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Evaluación en condiciones controladas :evaluación de selecciones individuales F4 por resistencia al virus del mosaico común y al virus del mosaico necrótico de fríjol en condiciones de invernadero

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Academic year: 2020

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(1)•. Evaluación en condiciones controladas: Evaluación de selecciones individuales F4 por resistencia al virus del mosaico común y al virus del mosaico necrótico del frijol en condiciones de invernadero. Francisco Morales Mauricio casta/lo. · Ubicación geográfica El Centro Internacional de Agricultura Tropical está ubicado en la ciudad de Palmira, Valle del. cauca a una altura de 965 m.s.n,m., temperatura promedio 24.s•c y una precipitación de 1.000 mm.. Material Vegetal. Se envió a la unidad de virologla del CJAT 20 semillas F4 de 241 selecciones individuales, las cuales tienen como padre a un genotipo resistente al virus del mosaico común (BRB151, BRE! 204 ó BRB 203).. Métodos. Las 241 selecciones individuales fueron sembradas en bandejas en condiciones de invernadero. Las hojas primarias bien extendidas fueron inoculadas con las cepas NL3 del virus del mosaico y la necrosis del frijol (BCMNV) y la cepa NL4 del virus del mosaico común del frijol (BCMV) (Morales, 1983). La evaluación se realizó en el estado V3, con la observación de slntomas de mosaico o de necrosis (Foto 1 y 2). Las plantas reSistentes fueron sembradas individualmente en materas. Resultados y discusión El vivero de cruces triples (Cargamanto-BCMV-Antracnosis) mostró que de las 241 selecciones individuales que comprendla, 178 presentaron Mosaico o sea con invasión sistémica y expresión de mosaico en aquellas selecciones susceptibles (M) debido a la presencia de genes recesivos no activos a la cepa BCMNV-NL3 utilizada. Una sola selección mostró una reacción de necrosis {N) indicando que posee el gen dominante de. 25. •.

(2) • necrosis (1). Solamente 2 selecciones (381 plantas 1 y 3) reaccionaron con ausencia total de sfntomas (O) lo cual confirma la presencia del gen recesivo be- 3. El total de las semillas de las dos selecciones serán sembradas en condiciones de campo para realizar evaluaciones por rendimiento y reacción a antracnosis. También se pudo comprobar que 37 selecciones estaban segregando por genes recesivos no activos contra la cepa del BCMNV inoculada y genes recesivos bc-3 (M y 0). Se detectó otro tipo de segregación en 15 selecciones por presentar reacciones de necrosis (N) y mosaico (M) y finalmente se observó que 8 selecciones reaccionaron con segregación de mosaico (M), necrosis (N) y genes recesivos be 3 (O) (tabla 3). Al observar la respuesta a la inoculación con la cepa BCMNV-NL3 de las selecciones que comprenden este vivero, se deduce que de los tres padres (BRB 151, BRB 203 y BRB 204) utilizados como fuente de resistencia del gen recesivo be-3, los materiales identificados BRB 203 y BRB 204 son los responsables de la presencia de la segregación por el gen de necrosis (N) .. • En cuanto al vivero de otros colores, el cual incluyó 20 selecciones individuales, se j. observó que 15 de ellas presentaron. Mosaico (M) y las 5 restantes segregaron. mostrando reacciones de Mosaico (M) y presencia del gen recesivo be- 3 (O). Cabe anotar que todas y cada una de las plantas que reaccionaron con ausencia total de sfntomas (O) debido a la presencia del gen recesivo be- 3, fueron chequeadas por prueba inmunoenzimática ELISA con un antisuero policlonal de BCMNV NL3 para corroborar su reacción y posteriormente colectar la semilla de estas plantas.. RESLM:NVI'JERO CRJCESTRPLES. NlwERo DESB.ECCIONES INDMI:ll!61 ES lE PlANTAS F3 CON REACCIÓN ABCMV N. M. o. NO. ND. NM. NND. 1. 178. 2. -. 37. 15. 8. N: f\a:rcsis. Gen:ltilllS cm rmx:ión de tipen;ensia!idai a I3CMV M IVklsaioo. Gen:ltilllS cm rmx:i6n des """'fJfialidai a BCMV Q Sin sfn!aras. Gen:.tilllS cm resisterda reoesiva a BCMV (Gen bc3). 26.

(3) • •. Foto1. Plantas de frijol con sfntomas de Foto 2. Plantas de frijol con sfntomas dEl puntos mosaico común en condicionas de invernadero necróticos en condiciones da invernadero. Tabla 3. Evaluación de selecciones lndMduales F4 a virus del mosaico común y al virus del mosaico necrótico del frijol. Padre. o selcc. lndiv.. ~. -ªll_. 44 47. 14 1. 10. con reacción. LN. Padre. selcc. lnlfw.. con reacción. LN.. 10_ 114. . !O. .. ~. 1. 3. ~. tlKB151. 152. 1. 18 48 51 '53. 67 71. 19 110 3 1. KJ:!l. 1. BRtl1•. ¡;. ~ 118. l~ 4. 71. ·~51. 1E. 13'4. .. 1151. 14. ~51. 1381 15 11. •de. ~:con. 18 119 120. ~. '1 1. ~. !lO. Llll. 1406 1N. con. ~. ~. o-. ~3. 117. .. ~ 10. !O. BRB151. B. 2 1. 11 12 2. 14 15. 19 20. 1<. ,, 18-. 1~. 11. 1f 13. 120 120. 120 15 15. 12 9 .. . O: Sin. f--. , Inmune•. "' 27.

(4) • •. ... Evaluación en condiciones controladas: Evaluación de selecciones individuales F4 de frijol por resistencia. a antracnosis en condiciones de casa de malla. George Mahuku cartos Jara. Material Vegetal. Se envió a la unidad de patologia del CIAT 50 semillas F4 de 96 selecciones individuales, las cuales tienen como padre a un genotipo resistente a la antracnosis (G-19833 6 AB 136). Métodos. Las 96 selecciones individuales serán sembradas en bandejas en condiciones de casa de malla. Las hojas primarias bien extendidas serán inoculadas con razas de antracnosis identificadas en Antioquia. La evaluación se realizará en dos semanas en el estado V3, con la aparición de síntomas en el envés de las hojas o muerte de las plantas . Las familias resistentes a antracnosis se compararán con las evaluaciones realizadas en la unidad de virologla y biotecnologia, para conocer cuales familias presentan resistencia simultanea a las dos enfermedades y cuales solo a una de ellas.. •. Evaluación en condiciones controladas: Estandarización de la metodologfa de marcadores moleculares tipo SCAR para los genes bc-3 e 1 del virus del mosaico común y virus del mosaico necrótico del frijol. Gloria E. Santana MatthewW. Blair. Material Vegetal. Ocho genotipos como. fuentes de resistencia a antracnosis, 17 genotipos fuente de. resistencia al virus del mosaico común procedentes del proyecto de frijol de CIAT, Palmira y 16 fuentes de germoplasma tipo Cargamanto, de las cuales 5 son lineas avanzadas (CC 21148-) del programa de mejoramiento de frijol del CIAT, 12 colectas procedentes de cultivos comerciales del Oriente Antioqueño (GES-), una variedad regional (mocho) y dos. •. 28.

(5) • variedades mejoradas volubles, para un total de 45 genotipos enviados al laboratorio de. •. caracterización de germoplasma de frijol de CIAT; asimismo se utilizó cuatro genotipos testigos (Tabla 4).. Tabla 4. Fuentes de gerrnoplasma donantes de genes de resistencia al virus del mosaico común y antracnosis y genotipos de tipo cargamanto. Germoplasma BRB 32, BRB 211, BRB 151, BRB 183, BRB 197, BRB 152, BRB 217, BRB 203, BRB 204, BRB 225, BRC 12, BRC 14, BRC 30, BRC 31, BRC 32, BRC 33 y BRC 34 G-2333, AB 136, T.O, Kaboon, G-2337, G-2338, G-19833, G7602 ce 21148- 74-1, ce 21148-R191-1, ce 21148- 67-1, ce 21148- R67-3, CC 21148- 25-2, GES 1, GES 3, GES 4, GES 5, GES 6, GES 7, GES 8, GES 9, GES 11, G7-T2.PI3, G7-T3.PI1, G7-T2.PI4, mocho La Ceja, lea Víbora y LAS106. G-6416, Jalo, Flor de Mayo, BAT 93 y Kaboon. Caracterlstica Fuente de resistencia al virus del mosaico común Fuente de resistencia a antracnosis Susceptibles a antracnosis y virus del mosaico común; semilla tipo comercial Testigos para las pruebas con marcadores tipo SCAR. Métodos Con los 44 genotipos se estandarizó la metodologfa de marcadores moleculares tipo SCAR (Sequense Characterized Ampiífied Regions) ligados al gen recesivo bc-3 o al gen dominante /. La aplicación de los marcadores involucró los siguientes pasos:. Extracción de ADN: Se . realizó a partir de 8 semillas de cada genotipo que fueron sembrados en condiciones de invernadero; se cosecharon entre 4 y 6 hojas trifoliadas jóvenes en forma masal. El tejido fue almacenado a -80 °C hasta la extracción del ADN. Al ADN extrafdo se le realizó la prueba de calidad • la cual consistió en sembrar en un gel de agarosa al 2% una solución de 2 ¡¡.1 de ADN, 3 ¡¡.1 de blue juice y 7 ¡¡.1 de agua destilada estéril, luego se corrió la electroforesis deJas muestras en solución. Las bandas corridas fueron observadas bajo la luz ultravioleta y fotografiadas para la lectura. En las 35 muestras preparadas se observó una banda bien definida, que indicaba que sí se había extraído el ADN.. . 29. •.

(6) • •. Cuantificación de ADN: Conocida la presencia del ADN, se cuantificó en ng/¡.¡.1 la cantidad inicial de ADN extraldo con el espectrofotómetro en cada una de las muestras para realizar una dilución de 1Ong/¡.¡.1 .. Amplificación por medio de PCR (Reacción en cadena de la Polimerasa): Se preparó un coctail para cada SCAR:. SCAR SW13 asobp: Marcador para el gen dominante 1 Agua bidestilada (11.8 ¡.¡.1), buffer con Mg (1.5 ¡.¡.1), buffer sin Mg (1.0 ¡.¡.1), dNTPs (0.5 ¡.¡.1 ), primer (F) (2.5 1.!1 ), primer (R) (2.5 ¡.¡.1 ), Taq polimerasa (0.2 ¡.¡.1 ) y ADN (5 ¡.¡.1 ). SCAR ROC 11. 420b0:. Marcador para el gen recesivo bc-3. Agua bidestilada (15.2 ¡.¡.1 ), buffer (2.5 ¡.¡.1 ), dNTPs (1.0 ¡.¡.1 ), primer (F) (0.5 ¡.¡.1), primer (R) (0.5 ¡.¡.1), Taq polimerasa (0.3 ¡.¡.1) y ADN (5 ¡.¡.1).. •. Programa para la amplificación de los dos SCAR's:. 92 °C/30s 55 °CI30 S 72 °C/1 min 34 veces (1) 72 °C/5 min 14 ° C/ hasta finalizar Fin El ADN de cada muestra se amplificó para los dos SCAR's.. Lectura de electroforesis: Los productos de amplificación (PCR) fueron teñidos con blue juice, sembrados en un gel de agarosa al 2%, corridos en electroforesis y fotografiados bajo la luz ultravioleta para la lectura (Foto 3).. •. 30.

(7) • •. Ausencia de la banda. presencia del gen bc-3. Presencia. de. la. banda, ausencia del gen bc-3 Presencia de banda tenue: dudosa. Foto 3. fotografia de un gel de agarosa con bandas del producto del PCR para el marcador ROC 11~ bajo luz ultravioleta.. Resultados y discusión SCAR ROC 11. 420. bp: La presencia de la banda (+) es la ausencia del gen bc-3, es decir,. los genotipos son susceptibles. Solo los genotipos BRB 32,, BRB 211, BRB 217, BRB 183, BRB 197, BRB 152, BRC 12,BRC 14, BRC 30, BRC 31, BRC 32, BRC 33 y BRC 34 poseen e! gen bc-3, es decir son resistentes a! BCMV; los genotipos BRB 203, BRB 204. y BRB 151 presentaron una banda tenue, considerados como dudosos y Jos demás genotipos son considerados como susceptibles (Tabla 5). Los genotipos resistentes son seleccionados como genotipos parentales, en donde se requiera una fuente de resistencia al virus del mosaico común.. SCAR SW13 aoobp: La presencia de !a banda(+) es la presencia del gen/, es decir son genotipos resistentes. Los genotipos T.O, CC 21148-25-2, CC21148- R67-3, CC2114874-1, CC21148-R191-1 presentan el gen/, los demás genotipos son susceptibles (tabla 6). Los genotipos que presentan el gen /, son descartados como padres en el programa de cruces del proyecto de fríjol cargamanto para Antioquia. Este gen está estrechamente ligado al color oscuro de la testa de fríjol. El típico color rojo-crema del fríjol cargamanto cambiaría por un color morado-crema, no deseado por los agricultores debido a que los. ". comerciantes compran esta semilla mucho más barata. De otra parte, solo el gen 1usado. 31. •.

(8) • como fuente de resistencia no es viable, debido a la presencia de la cepa necrótice NL3 del virus en Colombia, la cual causa muerte descendente en las variedades resistentes que presentan el gen dominante.. Tabla 5. Genotipos evaluados con el marcador ROC 11. Genotipo. Banda. -. Genotipo. 420bp. tipo SCAR. Banda. BRC12 G-5 + + BRC14 G-6 + BRC30 G-7 . BRC31 G-8 + + BRC32 G-9 + BRC33 G-11 + BRC34 G7T2PI1 + G-2337 + G7T2PI3 + G-2338 + + G7T2PI4 G-19833 + CC21148-25-2 + G-7602 + + CC21148-67-1 BRB32 CC21148-67R-3 + BRB 151 D 21148-74-1 + BRB 152 CC21148-191-1 + BRB 183 ICAVIBORAL + BRB 197 LA CEJA + BRB203 D LAS 106 + BRB204 D + AB136 BRB 211 + KABOON BRB217 G-2333 + BRB225 T.O + G-1 + Flor de Mayo G-3 + BAT93 G-4 + + G-6416 Jalo + Lectura con+. presencta de la banda, genotipos susceptibles,-. ausencta de la banda, genotipos resistentes, d: presencia de banda tenue, genotipos dudosos.. -. j.. -. ce. -. -. ... •. 32.

(9) • Tabla 6. Genotipos evaluados con el marcador SCAR SW13 BRC12 BRC14_ BRC30 BRC31. E:!RC 32 BRC33. BRC34. -. -. -. -. -_. G-i G-8 _G-9 G-11 _G7T2PI1 G7T2PI3 G7 L.i. w. ~ ~~. -. ""'. l<tO-Qtrh>. -. •. tipo SCAR. -. G-E. -. BRB 151 BRB 152. G-f. 690bp. + + ' -_. + +. CC21' """' 148--191-1. hE~lR~B1~83______~-----------~~ICQb~V~~n~IR~All~--------~-~----~----~ BRB 197 BRB 203 BRB .04 ~B .11 BRB .17 BRB 225 _G-1 G-3 G-4 con+:""'''"''" d de la banda,. •. lA CEJA _lAS 106 AB 136 KA300N. + +. T.C KA&UUI'I. ; -:. 1 de. ). •. 1a banda,. Evaluación en condiciones controladas: Selección de plantas F4 resistentes al virus del mosaico común y virus del mosaico necrótico del frijol mediante el marcador molecular tipo SCAR ROC 11 420bpara el gen recesivo bc-3. Gloria E. Santana Matthew W. Blair Héctor Fabio Buendla. Material Vegetal. Se envió al laboratorio de caracterización genética de frijol de CIAT, 1O semillas F4 de 281 selecciones individuales, las cuales tienen como padre a un genotipo resistente al virus del mosaico común {BRB 203, BRB 204, BRB 211, BRB 217, BRB 183. y BRB 151). con el gen recesivo bc-3 .. • 33. •.

(10) Métodos Cosecha de material vegetal: Se realizó a partir de 4 semillas de cada selección individual, las cuales fueron. sembradas y marcadas (A,B,C y D). en materas en. condiciones de invernadero. De cada planta se cosechó el corte de tres discos de 6mm de diámetro · de una hoja trifoliada joven. El tejido fue colocado en placas de ELISA y almacenado a -80 °C hasta la extracción del ADN. Extracción de ADN: Fue utilizada la metodologfa de extracción alcalina. A cada pozo se le adicionó 60 ¡.¡1 de NaOH (0.21M), se colocó en condiciones de baño maria (100° C) por 2 min., se maceró el tejido, se adicionó 60 ¡.¡1 de HCL (0.25M) y 30 ¡.¡1 de Tris HCI (0.5 M), se calentó a baño maria (1000C) por 2 min, se diluyó 1:1 en agua bidestida estéril y almacenó a -20°C, hasta la amplificación.. Amplificación por medio de PCR (Reacción en cadena de la Polímerasa): Se preparó el coctaíl para SCAR ROC 11. 420bp,. volumen por reacción:. Agua bidestilada microfiltrada y estéril (7.45 ¡.¡1 ), buffer Mg++ (1.5 ¡.¡1 ), dNTP·s (0.15 ¡.¡1 ), primer ROC 11 (F) (0.3 ¡.¡.1), primer ROC11 (R) (0.3 ¡.¡.1), Taq polimerasa (0.3 ¡.¡1) y ADN (5 ¡.¡.1).. Programa para la amplificación del SCAR ROC 11: 92°C/30 s 55 °C/30 S 72°C/1 min 34 veces (1 a 3) 72 °C/ 5 min 14 °C/ hasta finalizar Fin. Lectura de electroforesis: Los productos de amplificación (PCR) fueron teñidos con 5 ¡.¡1 de blue juice, sembrados en un gel de agarosa al2%, corridos en electroforesls a 120v y 11. fotografiados bajo la luz ultravioleta para la lectura.. •. M.

(11) • Resultados y discusión Para el marcador molecular tipo SCAR ROC 11. 420bp. la presencia de la banda (+) es la. ausencia del gen bc-3, es decir, las plantas son susceptibles. Fueron identificadas 148 selecciones individuales con la presencia del gen recesivo bc-3, resistentes al virus; 97 están segregando para el gen; 8 no tienen el gen, susceptibles y 25 no fueron leidas por pérdida de la banda en la electroforesis (tabla 7).. Las selecciones individuales F4. resistentes serán sembradas en condiciones de campo . para ser evaluadas por rendimiento y características comerciales de grano; así como las selecciones F4 que están segregando en viveros diferentes, con el fin de seleccionar en este último las plantas resistentes. Las selecciones F4 susceptibles son eliminadas, a pesar que en la evaluación preliminar en campo fueron asintomáticas. Esto pudo deberse a la falta de inóculo o de condiciones ambientales que favorecieran la expresión de los síntomas. Tabla 7. Evaluación de selecciones individuales F4 mediante el marcador molecular. tipo SCAR ROC 11 Parcela 748 749 750 751 752 753 754 755 756 757 759 760 761 768 769 770 771. m. 773 Parcela 775 776. m. 778 779. Con el gen bc-3 Resistentes 1,2,3,4 2, 2 2,3,4 1,3,4 2 3 2,3,4 4,5 1,2,4 1 1,3,4 1a7 2,3 1,3,4,5 1a7 3,4,5,6 Con el gen bc-3 Resistentes 2,3,4,5,8,9, 1o, 11 6 1a5 1a6 1,3,4,5,6,7. 420bp. Segregando 5 1,3 2 1 6 1 2 1,3,5,6 2,4. gen, Repetir Sin el susceptibles 3. .. 7,3,4,5 1a5 4. 1,3 3 2,6 1,4 2 Segregando. · el Sin gen, Repetir susceptibles. 1,7 1,3 2. 35. •.

(12) • \~. 15 i.f. 11. 14. l.t> 11. !.3. .5. L6. 1.4.5 3.6. 1.2. L1 ?.4 .. 2.4.7 6. .3.5. \58. 161. 5.6. 1 12. 11 1. 3,4. \2. 1.4.5. 15. .. 1.3,4,5 2.3. 1.:1,4 11.2,5. ... ·.. i.4,t>. 1.5 ~. :.3.5 !,3. 1564. 11,3. .. 4. 2. '6 !.4 !3-:5. .. 1 11. \116 1_!140 141 142 B43. 11.3.5,6. 14 11 !.3. .. !,3. 14 12.. 1.t>. 2. 73.5. ., •. 36.

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Tabla 3.  Evaluación de selecciones lndMduales F4 a virus del mosaico común y al  virus del mosaico necrótico del frijol
Tabla  4.  Fuentes de  gerrnoplasma  donantes  de  genes  de  resistencia  al virus del  mosaico común y antracnosis y genotipos de tipo cargamanto
Foto 3. fotografia  de  un gel de agarosa con bandas del producto del PCR para el  marcador ROC  11~  bajo luz ultravioleta
Tabla 5.  Genotipos evaluados con el marcador ROC 11  420bp  tipo SCAR
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