio de cultivos, tinción de gram y reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es útil sobre todo en los cultivos negativos, lo cual nos demuestra el rol tan importante de los métodos moleculares hoy en día como complemento diagnóstico. Los resultados deben interpretarse siempre de manera individualizada, ya que en niños que se encuentra inmunosuprimidos, se deben buscar otros patógenos causales como Pneumocystis jirovecii y citomegalovirus (CMV).
Las guías actuales, generalmente recomiendan el uso de antibioticoterapia empírica cuando se desconoce el agente etiológico y se sospecha de un cuadro de etiología bacteriana, aunque se sabe que la mayoría de los casos son de etiología viral. Sin embargo,
cambios en epidemiología, la emergencia de nuevos patógenos y el incremento en la resistencia de estos patógenos, destacan la importancia de identificar al agente causal. (14)
Como ya se mencionó en el capítulo previo, el Mycoplasma pneumoniae es una causa significativa de neumonía adquirida en la comunidad en niños y adolescentes.
Realizar el diagnóstico de NAC causada por Mycoplasma pneumoniae, continúa siendo un reto por la naturaleza del patógeno, la seropositividad meses posteriores a la infección y la posibilidad de ser un portador asintomático. El tratamiento con macrólidos es el recomendado actualmente para tratar estas infecciones, basándonos en los síntomas característicos. Sin embargo, recientemente se ha intentado evaluar de manera objetiva de manera retrospectiva y prospectiva la significancia estadística de ciertos signos y síntomas que se han descrito como clásicos de la neumonía atípica, dando pie a la prescripción indiscriminada de macrólidos, lo cual ocasiona uso inapropiado de antibióticos, que puede empeorar el pronóstico y aumentar la resistencia de los mismos. (11)
Siendo el objetivo de esta tesis demostrar la capacidad predictiva de una prueba que ha sido utilizada en pocos estudios, continuaremos analizando las pruebas diagnósticas más utilizadas en la actualidad para diagnosticar neumonía adquirida en la comunidad por Mycoplasma pneumoniae.
Las guías actuales y los estudios más recientes, recomiendan que la mayor sensibilidad diagnóstica se obtiene por medio de la PCR en exudado nasofaríngeo asociada a la toma de serología pareada para diagnosticar infección por Mycoplasma pneumoniae.
(12)(16).
2.1 Score TEF
En el año 2014, mediante un análisis retrospectivo de una muestra que incluía a 302 pacientes de 0 a 18 años, se elaboró una escala de descarte de neumonía por M. pneumoniae la cual nombraron TEF (tos, edad, fiebre). En esta escala, se tomaron en cuenta los siguientes datos: días de duración de la fiebre, días de duración de la tos y la edad del paciente, otorgando puntos por cada una de estas respuestas (17). En este estudio, de los 302 pacientes incluidos en la muestra, 34 casos se clasificaron en Mycoplasma positivo y 268 en Mycoplasma negativo. Las variables relevantes para la elaboración del score fueron edad, días con tos y días con fiebre, con lo que se conformó el score TEF. Se asignaron rangos para cada variable y puntos para cada rango. Un valor de igual o mayor a 5 equivale a un score positivo. Se aplicó el score TEF a los 302 casos resultando ahora en 164 casos Mycoplasma positivo y 138 Mycoplasma negativo. Este score resultó en una sensibilidad del 85% y especificidad del 49%. El objetivo de esta escala, es descartar esta patología, sin el uso de estudios de laboratorio y de manera temprana al momento de interrogar al paciente. De esta manera se pretendía descartar esta enfermedad sin invadir al paciente, y asimismo, evitar el uso indiscriminado de macrólidos.
Se concluyó que el score TEF tuvo mejor sensibilidad que otras herramientas diagnósticas clínicas (17). Con un valor predictivo negativo del 96% , siendo el objetivo poder descartar anticipadamente una neumonía por M. pneumoniae. Sin embargo, se requería un estudio prospectivo para verificar la utilidad de este score, razón por la cual se incluyó en un proyecto previo, conjunto a éste.
2.2 Serología
La serología es una herramienta que ha sido utilizada ampliamente en el diagnóstico de infección por Mycoplasma pneumoniae. Es más fácil obtener una muestra de sangre que una muestra nasofaríngea o de tracto respiratorio inferior. La sangre es normalmente estéril, así que el aislamiento de un microorganismo en ella (por medio de cultivo), debe considerarse una infección activa, aunque sabemos que se puede llegar a contaminar en un 2-3% de los casos y se ha descrito que sólo en 2.1% de los casos de neumonía se llega a presentar bacteriemia. Dicho esto, la sangre también debe de ser sometida a pruebas moleculares. Esto es especialmente útil para algunos microorganismos. Por ejemplo, la detección por PCR de S. pneumoniae debe ser asociada a enfermedad invasiva por neumococo. (14)
En el caso de Mycoplasma pneumoniae, la serología es de mayor utilidad para la confirmación diagnóstica en retrospectiva, especialmente para bacterias difíciles de aislar.
Sin embargo, se debe tener en cuenta que los títulos de anticuerpos de IgM aislados son menos sensibles y específicos que los títulos pareados de IgG e IgM, ya que la seroconversión de IgM puede no ocurrir en el escenario de una reinfección. El diagnóstico serológico generalmente requiere un aumento del doble o más de los títulos obtenidos, es decir se deben de tomar dos muestras separadas generalmente por una o dos semanas.
Asimismo, debe tomarse en cuenta que basarnos en estos resultados en el periodo agudo de la enfermedad, no debe definir el tratamiento del paciente. (14)
Las primeras determinaciones de respuesta inmunológica específica frente a M.
pneumoniae se realizaron por técnica de fijación del complemento (FC), utilizando como
antígenos bien un extracto lipídico de M. pneumoniae, o una suspensión de lisado bacteriano. La complejidad antigénica de este microorganismo, en comparación con los virus, condiciona un mayor número de inespecificidades. También se observan reacciones cruzadas con los antígenos de otros Mycoplasma. La técnica de FC determina principalmente IgM y, en menor medida, IgG. La demostración de un incremento de 4 veces el título entre una muestra de la fase aguda y una de la fase de convalecencia, o bien títulos superiores o iguales a 1/32 ofrece una sensibilidad del 90% y una especificidad del 88%. Para evaluar los resultados, se tiene que tener presente la dinámica de producción de anticuerpos frente a esta bacteria. La respuesta inmunológica en la primera infección se produce rápidamente y alcanza la máxima concentración en 3 a 6 semanas, para posteriormente, disminuir de forma gradual durante meses, aunque pueden persistir hasta 4 años. Las IgM específicas anti-Mycoplasma aparecen durante la primera semana de la infección y preceden en unas 2 semanas a la IgG. A menudo los anticuerpos están presentes en el momento de la sintomatología clínica debido al largo periodo de incubación (de 2 a 3 semanas). (8)
En la reinfección no hay respuesta de IgM sino una rápida elevación de IgG que se acompaña de producción de IgA. Además, se ha observado que, si se produce IgM, puede persistir durante meses o años, de modo que, en el adulto joven, la detección de IgM puede no ser secundaria a una infección reciente. Así, en la primoinfección las técnicas de detección de IgM tienen una sensibilidad y una especificidad buenas, mientras que, en las reinfecciones, la falta de detección de IgM específica no permite descartar una infección aguda por M. pneumoniae. Otros factores que también se deben tener en cuenta para el diagnóstico etiológico de estas infecciones por serología es que, al tratarse de una
enfermedad leve en la mayoría de los casos, da lugar a que se le conozca como neumonía del paseante (walking pneumonia). Por ende, la mayoría de los infectados, no requieren ingreso hospitalario y su recuperación, relativamente rápida, dificulta el cumplimiento de la segunda toma de muestra. (8)
La complejidad y las múltiples variables a controlar con esta técnica han contribuido a que la mayoría de los laboratorios busquen otras alternativas de diagnóstico serológico. (8).
2.3 Técnicas de aglutinación
Utilizan un transporte como la gelatina o el látex para una mezcla de antígenos específicos de M. pneumoniae y detectan conjuntamente IgG e IgM, permitiendo su cuantificación. Es fácil realizar esta prueba y cuantificar; sin embargo para conseguir una sensibilidad máxima, se recomienda también realizar dos muestras seriadas. En un estudio comparativo con técnicas de PCR, Templeton et al observaron que una muestra de suero de la fase inicial permite detectar el 50% de las infecciones, y que la sensibilidad alcanza el 66% si se dispone de una muestra de la fase de convalecencia, siempre que se valoren aglutinaciones a títulos iguales o superiores a 1/320 (8).
2.4 Cultivo
Para poder aislar una bacteria por medio de cultivo de esputo, dependemos de la calidad de la muestra obtenida, la carga bacteriana, el periodo de almacenamiento, los nutrientes y las condiciones para mantener la viabilidad. El haber recibido antibioticoterapia previo a la obtención de la muestra, puede impedir que haya crecimiento en el medio de cultivo, así como afectar la tinción de gram. Asimismo, se debe de tomar en cuenta a las bacterias que no se pueden aislar en cultivos, y estas se deben de buscar por medio de métodos moleculares que identifiquen el ADN de la bacteria sospechada. (14)
El cultivo en Mycoplasma pneumoniae no está recomendado, ya que es un microorganismo de lento crecimiento. Se realiza en medios de cultivo acelulares, en donde se agrega antibiótico beta lactámico de amplio espectro y antifúngico. Cuando se procede a aislar el Mycoplasma pneumoniae, el transporte del espécimen al laboratorio es crucial, se debe de tardar menos de 4 horas y debe permanecer menos de 4 horas en el medio de transporte, o si es necesario más tiempo, debe de conservarse a 4ºC.
El cultivo de esta bacteria, se considera un proceso largo que requiere la dilución del espécimen y cuyo resultado no puede ser negativo hasta después de 3 a 9 semanas de dejarlo en incubación (18).
Por lo anterior, no se considera un método diagnóstico útil.
2.5 Técnica de Amplificación de ADN o Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR)
La reacción en cadena de la polimerasa para M. pneumoniae fue usada por primera vez en 1989. La principal ventaja de la PCR en comparación con los otros métodos es que tiene mayor sensibilidad. La especificidad de la PCR depende de los primers que se eligen y se ha demostrado que en condiciones óptimas puede tener una especificidad para diagnosticar M. pneumoniae de hasta 100% (19).
La PCR convencional o punto final, es la que se utilizaba previamente como método estándar. Sin embargo, recientemente se han utilizado diferentes métodos de PCR para detección directa de Mycoplasma pneumoniae, entre los que se encuentran la PCR anidada, la cual es de alta sensibilidad y se requiere para detectar este agente en sitios extrapulmonares, donde el patógeno se aísla en menor cantidad. Asimismo, la PCR en tiempo real permite el monitoreo y la amplificación durante la PCR y actualmente es el método que se debe usar como de rutina por su mayor sensibilidad. (19)
A pesar de la avanzada tecnología in vitro, la PCR por sí sola, no es suficiente para el diagnóstico de infecciones respiratorias por M. pneumoniae. Diversos estudios han demostrado una correlación menor a la esperada en cuanto a la concordancia de anticuerpos positivos y los resultados de PCR para M. pneumoniae. Se refiere que la concordancia va desde el 50% hasta el 88.1% en algunos pacientes. Lo anterior se ha atribuido a que el patógeno aislado puede no estar asociado a la clínica del paciente, es decir, a portadores asintomáticos. También se debe tomar en cuenta que el periodo de incubación puede ser
de hasta 3 semanas. Y por último, recordar que en las primeras etapas de la enfermedad, pueden no detectarse anticuerpos. (19)
Existe discrepancia en cuanto la existencia de portadores asintomáticos. Algunos estudios refieren que se han encontrado portadores asintomáticos de Mycoplasma pneumoniae, encontrando ADN en el tracto respiratorio de niños sanos en hasta el 21% en un estudio que se realizó en Holanda del 2008 al 2011 y según un estudio estadounidense hasta en el 56% (2009-2011). (12). La prevalencia de la presencia de este agente en niños asintomáticos variaba de acuerdo a la época del año, lo que sugiere que esta fluctuación tiene un patrón epidémico. Por otro lado, existe bibliografía en la que se refiere que hay bacterias que no se consideran colonizadoras de la nasofaringe, como es el caso del Mycoplasma pneumoniae, en las que los casos positivos por medio de PCR, identifican al patógeno causal del cuadro en cuestión (14).
2.5.1 PCR en saliva para Mycoplasma pneumoniae
En el 2013, Komatsu, etal. evaluaron de manera prospectiva el uso de la PCR para detectar Mycoplasma pneumoniae en muestras de saliva sin extracción de DNA previa.
Esto con el objetivo de encontrar una prueba diagnóstica más sensible, fácil de obtener y rápida de realizar (20). Asimismo, para identificar cepas resistentes a macrólidos por PCR en tiempo real, diseñaron una sonda de LNA que pudiera discriminar entre la cepa mutante (A2063G) y la salvaje. Se incluyeron en el periodo entre abril 2011 y diciembre 2012, 87 pacientes pediátricos en el Hospital de Yokohama, con sospecha diagnóstica de infección
del tracto respiratorio por M. pneumoniae. De ellos, 51 resultaron positivos para M.
pneumoniae por PCR convencional o punto final. Su edad correspondía a un rango entre 7.8 + 4.5 años. De las 51 muestras analizadas, a las que se les realizó la extracción de ADN, el 100% resultaron positivas con PCR tiempo real. Por otro lado, en aquellas en las que no se realizó la extracción de ADN, 41 de 51 fueron positivas en PCR tiempo real (80.4%).
De las 29 de moco, fueron positivas el 79.3% y de las 22 de saliva, el 81.8%. (20)
La tasa de positividad de la PCR en tiempo real sin la extracción de DNA, resultó menor, que en las que sí se extrajo el ADN, lo cual resultó estadísticamente significativo (p<0.05). (20)
En este estudio se demostró que la capacidad para detección de Mycoplasma pneumoniae es la misma en moco y en saliva. Se concluyó que se debe examinar una muestra más grande de pacientes para confirmar que la PCR en saliva es útil para el diagnóstico de infección por Mycoplasma pneumoniae.
2.5.2 Novedades de PCR en saliva
La información más reciente en cuanto a la PCR en saliva, la debemos a la pandemia actual por COVID-19. En un estudio publicado este año realizado en Lituania, se realizó un estudio comparativo entre los hisopados nasofaríngeos y muestras en saliva.
Esta idea surgió, porque la saliva se trata de un fluido corporal que se puede obtener sin utilizar métodos invasivos, de una manera cómoda, e incluso disminuyendo el riesgo de infección de personal médico, ya que se puede auto-colectar la misma. En abril del 2020,
se aprobó por la FDA la primera prueba en saliva para detectar SARS-CoV-2. Se ha demostrado que las partículas virales aparecen en la saliva infectando las glándulas salivales y posteriormente el tracto respiratorio superior e inferior y del fluido crevicular gingival. La presencia de partículas del virus en la saliva se asocia a etapas tempranas de la infección, antes de la aparición de lesiones pulmonares, esto también se ha asociado a la transmisión del virus en infecciones asintomáticas. En este estudio, se demostró que las muestras en saliva para detectar SARS-CoV-2, son un método diagnóstico prometedor, ya que se encontró una concordancia de más del 75%, incluso reportado en otros estudios de hasta el 98%. (40)
Capítulo 3. Metodología
Diseño del estudio
El estudio cuenta con la autorización del Comité de Ética y el Comité de Investigación de la Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud del Tecnológico de Monterrey, con el número de registro 19- CEI -011-20161017 y 13CI 19039138 ante la Comisión Nacional de Bioética además del comité correspondiente del Hospital Regional Materno Infantil de Alta Especialidad obteniendo el registro DEISC- 190119010 ante la Dirección de Enseñanza, Investigación en Salud y Calidad.
Descripción del estudio
Se trata de un estudio multicéntrico, replicativo, observacional, de prueba diagnóstica, transversal, analítico y prospectivo en el que se busca obtener el rendimiento (sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y valor predictivo negativo) de la PCR para M. pneumoniae en saliva.
Fundamentos para el diseño del estudio
Se trata de un estudio convencional de pruebas diagnósticas en el que se buscó obtener el rendimiento (sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y valor predictivo negativo) de la prueba de PCR en saliva contra el estándar de oro diagnóstico que se eligió por conveniencia: la PCR para M. pneumoniae en exudado nasofaríngeo.
Fundamentos para la población de pacientes
El protocolo se llevó a cabo en una población de entre 0 y 17 años 11 meses de edad, debido a la alta incidencia de neumonías en esta etapa y su asociación como causa de morbi-mortalidad elevada. Se llevó a cabo en los hospitales de Tecsalud (Centro Médico Zambrano Hellion y Hospital San José) ya que aquí se realizan las dos pruebas consideradas estándar de oro (la PCR en el panel viral y la IgM para M. pneumoniae). Y en el Hospital Regional Materno infantil, teniendo como limitante la ausencia de IgM para mycoplasma y la toma de paneles respiratorios.
Considerando la prevalencia de neumonías atípicas causadas por M. pneumoniae en la población pediátrica, se requiere de una muestra de 191 pacientes con un nivel de significancia Z de 95% y un valor de 0.05.
Se llegó a este número basado en la siguiente fórmula para calcular la muestra:
𝑛𝑛 =𝑍𝑍𝛼𝛼2𝑑𝑑𝑃𝑃𝑃𝑃2 , donde
Z= 1.96, un nivel de significancia del 95%
P= prevalencia del 14.6%
Q= 1-P
d= precisión absoluta del 5%
𝑛𝑛 =(1.96)2(0.146)(1−0.146)
(0.05)2 = 191
Materiales y métodos
Se incluyeron a 200 pacientes con diagnóstico clínico de neumonía a su ingreso al área de hospitalización de los hospitales participantes que cumplían con los criterios de inclusión y cuyos padres firmaron previamente el consentimiento informado.
Criterios de inclusión y exclusión
Criterios de Inclusión:
Se incluyeron pacientes de sexo masculino o femenino, de entre 0 y 17 años 11 meses de edad, que ingresaron al área de hospitalización con sospecha clínica de neumonía por Mycoplasma pneumoniae, que no estuvieron hospitalizados en un periodo de 2 semanas previas al ingreso y que contaban con consentimiento informado debidamente firmado por los padres.
Criterios de Exclusión:
Pacientes que no se encontraron dentro del rango de edad establecido, que contaban con antecedentes personales patológicos de inmunocompromiso, que estuvieron hospitalizados en un periodo de 2 semanas previas al ingreso. Pacientes con consentimiento mal llenado o sin firma.
Criterios de Suspensión:
Detección durante el estudio de algunos criterios de exclusión.
Evaluaciones del Estudio
Formas de consentimiento informado y registro de selección:
Se explicó de manera clara a los padres la investigación a realizar y se solicitó durante el primer contacto con el paciente y sus familiares al ingreso al área de hospitalización el consentimiento informado de autorización para usar de sus datos en el presente estudio.
Historia clínica y datos demográficos:
Se obtuvo una historia clínica completa al ingreso de los pacientes que incluyó datos de la ficha de identificación como la edad y sexo, así como antecedentes personales relevantes al padecimiento investigado, en este caso enfermedades respiratorias como asma, fibrosis quística, etc. Se solicitaron además datos precisos del padecimiento actual como días de evolución, síntomas característicos de dificultad respiratoria, rinorrea, congestión nasal, tos, síntomas generales como cefalea, mialgias, artralgias, hiporexia y ataque al estado general.
Exploración física:
Dentro de los datos relevantes a estudiar nos enfocamos en datos de dificultad respiratoria como aleteo nasal, tiraje intercostal, retracción xifoesternal, quejido, disociación toraco-abdominal y polipnea. Se describieron también los signos vitales al ingreso de los pacientes y los hallazgos en la auscultación pulmonar.
Estudios de laboratorio y gabinete:
Se tomaron en cuenta los siguientes estudios solicitados: IgM para Mycoplasma pneumoniae y Panel respiratorio por PCR. Se incluyeron también los estudios generales de laboratorio como biometría hemática y reactantes de fase aguda como PCR y VSG en caso de contar con ellos. Posteriormente se procedió a tomar muestras de saliva e hisopado nasofaríngeo para posteriormente ser procesados en el Centro de Biotecnología del Tecnológico de Monterrey.
Metodología de la investigación
Se siguió el siguiente flujograma para realizar el presente protocolo de investigación:
Posterior a esto se integró la información en una base de datos en Microsoft Excel para realizar el análisis de la misma.
Día 1-3
Mantener muestras en refrigeración y llevarlas al Centro de Biotecnología para procesarlas.
Día 0
Ingreso a hospitalización con sospecha clínica de
neumonía
Invitación a participar en el protocolo y firma de consentimiento informado
Toma de Score TEF, toma de hispoado nasofaríngeo y
saliva para PCR
Procedimiento en Laboratorio:
Posterior a la obtención de las muestras, estas se mantuvieron refrigeradas a 4ºC por un periodo máximo de 3 días, posterior a lo cual se trasladaban al Centro de Biotecnología en el Tecnológico de Monterrey, donde fueron procesadas.
Extracción de ADN a partir de muestra de ADN en moco y saliva:
1. Se enciende la campana de flujo laminar. Se limpia con etanol al 70% y posteriormente se introduce todo el material necesario a esta área estéril. A los 15 minutos se apaga, se abre y se introducen muestras.
2. Se introduce muestra de saliva o moco en hisopo en PBS de 500 microlitros. Se toman 500 microlitros en tubo de 2 ml y se agregan 50 microlitros de SDS y 5 microlitros de proteinasa K.
3. Posteriormente se coloca en Termoblock y se incuba a 56ºC 12 horas para que la Proteinasa K degrade a la célula y se libere el ADN al medio.
4. Se retiran muestras de termoblock y se agregan 20 microlitros de Cloruro de Sodio 5M, mezclando bien por inversión.
5. Se añaden 287.5 microlitros de fenol y 287.5 microlitros de SEVAG y se mezclan bien por inversión.
6. Se centrifuga por 6 minutos a 13,500 rpm y posteriormente se toma fase superior (acuosa) y se coloca en tubo nuevo de 2 mililitros. Se agrega 1 mililitro de etanol (grado biología molecular) y se mezcla por inversión.
7. Se almacena muestra a -20ºC por 1-2 horas.
8. Centrifugar 15 minutos a 14,000 rpm.
9. Se decanta etanol.
10. Se deja secar el botón de ADN a temperatura ambiente hasta que no queden rastros de etanol.
11. Resuspender botón en 50 microlitros de TE (buffer).
12. Cuantificar concentración de DNA en Nanodrop.
13. Posteriormente se almacena a -20ºC o se procede a realizar PCR.
PCR:
1. Se mezclan los siguientes reactivos: Master Mix (12.5 microlitros), Primer 1 (FW) (0.5 microlitros), Primer 2 (RV) (0.5 microlitros), Agua (8.5 microlitros) y DNA (al menos 100 nanogramos/microlitro). Las cantidades anteriores son las necesarias para una reacción.
2. Posteriormente se realiza mismo procedimiento con control negativo (agua) y control positivo (plásmido diseñado).
Electroforesis:
1. Primero se prepara el gel de agarosa al 2%, para lo cual se mezcla 0.8 gramos de agarosa y 40 mililitros de TAE 1x. Se calienta un minuto para disolver la agarosa, se atempera y posteriormente se le agrega el reactivo Sybersafe 4 microlitros.
2. Se vierte en el dispositivo para preparar el gel y se coloca el peine. Posteriormente se espera 25 minutos para su solidificación.
3. Una vez solidificado, se retira el peine y se coloca el gel en la cámara de electroforesis cubriéndolo con TAE 1x.
4. Se colocan las muestras en los pozos del gel y se conecta la corriente.
5. Correr el gel a 100 V.
6. Observar el gel en fotodocumentador, utilizando luz ultravioleta. Fotografiar.
Variables
El resultado de la PCR en saliva y el resultado de la PCR en exudado nasofaríngeo, son variables dependientes, las cuales son variables cualitativas y dicotómicas que se reportan de forma positiva o negativa.
En todos los pacientes incluidos en el estudio se tomaron muestras para PCR en exudado nasofaríngeo y en saliva, las cuales fueron procesadas en el Laboratorio de Biotecnología (PCR punto final).
Por otro lado, 79/200 pacientes contaron con panel respiratorio en el ámbito privado, el cual consistió en una PCR en tiempo real de muestra de exudado nasofaríngeo.
Las variables independientes que se analizaron incluyeron los datos demográficos de los pacientes; es decir, edad, sexo, comorbilidades, antecedentes personales patológicos, uso de antibióticos previos a su ingreso, score TEF y datos clínicos propios de la patología (fiebre, cianosis, rinorrea, tos, datos de dificultad respiratoria), exploración física, signos vitales, sintomatología extrapulmonar y reactantes de fase aguda como biometría hemática y PCR. También se analizaron los días de estancia intrahospitalaria y si requirió o no requirió estancia en la unidad de cuidados intensivos pediátricos. Asimismo, se incluyó el resultado de IgM para Mycoplasma pneumoniae en caso de contar con él.
Debido a que no se obtuvo ningún resultado positivo en las reacciones en cadena de polimerasa procesadas en el laboratorio de Biotecnología, el análisis de este estudio tomó como referencia por conveniencia los resultados de las reacciones en cadena de polimerasa reportados en el panel viral de los 79 pacientes que contaban con el mismo.
La PCR punto final que se realizó en el laboratorio del Tecnológico de Monterrey, fue estandarizada por el grupo de Biotecnología de esta institución, después de un análisis de la literatura, detectando a M. pneumoniae por medio de la amplificación del gen ribosomal 23s (20) , identificando el resto de la secuencia de estos genes en la base de datos de NCBI y GenBank, para identificar las secuencias de estos genes y regiones que amplifican los primers en cada uno y se mandaron sintetizar con GenScript quien realizo un plásmido (pJET1.2) que incluye esta región. Posteriormente se corroboró que los primers identificaban las regiones adecuadas con el plásmido, realizando la reacción en cadena de polimerasa.
El panel respiratorio que se utiliza en los hospitales privados incluidos en el estudio, se trata de un FilmArray, el cual es un equipo comercial automatizado de PCR múltiples que detecta 17 virus respiratorios (virus sincicial respiratorio, influenza A, influenza A/H1, influenza A/H1 2009, influenza A/H3, influenza B, parainfluenza 1-4, adenovirus, metapneumovirus, enterovirus, bocavirus, coronavirus OC43, 229E, NL63 y HKU1 además de 3 bacterias (Bordetella pertussis, Mycoplasma pneumoniae y Chlamydophila pneumoniae). Se lleva a cabo en un sistema cerrado que requiere de 5 minutos de procesamiento y una hora de instrumentación utilizando como muestra aspirado
nasofaríngeo o exudado nasofaríngeo. Tiene una sensibilidad clínica del 90% y una especificidad del 100% específicamente para M. pneumoniae.
Tabla 2. Variables
Variable Definición conceptual Definición
operacional Tipo de
variable Escala de
medición Valor de la
variable Estadística Edad Tiempo de vida de una
persona al día de la realización del estudio.
Se cuantificarán los años cumplidos a la fecha de ingreso hospitalario y van de
0 a 17 años.
Cuantitativa, continua y
discreta
Numérica De 0 a 17
años (número de meses)
0 a 17 t-Student
Sexo Condición orgánica que distingue al hombre de la
mujer, es decir, el sexo biológico de los pacientes
Es la asignación del sexo por parte del
paciente
Cualitativa y
nominal 1:
Femenino Masculino 2:
1, 2 Chi 2
Días de tos Tos se define como expulsión brusca y ruidosa de aire contenido
en los pulmones.
Se cuantificarán el número total de días
que cursa con tos previo a su ingreso
hospitalario.
Cuantitativa
y continua. Numérica
De 0 a 14 0 a 14 t-Student
Días de
fiebre Fiebre se define como un aumento de la temperatura corporal
mayor de 38ºc corroborado con
termómetro
Se cuantificarán los días de evolución que
cursa con fiebre previo a su ingreso
hospitalario.
Cuantitativa
y continua Numérica
De 0 a 14 0 a 14 t-Student
Score TEF Escala formulada para el diagnóstico y descarte de
neumonía por Mycoplasma pneumoniae
en pacientes pediátricos
Escala numérica que comprende elementos
de anamnesis y datos demográficos
(descritos previamente)
Cuantitativa con puntos
de 0 a 15
Numérica
De 0 a 15 0 a 15 Chi 2
Resultado Mycoplasma IgM
Resultado de la prueba sanguínea para
Mycoplasma
Resultado positivo o negativo de la toma de muestra sanguínea
y el análisis por EIA de la búsqueda de anticuerpos contra
Mycoplasma
Cualitativa y
dicotómica 1: Positiva Negativa 2:
1, 2 Chi 2
Resultado Mycoplasma PCR
en exudado nasofaríngeo
Resultado de la prueba de secreción nasal o exudado faríngeo en búsqueda de material genético de Mycoplasma
Resultado positivo o negativo para la muestra de exudado faríngeo o secreción
nasal para la búsqueda de material
genético de Mycoplasma
Cualitativa y
dicotómica 1: Positiva Negativa 2:
1, 2 Chi 2
Resultado
PCR Resultado de la prueba de
saliva en búsqueda de Resultado positivo o
negativo para la Cualitativa y
dicotómica 1: Positiva 1, 2 Chi 2
Mycoplasma
saliva material genético de
Mycoplasma muestra de saliva para la búsqueda de material genético de
Mycoplasma
Negativa 2:
Técnicas de Análisis Estadístico
Primero se analizaron las variables demográficas, obteniendo medidas de tendencia central. Posteriormente al tratarse de un estudio de prueba diagnóstica, se procedió a realizar cuadros de 2X2 donde se pretendió comparar el grado con que una prueba puede distinguir entre los individuos que presentan la enfermedad y los que no la presentan.
Estándar de oro
Enfermo PCR moco +
Sano
PCR moco - Prueba
PCR Saliva +
Positiva a b (a+b)
Negativa c d (c+d)
(a+c) (b+d) TOTAL
Se planeaba calcular la sensibilidad definida como la proporción de individuos que tienen la enfermedad y el resultado de la prueba es positivo, expresada como ((a/(a+c)) así como la especificidad siendo definida como la proporción de individuos que no tienen la enfermedad y que tienen un resultado de prueba negativa, como ((d/(b+d)).
El valor predictivo positivo se trata de la probabilidad de que individuos con un resultado positivo de la prueba tengan la enfermedad y se expresa como ((a/(a+b)) y el valor predictivo negativo expresado como ((d/(c+d)) que menciona la probabilidad de que un individuo con un resultado de prueba negativa no tenga la enfermedad.
Con estos resultados, el objetivo era comprobar si la prueba que se busca validar es mejor que la prueba actual para diagnosticar o descartar neumonías por Mycoplasma pneumoniae.
Programas a utilizar para análisis de datos
Se realizó la base de datos en el software Microsoft Excel y posteriormente se analizó esta base de datos utilizando (Stata v 15, College Station, Tx). (SPSS v 18). Se aplicó la prueba de Chi Cuadrada de Pearson aceptándose una p de 0.05 o menor.
Capítulo 4. Resultados
Se incluyeron en el estudio 200 pacientes con sospecha de neumonía adquirida en la comunidad a su ingreso a hospitalización en un periodo comprendido entre Diciembre 2018 y Febrero del 2020.
Se analizó la información, sin lograr calcular la sensibilidad, especificidad ni valores predictivos de la PCR en saliva, ya que no se obtuvo ninguna prueba positiva.
A continuación se analizará la información obtenida.
La mediana de edad de los pacientes fue de 14 (5-37) meses. Del total, 82 (41%) fueron mujeres y 118 (59%) varones. El 5.5% tuvo antecedente de alojamiento en guardería, 8% había sido hospitalizado un mes previo al ingreso al momento del estudio, 31% había usado algún antibiótico en las dos semanas previas a su inclusión en el trabajo y 69% tenía esquema completo de vacunación (tabla 3).
Tabla 3. Características basales de los pacientes.
Variable Sexo
Femenino 82 (41%)
Masculino 118 (59%)
Edad (meses) 14 (5-37)
Guardería 11 (5.5%)
Hospitalización previa en el último mes 16 (8%) Uso de antibiótico en últimas 2 semanas 62 (31%)
Esquema de vacunación completo 138 (69%)
En la tabla 4 se resumen los antecedentes personales patológicos o comorbilidades de los pacientes. Los más frecuentes fueron sibilancias recurrentes del lactante en 9.5%, antecedente de prematurez en 8.5%, asma en 7%, síndrome de Down en 5.5%, epilepsia en 4.5% y comunicación interventricular en 3%.
Tabla 4. Antecedentes personales patológicos de los pacientes.
Antecedentes personales patológicos
Asma 14 (7%)
Síndrome de Down 11 (5.5%)
CIV 6 (3%)
Epilepsia 9 (4.5%)
Sibilancias recurrentes 19 (9.5%)
Recién nacido prematuro tardío 17 (8.5%)
DBP 5 (2.5%)
Infección de vías urinarias 1 (0.5%)
Fibrosis quística 1 (0.5%)
Asfixia severa 0 (0%)
Síndrome dismórfico 2 (1%)
Encefalopatía CMV 1 (0.5%)
Endocarditis resulta con insuficiencia
tricuspídea 1 (0.5%)
Encefalopatía HI 1 (0.5%)
Parálisis cerebral infantil 5 (2.5%)
Miocardiopatía HI 1 (0.5%)
PCA 1 (0.5%)
CIA 2 (1%)
Hidrocefalia y VDVP 3 (1.5%)
Hidronefrosis 1 (0.5%)
Mielomeningocele 1 (0.5%)
Escoliosis 1 (0.5%)
Disgenesia del cuerpo calloso 1 (0.5%)
Retraso psicomotor 3 (1.5%)
Síndrome de Asperger 1 (0.5%)
Obesidad 1 (0.5%)
Hidronefrosis 3 (1.5%)
Hidroureter 2 (1%)
ERGE 1 (0.5%)
LES 1 (0.5%)