Estudio de la capacidad inmunomoduladora de las células madre mesenquimales murinas en ausencia de los receptores TLR3 y TLR4: evaluación en modelo experimental de colitis aguda

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3.3. Capacidad inmunomoduladora de las MSCs ... 13

3.4 MSCs y Receptores tipo Toll (TLRs) ... 16

2.5 Receptores TLR3 y TLR4 ... 17

3.6 Aplicaciones clínicas de las MSCs ... 18

3.7 Modelo experimental de colitis aguda ... 19

CAPÍTULO 4: HIPÓTESIS 21 CAPÍTULO 5: OBJETIVO GENERAL 22 CAPÍTULO 6: OBJETIVOS ESPECÍFICOS 23 CAPÍTULO 7: METODOLOGÍA 24

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7.5.2 Diseño experimental in vivo ... 35 6.6 Método estadístico de análisis de las muestras ... 38

CAPÍTULO 8: RESULTADOS 39

8.1. Evaluación de la capacidad inmunosupresora de MSCs TLR3 y TLR4 ... 39 knockout a través de la proliferación de los linfocitos ... 39 8.2 Evaluación de la capacidad inmunosupresora de MSCs TLR3 y TLR4 knockout a través de la producción de óxido nítrico. ... 45 8.3 Evaluación del efecto inmunosupresor de MSCs TLR3 y TLR4

knockout en un modelo murino experimental de colitis aguda. ... 48 8.3.1 Evaluación de signos en colitis aguda experimental... 48 8.3.2 Evaluación de acortamiento de colon en colitis aguda ... 50

CAPÍTULO 9: DISCUSIÓN 52

CAPÍTULO 10: CONCLUSIONES 56

CAPÍTULO 11: REFERENCIAS 57

CAPÍTULO 12: ANEXOS 61

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ÍNDICE DE FIGURAS:

FIGURA 3.1: Resumen de las propiedades inmunomoduladoras de las MSCs 16 FIGURA 3.2: Características de los fenotipos MSC1 y MSC2 (Adaptado de

Betancourt A., 2012) ... 18

FIGURA 7.1: Diseño experimental in vitro ... 27

FIGURA 7.2: Cámara de Neubauer ... 29

FIGURA 7.3: Diseño experimental in vivo ... 35

FIGURA 8.1: Detección de la proliferación de MSCs wild type pre tratadas con mitomicina C a diferentes concentraciones mediante kit Cell Proliferation Reagent WST-1. ... 40

FIGURA 8.2 Estandarización de la concentración de Linfocitos activados con concanavalina ... 41

FIGURA 8.3 Absorbancia de co-cultivos (MSCs:Linfoticos) de MSC wild type TLR3 knockout y TLR4 knockout. ... 43

FIGURA 8.4 Porcentaje de proliferación de linfocitos en cocultivo con MSCs wild type, TLR3 y TLR4 knockout a diferentes proporciones celulares... 44

FIGURA 8.5 Curva de calibración NaNO2.. ... 46

FIGURA 8.6 MSCs wild type secretan mayor concentración de NO que TL3 y TLR4 knockout. ... 47

FIGURA 8.7 Evaluación del efecto inmunosupresor de MSCs TLR3 y TLR4 knockout en un modelo murino de colitis aguda a través de los signos clínicos. ... 49

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ÍNDICE DE TABLAS

-MEM completo para cada formato

de flask ... 30

TABLA 7.2: Concentración de LPS e INF- ... 32

TABLA 7.3: Concentración de MSC sembradas por pocillo ... 33

TABLA 7.4: Grupos del modelo murino experimental de colitis aguda ... 36

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CAPÍTULO 1: RESUMEN

Las células madre mesenquimales (MSCs) son células multipotentes con morfología fibroblastoide y capacidad de diferenciación hacia distintos linajes mesodérmicos. Además poseen una alta capacidad de proliferación in vitro y son fáciles de aislar. Estas características las hace muy atractivas para su uso en terapia celular, por lo que se han convertido en una herramienta útil en medicina regenerativa.

Actualmente se sabe que las MSCs tienen un papel importante en la regulación del sistema inmunológico, siendo blanco de estudios, como posible tratamiento para enfermedades autoinmunes e inflamatorias. Se ha demostrado que las MSCs pueden suprimir la activación, proliferación y función de diversas células del sistema inmune.Dentro del sistema inmune innato, en los últimos diez años se han descrito receptores que son reconocidos por los patrones moleculares de patógenos, los cuales se denominan receptores tipo Toll. Estos se expresan en las MSCs, siendo aún más importante los hallazgos sobre la relación que estos tienen sobre la capacidad inmunoreguladora de las MSCs, ya que puede ser modulada mediante la estimulación de los TLR, específicamente de TLR3 y TLR4.

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fueron suficientes como para revertir el efecto inmunosupresor de las MSCs wild Type.

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CAPÍTULO 2: INTRODUCCIÓN

Las Células Madre Mesenquimales (MSCs) son células multipotentes caracterizadas por la capacidad de diferenciarse hacia tejidos de origen mesodermales tales como adipocitos, condrocitos y osteoblastos. Primero fueron aisladas y caracterizadas de médula ósea, pero actualmente pueden ser obtenidas de una gran variedad de tejidos.

Las MSCs han llamado mucho la atención en el último tiempo ya que parecen escapar del reconocimiento del sistema inmune y ejercen efectos anti- inflamatorio e inmunomoduladores a través de la supresión de l inf oc i t os T, B, c é lu l a s dendríticas y NK. Es por estas características que el uso de las MSCs ha cobrado una gran relevancia para el tratamiento de enfermedades auto-inmune e inflamatorias.

Estudios recientes indican que las MSCs expresan receptores tipo

toll (TLRs), los cuales juegan un papel crucial para establecer la inmunomodulación debido a que censan el medio ambiente mediante el reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos.

En el año 2010 Waterman y colaboradores propusieron que la activación de los receptores TLR3 y TLR4 en MSCs humanas induciría un aumento o disminución, respectivamente; de las propiedades inmunosupresoras de las MSCs.

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los receptores TLR3 y TLR4 mediante un ensayo de proliferación de linfocitos y un modelo murino de colitis experimental aguda.

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CAPÍTULO 3: MARCO TEÓRICO

3.1 Células Madre

Las células madre, también llamadas células troncales son las responsables de la formación y regeneración de los tejidos desde el estado embrionario al adulto. Son células indiferenciadas que a través de la replicación tienen la capacidad de diferenciarse a células especializadas (Burt RK, 2008).

Las células madre pueden clasificarse principalmente según dos criterios: Su potencial de diferenciación y su origen (Valero- Palencia P, 2011).

Según su potencial de diferenciación pueden dividirse en: totipotentes, capaces de generar un organismo completo; pluripotentes, células que pueden dar origen a cualquiera de las tres capas germinales embrionarias (mesodermo, endodermo y ectodermo); multipotentes, aquellas capaces de originar precursores relacionados solamente con una de las tres capas embrionarias; unipotentes, células muy comprometidas y con un potencial de diferenciación muy limitado que se diferencian hacia un único tipo celular(Munévar J, 2005).

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indiferenciadas pudiendo originar diferentes tipos celulares más especializados (Ingrid Ordás, 2010). En la actualidad, la lista de células madre adultas caracterizadas es muy amplia, pero de entre todas ellas, las células madre mesenquimales son unas de las que más atención han concentrado a lo largo de los últimos años.

3.2. Células Madre Mesenquimales

Las células madre mesenquimales (MSC) son células multipotentes con morfología fibroblastoide y alta capacidad de diferenciación hacia distintos linajes celulares de origen mesodérmico tales como condrocitos, osteocitos y adipocitos entre otros. Estas células pueden ser aisladas principalmente de medula ósea, sangre de cordón umbilical y adipocitos, de donde se ha logrado establecer cultivos que han permitido estudiar sus características funcionales y fenotípicas (Arévalo Romero J, 2007).

La Sociedad Internacional de Terapia Celular (ISCT) en el año 2006 estableció 3 criterios mínimos para definir las MSCs(Macías Abraham C, 2010):

I. Deben ser plástico adherentes en condiciones estándar de cultivo.

II. Deben expresar antígenos de superficie específicos, CD73, CD90, CD105 y ser CD45 y CD34 negativo (marcadores de células hematopoyéticas).

III. Deben ser capaces de diferenciarse in vitro a osteoblastos, adipocitos y condrocitos.

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estas son las responsables de que los linfocitos rechacen los tejidos trasplantados y detecten elementos extraños, por lo que son prácticamente indetectables al sistema inmune. Esta característica las hace muy atractivas para la terapia celular, por lo tanto se han convertido en una herramienta útil en medicina regenerativa, utilizándose como fuente celular para reparación de diversos tejidos tales como: óseo y cartilaginoso.

El descubrimiento de que las MSCs contribuyen a la regeneración de tejidos, mediante la modulación de la inflamación, ha revolucionado la terapia celular en el tratamiento de enfermedades inflamatorias. Sin embargo los mecanismos por los que las MSCs y la inflamación interactúan durante diversos procesos patológicos para regular la respuesta inmune no han sido totalmente entendidos y se encuentran bajo intenso estudio.(Wang Y, 2014).

3.3. Capacidad inmunomoduladora de las MSCs

El sistema inmunitario se puede dividir en inmunidad innata y adaptativa. Los principales componentes de la inmunidad innata son los macrófagos, células dendríticas, células asesinas naturales (NK) entre otras; mientras que la inmunidad adaptativa se compone principalmente de los linfocitos B y T (Figura 3.1).

Muchos estudios han demostrado que la modulación del sistema inmune se debe a su capacidad de inhibir la proliferación de los linfocitos T, pero hoy en día se sabe que son capaces de regular la actividad de diversas células del sistema inmune, incluyendo macrófagos, neutrófilos, linfocitos NK, células dendríticas, linfocitos T y linfocitos B(López Y, 2009).

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o por virus (Di Nicola, 2002). Hoy en día se sabe que esta capacidad inmunosupresora de las MSCs es dependiente del entorno inflamatorio presente en el microambiente (Bartholomew, 2002). Más aún, se propone que la actividad inmunosupresora de las MSCs no sería espontánea, sino que requiere un proceso de “licenciamiento” en un ambiente apropiado para ejercer sus efectos inmunosupresores (Dazzi F, 2007). Krampera et al., define el término “licenciamiento” como un proceso de múltiples pasos que conduce a la maduración funcional de las MSCs e implica:

1. La “Activación” mediante citoquinas inflamatorias tales como IFN-γ, IL-1α/β o Factor de Necrosis tumoral-α (TNF-α), las cuales son producidos de manera temprana como consecuencia de la acción de antígenos y activación de células efectoras inmunes.

2. La prevalencia de estímulos activadores en la MSCs por sobre las señales que pueden inhibir sus mecanismos inhibitorios.

3. El momento correcto o tiempo adecuado donde ocurra la interacción MSC-células inmunes efectoras que posibiliten su activación in situ. (Krampera, 2011).

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de NO, así como el aumento en la expresión de moléculas de adhesión que favorecen el contacto entre la MSC y el linfocito. Se demostró que esta interacción es fundamental para que el NO ejerza su efecto sobre el linfocito (Ren G., 2008). Mientras, que el IFN-γ/NO es importante para el modelo murino, en humanos la inhibición de la proliferación de células T no se ve mayormente afectada por la producción de NO. Alternativamente, la activación de la enzima indolamina-2,3 dioxigenasa (IDO) es un factor clave para MSCs humanas. IFN-γ estimula la producción de IDO en MSCs humanas (Ryan, 2007), y actúa suprimiendo la proliferación de células T, ya sea por su depleción de triptófano en el micro entorno local ó al causar un aumento en los metabolitos de quinurenina.

Como se mencionó anteriormente, las MSCs expresan receptores tipo

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FIGURA 3.1: Resumen de las propiedades inmunomoduladoras de las

MSCs

(Liu L., 2012)

3.4 MSCs y Receptores tipo Toll (TLRs)

La MSCs interactuan con muchos componentes del sistema inmunitario innato, entre ellos encontramos los receptores tipo Toll (TLRs) (Choi H, 2011). Estos pertenecen a la familia de receptores de reconocimiento de patrones (PRRs) y participan en el reconocimiento de estructuras moleculares especificas asociadas a patógenos (PAMPs), que son estructuras moleculares únicas en los microorganismos.

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Hasta la fecha han sido descritos 10 TLR funcionales en humanos y 12 en ratón (Mesa-Villanueva M., 2006). Estos receptores son divididos en dos subgrupos dependiendo de su localización celular y ligandos PAMPs. El primer grupo se expresa en la superficie celular y reconoce componentes de membrana principalmente microbianos, tales como lipoproteínas y lípidos (TLR1, TLR2 y TLR6); lipopolisacárido (LPS) (TLR4) y flagelina (TLR5). El segundo grupo se expresa en el compartimento intracelular, en donde reconoce ARN de doble cadena (TLR3), ARN viral monocatenario (TLR7, TLR8) y ADN no metilado de bacterias y virus (TLR9).

2.5 Receptores TLR3 y TLR4

El receptor TLR3 es un receptor intracelular que se puede encontrar en la membrana de los endosomas y reconoce ARN bicatenario (dsRNA) que se produce en la célula después de la infección por virus. Además, el TLR3 también puede ser activado al utilizar el ligando artificial ácido poliribosínico-policitidílico, o Poly I:C, un análogo sintético de ARN de doble hebra (Fischer M., 2008). Por otro lado el receptor TLR4 es un receptor extracelular y reconoce el Lipopolisacárido (LPS), que es un componente estructural de la pared externa de las bacterias gram-negativas, y que es altamente inmunogénico.

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FIGURA 3.2: Características de los fenotipos MSC1 y MSC2 (Adaptado de Betancourt A., 2012)

3.6 Aplicaciones clínicas de las MSCs

Debido a sus habilidades excepcionales para diferenciarse en diferentes líneas y sus propiedades inmunomoduladoras, las MSCs se han probado como un agente terapéutico en la medicina regenerativa y enfermedades inflamatorias. Sus efectos antiinflamatorios han sido demostrados en un gran número de modelos experimentales in vivo, incluyendo enfermedad de injerto contra huésped (GvHD), encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), lupus eritematoso sistémico (SLE), diabetes de tipo 1, artritis inducida por colágeno (CIA), enfermedad inflamatoria intestinal (EII) y enfermedad de las vías respiratorias alérgicas (Akiyama., 2012)(Spaggiari., 2006).

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MSCs no parece estar asociado con su diferenciación en los tipos de células residentes, sino parece estar básicamente relacionado con un efecto antiproliferativo y antiinflamatorio.

3.7 Modelo experimental de colitis aguda

La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es una patología del tracto gastrointestinal crónica y progresiva. La EII incluye dos principales entidades clínicas, la colitis ulcerosa (CU) y la enfermedad de Crohn (EC). Su incidencia y prevalencia se han incrementado en el último tiempo paralelamente al progreso de la sociedad (Quera., 2008).

Dada la amplia variedad de factores etiológicos y la heterogeneidad del complejo genético de la EII humana, gran parte de la actual comprensión de la patogénesis de la EII ha venido de los estudios de varios modelos animales (Strober W., 2002). Estos modelos experimentales se asemejan tanto inmunológicamente como histopatológicamente en varios aspectos a la enfermedad en humanos, por lo que se han convertido en herramientas esenciales para investigar los mecanismos fisiopatológicos e inmunológicos de inflamación de la mucosa crónica.

Dentro de los modelos experimentales de EII existen dos formas de inducción, la primera colitis inducida por el sulfato sódico dextrano (DSS), y la segunda colitis inducida por el ácido 2,4,6 trinitrobenceno sulfónico (TNBS) (Philip, 2009).

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CAPÍTULO 4: HIPÓTESIS

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CAPÍTULO 5: OBJETIVO GENERAL

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CAPÍTULO 6: OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Evaluar proliferación de linfocitos en co-cultivos con MSCs TLR3 y TLR4 knockout mediante ensayo de proliferación con WST-1 a través de espectrofotometría.

2. Cuantificar la secreción de óxido nítrico (factor inmunosupresor) por MSCs TLR3 y TLR4 knockout mediante un ensayo espectrofotométrico con reactivo de Griess.

3. Evaluar el efecto inmunosupresor de MSCs TLR3 y TLR4

knockout en un modelo murino experimental de colitis aguda a través de : i. Evaluación de signos clínicos de la enfermedad

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CAPÍTULO 7: METODOLOGÍA

7.1. Tipo de estudio

Este estudio corresponde a una investigación de tipo experimental tanto in vivo como in vitro, donde se analizó la capacidad inmunosupresora de las células madre mesenquimales murinas control o wild type, como células madre mesenquimales murinas deficientes (knockout) en los receptores TLR3 y TLR4.

7.2. Lugar de realización

La investigación se realizó en el Laboratorio de Inmunología Celular y Molecular del Centro de Investigación Biomédica (CIB) de la Universidad de Los Andes, ubicado en San Carlos de Apoquindo 2200, comuna de Las Condes, Santiago, Chile. En el período comprendido entre los meses de Marzo a Julio del año 2015.

7.3. Muestra

Para los estudios tanto in vitro como in vivo se utilizaron ratones adultos C57BL/6 pertenecientes al Bioterio del Laboratorio de Inmunología Celular y Molecular de la Universidad de los Andes, distribuidos originalmente por Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine, USA). Los animales fueron utilizados para extraer células linfocitarias, MSCs y para el modelo de colitis aguda

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bazo de ratones adultos C57BL/6 antes mencionadas. Las células madre mesenquimales deficientes en TLR3 y TLR4 provenían de ratones knockout

para TLR3 y TLR4, ambos homocigotos para la deleción del gen. Las MSCs ya habían sido aisladas previamente por el laboratorio de Inmunología y fueron facilitadas para desarrollar este trabajo. Sin embargo, queremos destacar que las células MSCs aisladas deben cumplir los siguientes criterios:

Criterios de inclusión:

 Las células deben provenir de ratones sanos.

 Las células madre mesenquimales se deben adherir al plástico.

 Las células madre mesenquimales se deben diferenciar hacia diferentes linajes celulares, tales como: osteoblastos, condrocitos y adipocitos.

 Las células madre mesenquimales deben expresar marcadores de superficie propios de estas células (CD73, CD90 y CD105, entre otros).

Criterios de exclusión:

 Células que provengan de ratones enfermos.

 Las células madre mesenquimales que no se adhieren al plástico.

 Las células madre mesenquimales que no se diferencian a células de otros linajes.

 Las células madre mesenquimales que expresen un alto porcentaje de marcadores de superficie hematopoyéticos, como CD34 y CD45.

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Por otra parte, para el experimento in vivo los animales se obtuvieron de ratones adultos C57BL/6 pertenecientes al Bioterio del Laboratorio de Inmunología Celular y Molecular de la Universidad de los Andes. Estos son mantenidos en jaulas con filtro HEPA (microaisladores) con comida y agua autoclavada, en una pieza con temperatura controlada de 22°C – 24°C, y foto período 12h luz/12h oscuridad, regidos bajo las normas internacionales de mantención de animales de experimentación y manipulados de acuerdo a la guía del Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Para ello se establecieron los siguientes criterios para la selección de los animales:

Criterios de inclusión:

 Ratones deben estar sanos.

 Debe tener un peso promedio entre 20 a 25 gramos.

 Debe tener una edad promedio de 10 a 14 semanas.

Criterios de exclusión:

 Ratones con presencia de algún signo de enfermedad autoinmune o intestinal.

 No debe pesar menos de 18 gramos

 No debe tener menos de 10 semanas

7.4. Variables a estudiar

7.4.1 Variables dependientes:

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Respuesta que se generada a partir de los diferentes estímulos a los que se someten las MSCs.

7.4.2 Variables independientes:

Ligandos de TLRs que se utilizaran para la estimulación de las MSCs (LPS, Poly( I:C)).

7.5. Diseño experimental

7.5.1. Diseño experimental in vitro

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7.5.1.1Descongelamiento de MSCs

Las MSCs previamente aisladas, tanto células controles como kockout

se mantienen congeladas a -80°C en medio de congelación (10% de Dimetil Sulfóxido (DMSO) y 90% de suero fetal bovino certificado), por lo tanto es necesario descongelarlas para su utilización. Este proceso se realizó agregando medio de cultivo α- MEM completo, el cual se prepara agregando L- glutamina al 1%, penicilina-estreptomicina al 1% y suero fetal bovino certificado al 10%, completando a él volumen requerido con α- MEM. Luego de agregado el medio a las células se centrifugan por 7 minutos a 1700 rpm y se resuspendió el pellet en 1 mL de α- MEM completo.

7.5.1.2 Cultivo de MSCs

Para realizar el cultivo antes fue necesario realizar el cálculo para determinar la cantidad de células que se necesitan para la siembra de MSCs en frascos o placas de cultivo. Primero se contaron las células en la cámara

Neubauer y se multiplicó por el factor de dilución de la muestra (Volumen total/ Volumen muestra) y luego se aplicó la fórmula de conversión para calcular la concentración de células que se encuentran en 1 mL (figura 7.2). Luego de obtenida la cantidad de células necesarias para siembra, se efectuó el cultivo en una placa de 96 pocillos con medio de cultivo a-MEM completo. La incubación se realizó en la estufa a 37°C con 5% de CO2 y en ambiente estéril, donde se mantuvieron hasta lograr una confluencia del 80%.

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7.5.1.3 Tripsinización

La Tripsinización se basa en la capacidad de la tripsina (enzima) de remover células plástico adherente desde la superficie de un contenedor, para luego ser sembradas en nuevos frascos de cultivo (subcultivo). Cada ciclo de creación de un subcultivo de células es denominado pasaje celular.

Una vez que las células alcanzaron una confluencia de un 80% estas se tripsinizaron, para lo cual se eliminó primero el medio de cultivo del contenedor o flask, posteriormente se efectuó un lavado con buffer fosfato salino 1X (PBS). Seguido se agregó el reactivo tripsina-EDTA 1X, y se incubo por 5 minutos a 37°C con 5% de CO2. Al término de la incubación se observó al microscopio las células para corroborar que estas se encontraran totalmente despegadas. Luego para bloquear el efecto la tripsina es necesario agregar el doble de volumen α- MEM completo con respecto a la cantidad de tripsina 1X, según tabla adjunta. El contenido se centrifugo por 7 minutos a 1700 rpm, eliminando el sobrenadante y resuspendiendo el pellet en 1 mL de α- MEM completo. Finalmente se realizó el recuento de las células en cámara de Neubauer.

Cámara de Neubauer

Fórmula

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TABLA 7.1 -MEM completo para cada formato de flask

7.5.1.4 Tratamiento de MSCs con mitomicina C

La mitomicina C es un agente alquilante que desorganiza el ADN e inhibe su síntesis, para que se inhiba la replicación de la célula, la mitomicina C debe activarse, esta activación es producida por agentes reductores, por enzimas microsomales, o por la exposición a pH ácido. El metabolito activo se une con el ADN formando reticulaciones lo que resulta en la inhibición de la síntesis de ADN. La mitomicina se une al ADN en las bases adyacentes de guanina en el surco menor del ADN. La unión puede ser monofuncional o bifuncional, creándose en este último caso puentes de unión capaces de impedir la duplicación del DNA. (García, 2003)

La mitomicina tiene una actividad sobre el ciclo celular no específica, pero los máximos efectos citotóxicos se producen en las células a finales de las fases G1 y S. La mitomicina también actúa como un sensibilizador de la radiación. La mitomicina causa roturas cromosómicas y las hebras de ADN se acortan lo que conduce a aberraciones cromosómicas (Flórez, 1997).

Para agregar la mitomicina C en los cultivos de MSCs primero fue

necesario realizar una dilución del stock de 500µg/ml a 10µg/ml, y luego calcular la cantidad necesaria para un volumen final de 200µL (4µL), luego se

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lavó el medio de las MSCs y se agregó la mitomicina C, la cual se incubo por 30 minutos a 37°C con 0,5% de CO2, pasado el tiempo de incubación se retiró la mitomicina C lavando el medio en el que se encontraba.

7.5.1.5Licenciamiento de MSCs con LPS e INFγ.

Las MSCs son capaces de modular la respuesta del sistema inmunológico a través de su capacidad de inhibir la proliferación de linfocitos T (Bartholomew, 2002) hoy se sabe que las MSCs son capaces de regular la actividad de las células T, células B, Células Dendríticas (DCS), células natural killer (NK) y macrófagos (Asari S., 2009), ya sea por contacto célula/célula o a través de la producción de factores solubles.

Esta inhibición de la proliferación de células T se produce bajo un entorno inflamatorio, pero in vitro es inducida por un activador mitogénico, aloantigénico o por un virus (Di Nicola, 2002) esta activación o licenciamiento con citoquinas pro-inflamatorias (LPS, IFN-γ, TNF-α, y / o IL-1β) provoca la activación de la capacidad inmunosupresora en la MSC.

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TABLA 7.2: Concentración de LPS e INF-

Para realizar el licenciamiento primero se debe lavar el medio donde se encuentran las células, luego se colocan los estímulos por 1 hora a 37°C con 0,5% de CO2, transcurrido el tiempo se eliminó el medio con los estímulos y se les agregó el nuevo medio.

7.5.1.6 Obtención de esplenocitos

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minutos a 1700 rpm, donde se descartó el sobrenadante y se resuspendió el pellet en 5 ml de RPMI, obteniéndose de esta forma los linfocitos para el co-cultivo.

7.5.1.7 Co- cultivo de MSCs con linfocitos activados con Concanavalina A

Primero se determinó relación MSCs/linfocitos (ratio) según el recuento obtenido de MSCs. Para la realizar el montaje del co-cultivo primero se sembraron las MSCs murinas según tabla adjunta, incubándose por 4 horas para lograr que estas se adhirieran a la placa, luego se agregaron los linfocitos y por último concanavalina A (activador mitógeno policlonal, que produce proliferación de linfocitos) a una concentración de 2 µg/mL. Una vez lista la placa, se incubo por 3 días a 37°C con 5% de CO2. Durante estos días se revisó la placa, observándola al microscopio una vez al día para mantener el estado de las células.

TABLA 7.3: Concentración de MSC sembradas por pocillo

7.5.1.8. Medición de proliferación de linfocitos a través de WST-1

Pasados los 3 días de incubación del co-cultivo se evaluó la proliferación de linfocitos a través de WST-1, este método consiste en un

MSCs/cm2 20000 10000 5000 2500 1250 625

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ensayo colorimétrico que se basa en la escisión de una sal de tetrazolio, WST-1 (4- [ 3- ( 4 - yodofenil) -2- ( 4 - nitrofenil) -2H- 5 - tetrazolio ] -1,3- benceno disulfonato), por deshidrogenasas mitocondriales para formar formazán en células viables. Cuanto mayor es el número de células viables, metabólicamente activas, mayor es la cantidad de producto de formazán producido después de la adición de WST-1.

A los co-cultivos dispuestos en una placa de 96 pocillos se le agregaron 10 µL de WST-1 por cada 100 µL de volumen final. Para lograr la homogenización de las sales de tetrazolio con el co-cultivo se realizó una agitación fuerte por 2 minutos, luego se incubo por 4 horas a 37°C con 5% de

CO2. Después de este periodo se cuantificó la cantidad de formazán producido

a través del lector de placa ELISA, INFINITE F50, marca TECAN a 450 nm con

3 segundos de agitación suave.

7.5.1.9. Medición de Óxido Nítrico (NO)

Recientemente se ha propuesto que la capacidad inmunosupresora de las MSCs se induciría en un microambiente pro-inflamatorio, donde las MSCs serían capaces de inhibir la proliferación de linfocitos T de manera eficiente. Uno de los mecanismos que poseen las MSCs murinas está dado por la enzima óxido nítrico sintasa inducible (iNOS), la cual produce óxido nítrico, molécula que es inmunosupresora a altas concentraciones.

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depositaron en una microplaca para ELISA, posteriormente se agregaron 50 μL del reactivo Griess y se incubo a 37°C con 5% de CO2 durante 30 minutos.

Una vez terminada la incubación se procedió con la lectura de la placa en lector de placa ELISA, INFINITE F50, marca TECAN a 492 nm con 3 segundos de agitación suave. Los resultados se extrapolaron con la ecuación entregada por la curva de calibración para obtener la concentración de óxido nítrico.

Cada vez que se realizó este procedimiento, se realizó una curva de calibración con una solución estandarizada de nitrato de sodio de concentración 1 M, a partir de la cual se realizaron diluciones seriadas con nueve concentraciones distintas que van desde 100 μM a 0 μM de Nitrito de Sodio (NaNO2).

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7.5.2.1 Inducción y mantención de colitis

La inducción química de colitis aguda por DSS está establecida en modelos animales de inflamación intestinal y ha sido usada por más de 2 décadas en estudios preclínicos, para evaluar la patogénesis de EII.

Para la realización del modelo murino experimental de colitis aguda se seleccionaron ratones C57BL/6 de 8 a 10 semanas con un peso promedio de 19 a 21 gramos, que fueron mantenidos bajo las normas internacionales de mantención y cuidado de animales de experimentación (IACUC). Éstos fueron distribuidos en cinco grupos experimentales: Control Sano, Colitis, Colitis más MSCs wild type, Colitis mas MSCs TLR3 knockout y Colitis mas MSCs TLR4

knockout, cada uno con 7 o 8 animales por grupo como se muestra en la siguiente tabla.

TABLA 7.4: Grupos del modelo murino experimental de colitis aguda

GRUPO N° DE RATONES

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necesario dejarlo en el agitador por 1 hora a 100 rpm, luego fue filtrado bajo campana de flujo laminar con filtro Whatman 0,45µm.

Para la inducción de la enfermedad en los grupos colitis, el día 0 se suministró el DSS al 2,3% el cual se mantuvo por 7 días y luego se cambió por agua sin DSS hasta el día 11.

El día N°1 se inyectaron vía intraperitoneal MSCs: wild type, TLR3

knockout y TLR4 knockout, a cada ratón se le administraron 2,3 x 106 celulas diluidas en 100 μL de PBS 1X.

Diariamente se registraron los signos clínicos, mediante el índice de la actividad de la enfermedad, en todos los animales. Registrando él % de pérdida de peso corporal, la consistencia de las heces y la presencia de sangre oculta (Kit de hemorragias ocultas, Valtek), a través del método de puntuación como se muestra en la Tabla 7.5.

TABLA 7.5: Criterios para evaluar el índice de actividad de la enfermedad (Murthy et al., 1993).

4 >15 Diarrea Sangramiento

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Además se evaluó el porcentaje de supervivencia de cada grupo experimental.

6.6 Método estadístico de análisis de las muestras

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CAPÍTULO 8: RESULTADOS

8.1. Evaluación de la capacidad inmunosupresora de MSCs TLR3 y TLR4

knockout a través de la proliferación de los linfocitos

Se ha demostrado que las MSCs pueden ejercer inmunomodulación sobre diferentes células del sistema inmune, entre ellas podemos encontrar: inhibición de la proliferación de linfocitos T y B e inhibición de las células NK mayor será cantidad de producto de formazán producido.

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concentración celular. El objetivo era determinar la concentración adecuada de MSCs a sembrar por pocillo, que fuese sensible a detectar diferencias entre cada condición experimental. Descartar aquellas concentraciones de MSCs que saturaran el sistema (Elevados niveles de Absorbancia, fuera del rengo lineal de detección de la técnica)

FIGURA 8.1: Detección de la proliferación de MSCs wild type pre tratadas con mitomicina C a diferentes concentraciones mediante kit Cell Proliferation Reagent WST-1.Los datos muestran la

absorbancia de MSCs wild type a distintas densidades de cultivo: 20000 células/cm2, 10000 células/cm2, 5000 células/cm2, 2500 células/cm2, 1250 células/cm2. Método: Las MSCs fueron sembradas y luego de que estas se encontraran adheridas al plástico se les agrego la mitomicina C, después de 72 horas de incubación a 37°C con 0,5% de CO2, se midió la proliferación a través del método de WST-1 mediante

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Luego de estandarizadas las distintas concentraciones de MSCs a utilizar fue necesario estandarizar la concentración de linfocitos por condición experimental, para lo cual medimos la proliferación de dos concentraciones: 100000 linfocitos/cm2 y 200000 linfocitos/cm2 con concentraciones creciente de concanavalina A como se muestra en la figura 8.2. Podemos observar que en la concentración de 200000 linfocitos/cm2 (figura 8.2 B) existen diferencias significativas entre la absorbancia de los linfocitos sin concanavalina A y los linfocitos con concentraciones de 1 µg/mL, 2 µg/mL y 4 µg/mL de concanavalina A, por el contrario no se observan diferencias significativas con una concentración de 100000 linfocitos/cm2, mostrando entonces ser menos sensible a esta concentración celular (figura 8.2 A).

FIGURA 8.2 Estandarización de la concentración de Linfocitos activados con concanavalina A para realizar ensayos de proliferación con kit Cell Proliferation Reagent WST-1. La figura muestra la absorbancia de dos concentraciones del linfocitos: 100000 linfocitos/cm2 (A) y 200000 linfocitos/cm2 (B) activados con concanavalina A en concentraciones crecientes de 0,5 µg/mL, 1 µg/mL, 2

µg/mL y 4 µg/mL, cultivados por 72 horas a 37°C con 0,5% de CO2,, después de este periodo se midió la

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Después de estandarizada la concentración de MSCs y linfocitos a utilizar se realizaron los ensayos de inmunosupresión con MSCs wild type, TLR3 knockout y TLR4 knockout con concentraciones decrecientes desde 10.000 MSCs/cm2, 5.000 MSCs/cm2, 2.500 MSCs/cm2, 1.250 MSCs/cm2 hasta 625 MSCs/cm2 con una concentración constante de linfocitos de 200.000 linfocitos/cm2 activados con 2 µg/mL de concanavalina A respectivamente, donde se analizó la inmunosupresión a los distintos ratios MSCs/Linfocitos como se muestra en la figura 8.3.

Para las MSCs wild type (figura 8.3.A) se observó una tendencia a disminuir la absorbancia de los linfocitos con MSCs a partir del ratio 1/40 hasta el ratio 1/160 con respecto a la absorbancia de los linfocitos sin MSCs. En MSCs TLR3 knockout (figura 8.3.B) se observó una disminución significativa en ratios 1/20, 1/40 y 1/80 con respecto al control, por último en MSCs TLR4

knockout (figura 8.3 C) solo en los ratios 1/80 y 1/160 hubo una disminución significativa en la proliferación de los linfocitos con respecto a los linfocitos sin MSCs.

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FIGURA 8.3 Absorbancia de co-cultivos (MSCs:Linfoticos) de MSC wild type TLR3

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MSCs wild type (A), TLR3 knockout (B)y TLR4 knockout (C) en concentraciones de 1.0000 células/cm2, 5.000 células/cm2, 2.500 células/cm2, 1.250 células/cm2 y 625 células/cm2 y co-cultivos en ratios 1/20,

1/40, 1/80, 1/160 y 1/320 respectivamente, medidos a través del método de WST-1 mediante espectrofotometría. Método: primero se sembraron las diferentes concentraciones de MSCs (10.000 células/cm2, 5.000 células/cm2, 2.500 células/cm2, 1.250 células/cm2 y 625 células/cm2) , luego que estas

se encontraran adheridas al plástico se les agrego la mitomicina C por 30 minutos de modo de detener su proliferación, a continuación se licenciaron con LPS (0,5μg/mL) y IFNγ (1μg/mL) por una hora, terminado el licenciamiento se colocaron los linfocitos a una concentración de 200000 linfocitos/cm2, a los cuales se les agrego concanavalina A (2μg/Ml), después de 60 horas de incubación a 37°C con 0,5% de CO2 se midió la

proliferación de los linfocitos a través del método de WST-1 por espectrofotometría. Los resultados fueron analizados mediante test no paramétrico Mann-Whitney expresados como el promedio ± la desviación estándar, *p<0,05, **p<0,05, ***p<0,05.

Ratio 1/20 Ratio 1/40 Ratio 1/80 Ratio 1/160 Ratio 1/320

0 proliferación de los linfocitos (200000 linfocitos/cm2), en cocultivo con MSCs wild type (A), TLR3 knockout (B)y TLR4 knockout (C) sembradas a concentraciones de 10.000 células/cm2, 5.000 células/cm2, 2.500 células/cm2, 1.250 células/cm2 y 625 células/cm2 medidos a través del método de WST-1 a través de

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8.2 Evaluación de la capacidad inmunosupresora de MSCs TLR3 y

TLR4 knockout a través de la producción de óxido nítrico.

Actualmente existen numerosos estudios que han documentado la actividad inmunosupresora de las MSCs, pero aún queda por profundizar en los mecanismos que sustentan este efecto. Recientemente se ha propuesto que la capacidad inmunosupresora de las MSCs se induciría en un microambiente pro-inflamatorio, donde las MSCs serían capaces de inhibir la proliferación de linfocitos T de manera eficiente.

Uno de los mecanismos que poseen las MSCs murinas está dado por la enzima óxido nítrico sintasa inducible (iNOS), la cual produce óxido nítrico, molécula que es inmunosupresora a altas concentraciones.

En vista de lo antes mencionado es que nos propusimos evaluar el potencial inmunosupresor de las células MSCs a través de la secreción de óxido nítrico mediante espectrofotometría.

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FIGURA 8.5 Curva de calibración NaNO2. Los datos muestran la absorbancia de concentraciones de 50 µM NaNO2, 25 µM NaNO2, 12,5µM NaNO2,, 6,25 µM NaNO2, 3,125 µM NaNO2 y

1,5625 µM NaNO2 medidos por método de Griess a través de espectrofotometría. Método: se realizó una

dilución 1/100 del stock de 1 M de NaNO2, una vez lista la concentración de 100 µM de NaNO2 se

realizaron diluciones seriadas de: 50 µM NaNO2, 25 µM NaNO2, 12,5µM NaNO2,, 6,25 µM NaNO2, 3,125

µM NaNO2 y 1,5625 µM NaNO2, a cada una de estas concentraciones se le agrego 50 μL de Griess y se

incubo por 30 minutos a 37°C con 0,5% de CO2 , transcurrido el tiempo de incubación se midieron las

absorbancias a través de espectrofotometría. Los resultados se graficaron de forma lineal de modo de obtener la ecuación de la recta e índice de correlación lineal (R2).

Con la calibración de la curva se procedió a medir la secreción de óxido nítrico de co-cultivos de MSCs wild type, TLR3 y TLR4 knockout con linfocitos (200000 linfocitos/cm2) activados con concanavalina A como se observa en la figura 8.6, donde las MSCs wild type presentaron mayor secreción de óxido nítrico en comparación con TLR3 y TLR4 knockout. Además se observaron diferencias significativas en las MSCs wild type (Figura 8.6.A) entre los ratios 1/20, 1/40 y 1/80, en los ratios 1/160 y 1/320 no se detectaron niveles de NO. En las MSCs TLR3 knockout (figura 8.6.B) no se observó secreción de óxido nítrico de ninguno de los ratios estudiados. Y por último en las MSCs TLR4

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FIGURA 8.6 MSCs wild type secretan mayor concentración de NO que TL3 y TLR4

knockout. Los datos muestran la concentración de NO de los co-cultivos de MSCs wild type, TLR3 y TLR4

knockout a concentraciones de 10000 células/cm2, 5000 células/cm2, 2500 células/cm2, 1250 células/cm2 y 625 células/cm2 con linfocitos (200000 linfocitos/cm2) activados con concanavalina A, medidos por el método de Griess a través de espectrofotometría. Método: primero se sembraron las diferentes concentraciones de MSCs (10000 células/cm2, 5000 células/cm2, 2500 células/cm2, 1250 células/cm2 y

625 células/cm2) , luego que estas se encontraran adheridas al plástico se les agrego la mitomicina C por

30 minutos de modo de detener su proliferación, a continuación se licenciaron con LPS (0,5μg/mL) y IFNγ (1μg/mL) por una hora, terminado el licenciamiento se colocaron los linfocitos a una concentración de 200000 linfocitos/cm2, a los cuales se les agrego concanavalina A (2μg/Ml), después de 60 horas de

incubación a 37°C con 0,5% de CO2 se midió la secreción de NO por el método de Griess a través de

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8.3 Evaluación del efecto inmunosupresor de MSCs TLR3 y TLR4 knockout en un modelo murino experimental de colitis aguda.

Luego de evaluar la capacidad inmunosupresorade las células

knockout para los receptores TLR3 y TLR4 in vitro, mediante un ensayo de proliferación de linfocitos T y producción de óxido nítrico, se procedió a evaluar el potencial terapéutico de las mismas en un modelo experimental de colitis aguda.

8.3.1 Evaluación de signos en colitis aguda experimental

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50

intraperitoneal. (2,3 x106/ratón). El grupo control sano correspondió a ratones que recibieron agua acida de beber sin DSS. Los signos clínicos (A) y el porcentaje de pérdida de peso (B) fueron medidos diariamente. El score acumulado fue calculado al final del experimento a través de la sumatoria de los signos clínicos diarios para cada grupo (C). Los resultados son expresados como el promedio del grupo ± la desviación estándar del grupo. Test de comparación Mann-Whitney fue usado para analizar los resultados; *p<0,05,**p<0,005 vs grupo colitis. n=7 ratones/grupo.

8.3.2 Evaluación de acortamiento de colon en colitis aguda

Los resultados de la visualización macroscópica del colon mostraron una reducción significativa de su longitud en los animales del grupo colitis con respecto al grupo control sano. Las MSCs basales no mostraron una diferencia con respecto al grupo colitis, sin embargo las MSCs TLR3KO si mostró una recuperación significativa de la longitud del colon .Por el contrario en el tratamiento con MSCs TLR4KO no hubo un aumento significativo.

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CAPÍTULO 9: DISCUSIÓN

Se ha demostrado que los receptores tipo toll son de vital importancia en la coordinación de las respuestas pro-homeostáticas en lesiones de tejido de células inmunes, pero también en la coordinación de respuestas inmunes de las células madre mesenquimales de diversos orígenes (Waterman R, 2010). Estudios previos han señalado que se producen efectos contrarios al estimular las MSCs con agonista de TLR3 y TLR4. La estimulación de TLR3 en las MSCs desencadena un fenotipo anti-inflamatorio, mientras que la estimulación de TLR4 desencadena un fenotipo pro-inflamatorio. En esta misma línea nuestro estudio propone que la ausencia de estos receptores generará el efecto contrario al de su presencia, es decir, la ausencia del receptor TLR3 inducirá a una disminución de su capacidad inmunosupresora por lo que al llevarlo a un modelo experimental de colitis aguda provocara un empeoramiento de la enfermedad y de manera contraria ocurrirá con la ausencia del receptor TLR4.

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amarillo por el consumo total de los nutrientes y esto no nos permitiría distinguir la disminución de la proliferación de linfocitos en co-cultivo mediante el método antes mencionado, ya que dificultaría la visualización de la absorbancia de los linfocitos, por lo que se decidió trabajar con concentraciones decrecientes desde los 10.000/cm2 en adelante. Para estandarizar la concentración de linfocitos y cocanavalina A se sembraron linfocitos dos concentraciones diferentes:100.000 linfocitos/cm2 y 200.000 linfocitos/cm2 activados con concanavalina A en concentraciones crecientes:0,5 µg/mL, 1 µg/mL, 2 µg/mL y 4 µg/mL (Figura 8.2), donde la mayor proliferación se observó en los linfocitos sembrados a 200.000/ cm2 activados con 2 ug/mL de concanavalina A, por lo que esta fue la que se utilizó para los experimentos posteriores, ya que al tener una mayor absorbancia de linfocitos podríamos notar mayormente la inhibición de estos .

Luego de haber estandarizado las concentraciones de MSCs, linfocitos y concanavalina A , evaluamos la capacidad inmunosupresora de las MSCs en ausencia del receptor TLR3 o TLR4 in vitro donde se sembraron MSCs en co-cultivo con linfocitos (200.000 cell/ cm2) activados con concanavalina A (2 ug/mL) en proporciones de 1/20 , 1/40 , 1/180, 1/160 y 1/320 (Figura 8.3) . Se observó que las MSCs TLR3KO presentaron una mayor inmunosupresión con respecto las MSC wild type y TLR4KO siendo el ratio 1/20 en el que mejor se puede observar la inmunosupresión (Figura 8.4). Por otro lado las MSCs TLR4KO fueron las menos inmunosupresoras, resultado que se contradice con lo esperado, ya que pretendíamos observar el efecto contrario al de la estimulación de estos receptores, sin embargo, pareciera que la ausencia de estos receptores no revierte el efecto de la estimulación de estos.

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células midiendo la producción de óxido nítrico en los sobrenandates de los cocultivos, ya que la MSCs al encontrarse en un ambiente inflamatorio, como el que tratamos de simular con el licenciamiento, secreta factores anti-inflamatorios como el óxido nítrico siendo uno los mecanismos por los cuales las MSCs ejercen su efecto inmunosupresor (Ren G., 2008). En las MSCs wild type se observaron niveles de secreción de óxido nítrico decrecientes a medida que iba disminuyendo el ratio, pero en las MSCs TLR3 y TLR4 knockout no fue posible detectar óxido nítrico, resultados que no se relacionan con la proliferación de linfocitos en cocultivos determinada previamente. Estos resultados pueden deberse a la variación técnica del experimento o el licenciamiento no fue suficiente para estimular la producción de niveles de óxido nítrico detectables a través de la técnica utilizada.

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CAPÍTULO 10: CONCLUSIONES

i. Las MSCs TLR3KO aunque no disminuyen significativamente la

proliferación de linfocitos T, si muestran una tendencia a inmunosuprimir la proliferación de linfocitos en cocultivo.

ii. Las MSCs TLR3KO llevan a una mejoría de los animales con colitis

aguda experimental, mientras que las TLR4KO muestran una tendencia similar a la colitis, no ayudando a mejorar la enfermedad. Lo anterior se reflejó en los signos clínicos de la enfermedad y el acortamiento de la longitud del colon de los animales.

iii. La ausencia del receptorTLR3 induce un aumento de la capacidad

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CAPÍTULO 11: REFERENCIAS

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CAPÍTULO 12: ANEXOS

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Figure

FIGURA 3.1: Resumen de las propiedades inmunomoduladoras de las  MSCs

FIGURA 3.1:

Resumen de las propiedades inmunomoduladoras de las MSCs p.15
FIGURA 3.2: Características de los fenotipos MSC1 y MSC2  (Adaptado de Betancourt A., 2012)

FIGURA 3.2:

Características de los fenotipos MSC1 y MSC2 (Adaptado de Betancourt A., 2012) p.17
FIGURA 7.1: Diseño experimental in vitro

FIGURA 7.1:

Diseño experimental in vitro p.26
FIGURA 7.2: Cámara de Neubauer  (Bastidas, 2015)

FIGURA 7.2:

Cámara de Neubauer (Bastidas, 2015) p.28
TABLA 7.1 -MEM completo para cada formato de flask

TABLA 7.1 -

MEM completo para cada formato de flask p.29
TABLA 7.3: Concentración de MSC sembradas por pocillo

TABLA 7.3:

Concentración de MSC sembradas por pocillo p.32
TABLA 7.4: Grupos del modelo murino experimental de colitis aguda

TABLA 7.4:

Grupos del modelo murino experimental de colitis aguda p.35
TABLA 7.5: Criterios para evaluar el índice de actividad de la enfermedad  (Murthy et al., 1993)

TABLA 7.5:

Criterios para evaluar el índice de actividad de la enfermedad (Murthy et al., 1993) p.36
FIGURA 8.1: Detección de la proliferación de MSCs wild type pre tratadas con mitomicina C  a  diferentes  concentraciones  mediante  kit  Cell  Proliferation  Reagent  WST-1

FIGURA 8.1:

Detección de la proliferación de MSCs wild type pre tratadas con mitomicina C a diferentes concentraciones mediante kit Cell Proliferation Reagent WST-1 p.39
FIGURA  8.2  Estandarización  de  la  concentración  de  Linfocitos  activados  con  concanavalina A para realizar ensayos de proliferación con kit Cell Proliferation Reagent WST-1

FIGURA 8.2

Estandarización de la concentración de Linfocitos activados con concanavalina A para realizar ensayos de proliferación con kit Cell Proliferation Reagent WST-1 p.40
FIGURA  8.3  Absorbancia  de  co-cultivos  (MSCs:Linfoticos)  de  MSC  wild  type  TLR3  knockout y TLR4 knockout

FIGURA 8.3

Absorbancia de co-cultivos (MSCs:Linfoticos) de MSC wild type TLR3 knockout y TLR4 knockout p.42
FIGURA  8.4  Porcentaje  de  proliferación  de  linfocitos  en  cocultivo  con    MSCs  wild  type,  TLR3  y  TLR4  knockout  a  diferentes  proporciones  celulares

FIGURA 8.4

Porcentaje de proliferación de linfocitos en cocultivo con MSCs wild type, TLR3 y TLR4 knockout a diferentes proporciones celulares p.43
FIGURA  8.5   Curva  de  calibración  NaNO 2 .  Los  datos  muestran  la  absorbancia  de  concentraciones de 50 µM NaNO 2 , 25 µM NaNO 2 , 12,5µM NaNO 2, , 6,25 µM NaNO 2 , 3,125 µM NaNO 2  y  1,5625 µM NaNO 2  medidos por método de Griess a través de esp

FIGURA 8.5

Curva de calibración NaNO 2 . Los datos muestran la absorbancia de concentraciones de 50 µM NaNO 2 , 25 µM NaNO 2 , 12,5µM NaNO 2, , 6,25 µM NaNO 2 , 3,125 µM NaNO 2 y 1,5625 µM NaNO 2 medidos por método de Griess a través de esp p.45
FIGURA  8.6   MSCs  wild  type  secretan  mayor  concentración  de  NO  que  TL3  y  TLR4  knockout

FIGURA 8.6

MSCs wild type secretan mayor concentración de NO que TL3 y TLR4 knockout p.46
FIGURA 8.7   Evaluación del efecto inmunosupresor de MSCs TLR3 y TLR4 knockout en un  modelo  murino  de  colitis  aguda  a  través  de  los  signos  clínicos

FIGURA 8.7

Evaluación del efecto inmunosupresor de MSCs TLR3 y TLR4 knockout en un modelo murino de colitis aguda a través de los signos clínicos p.48
FIGURA  8.8    Evaluación  del  potencial  efecto  terapéutico  de  las  MSCs  TLR3  y  TLR4  knockout  en  un  modelo  murino  de  colitis  aguda  a  través  del  análisis  de  la  longitud  del  colon

FIGURA 8.8

Evaluación del potencial efecto terapéutico de las MSCs TLR3 y TLR4 knockout en un modelo murino de colitis aguda a través del análisis de la longitud del colon p.49

Referencias

Actualización...