Introducción 1
Modelado, análisis y control de un sistema biológico
biestable
El trabajo que se detalla en este documento compendia y profundiza en los estudios de modelado matemático que llevé a cabo durante el año 2011 para el proyecto de investigación 'Flashbacter' realizado por el grupo de trabajo UPO-Sevilla.
En el preámbulo del texto, se ha intentado situar al lector en el contexto de la Biología Sintética como marco científico y tecnológico. Además se recomienda la lectura del
“Anexo: Fundamentos Biológicos” al final de este documento para el lector no conocedor de aspectos de biología molecular.
El desarrollo que se explica a continuación elaborará una argumentación que pasará desde la presentación de las construcciones a modelar y su comportamiento esperado, hasta la contraposición de los resultados extraídos de las simulaciones realizadas en Matlab, con los resultados experimentales presentados en el concurso de biología sintética iGEM 2011.
Además, a lo largo de todo este estudio, se mostrarán el bajo el cual se han alcanzado todos los sistemas, se procederá a un análisis de estabilidad, robustez y bifurcaciones en los parámetros. Tras ellos, y con el enfoque estocástico, se simularán los modelos estudiados, logrando así una comprensión mayor de los mismos.
Por último, y antes de las conclusiones finales del documento, mostraremos los resultados experimentales que, el grupo de investigación UPO-Sevilla de la Universidad Pablo de Olavide, realizaron durante el año 2011.
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1. Objeto
El proyecto Flashbacter creó un sistema que variaba entre dos situaciones estables. Al igual que un conmutador puede estar abierto o cerrado, se planteó la posibilidad de tener un sistema viviente que asemejara su comportamiento al de un interruptor. Así, partiendo de diversos estudios actuales que habían conseguido sintetizar construcciones que actuaban de esa forma, se buscó ir un paso más allá en la creación de nuevas células que tuvieran un comportamiento más estable y robusto.
El problema surge en el momento de comprender el sistema una vez creado. Una bacteria es un sistema viviente cuyas interacciones internas no se pueden controlar desde el exterior. Aunque ésta se usa como chasis, i.e. como ambiente aislado, no es controlable cada aspecto de la evolución de las poblaciones. Además, tampoco es posible obtener una medición fiable de la cantidad de moléculas que se encuentran en su interior.
Dada la dificultad que se encuentra al tratar con sistemas vivientes donde no podemos predecir exactamente lo que ocurre en su interior, se hizo necesario tener una herramienta capaz de simular este funcionamiento de la forma más simple y rápida posible. Es esta necesidad la que se intentó cubrir con el trabajo que se presenta a continuación.
Por lo tanto, los objetivos generales que pretende cubrir este estudio son:
• Crear modelos fiables de los sistemas que comprende el proyecto Flashbacter.
• Lograr que las simulaciones de estos modelos reproduzcan el comportamiento cualitativo observado en laboratorio.
• Profundizar en el estudio de los modelos, de forma que podamos conocer la estabilidad y robustez de cada sistema.
• Modelar las acciones de control sobre los sistemas.
• Desarrollar herramientas de simulación, no sólo para estos sistemas.
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2. Alcance
Tras haber definido el objeto del proyecto, se comenzó a plantear la alcanzabilidad de tales propósitos.
En un primer enfoque se pensó en la posibilidad de estudiar el sistema en laboratorio, de forma que pudiéramos obtener diferentes datos acerca del comportamiento de algunas de las especies interviniente. De esta forma, podríamos aproximar los modelos, conociendo parte de las evoluciones reales, a la realidad.
Esta primera idea se desechó debido a la dificultad de estudio de etapas tan específicas de las reacciones moleculares como a la cantidad de datos necesarios.
Se comprendió que lo primero que se haría era comenzar con el modelo matemático e ir simplificándolo hasta hacerlo lo más manejable posible. Así, a partir de estudios anteriores de otros científicos, podríamos establecer una meta alcanzable y realista.
El modelo simplista debería ayudarnos a comprender de forma global las respuestas observadas en laboratorio. Sin embargo, el modelo no podría asemejarse cuantitativamente a lo observado a través de los experimentos dada la dificultad de encontrar experimentos válidos para nuestra construcción en la bibliografía.
Así, establecemos los siguientes puntos a alcanzar dentro de este estudio:
• Crear modelos cualitativos.
• Análisis de estabilidad de tales modelos.
• Análisis paramétrico y de bifurcaciones. Establecer valores críticos.
• Modelado cualitativo de las acciones de control. Comprender la manera en que éstas afectan al sistema autónomo.
Por lo que, los resultados que de este documento extraigamos:
• No reflejarán los comportamientos estudiados en laboratorio.
• Los valores de decisión que podamos obtener durante el desarrollo, serán orientativos y cualitativos, entendiendo que suponen una barrera para la estabilidad o robustez del sistema, pero no así su valor concreto.
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3. Antecedentes. Discusión de Metodologías
El problema al que nos enfrentamos al comenzar la tarea de modelado del sistema biológico es el de encontrar el método adecuado. Las redes reguladoras como sistemas biológicos reales no tienen un comportamiento ideal ni determinista, lo cual, implica que sea necesario utilizar técnicas de modelado no convencionales que nos pongan a disposición una visión más amplia y adecuada del funcionamiento interno de los entes biológicos que participan de la regulación.
Características de las Redes Reguladoras de Genes
La expresión de un gen es un proceso complejo regulado por varias etapas de diferentes niveles. Una red reguladora de genes se compone de la expresión de las proteínas reguladoras (que a su vez se descompone en la transcripción y traducción del gen), de su activación o inhibición, además de la síntesis y degradación de las especies intervinientes, tales como, ARN mensajero, ARN polimerasa, ribosomas, proteasas,... La gran cantidad de datos de los que se compone un sistema de este tipo convierte el estudio de su dinámica en una tarea compleja.
8 Introducción Desde la visión de la mecánica clásica, dadas unas condiciones iniciales y definidas las ecuaciones diferenciales que gobiernan el comportamiento del sistema, es posible conocer el estado final que alcanzará en un determinado tiempo. Sin embargo hay varias razones por las que en nuestro sistema, esto no es válido:
• Incluso si el sistema evolucionara de forma determinista respecto a posición, velocidad, aceleración de las partículas y población de las especies, le evolución de cada una de ellas no puede ser calculada deterministamente.
• No se pueden evitar las implicaciones que resultan de la indeterminación cuántica. No podemos saber cuándo se producirá la reacción.
• El sistema real no puede estar mecánicamente aislado.
Según Adam P. Arkin, “Las simulaciones deterministas son suficientes para predecir el comportamiento medio de los niveles de población, pero no pueden abordar cuestiones sobre el ruido, el cambio aleatorio entre estados estables del sistema, o el comportamiento del sistema con unas pocas moléculas de las especies claves. Estos temas se tratan con simulaciones estocásticas” [1].
Técnicas de modelado de redes reguladoras de genes
Se expondrán a continuación algunas de las técnicas de modelado para redes reguladoras de genes, que se utilizan hoy día entre numerosos investigadores. Tras la exposición de los diferentes enfoques se incluirá una decisión y los motivos que han llevado a adoptarlos.
Entre las más importante se encuentran: Modelo en EDOs (Ecuaciones Diferenciales Ordinarias) acopladas, Redes de Petri, Booleanas o Bayesianas, o Ecuaciones Estocásticas.
Introducción 9 ECUACIONES DIFERENCIALES ORDINARIAS
Es el método más utilizado para el estudio de sistemas en ingeniería y ha sido amplia su aplicación para el estudio de sistemas reguladores de genes. Gracias a esto, en la literatura podemos encontrar un amplio número de enfoques de modelado por ecuaciones diferenciales ordinarias así como de diversas leyes cinéticas.
La regulación se modela mediante ecuaciones cinéticas del nivel de expresión de cada componente del sistema como una función de la concentración del resto de componentes.
𝑥 = [𝑥1, … , 𝑥𝑛]′ ≥ 0 Concentración de las proteínas, y otros elementos.
𝑑𝑥𝑖
𝑑𝑡 = 𝑓𝑖(𝑥), 1 ≤ 𝑖 ≤ 𝑛 Ecuaciones cinéticas del nivel de expresión de cada elemento.
También existe una versión discreta en el caso en que se desee modelar los retrasos debidos al tiempo que requiere cada reacción en ocurrir.
Consideraciones
• Resulta adecuado utilizar el método cuando lo que son resultados cualitativos del sistema que se analiza.
• La simulación del funcionamiento de las redes se suele complementar con un análisis de bifurcaciones para investigar la sensibilidad de los regímenes permanentes y los valores de los ciclos límites de los parámetros.
• El principal problema que tiene este método es que es muy difícil encontrar valores para los parámetros cinéticos. Sólo están disponibles valores para sistemas que se han estudiado en profundidad.
• Los parámetros se estimaran usando técnicas de identificación de sistemas.
10 Introducción REDES BAYESIANAS
El regulador génico es un sistema donde cada módulo recibe un número de entradas y las procesa según combinaciones lógicas que confiere al sistema una característica de causalidad. Por otro lado, la red se componente de diversos subconjuntos que realizan una función específica. Las redes bayesianas representan comúnmente una red de variables cuyas relaciones son causales. La probabilidad condicional, de la que hace uso esta técnica, parece las más adecuada para interpretar las relaciones que se establecen entre los subsistemas de los que se compone una red reguladora compleja.
La estructura de los sistemas reguladores de genes se modela a través de un grafo 𝐺 = 〈𝑉, 𝐸〉. Los nodos representan los genes u otros elementos a los que se le asocie una variable aleatoria. Si el nodo es un gen, la variable describe su nivel de expresión. A cada variable aleatoria se le asocia una probabilidad condicional. El grafo G y las probabilidades condicionadas definen la red bayesiana.
𝑋 = {𝑥1, … , 𝑥𝑛} Variables aleatorias de la red 𝑖 ∈ 𝑉 , 1 ≤ 𝑖 ≤ 𝑛 Cada uno de los nodos de la red Pr{𝑥1, … , 𝑥𝑛} = ∏ Pr{𝑥𝑛𝑖=1 𝑖| 𝑝𝑎(𝑋𝑖)} Distribución de probabilidad de X Consideraciones
• Este método es muy atractivo ya que la base estadística es muy sólida, permitiendo incorporar los aspectos estocásticos de las redes reguladores y los ruidos de las mediciones de forma natural en el modelo.
• Tienen el problema de eliminar la dinámica implícita en la regulación de genes.
Una solución de este inconveniente es la de estudiarlos haciendo uso de las redes bayesianas dinámicas.
Introducción 11 REDES BOOLEANAS
Los nodos del gráfico de una red booleana, se asocian a un gen y otro elemento que participe en el sistema. Cada uno de los nodos se puede describir en 2 estados:
activo/inactivo. El estado de un gen se puede describir como una variable Booleana que indique si está activa su expresión o no. Las interacciones entre los elementos también se pueden representar mediante funciones Booleanas que calcule el estado de un gen a través de la activación de otros.
𝑥� = {𝑥�1, … , 𝑥�𝑛} Variables booleanas que describen el estado de un sistema regulador de genes de n elementos.
𝑥�𝑖(𝑡 + 1) = 𝑏�𝑖�𝑥�(𝑡)�, 1 ≤ 𝑖 ≤ 𝑛 El nuevo estado de cada variable booleana se calcula a través del estado actual y de una función booleana 𝑏�𝑖.
Consideraciones
• No es posible incluir los efectos de aleatoriedad o ruidos.
• Las redes booleanas son muy aconsejables en el caso de tener grandes redes reguladoras de genes. Las simplificaciones que hace sobre la estructura de estos sistemas, permite analizarlos de una manera muy eficiente.
• Las transiciones entre estados se asumen síncronos, pero el algoritmo no es capaz de tratar con situaciones no simultáneas.
• El nivel de expresión de un gen sólo se puede modelar como activo/inactivo
12 Introducción ECUACIONES ESTOCÁSTICAS MAESTRAS
Este método toma modelos discretos y estocásticos de la red reguladora. Tomando variables discretas para el número de moléculas de cada especie, y una función de distribución probabilística.
𝑝(𝑋, 𝑡 + ∆𝑡) = 𝑝(𝑋, 𝑡) �1 − � 𝛼𝑗∆𝑡
𝑚 𝑗=1
� + � 𝛽𝑗∆𝑡
𝑚
𝑗=1
Evolución temporal de las poblaciones
𝑚 El número de reacciones que pueden ocurrir en el sistema
𝛼𝑗∆𝑡 Probabilidad de que ocurra la reacción j en el intervalo de tiempo [𝑡, 𝑡 + ∆𝑡) Hallando ∆𝑡 → 0 se alcanza la expresión de la ecuación maestra
𝜕
𝜕𝑡 𝑝(𝑋, 𝑡) = � 𝛽𝑗− 𝛼𝑗 · 𝑝(𝑋, 𝑡)
𝑚
𝑗=1
Consideraciones
• La resolución analítica resulta aún más complicada que en el enfoque determinista
• Bajo ciertas condiciones, la ecuación maestra se puede simplificar en ecuaciones diferenciales estocásticas, permitiendo aligerar el coste computacional para la resolución numérica.
• La aproximación de la realidad molecular de una red reguladora es mucho más cierta.
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4. Decisión de las técnicas de modelado
Las técnicas basadas en redes (Booleanas, Bayesianas) parecen muy adecuadas para sistemas reguladores de subconjuntos y especies al permitir establecer relaciones muy simples entre ellas. Aunque nuestro sistema no sea demasiado complejo, lo que pretendemos conseguir con el modelo es hacer una descripción capaz de reproducir los resultados mostrados en laboratorio de la bacteria.
Las redes no profundizan en las dinámicas de las reacciones, y centran su estudio en el comportamiento global. Además, parece no ser posible introducir en las probabilidades de las transiciones, las dinámicas propias de las reacciones moleculares. Por ese motivo, las redes no permiten alcanzar el nivel de profundidad en el estudio del comportamiento ni identificar los procesos que confieren la estabilidad. No nos interesa este enfoque, ya que no parece que cubra el objetivo planteado.
Por otro lado, el modelado en ecuaciones diferenciales ordinarias no lineales plantea una situación determinista y los efectos del ruido propio de un sistema molecular no se modelan. Una resolución analítica no tiene sentido plantearla para mecanismos donde la aleatoriedad gobierna el desarrollo dinámico de las especies. Sin embargo, parece muy adecuado comenzar con esta técnica para obtener unas primeras nociones del comportamiento global al que tenderá en función de los diferentes estados que pueda alcanzar.
Por último, acudimos a las ecuaciones estocásticas maestras. Parece el más adecuado de todos para hacer un estudio cuantitativo y cualitativo del sistema. El inconveniente que tenemos es que no tenemos tantas herramientas como en el caso anterior para comprender la estabilidad y robustez del sistema.
Por estos motivos, nos parece adecuado llevar a cabo un doble modelado.
Comenzaremos estudiando el sistema a través del método por EDO. Tras el análisis de estabilidad y de bifurcaciones en los parámetros y una comprensión del comportamiento global que muestra el sistema, acudimos al modelado por ecuaciones estocásticas maestras.
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