Evaluación de 42 extractos vegetales para el control de la broca del café (Hypothenemus Hampei, Ferrari)

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(1)EVALUACION DE 42 EXTRACTOS VEGETALES PARA EL CONTROL DE LA BROCA DEL CAFÉ (Hypothenemus hampei, FERRARI). ANGELICA MARIA BUSTAMANTE PELAEZ. UNIVERSIDAD TECNOLOGICA DE PERERIA FACULTAD DE TECNOLOGIA ESCUELA DE TECNOLOGIA QUIMICA. 1.

(2) PEREIRA JULIO 2007. EVALUACION DE 42 EXTRACTOS VEGETALES PARA EL CONTROL DE LA BROCA DEL CAFÉ (Hypothenemus hampei, FERRARI). TRABAJO DE GRADO Requisito parcial para optar al titulo de Tecnóloga Química. Presentado por ANGELICA MARIA BUSTAMANTE PELAEZ. Director JAIME NIÑO OSORIO. 2.

(3) UNIVERSIDAD TECNOLOGICA DE PEREIRA FACULTAD DE TECNOLOGIA ESCUELA DE TECNOLOGIA QUIMICA PEREIRA JULIO 2007. 1. INTRODUCCION El cultivo del cafeto (Coffea arabica) constituye uno de los principales rubros generadores de divisas en América Latina y particularmente en Colombia; sin embargo, diversos factores bióticos y abióticos, influyen en la producción de este cultivo. Entre los factores bióticos los insectos participan como agentes responsables de los daños presentados en las plantaciones de café (Rosales et al., 1998). Se estima que la broca del café (Hypothenemus hampei Ferrari), provoca daños del orden de 500 millones de dólares en todo el mundo (Neves et al., 2005), siendo el insecto plaga de mayor importancia en las plantaciones de café. En muchas regiones cafeteras del mundo, afectadas por la broca del café, utilizan ampliamente los insecticidas como la principal medida de control (Decazy, 1978). En Colombia el uso indiscriminado de insecticidas ha causado serios problemas a la salud de los habitantes y trabajadores de las zonas cafeteras, contaminación de las fuentes de agua, mortalidad de la fauna y residualidad en el producto final, esto último puede conllevar a problemas de mercadeo del café en el ámbito internacional (Bustillo et al., 1998). El manejo integrado de la broca del café es de importancia fundamental debido a que la carencia de control puede causar reducción significativa en la producción de los cafetales; en este sentido, la aplicación de un programa de manejo integrado de plagas (MIP) que utilice al máximo los conocimientos integradores del agroecosistema, desempeña un papel fundamental para el control de sus poblaciones. El MIP es una filosofía de control que trata de preservar e incrementar los factores de mortalidad natural, implementando diferentes métodos de control, tomando en consideración aspectos ecológicos, económicos y sociales, con la finalidad de maximizar los rendimientos y minimizar su interferencia con el ecosistema (Rosales et al., 1998). Como forma de controlar la broca del café se utilizan técnicas biológicas en reemplazo de los insecticidas sintéticos, puesto que estos son costosos y altamente tóxicos al aplicarlos para controlar la plaga.. 3.

(4) Por lo anterior, con este trabajo se busca encontrar extractos vegetales con actividad insecticida contra la broca del café (Hypothenemus hampei Ferrari), que puedan integrarse a un programa MIP en los cafetales de la región colombiana, a partir de 21 especies de plantas recolectadas en la Reserva Natural Bremen-La Popa.. 4.

(5) 2. MARCO TEORICO 2.1. DESCRIPCIÓN ZONA DE ESTUDIO Reserva Natural Bremen-La Popa Esta Reserva se encuentra ubicada en la zona limítrofe de los municipios de Finlandia y Circasia (Quindío), vía que de Armenia conduce a Pereira y es el remanente natural de bosque de mayor área en este departamento.. Figura 1. Zona de Reserva Natural Bremen-La Popa La reserva forestal de Bremen-La Popa fue establecida a principios de la década de los 70 para la protección de cuencas hidrográficas del departamento del Quindío. Hoy en día, tiene 336 ha de bosque nativo y 411 ha de plantaciones maderables de árboles exóticos (figura 1). Actualmente estas plantaciones están siendo aprovechadas y dejadas en regeneración natural; por consiguiente en el futuro esta Reserva tendrá una extensión de 747 ha de bosque natural.. Figura 2. Ubicación geográfica zona de estudio Bremen-La Popa. 5.

(6) 2.2. DESCRIPCION DE LA BROCA DEL CAFÉ, Hypothenemus hampei Ferrari (Coleóptera: Curculionidae: Scolytidae) Clasificación taxonómica: Reino: animalia Clase: insecta Orden: coleoptera Familia: scolytidae Genero: Hypothenemus Especie: Hypothenemus hampei Nombre común: broca del café (Farrell et al., 2001) El adulto de la broca es un pequeño escarabajo de coloración café oscuro brillante, casi negro, los elitros presentan estrías longitudinales paralelas, cubiertos de pelos cortos que crecen hacia atrás. En los machos, las alas son soldadas (rudimentarias) impidiéndoles volar. Caso contrario ocurre en las hembras. La cabeza es globular, con antenas capitadas de cinco segmentos como puede observarse en la figura 3. La hembra mide aproximadamente de 1,65 a 2,0 mm de largo, el macho mide 1,18 mm de largo. En el grano de café afectado, la relación entre el número de machos y hembras es de 1:10 (Rosales et al., 1998).. A. B. Figura 3. (A) Hembra de broca del café. (B) Macho de broca del café (Bustillo et al., 1998).. Las hembras, al iniciar el periodo de oviposición, colocan en promedio dos huevos diarios y posteriormente, después de 10 a 20 días del inicio de la. 6.

(7) oviposición ponen un huevo por día durante 10 a 12 días y finalmente, un huevo cada dos días. Su ciclo biológico varia de 27 a 30 días (huevo: 6-10 días; larva: 14 días y pupa: 7 días) y se pueden presentar hasta siete generaciones de broca por año. Prepupa. Larva. Huevo. Pupa. Figura 4. Ciclo de vida de la broca del café Hypothenemus hampei (Bustillo et al., 1998).. Adulto. La longevidad promedio del adulto es de 156 días y cada hembra pone de 31 a 119 huevos. Entre cosechas, la hembra permanece en los frutos que caen al suelo debajo de la sombra del cafetal, manteniéndose allí hasta la próxima fructificación. Este lapso se denomina periodo de transito. Los daños se inician en los frutos entre los 120 a 150 días después de la floración, cuando ataca con preferencia frutos de consistencia sólida de aproximadamente un 20% de su peso seco. Este periodo es muy importante, ya que en el deben iniciarse las actividades de muestreos de frutos. Si los frutos se encuentran muy tiernos o acuosos no son preferidos por la broca. Diversos factores favorecen la infestación del insecto. Dentro de ellos los componentes del clima, las lluvias tienen un efecto directo cuando son de poca intensidad, ya que favorecen la reproducción abundante del insecto y su exceso tiene un efecto indirecto al retrasar la cosecha normal (Souza y Reis, 1993). También, la temperatura y la humedad relativa afectan directamente la duración del ciclo de vida; las altas temperaturas lo disminuyen y la elevada humedad facilita su sobrevivencia entre cosechas. De manera similar, al realizar la cosecha de forma incorrecta, o donde exista exceso de sombra y/o plantaciones densas se favorece la reproducción, dispersión e infestación de esta plaga (Matiello, 1991; Rena et al., 1994; Souza et al., 1993).. 7.

(8) Por otra parte, la tasa de reproducción del insecto varia de acuerdo con la altitud; a medida que esta aumenta se afecta negativamente su ciclo biológico y se reproduce lentamente (Souza et al., 1993). La broca inicia su ataque cuando las hembras fecundadas abandonan el interior del fruto, tratando de encontrar otro para su reproducción. Para ello, buscan las condiciones ideales para penetrarlo, generalmente la realizan por la corona. Después de la penetración, la hembra abre una galería y llega hasta el interior del grano, donde fabrica una pequeña cámara para depositar los huevos (Federación Nacional de Cafeteros de Colombia, 1989; Oliveira, 1982). 2.3. Estrategias para el control de la Broca del café Para la broca del café, el control se debe iniciar cuando en el muestreo se obtiene 5% o más de frutos dañados y de 10% o más de frutos infestados para los muestreos convencionales o secuenciales, respectivamente (Crocomo, 1990; Gravena, 1992). 2.3.1. Alternativas de manejo De manera general, la aplicación de un programa de manejo integrado de plagas, utilizando el control cultural, biológico y químico tiene las siguientes estrategias: 1. Reducción de las poblaciones de la plaga y de la infestación inicial 2. Preservación e incremento de los enemigos naturales 3. Preservación e incremento de la diversidad del agroecosistema 4. Monitoreo de las plagas y de sus enemigos naturales 2.3.2. Control cultural Al analizar el daño que la broca le hace al café, su biología y comportamiento de ataque es fácil deducir que el control cultural del insecto está sustentado en las prácticas encaminadas a minimizar la disponibilidad de alimento y refugio de la plaga (Bustillo et al., 1998). Recomendaciones del manejo del cultivo para minimizar los daños causados por la broca del fruto del café. • • • • • •. La cosecha debe realizarse muy bien, iniciándola, por los lotes de mayor infestación. Recolección de los frutos caídos al suelo y de los que permanecen en la planta después de la cosecha (re-re). Descomponer la pulpa del fruto antes de usarla como abono. Eliminación de los cafetales abandonados. Regulación del sombrío y control de las malezas. Fertilización adecuada y oportuna.. 8.

(9) En Colombia las practicas de cosechas oportunas y recolección de todos los frutos maduros, redujeron los niveles de infestación de un 70% a menos del 6% durante la cosecha (Saldarriaga, 1994). 2.3.3. Control biológico Para el control biológico de la broca del fruto del café, en 1929 fue introducida de Uganda (África) a Sao Paulo (Brasil) la avispa Prorops nasuta Waterson, de la familia Bethylidae. Existen otros enemigos naturales que pueden ser utilizados (tabla 1). Parasitoide: Un parasitoide es un insecto que depreda o parasita a un insecto de otra especie inyectando sus huevos dentro del cuerpo de su huésped para que al eclosionar, sus larvas se alimenten de él, tal como es el caso de Prorops nasuta, Cephalonomia stephanoderis y Phymastichus caffea Entomopatógeno: Organismo causante de enfermedades en los insectos, normalmente son bacterias, virus, hongos o protozoos. Por ejemplo Beauveria bassiana, Metarrhizium anisopliae y Paecilomyces spp. Aplicaciones localizadas de hongo entomopatógeno Beauveria bassiana, en localidades que presentan tiempo nublado y alta humedad relativa favorecen su eficiencia de control, así como también la liberación de los parasitoides Cephalonomia stephanoderis y Heterospilus coffeicola. La liberación de los enemigos naturales de los insectos-plagas, contribuyen a incrementar el impacto del control biológico en un programa de manejo integrado. Tabla 1. Enemigos naturales de la broca del café (Rosales et al., 1998) Enemigo Natural Nombre común Nombre científico Prorops nasuta Avispa de Uganda Avispa de Costa Cephalonomia stephanoderis de Marfil Phymastichus Avispa de Togo caffea Beauveria bassiana Hongos Metarrhizium anisopliae Paecilomyces spp. Hábito Parasitoide Parasitoide Parasitoide Entomopatógeno Entomopatógeno Entomopatógeno. 2.3.4. Control químico El control químico de la broca del café debe realizarse cuando las hembras adultas están volando en la búsqueda de nuevos granos de café ó cuando están iniciando la perforación, pretendiendo evitar daños en los granos de café 9.

(10) sanos (Bustillo et al., 1998); adicionalmente se deben tomar en consideración los índices porcentuales del muestreo o nivel de acción para las plagas (Gravena, 1992). Los insecticidas clorpirifos (O,O-dietil O-3,5,6-tricloro-2-piridil fosforotioato) y endosulfan (6,9-metano-2,4,3-benzodioxatiepin) son los más usados para el control de la broca. El endosulfan causa una alta mortalidad, pero se han encontrado en Nueva Caledonia linajes de broca resistentes (Brun et al., 1989). Son comunes los casos de envenenamiento, por lo que se recurre a insecticidas más inocuos tales como fenitrothion, fenothion y pirimifos de metilo (Bustillo et al., 1998). No obstante, en general cualquier insecticida es peligroso para la salud del ser humano y contamina el ambiente. 2.4. DESCRIPCION DE LAS FAMILIAS SELECCIONADAS EN EL ESTUDIO Plantas pertenecientes a las familias Apocynaceae, Asclepiedaceae, Asteraceae, Euphorbiaceae, Rubiácea y Solanaceae, han sido muy utilizadas en la medicina natural, aunque algunos de sus componentes se usan como antibacterianos o antimicrobianos, antimaláricos o como sedantes (Mahabir, 1995); en este grupo de familias se encuentran algunas especies cuyos extractos se han empleado como insecticidas (Tabla 2), generando la posibilidad de investigar los extractos vegetales de las familias en estudio, de las cuales a continuación, se presenta una descripción general. 2.4.1. Familia Asteraceae Pueden ser hierbas, bejucos, arbustos o árboles, que presentan hojas alternas, verticiladas u opuestas, simples o compuestas; sin estípulas. Inflorescencia de una a numerosas cabezuelas o capítulos con una a numerosas flores sésiles sobre un receptáculo común; cabezuelas heterógamas radiadas o disciformes, u homógamas discoides o liguladas, basalmente rodeadas por un involucro de brácteas (filarias) libres o connatas, en una o varias series; receptáculo convexo, cóncavo, plano o cónico; paleas rodeando las flores o reducidas a cortas escamas o ausentes, un ejemplo de esta familia puede observarse en la figura 5.. Figura 5. Tilesia baccata (Asteraceae).. 10.

(11) En esta familia se encuentran flores perfectas, femeninas, masculinas o estériles; corola gamosépala, regular, tubular, bilabiada, ligulada o filiforme, 2–5 dentada; 4–5 estambres, filamentos usualmente libres, anteras formando un tubo alrededor del estilo, ápice con apéndice, base truncada o con apéndices de varios tipos; ovario ínfero, unilocular, con un óvulo, estilo con 2 ramas, pubescente, glabro o glandular, con las porciones estigmáticas hacia adentro. Frutos con un aquenio coronado por el vilano o papo que es el cáliz modificado a manera de cerdas, escamas, pelos, aristas o setas (Aristeguieta, 1964). 2.4.1.1.. Actividad biológica:. Algunos extractos de plantas de la familia Asteraceae, como Achyrocline satureioides presentan actividad antmicrobiana; Ageratum conyzoides y Ambrosia cumanensis entre otras, presentaron actividad antimicrobiana contra Staphylococus aureus (Mahabir, 1995). 2.4.2. Familia Euphorbiaceae La familia Euphorbiaceae consta de unos 300 géneros y 7500 especies de distribución cosmopolita, mejor desarrollada en las regiones tropicales y subtropicales (Macbride, 1951). Se encuentran en esta familia hierbas, bejucos, árboles o arbustos, generalmente con látex lechoso o coloreado; plantas monoicas o dioicas. Hojas alternas, simples; estípulas generalmente presentes. Inflorescencia cimosa, racimosa, espigada como se observa en la figura 6. Posee flores unisexuales, perianto inconspicuo, estambres 5 a numerosos, filamentos libres o unidos, anteras con dehiscencia longitudinal; ovario súpero, 3-locular y 3-carpelar (raramente 2), estilos libres o unidos; óvulos 1–2 por lóculo en placentas axilares. Fruto capsular, tricoco con dehiscencia elástica y separándose de la columela central, o algunas veces una drupa; 1–2 semillas.. Figura 6. Acalypha diversifolia (Euphorbiaceae).. 11.

(12) 2.4.2.1.. Actividad biológica:. El extracto etanólico de Acalypha alopecuroidea presentaron actividad antibacteriana; los extractos etanólicos de Acalypha guatemalensis mostraron actividad antimicrobiana contra cepas de Salmonella typhi (60%), Staphilococcus aureus (50%) y Pseudomona aureginosa (15%); además, los extractos acuosos y etanólicos de Jatropha gossypiifolia fueron activos como molluscicida frente a Bulinus globulus (Mahabir, 1995). Varias especies de Phyllantus, presentaron efectos antivirales contra la hepatitis B (Venkateswaran et al., 1987; Thyagarajan et al., 1988; Shead et al., 1992). 2.4.3. Familia Rubiaceae Esta família está constituída por árboles o arbustos, hierbas o trepadoras. Poseen hojas opuestas, simples; estípulas generalmente interpeciolares, persistentes o caducas. Flores perfectas o unisexuales; cáliz con el tubo unido al ovario formando un hipanto, limbo con 4–5 dientes o lóbulos o espatulado; corola gamopétala, actinomorfa, infundibuliforme, campanulada o rotada, lóbulos usualmente 4–6, imbricados, valvados o abiertos; estambres en igual número y alternos con los lóbulos de la corola, insertos en el tubo de la corola, anteras dehiscentes por hendiduras longitudinales; ovario ínfero, usualmente 2locular, coronado por un disco carnoso, numerosos óvulos en cada lóculo. El fruto puede ser una baya o una cápsula (Andersson, 1992) un ejemplo de esta familia se observa en la figura 7.. Figura 7. Guettarda crispiflora (Rubiaceae). La familia Rubiaceae es una de las más grandes que poseen plantas con flores, consta de unos 600 géneros y de unas 10.000 especies. Su distribución es cosmopolita pero está mejor representada en las zonas tropicales (Andersson, 1992). 2.4.3.1.. Actividad biológica:. En algunas especies de esta familia se han reportado saponinas esteroidales (Sparg et al., 2004); así como la presencia del alcaloide camptotecina aislado de Ophiorrhiza mungos, O. pumila, O. filistipula (Wink, 2003). Es importante destacar que este alcaloide es la materia prima para hemisíntesis de una serie 12.

(13) de derivados con propiedades anticancerígenas. La corteza del árbol Ladambergia macrocarpa, se utiliza contra las fiebres palúdicas y estados febriles en general (García, 1992). 2.4.4. Familia Solanaceae En esta familia se pueden encontrar hierbas, arbustos o árboles, con pelos estrellados y algunas veces con espinas; biosintetizan alcaloides. Poseen hojas alternas, simples (raramente compuestas) enteras o hendidas; sin estípulas, como puede observarse en la figura 8. Poseen flores perfectas pequeñas a muy grandes; cáliz gamosépalo; corola simpétala, rotada a tubular, lóbulos convolutos, imbricados o valvados; estambres adheridos a la base del tubo de la corola, en igual número y alternos a los lóbulos o reducidos a 4, anteras con dehiscencia longitudinal o por poros; ovario súpero, bicarpelar, generalmente bilocular, numerosos óvulos en placentas axilares elaboradas. La familia Solanaceae consta de 83 géneros y unas 2800 especies de distribución cosmopolita, pero está mejor desarrollada en América del Sur. De importancia económica son la papa (Solanum tuberosum L.), el tomate (Lycopersicon esculentum Miller), el ají (Capsicum frutenses), el tabaco (Nicotiana tabacum), el lulo (Solanum quitoense), entre otros (Hunziker, 1979).. Figura 8. Solanum acerifolium (Solanaceae). 2.4.4.1.. Actividad biológica:. Plantas de esta familia tienen usos medicinales debido a los alcaloides que biosintetizan, tales como hiosciamina, atropina y escopolamina, entre otros, los cuales actúan como anticolinérgicos, antirreumáticos y estimulantes del sistema nervioso central (SNC); así mismo, son usados por causar efectos relajantes y somnolencia. También se han reportado metabolitos secundarios como saponinas, esteroles, taninos, carbohidratos, flavonoides, ácidos grasos y vitamina D (Córdoba, 2002; Mora y Orozco, 2002). Solanum torvum Swartz contiene en sus frutos isoflavonoides como el torvanol A y el glicósido esteroidal torvosido H que le confiere una actividad fuerte contra el virus herpes simplex tipo I (Arthan et al., 2002).. 13.

(14) La especie Acnistus arborescens posee fuerte actividad citotóxica debido a sus lactonas esteroidales (Minguzzi et al., 2002). Las especies Solanum lycioides L. y Cestrum parifolium Willd. ex Roem et Schult. También son conocidas por tener metabolitos con capacidad citotóxica y son usadas popularmente en el tratamiento de enfermedades de la piel, úlceras y fiebre (Moreno-Murillo et al., 2001). 2.4.5. Familia Apocynaceae Esta familia botánica se encuentra distribuida en todas las zonas tropicales y subtropicales del planeta contando con 15.000 especies divididas en 180 géneros. Presentan diferentes estructuras pudiendo ser leñosas, arbóreas y bejucos; prefieren los climas templados a secos y en algunos casos su crecimiento se circunscribe a suelos arcillosos (Schmidt, 2006) en la figura 9 se observa una planta característica de esta familia.. Figura 9. Ervatamia divaricata (Apocynaceae) 2.4.5.1.. Actividad biológica:. La especie Acokanthera schimperi se utiliza en el tratamiento de varias enfermedades de la piel de origen viral; además, de ella se han identificado compuestos como la ouabaina, amirina, uvaol y derivados del ácido ursólico que inhibe infecciones causadas por rinovirus (Gebre-Mariam et al., 2006). Así mismo Acokantera schimperi ha demostrado actividad antimicrobiana sobre Staphylococcus aureus y Pseudomona aeruginosa, lo cual hace que sus extractos puedan utilizarse contra enfermedades causadas por estos microorganismos (Tadeg et al., 2005). En esta familia también se encuentran los alcaloides vinblastina y vincristina, aislados de Cantharanthus roseus, los cuales poseen marcada acción para el tratamiento del cáncer, por lo que son utilizados clínicamente contra la leucemia, el cáncer de seno, entre otros (Pung, 2000).. 14.

(15) 2.4.6. Familia Asclepiadaceae La familia Asclepiadaceae constituye un gran grupo que comprende unas 1700 especies. Se trata de plantas herbáceas, lianas y árboles ocasionalmente, caracterizadas por tener hojas opuestas, simples y sin estípulas. Algunas veces presenta hábitos xerofíticos, con tallos suculentos y sin hojas, en relación con la adaptación al ambiente árido. Las flores son hermafroditas y actinomorfas, pentámeras, dispuestas en inflorescencias cimosas (figura 10). El cáliz está formado por 5 sépalos más o menos libres, y la corola por 5 pétalos escasamente concrescentes, normalmente con una corona de derivación corolina o de origen estaminal. El androceo está constituido por 5 estambres, generalmente soldados procurando una protección al gineceo, es decir, formando un ginostegio. El gineceo está compuesto por 2 carpelos formando un ovario súpero o, en alguna ocasión, semiínfero; los estilos están fusionados pero presentan 5 estigmas diferenciados con masas polínicas que se enganchan en los insectos polinizadores y aseguran la fecundación cruzada.. Figura 10. Asclepias curassavica (Asclepiadaceae) 2.4.6.1.. Actividad biológica:. Asclepias linaria posee actividad insecticida contra el gorgojo del maíz Sitophilus zeamais y S. orizae (Hernandez, 1994). En el género Asclepias se encontró ácido cinnámico que actúa como fungicida, pesticida y herbicida, además polifenoles que poseen efectos antibacterianos (Mahabir, 1995). 2.5.. Teorías de defensa de las plantas. Los mecanismos de resistencia, son aquellas características de la planta que hacen que el insecto atacante le cause menos daños. La resistencia, es una herramienta importante con la cual cuenta el hombre para encontrar novedosos compuestos bioactivos que ayuden a reducir el daño que éstos puedan causar sobre los cultivos (Álvarez et al., 2001). 15.

(16) Dos de los principales mecanismos de resistencia a insectos son la ecológica y la genética. Dentro de esta última se destacan las plantas que poseen factores de no preferencia, las que tienen tolerancia al daño y aquellas que provocan antibiosis. La antibiosis implica un efecto fisiológico adverso al desarrollo de un insecto de tipo transitorio o permanente, este efecto puede ser provocado por la presencia de sustancias como metabolitos tóxicos (glucósidos, quinonas), plantas que presentan un desbalance de nutrientes para el organismo plaga y la presencia de enzimas inhibidoras de la digestión. Estas sustancias pueden provocar la muerte de insectos pequeños, disminución de la tasa de crecimiento, fallas en la metamorfosis, alteración de la diapausa, reducción de la fertilidad, entre otros (Aragón, 2003). La resistencia a plagas es una tecnología que puede brindar control a gran diversidad de insectos que suelen afectar a los cultivos pero su utilización debe ser efectuada dentro de un programa de control integrado, lo que permite fomentar el control biológico y reducir el uso de insecticidas. Entre las ventajas de las plantas resistentes se destacan su especificidad, persistencia, compatibilidad con otras tácticas de manejo integrado y el medio ambiente (Aragón, 2003). Las plantas contienen gran riqueza de agentes químicos, algunos de los cuales pueden ser tóxicos e incluso pueden hacer que una plaga se desarrolle más lentamente. Hay docenas de productos naturales de plantas que tienen algún efecto antibiótico en los insectos, incluyendo los pesticidas botánicos como la rotenona y el piretro. La resistencia a insectos permite a una planta evitar, tolerar o recuperarse de los daños provocados por las poblaciones de insectos u otros organismos dañinos. Esta característica puede provenir de aspectos morfológicos y/o bioquímicos que afectan el comportamiento y metabolismo de las plagas. Algunos de los compuestos, como el ácido jasmónico, pueden ser producidos por las plantas al primer ataque de un insecto o patógeno. Sin embargo, sus niveles son a veces muy bajos para proporcionar la protección adecuada. Igualmente, las plantas poseen estructuras como vellos o espinas que pueden impedir que insectos o agentes extraños la ataquen y de esta forma también se presenta un efecto de antibiosis (Caldwell et al., 2004). 2.6. Insecticidas naturales a partir de extractos vegetales A partir de la necesidad por encontrar nuevas alternativas naturales para el control de insectos plagas y en lo posible reemplazar los pesticidas sintéticos aparecen los insecticidas botánicos ofreciendo seguridad para el medio ambiente y una eficiente opción agronómica. Muchas plantas son capaces de sintetizar metabolitos secundarios que poseen propiedades biológicas importantes contra insectos plagas (Céspedes et al., 2001), estos deben tener principios activos potentes, con alta estabilidad química y óptima producción.. 16.

(17) En hortalizas como, la papa, el tomate y la berenjena pertenecientes a la familia Solanaceae, se producen alcaloides como chaconina, solanina y tomatina, que poseen un efecto insecticida amplio, aunque algunas especies de insectos han aprendido a tolerar estas toxinas (Menjivar, 2001). El uso de insecticidas naturales reduce el riesgo de la resistencia en los insectos, tiene menos consecuencias letales para los enemigos naturales, reduce la aparición de plagas secundarias, es menos nocivo para el hombre, y no ocasiona daños al medio ambiente (Stoll, 1989). Los compuestos son tan variados como las plantas de las cuales han sido aislados y el rango de su efecto protector va desde repelencia, disuasión de la alimentación y oviposición hasta toxicidad aguda e interferencia con el crecimiento y el desarrollo. Algunos extractos de diferentes familias de plantas que han presentado actividad para el control de insectos se muestran en la tabla 2. Tabla 2. Ejemplos de extractos de plantas que presentan actividad insecticida. FAMILIA. ESPECIE. Alliaceae. Allium sativum. Apocynaceae. Ervatamia divaricata. El extracto de ajo ha sido utilizado como insecticida, repelente, fungicida, bactericida y nematicida (Silva et al., 2002). Actividad insecticida contra T. confusum (17%) y C. formicarius (Mitchell et al., 2006).. Asclepiadaceae. Asclepias curassavica. Actividad insecticida contra B. microplus (Mitchell et al., 2006).. Ambrosia cumanensis. En extractos de la planta se han encontrado propiedades insecticidas (Mahabir, 1995).. Franseria artemisioides. La coronofilina extraída de esta planta, posee actividad insecticida contra ciertos dípteros (Mahabir, 1995).. Asteraceae. Asteraceae. Compositae. Agerantum conyzoides. Chrysantemum cinaerifolium. Croton linearis Euphorbiaceae. Croton cajucara. COMENTARIO. El extracto acuoso de la planta entera ha demostrado actividad insecticida contra Tribolium castaneum y Musca domestica (Mahabir, 1995). Las piretrinas son ésteres con propiedades insecticidas atacan tanto el sistema nervioso central como el periférico, lo que hace que el insecto apenas entre en contacto con la superficie tratada deje de alimentarse y caiga (Silva et al., 2002). Actividad insecticida contra T. confusum (37%) y Cylas formicus (Mitchell et al., 2006). De esta planta se aisló un diterpeno (cisdehidro-crotonin) que presenta propiedades insecticidas (Bittner et al., 2001). 17.

(18) Moraceae. Artocarpus altilis Park. Actividad insecticida contra C. formicarius e Hypothenemus hampei (Mitchell et al., 2006). Myrtaceae. Eucalyptus globulus. Las hojas de esta especie poseen actividad insecticida (parásitos) (García B, 1992).. Papaveraceae. Boconia frutescens. Las semillas poseen un aceite empleado contra la sarna y los piojos (García B, 1992).. Gliricidian sepison El mata-ratón (nombre común) es utilizado como insecticida (García B, 1992).. Papilionaceae. Indigofera lespedezioides. El polvo de las semillas y raíces se empleam como insecticida (García B, 1992).. Tephrosia toxicaria. Las hojas de esta especie maceradas en agua fría poseen actividad insecticida (García B, 1992). Abrus precatorius La parte aérea de esta planta posee actividad insecticida (García B, 1992). Poligonaceae. Polygonum segetum Coffea liberica. Rubiaceae. Sapindaceae. Solanaceae. Insecticida y emplean las hojas trituradas contra la sarna y pulgas de perros (García B, 1992). Actividad insecticida contra T. confusum (13%) (Mitchell et al., 2006). Borreria laevis. Actividad insecticida contra T. confusum (13%) (Mitchell et al., 2006).. Blighia sapida. Presenta actividad insecticida contra C. formicarius (100%) e Hypothenemus hampei (2.3%) (Mitchell et al., 2006). La nicotina es básicamente un insecticida de contacto no persistente. La actividad insecticida de la nicotina provoca Nicotiana tabacum contracciones espasmódicas, convulsiones y la muerte del insecto (Silva et a, 2002).. Solanaceae. Capsicum frutenses. Theaceae. Mammea americana. El extracto de ají es usado como repelente de contacto para insectos adultos, ovicida y disuasor de alimentación (Silva et al., 2002). Las semillas (molidas) haciendo una emulsión con agua presentan actividad insecticida (García B, 1992).. Cuatro extractos (tabla 2) han sido usados como repelentes contra la broca del café, estos son: ají (Capsicum frutenses, Solanaceae), tabaco (Nicotiana tabacum, Solanaceae), ajo (Allium sativum, Alliaceae) y el extracto del árbol de Neem (Azadirachta indica, Meliaceae). Los extractos de las plantas Artocarpus altilis Park (Moraceae) y Blighia sapida (Sapindaceae) han sido evaluados como insecticidas contra la broca del café. 18.

(19) 3. JUSTIFICACION Con este proyecto se trata de realizar el tamizado de los extractos vegetales de las plantas recolectadas en la reserva natural Bremen-La Popa, para determinar cuales impiden que la broca perfore y penetre el grano de café y así no puedan llegar a reproducirse dentro del grano, donde causa el verdadero daño cuando sus larvas se alimentan de la almendra. En nuestro país, la broca del café fue registrada por primera vez en 1988 afectando cafetales del sur del país. Se ha estimado que Colombia tiene aproximadamente 870.000 hectáreas cultivadas en café y actualmente la broca se encuentra distribuida en el 82% del área cafetera, 715.073 ha (Herrón, 1998). La inversión para el manejo de broca es de aproximadamente $96.385 pesos por ha/año (Duque, 1994), los costos se sitúan en un rango que va del 4,8%, hasta un 11,7% del costo total de producción (Marquez, 1998) Respecto a los insecticidas, un alto porcentaje de agricultores utilizan esta herramienta (95,8%), el producto más utilizado es el Thiodan (endosulfan) y el 34% de los agricultores aplican insecticidas cuatro o más veces por año. Estas condiciones muestran un uso intensivo de estos agentes, a pesar de que solo el 2,8% lo hace de acuerdo a los lineamientos del Manejo Integrado de Broca (MIB) (Duque et al., 1996). Se descubrió que la broca ha desarrollado gran resistencia al Endosulfan y otros insecticidas sintéticos (Brun et al., 1989); además, estos productos causan un impacto adverso en los ecosistemas. Teniendo en cuenta las hectáreas de cultivo de café afectadas por la broca y el costo de control por ha/año, en Colombia se invierten aproximadamente 6800 millones de pesos en un solo año para el control de la plaga. Por lo anterior, es de gran importancia evaluar y encontrar métodos que contribuyan a la disminución de las poblaciones de broca del café, que sean menos contaminantes para el medio ambiente y menos tóxico para la población humana. Se pretende con este trabajo contribuir al descubrimiento de la actividad insecticida de las plantas de nuestra región y adicionalmente valorar la flora regional.. 19.

(20) 4. OBJETIVOS 4.1. Objetivo general Identificar especies de la Reserva Natural Bremen-La Popa con actividad insecticida contra Hypothenemus hampei (Ferrari). 4.2. Objetivos específicos •. Obtener extractos de diclorometano y metanol de 21 plantas recolectadas en la Reserva Natural Bremen-La Popa.. •. Caracterizar fitoquímicamente los extractos de diclorometano y metanol.. •. Evaluar el efecto insecticida de los 42 extractos vegetales contra Hypothenemus hampei (Ferrari) utilizando granos de café pergamino húmedo.. 20.

(21) 5. SECCION EXPERIMENTAL 5.1. Materiales 5.1.1. Reactivos La extracción de los materiales vegetales se realizó con n-hexano (C6H14), metanol (MeOH) y diclorometano (CH2Cl2) grado comercial. En la preparación de la dieta artificial se utilizó agar bacteriológico Nº1 (Oxoid, Inglaterra), Derosal (Bayer Cropscience, Colombia), benzoato de Sodio (comercial), nipagin (Methyl 4-hydroxybenzoate Sigma, USA), levadura torula (MP Biomedicals, Inc., Francia), formaldehído 37% (Fisher Scientific, USA), ácido ascórbico (Carlo Erba), sacarosa (Sigma, USA), caseína hidrolizada (Oxoid, Inglaterra), etanol absoluto (Carlo Erba), sales de wesson (SigmaAldrich, USA) y colesterol (Sigma, USA). Para realizar la marcha fitoquímica se utilizaron cromatofolios de silica gel 60 F254 soportados sobre una placa de aluminio de 20 x 20 cm (Merck, Alemania). Los solventes utilizados en la preparación de las soluciones patrón de los extractos a 40000 mg/L fueron etanol (EtOH) y butanol (BuOH) ambos Merck, (Alemania) grado analítico. 5.1.2. Controles Como control positivo se utilizó el plaguicida Endosulfan, el cual ha sido el más utilizado para el control de la broca del café, así mismo se usó como control negativo EtOH al 1 % para extractos metanólicos y la mezcla BuOH-EtOH (3:1) para los extractos de diclorometano. 5.1.3. Material de vidrio Para esterilizar el agar y el café pergamino molido se utilizaron erlenmeyers de diferente volumen Schott Duran (Mainz, Alemania). Para la medición de volúmenes entre 100 y 1000 µL se usaron micropipetas Eppendorf serie 2100 de volumen variable y para los volúmenes entre 10 y 100 µL la pipeta Brand (Mainz, Alemania) serie 01T08000. Las cajas Petri que se emplearon para servir la dieta artificial Cenibroca D-200 fueron Pyrex 100 X 30 mm. Para realizar los ensayos por antibiosis se emplearon tubos eppendorf de 2 mL (tyco/Healthcare Kendall, USA) 5.1.4. Equipos Para pesar los reactivos a utilizar en este bioensayo se utilizó la balanza analítica Mettler Toledo AB 204 (Suiza), y para la preparación de los extractos vegetales se empleó un vortex IKA MS1 (Wilmington, EEUU). Soluciones de agar, el café pergamino molido y demás material aseptico fueron esterilizados. 21.

(22) en autoclaves All American (NY, USA) y para asegurar un ambiente estéril, los ensayos se realizaron en la cabina de flujo laminar Purificación y análisis de fluidos C4 FLC 120 (Colombia) y para succionar las brocas del café se utilizó una bomba de vacío Vacuubrand ME 2C (Alemania). 5.1.5. Material vegetal El material vegetal fue recolectado en la Reserva Natural Bremen La Popa por el Grupo de Biotecnología Productos–Naturales de la Universidad Tecnológica de Pereira UTP bajo la asesoría del taxónomo del Herbario de la Universidad de Antioquia, Francisco Javier Roldán (HUA, Medellín, Colombia) durante el periodo de 22-24 de agosto del 2005, tiempo en el cual se recolectaron 21 especies de plantas pertenecientes a las familias botánicas Apocynaceae, Asclepiedaceae, Asteraceae, Euphorbiaceae, Rubiácea y Solanaceae. 5.1.5. Material biológico Para la infestación de la dieta artificial se hizo una compra de 40000 hembras adultas de broca (Hypothenemus hampei, FERRARI) en el laboratorio BIOCAFE (Chinchiná, Colombia) 5.2. Métodos 5.2.1. Proceso de extracción Con el fin de obtener los extractos crudos que se usaron en el bioensayo, el material vegetal se Secar sometió a extracción con tres diferentes solventes, como se el material vegetal a 50 ºC por 48 horas resume en la figura 11. Moler (Someter a extracción 300 g del material vegetal seco y molido con n-hexano) x 3 Filtrar. Rotaevaporar hasta sequedad (Extracto seco n-hexano). Marco (Extraer con Diclorometano) x 3. Rotaevaporar hasta sequedad (Extracto seco CH2Cl2). Marco (Extraer con Metanol) x 3. Rotaevaporar hasta sequedad (Extracto seco MeOH). Eliminar Marco. Guardar los extractos a –10°C. Figura 11. Proceso de extracción del material vegetal y obtención de los extractos 22.

(23) 5.2.2. Proceso de desinfección del café pergamino En la realización del bioensayo, se utilizaron granos de café pergamino húmedo desinfectado como se describe en la figura 12. Seleccionar los granos de café que se encuentren enteros y sin perforaciones de broca. Preparar una solución de Derosal (antifúngico) al 3% y sumergir los granos de café seleccionados por 24 horas. Sacar los granos de café de la solución, ponerlos en una malla y dejar secar completamente Figura 12. Proceso de desinfección para los granos de café pergamino. 5.2.3. Proceso de desinfección de la broca del café Para la realización del bioensayo usando granos de café pergamino húmedo se realizó la desinfección de la broca con un solo producto (figura 13), el cual contribuyó a reducir la contaminación experimento. Asperjar las brocas con solución de cloruro de benzalconio al 10% (Sanivec) en la cabina de flujo laminar Secar las brocas en corriente de aire por 2 minutos o hasta cuando se muevan (Depositar las brocas en los eppendorf con el grano de café pergamino) X 90 Figura 13. Proceso de desinfección de la broca del café para usar en ensayos de antibiosis con granos de café pergamino. Para el caso de la dieta artificial, la desinfección con cloruro de benzalconio al 10% no fue suficiente y se observó rápidamente contaminación en las cajas Petri; motivo por el cual, se encontró una manera adicional de desinfectar la broca del café y eliminar posibles hongos en la superficie de su cuerpo, obteniendo buenos resultados para el control de la contaminación en la dieta Cenibroca D-200 (figura 14).. 23.

(24) Asperjar las brocas con solución de EtOH al 96% por 1 minuto Asperjarlas con una solución de hipoclorito de sodio al 3% por 3 minutos Asperjarlas con EtOH al 70% por 30 segundos (Enjuagar las brocas con agua destilada estéril) X 3. Secar las brocas en corriente de aire por 2 minutos o hasta cuando se muevan. E N C O N D I C I O N E S A S É P T I C A S. Depositar las brocas en cajas de petri con la dieta artificial Cenibroca D-200 previamente preparada Figura 14. Proceso de desinfección para la broca del café usada en la dieta artificial Cenibroca D-200 (Carrión et al., 2004) 5.2.4. Dieta artificial para la cría de broca del café in vitro Para tener disponibilidad de broca del café en el laboratorio, se requiere una dieta adecuada para su cría, de esta forma se eligió la dieta artificial Cenibroca D-200 que es una pasta dura maleable apta para el desarrollo y crecimiento de la misma (Portilla, 1999). La composición de la dieta se resume en la tabla 3. Tabla 3. Composición de la dieta artificial Cenibroca D-200 para la cría de broca del café. Ingrediente Agua Agar Café molido Sacarosa Caseína Levadura torula Benzoato de sodio Derosal Nipagin Colesterol Acido ascórbico Sales de Wesson Etanol Formaldehído 37%. Cantidad para 800 mL 800 mL 22.4 g 106.6 g 14.9 g 21.4 g 21.4 g 0.85 g 2.4 mL 1.06 g 0.64 g 1.3 g 2.14 g 10.6 mL 2.3 mL. 24.

(25) La dieta artificial se realizó con el fin de mantener la cría de broca que luego servirá para realizar los bioensayos con los extractos vegetales obtenidos a partir de las plantas recolectadas, en el anexo 1 puede observarse el proceso de preparación de la dieta. 5.2.5. Evaluación de los extractos vegetales El bioensayo contra la broca del café (figura 15) se realizó por duplicado con el fin de tener confiabilidad en los resultados.. Tomar 90 granos de café pergamino previamente desinfectados. Poner los granos en solución de los extracto a 1000 mg/L por 24 horas.. Sacar los granos de café del tratamiento con el extracto y secarlos por 24 horas.. Poner un grano de café con una broca adulta recién emergida desinfectada en un eppendorf. Control positivo Endosulfan 1 mg/L Cada 4 días por 40 días, se abren dos granos de café y se hace una revisión de los estados biológicos.. Figura 15. Proceso para evaluar los extractos vegetales contra Hypothenemus hampei en café pergamino 5.2.6. Marcha fitoquímica aplicada a los extractos crudos de n-hexano, diclorometano y metanol Con el fin de detectar los núcleos fitoquímicos presentes en los diferentes extractos crudos evaluados, se realizó una marcha fitoquímica por cromatografía de capa delgada (CCD) para cada extracto vegetal, siguiendo la metodología descrita por Stahl (1969). Se utilizaron reveladores y patrones específicos para cada tipo de núcleo fitoquímico con el fin de comparar los resultados de los extractos con los patrones (tabla 4).. 25.

(26) Tabla 4. Patrones y reveladores utilizados en CCD para la detección de los núcleos fitoquímicos en estudio. Núcleo fitoquímico Alcaloides Terpenos Triterpenos Esteroles Flavonoides Taninos Fenoles Saponinas esteroidales y triterpénicas Sesquiterpenlactonas. Patrón Papaverina. Revelador Dragendorff. Taxol y lanosterol. Anisaldehído/ CH3COOHH2SO4. Kaempferol Acido gálico y ácido tánico Digitonina. AlCl3 al 2% en EtOH absoluto FeCl3 al 5% en solución salina saturada. Digitoxina. Acido 3,5-dinitrobenzóico MeOH-KOH. 26. H2SO4 10% en EtOH absoluto.

(27) 6. RESULTADOS Y DISCUSION 6.1. Recolección de plantas y obtención de extractos En la figura 16 se pueden observar los puntos de muestreo y en la tabla 5 se muestra la lista de plantas y la cantidad de cada extracto obtenido (n-hexano, diclorometano y metanol).. Figura 16. Mapa de la Reserva Natural Bremen-La Popa y sitios de muestreo. Tabla 5. Plantas recolectadas y peso de cada extracto obtenido del material vegetal recolectado en la Reserva Natural Bremen-La Popa (ventana 1: cuenca río La Vieja). Familia Apocynaceae Asclepiedaceae. Asteraceae. Nombre Científico Cynanchum sp Oxypetalum cordifolium Pentacalia urbanii Mikania banisteriae. Voucher FJR 3964. Nº UTP 123. 3981. 139. 10,064. 12,797. 16,331. 3963. 122. 7,326. 4,276. 9,282. 3965. 124. 7,091. 7,107. 9,282. 27. Peso Extracto (g) n-Hexano CH2Cl2 MeOH 16,282 6,362 32,286.

(28) Asteraceae. Euphorbiaceae. Rubiaceae. Solanaceae. Clibadium pentaneuron Critoniella acuminata Baccharis sp Tilesia baccata Mikania lloensis Lepidaploa lehmannii Acalypha diversifolia Alchornea calophylla Hyeronima sp Alchornea grandis Guettarda crispiflora Faramea sp Solanum acerifolium Solanum trachycyphum Sin Identificar Solanum lepidotum Cestrum sp. 3966. 125. 2,984. 4,972. 8,270. 3968. 127. 6,463. 5,757. 22,907. 3972 3974. 131 133. 7,097 3,510. 7,587 7,600. 10,901 10,328. 3977. 136. 2,720. 5,973. 14,375. 3976. 135. 1,337. 1,058. 12,617. 3967. 126. 4,279. 5,469. 22,178. 3969. 128. 6,188. 3,756. 24,975. 3971. 130. 7,947. 4,912. 40,649. 3982. 140. 2,227. 3,159. 14,058. 3973. 132. 0,900. 4,823. 25,891. 3979 3961. 138 120. 3,408 11,804. 4,818 9,720. 9,601 11,695. 3962. 121. 12,987. 6,359. 36,344. 3970. 129. 4,909. 3,626. 13,043. 3975. 134. 1,410. 5,180. 19,210. 3978. 137. 8,117. 5,657. 7,389. 6.2. Caracterización fitoquímica En la tabla 6 se muestran los resultados de la caracterización fitoquímica; con el signo (+) se confirma la presencia del núcleo fitoquímico en estudio y con el signo (–) la ausencia de esta en los extractos evaluados. De acuerdo a la marcha fitoquímica, las especies evaluadas de las familias Asteraceae y Euphorbiaceae, presentaron abundancia de esteroles, triterpenos, saponinas, fenoles, flavonoides y taninos. Estos hallazgos concuerdan con la literatura en la cual se reportan flavonoides, diterpenos y lactonas sesquiterpénicas para la familia Asteraceae y diterpenos, flavonoides y esteroles en la familia Euphorbiaceae (Bruneton, 2001).. 28.

(29) Los metabolitos secundarios encontrados en las plantas evaluadas de la familia Rubiaceae fueron esteroles, triterpenos, fenoles, flavonoides y taninos en baja proporción. El reporte bibliográfico indica la presencia de alcaloides indólicos, diterpenos, antraquinonas y cumarinas (Bruneton, 2001). Los núcleos fitoquímicos encontrados en los extractos de las plantas pertenecientes a estas familias, son los posibles responsables de la actividad contra la broca del café.. 29.

(30) Tabla 6. Marcha fitoquímica de los 63 extractos de las plantas recolectadas en la Reserva Natural Bremen-La Popa. Familia. Nombre Científico. Extracto. Metabolitos Secundarios Alcaloides. Apocynaceae. Cynanchum sp. Asclepiedaceae. Oxypetalum cordifolium Pentacalia urbanii Mikania banisteriae Clibadium pentaneuron. Asteraceae. Critoniella acuminata Baccharis sp. Tilesia baccata Mikania lloensis. Hexano Diclorometano Metanol Hexano Diclorometano Metanol Hexano Diclorometano Metanol Hexano Diclorometano Metanol Hexano Diclorometano Metanol Hexano Diclorometano Metanol Hexano Diclorometano Metanol Hexano Diclorometano Metanol Hexano Diclorometano Metanol. -1 + + + -. Esteroles y Triterpenos + + + + + + + + + + + + -. 30. Saponinas + + + + + +. Fenoles + + + + + -. Flavonoides. Taninos. + + + + + + -. + + + + + -.

(31) Continuación tabla 6 Acalypha diversifolia Alchornea calophylla Euphorbiaceae Hyeronima sp. Alchornea grandis Guettarda crispiflora Rubiaceae. Faramea sp. Solanum acerifolium Solanum trachycyphum Solanaceae. Sin Identificar Solanum lepidotum Cestrum sp. Hexano Diclorometano Metanol Hexano Diclorometano Metanol Hexano Diclorometano Metanol Hexano Diclorometano Metanol Hexano Diclorometano Metanol Hexano Diclorometano Metanol Hexano Diclorometano Metanol Hexano Diclorometano Metanol Hexano Diclorometano Metanol Hexano Diclorometano Metanol Hexano Diclorometano Metanol 1. + + + + + +. + + + + + + + + + + + + + + -. (+) = Presente. + + + + + + + + -. (-) = Ausente 31. + + + + + + + + + + -. + + + + + + + + + + + -. + + + + + + + + + + -.

(32) 6.3. Actividad contra la broca del café de extractos de diclorometano y metanol El porcentaje de humedad de los granos de café al inicio de los ensayos fue superior al 40%, sin embargo a los 32 días después del inicio del experimento para los extractos metanólicos, la humedad fue menor al 20%, por lo cual se descartaron estos últimos datos. En las figuras 17 y 18 se presenta el avance del experimento en el tiempo, para los extractos metanólicos y de diclorometano respectivamente, en la figura 17 el extracto metanólico de Alchornea calophylla (Euphorbiaceae) fue el que mas se acercó a la acción insecticida del control negativo (endosulfan 1 mg/L) presentando la mayor cantidad de brocas adultas muertas, seguido de los extractos metanólicos de las plantas Lepidaploa lehmannii (Asteraceae) y Alchornea grandis (Euphorbiaceae), entre tanto, en un extracto de diclorometano (figura 18) el total de individuos varía, ya que a medida que avanzaba el experimento, las brocas desarrollaban su ciclo biológico, por lo cual los extractos de diclorometano no presentaron ningún efecto tóxico sobre la broca del café que pudiera causar su muerte.. Figura 17. Brocas muertas hasta el día 28 en extractos MeOH. 32.

(33) 16 14 12 brocas. 10 8 6 4. Positivo. Negativo. Alchornea grandis. Oxypetalum cordifolium. Faramea sp. Cestrum sp. Mikania lloensis. Lepidaploa lehmannii. Solanum lepidotum. Tilesia baccata. Baccharis sp. Guettarda crispiflora. Indet. Hyeronima sp. Alchornea calophylla. Critoniella acuminata. Clibadium pentaneuron. Mikania banisteriae. Cynanchum sp. Pentacalia urbanii. Solanum trachycyphum. Solanum acerifolium. 0. Acalypha diversifolia. 2. Figura 18. Brocas muertas hasta el día 28 en extractos de diclorometano. En la búsqueda de agentes insecticidas de origen vegetal para el control de la broca del café a través de este bioensayo in vitro, se encontró que solo los extractos metanólicos presentaron un posible efecto sobre el insecto; en la figura 19 también se presentan los extractos metanólicos con posible actividad insecticida, ya que se alejaron del control negativo y presentaron tendencia hacia el control positivo (línea base), ya que se presentaron pocos individuos en el tiempo. En este gráfico también se puede observar el efecto que el extracto metanólico de la planta Alchornea calophylla (Euphorbiaceae) (voucher 3969) presentó sobre el total de individuos.. 33.

(34) 6,0. 5,0 Mikania banisteriae Critoniella acuminata. Individuos. 4,0. Alchornea calophylla Tilesia baccata. 3,0. Lepidaploa lehmannii Faramea sp. 2,0. Alchornea grandis Negativo. 1,0. 0,0 0. 4. 8. 12. 16. 20. 24. 28. 32. DDM. Figura 19. Extractos MeOH con posible actividad contra la broca Con base en los gráficos realizados se encontró que 7 extractos metanólicos presentaron actividad contra la broca del café (Hypothenemus hampei, Ferrari), este valor representa un 33.3% de las plantas usadas para el bioensayo, las familias Euphorbiaceae y Asteraceae ambas contribuyeron con 14.3%, mientras que la familia Rubiaceae contribuyó con un 4.7%. En la tabla 7 se pueden observar las plantas cuyos extractos metanólicos presentaron posible actividad contra la broca del café (Hypothenemus hampei Ferrari), pertenecientes a las familias botánicas Asteraceae, Euphorbiaceae y Rubiaceae. Tabla 7. Plantas cuyos extractos presentaron actividad insecticida contra la broca del café. Familia. Nombre científico. Critoniella acuminata Lepidaploa ASTERACEAE lehmannii Tilesia baccata Alchornea calophylla Acalypha EUPHORBIACEAE diversifolia Alchornea grandis Faramea sp RUBIACEAE 34. Voucher FJR 3968 3976 3974 3969 3967 3982 3979.

(35) En la familia Euphorbiaceae, se ha reportado actividad de los aceites esenciales de plantas del genero Croton como Croton zehntneri, Croton argyrophylloides, Croton nepetaefolius y Croton sonderianus contra larvas del mosquito emisor del dengue (Aedes aegypti, Diptera: Culicidae) (Lima et al., 2006); en esta familia también se presentan diterpenos que poseen propiedades insecticidas, por ejemplo, de Croton cajucara se aisló cis-dehidrocrotonina y de Croton linearis se aisló otro diterpeno tóxico para los insectos (Bittner et al., 2001). En la figura 20 se puede observar el efecto del extracto metanólico activo Alchornea calophylla (Voucher 3969), que causó la muerte de la broca del café, contrastado con el extracto inactivo de diclorometano (figura 21) de Mikania lloensis (Voucher 3977) el cual permitió que la broca perforara y penetrara el grano de café para reproducirse en su interior y de esta forma cumplir con su ciclo biológico en los 40 días del ensayo.. Figura 20. Acción sobre la broca del café de un extracto metanólico activo (muerte del insecto).. Figura 21. Acción sobre la broca del café de un extracto inactivo (desarrollo del ciclo biológico).. 35.

(36) 7. CONCLUSIONES Siete extractos metanólicos presentaron posibles compuestos bioactivos contra la broca del café. La actividad biológica en los extractos metanólicos podría explicarse por la presencia de esteroles, triterpenos, saponinas, fenoles, flavonoides o taninos. Los extractos de diclorometano fueron inocuos, permitiendo a la broca del café la perforación del grano y el desarrollo completo del ciclo biológico en su interior.. 36.

(37) 8. RECOMENDACIONES. No sólo realizar para los ensayos un control negativo, introducir un testigo libre de solvente para garantizar que la humedad del grano es apta para el desarrollo del insecto y descartar posibles efectos del solvente. Realizar ensayos con los extractos metanólicos donde se evalúen mayor cantidad de muestras (100 aproximadamente) y en una sola revisión seleccionar las plantas activas, teniendo tres repeticiones para cada extracto a evaluar. Realizar un análisis del efecto subletal en las plantas que presentan actividad, siguiendo en estos ensayos el ciclo biológico de la broca. Realizar la separación e identificación de los metabolitos secundarios de los extractos metanólicos que presentaron mayor actividad contra la broca del café. Efectuar evaluaciones in vivo de los extractos activos. Continuar los estudios de actividad contra la broca del café de las plantas de la flora regional.. 37.

(38) BIBLIOGRAFIA 1. Alvarez, J. H.; Cortina, H. A.; Villegas, J. F. 2001. Métodos para evaluar Antibiosis a Hypothemenus hampei en café bajo condiciones controladas. Cenicafé 52 (3):205-214 2. Andersson, L. 1992. A provisional check-list of Neotropical Rubiaceae. Scripta Botanica Bélgica 1:1–199. 3. Aragón, J. 2003. Avances en el desarrollo de soja con resistencia a insectos. (INTA) Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (Argentina). Estación Experimental Agropecuaria Marcos Juárez. 4. Aristeguieta, L. 1964. Compositae, en: T. Lasser (ed.), Flora de Venezuela 10 (I–II): 1–941. Instituto Botánico, Ministerio de Agricultura y Cría, Caracas. 5. Arthan D, Svasti J, Kittakoop P, Pittayakachonwut D, Tanticharoen M, Thebtaranonth Y. 2002. Antiviral isoflavonoid sulfate and steroidals glycosides from the fruits of Solanum torvum. Pythochemistry. 59: 459-463. 6. Baker P.S. 1990. La bioecología de la broca del café (Hypothemenus hampei). Seminario sobre la broca del café, Medellín, Colombia. 7. Bittner, M.; Alarcón, J.; Aqueveque, P.; Becerra, J.; Hernandez, V.; Hoeneisen, M.; Silva, M. 2001. Estudio Químico de especies de la Familia Euphorbiaceae en Chile. Boletín de la Sociedad Chilena de Química 46 (4): 419-431. 8. Brun, L.O.; Marcillaud, C.; Gaudichon, V.;Suckling, D. M. 1989. Endosulfan resistance in Hypothemenus hampei (Coleoptera: Scolytidae) in New Caledonia. Journal of Economic Entomology 82 (5): 1312-1316. 9. Bruneton, J. 2001. Farmacognosia. Fitoquimica. Plantas medicinales. 2001. 2a ed. Editorial Acribia. Zaragoza. España: 1099. 10. Bustillo, P.A; Cardenas, M.R; Villalba, G.D; Benavides, M.P; Orozco, H.J; Posada, F.F. 1998. Manejo Integrado de la Broca del Cafè Hypothemenus hampei (Ferrari), Chinchinà, Colombia: 134. 11. Caldwell, B.; Brown E.; Sideman E.; Shelton A.; Smart C. 2004. Resource guide for organic insect and disease management. Appendix A: Plant resistance to insects and diseases: 147-149. 38.

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(43) ANEXOS. xliii.

(44) Anexo 1. Preparación de 800 mL de dieta artificial Cenibroca D-200.. Transferir a un erlenmeyer 800 mL de agua Adicionar 22.4 g de Agar Calentar hasta disolución Esterilizar la mezcla por 20 minutos Adicionar 106.06 g de café molido estéril Adicionar 14.9 g de sacarosa Adicionar 21.4 g de caseína Adicionar 21.4 g de levadura torula Adicionar 0.85 g de benzoato de sodio Adicionar 1.06 g de Nipagin Adicionar 0.64 g de colesterol Adicionar 1.3 g de ácido ascórbico. xliv.

(45) Adicionar 2.14 g de Sales de Wesson Adicionar 2.4 mL de derosal Adicionar 10.36 mL de etanol Adicionar 2.3 mL de formaldehído 37 % Licuar los ingredientes hasta completa homogenización, teniendo el vaso, la tapa y la cuchilla de la licuadora previamente esterilizados Servir en una bandeja y poner en la estufa por 48 horas a 50ºC Servir en cajas petri esterilizadas y dejar en cabina de flujo laminar por 24 horas para que seque completamente. Realizar la infestación con brocas adultas recién emergidas, previamente desinfectadas Anexo 2. Datos obtenidos en las revisiones de los bioensayos. Extractos metanólicos EXTRACTO Rep 120 1 120 1 120 1 120 1 120 1 120 1 120 1 120 2 120 2 120 2 120 2 120 2 120 2 120 2. t 4 8 12 16 20 24 28 4 8 12 16 20 24 28. H 0 0 1 0 1 0 2 5 0 1 1 0 0 0. L 0 0 0 2 4 3 0 0 0 0 1 2 2 1. P 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0. xlv. C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0. A 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1. T 0 1 2 3 6 4 3 6 1 2 3 3 3 2. Rep= repetición t= tiempo (Días) H= huevos L= larvas P= pupas C= carmelitas A= adultos T= total indivíduos.

(46) 121 121 121 121 121 121 121 121 121 121 121 121 121 121 122 122 122 122 122 122 122 122 122 122 122 122 122 122 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123. 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2. 4 8 12 16 20 24 28 4 8 12 16 20 24 28 4 8 12 16 20 24 28 4 8 12 16 20 24 28 4 8 12 16 20 24 28 4 8 12 16 20. 1 0 0 5 0 0 0 3 1 2 1 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 5 1 1 4 0 0 2 0 2 2 0 0 0 2 3 1 2 0 1. 1 0 1 0 0 0 0 0 2 1 1 1 2 1 0 0 0 4 4 2 0 0 0 1 0 0 0 1 0 4 0 2 0 2 3 0 0 0 3 3. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0. xlvi. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0. 1 0 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1. 3 0 2 6 0 0 0 4 4 4 3 2 3 2 0 1 3 5 5 3 0 6 2 3 5 0 0 4 0 7 3 3 0 3 6 4 2 3 4 5.

(47) 123 123 124 124 124 124 124 124 124 124 124 124 124 124 124 124 125 125 125 125 125 125 125 125 125 125 125 125 125 125 126 126 126 126 126 126 126 126 126 126 126. 2 2 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2. 24 28 4 8 12 16 20 24 28 4 8 12 16 20 24 28 4 8 12 16 20 24 28 4 8 12 16 20 24 28 4 8 12 16 20 24 28 4 8 12 16. 0 0 0 2 0 0 0 0 0 4 0 0 0 1 1 1 2 0 0 0 0 0 0 5 4 0 1 1 0 0 0 0 0 2 2 0 0 2 1 0 0. 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 2 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 2 0 1 1 0 0 0 3 3 4 2 0 0 0 0. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0. xlvii. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0. 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0. 3 0 1 3 0 0 0 0 0 5 1 0 2 2 2 4 3 0 0 2 0 0 0 6 5 0 4 2 2 2 1 1 0 6 6 5 3 3 2 0 0.

(48) 126 126 126 127 127 127 127 127 127 127 127 127 127 127 127 127 127 128 128 128 128 128 128 128 128 128 128 128 128 128 128 129 129 129 129 129 129 129 129 129 129. 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2. 20 24 28 4 8 12 16 20 24 28 4 8 12 16 20 24 28 4 8 12 16 20 24 28 4 8 12 16 20 24 28 4 8 12 16 20 24 28 4 8 12. 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 2 1 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 2 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 1 2 2. 1 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 1 2 1 2 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0. xlviii. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0. 1 0 0 1 1 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1. 3 0 0 1 2 0 0 3 0 0 2 3 3 3 3 3 3 2 0 0 0 0 0 0 3 0 2 2 0 0 2 1 1 0 0 2 2 1 2 3 3.

(49) 129 129 129 129 130 130 130 130 130 130 130 130 130 130 130 130 130 130 131 131 131 131 131 131 131 131 131 131 131 131 131 131 132 132 132 132 132 132 132 132 132. 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 2 2. 16 20 24 28 4 8 12 16 20 24 28 4 8 12 16 20 24 28 4 8 12 16 20 24 28 4 8 12 16 20 24 28 4 8 12 16 20 24 28 4 8. 0 1 1 0 0 8 2 0 2 0 2 0 0 2 2 1 0 2 0 0 0 0 3 0 0 3 2 0 0 1 0 1 1 1 1 1 3 3 0 2 0. 0 3 1 0 0 0 0 2 0 2 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 2 1 4 4 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0. xlix. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0. 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 0 0 1 1 1 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1. 0 5 3 0 1 9 3 3 3 3 4 1 0 3 4 2 0 4 0 0 3 2 8 5 0 4 3 0 0 2 2 2 2 2 2 2 4 4 0 3 1.

(50) 132 132 132 132 132 133 133 133 133 133 133 133 133 133 133 133 133 133 133 134 134 134 134 134 134 134 134 134 134 134 134 134 134 135 135 135 135 135 135 135 135. 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 2. 12 16 20 24 28 4 8 12 16 20 24 28 4 8 12 16 20 24 28 4 8 12 16 20 24 28 4 8 12 16 20 24 28 4 8 12 16 20 24 28 4. 0 1 0 1 1 0 0 0 0 2 2 0 0 1 0 1 0 0 1 3 3 3 0 0 2 2 2 1 2 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0. 0 1 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0. l. 0 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0. 0 3 3 2 2 1 1 0 0 3 3 0 0 4 2 3 0 2 3 4 4 4 0 0 3 3 3 2 3 0 4 3 2 0 0 0 0 0 0 0 0.

(51) 135 135 135 135 135 135 136 136 136 136 136 136 136 136 136 136 136 136 136 136 137 137 137 137 137 137 137 137 137 137 137 137 137 137 138 138 138 138 138 138 138. 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1. 8 12 16 20 24 28 4 8 12 16 20 24 28 4 8 12 16 20 24 28 4 8 12 16 20 24 28 4 8 12 16 20 24 28 4 8 12 16 20 24 28. 1 2 0 1 1 2 0 0 3 3 2 2 2 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 3 2 1 4 0 0 0 0 1 2 2 0 0 0 0 0. 0 0 1 2 0 1 0 0 0 2 4 4 4 0 0 0 0 1 3 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 1 2 0 0 0 0 0 0 0. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0. li. 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0. 2 3 2 4 2 4 0 0 4 6 7 7 7 2 1 0 2 2 4 0 0 0 1 0 0 6 3 2 5 0 0 0 2 4 3 3 0 0 0 0 0.

(52) 138 138 138 138 138 138 138 139 139 139 139 139 139 139 139 139 139 139 139 139 139 140 140 140 140 140 140 140 140 140 140 140 140 140 140 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo. 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1. 4 8 12 16 20 24 28 4 8 12 16 20 24 28 4 8 12 16 20 24 28 4 8 12 16 20 24 28 4 8 12 16 20 24 28 4 8 12 16 20 24. 0 1 0 2 1 0 0 0 1 0 0 2 2 0 0 2 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 2 1 1 0 1 3 2 0 4 4 1. 0 0 2 1 3 1 1 0 0 0 0 5 5 0 0 0 1 0 0 2 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 2 3 2 2. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0. lii. 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1. 1 2 3 4 5 2 2 0 2 0 0 8 8 0 0 3 3 0 2 3 0 0 0 0 3 0 0 0 2 0 3 2 2 0 3 4 3 3 8 7 4.

(53) Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo. 1 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2. 28 4 8 12 16 20 24 28 4 8 12 16 20 24 28 4 8 12 16 20 24 28. 2 2 2 3 2 3 1 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0. 1 0 0 1 0 1 1 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0. 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0. 4 3 3 5 3 5 3 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0. Resumen La broca del café Hypothenemus hampei (Ferrari) es la plaga más importante para el café en Colombia y hace el daño al atacar la cereza y reproducirse internamente en el endospermo, causando la pérdida del grano y muchas veces la caída prematura de los frutos. La zona cafetera Colombiana presenta altas densidades de siembra, topografía de difícil acceso para realizar las prácticas de control así como condiciones climáticas que favorecen la fructificación durante gran parte del año, lo cual hace que el ataque de la broca sea más severo que en muchas otras regiones del mundo cafetero. La mayoría de los países en los cuales la broca es un problema, la han atacado utilizando insecticidas sintéticos que causan efectos negativos en el ecosistema.. liii.