UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
ESCUELA PROFESIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
Evaluación del efecto in vitro del extracto hidroetanólico de Vaccinium corymbosum L. “arándano” sobre el crecimiento y algunos factores de virulencia de Candida
albicans ATCC 10231.
TESIS PARA OBTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO
Autor : Br. Pastor García, Hebert Jhimsy
Asesor : Dra. Luján Velásquez, Manuela Natividad
TRUJILLO – PERÚ
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AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
Dr. Carlos Alberto Vásquez Boyer Rector
D. Juan Amaro Villacorta Vásquez Vicerrector académico
Dr. Guillermo Arturo García Pérez Vicerrector de investigación
Dr. Esteban Alejandro Illich Zerpa Secretario general
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AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS
Dr. Adalberto González Varas Decano
Dr. Fátima Zavala de la Cruz Secretario
Dr. Julio Chico Ruíz Director de la escuela académico Profesional de Ciencias Biológicas
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JURADO DICTAMINADOR
Mblgo. Juan H. Wilson Krugg Presidente del jurado
Blgo. José A. Saldaña Jiménez Secretario del jurado
Dra. Manuela Natividad Luján Velásquez Vocal del jurado
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PRESENTACION
Señores miembros del Jurado Dictaminador
Dando cumplimiento a lo dispuesto en el Reglamento de Grados y Títulos de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, me honro en presentar y someter a vuestra consideración y elevado criterio el presente informe de tesis titulado Evaluación del efecto in vitro del extracto hidroetanólico de Vaccinium corymbosum L. “arándano” sobre el crecimiento y algunos factores de virulencia de Candida albicans ATCC 10231, con el que pretendo obtener el Título Profesional de Biólogo.
Trujillo, octubre del 2020
Hebert Jhimsy Pastor García Br. EN CIENCIAS BIOLOGICAS
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APROBACION DE TESIS
Los que suscriben miembros del Jurado Dictaminador declaramos que el presente informe de tesis reúne los requisitos fundamentales exigido por lo que ha sido APROBADA por UNANIMIDAD.
Mblgo. Juan H. Wilson Krugg Presidente del jurado
Blgo. José A. Saldaña Jiménez Secretario del jurado
Dra. Manuela Natividad Luján Velásquez Vocal del jurado
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DEDICATORIA
A Dios Yahvé por brindarme la sabiduría, la salud y la paciencia necesaria para poder
culminar este trabajo y no desalentarme durante todo este tiempo.
A mi madre Mery por haberme brindado su apoyo incondicional en todo momento ante cualquier adversidad y siempre dándome
ánimos de seguir adelante y ser un buen profesional.
A mi padre Jhonny por ser un ejemplo de esfuerzo y sacrificio, por brindarme sus
consejos y enseñarme a tratar de dar soluciones a los diferentes problemas que se
presenten en la vida.
A mis hermanos Merly y Luis, quienes me alientan a seguir luchando y por los momentos
de alegría y superación que pasamos.
A mi novia Sheyla, por ayudarme en el desarrollo de esta investigación y por estar presente en todo momento acompañándome.
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RECONOCIMIENTO
A mi asesora Dra. Manuela Natividad Luján Velásquez por brindarme su tiempo, paciencia y
su apoyo en el desarrollo de este trabajo de investigación.
Al profesor Marco Salazar por brindarme su apoyo en el tamizaje
fitoquímico del extracto hidroetanólico de V. corymbosum
L. “arándano”
Al profesor Juan Wilson Krug por apoyarme con las mediciones
microscópicas para el desarrollo de esta investigación y por sus
sugerencias.
Al profesor José Saldaña Jiménez, por el tiempo que se tomó en revisar esta investigación y por
sus sugerencias.
A los Ing. Víctor Ramírez Carrillo e Ing. María Edquén Quintana,
por apoyarme con el material biológico de V. corymbosum L.
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CONTENIDO
Pág.
Autoridades de la Universidad Nacional de Trujillo ……….……….... i
Autoridades de la Facultad de Ciencias Biológicas ……….. ii
Jurado Dictaminador ………. iii
Presentación………... iv
Aprobación de tesis……….v
Dedicatoria………..………..………...vi
Reconocimiento………..………...vii
Contenido………..………viii
Lista de figuras y tablas………..ix
Resumen………..x
Abstract………...xi
Introducción……….01
Material y métodos………..10
Resultados………...24
Discusión………..31
Conclusiones………50
Referencias bibliográficas………..51
Anexos………..72
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LISTA DE FIGURAS Y TABLAS
Figura 1. Efecto de las concentraciones de 25%, 50% y 75% del extracto hidroetanólico de V. corymbosum L. sobre el crecimiento de Candida albicans ATCC 10231 (a) Ausencia de halos de inhibición. (b) Nistatina (C+) y SSF (C-)………..………26 Figura 2. Efecto del extracto hidroetanólico de V. corymbosum L. sobre la formación del tubo germinativo de C. albicans ATCC 10231. En presencia de suero (a), Nistatina (b) y extracto: 25% (c), 50% (d) y 75% (e). ………...27 Figura 3. Efecto del extracto hidroetanólico de V. corymbosum L. sobre la
elongación de la hifa de C. albicans ATCC 10231. En presencia de suero (a), Nistatina (b) y extracto: 25% (c), 50% (d) y 75% (e).
………...28 Figura 4. Densidad Óptica a 490 nm (DO490) en la determinación de la
actividad metabólica de la biopelícula de C. albicans ATCC 10231 frente a concentraciones de 25% (T1), 50% (T2) y 75% (T3) del extracto hidroetanólico de V. corymbosum L., medio MEM (CN) y Nistatina (CP) .………...….29
Tabla 1. Clasificación de la formación de biopelícula en relación a las lecturas de densidad óptica a 490nm (DO490) ..……….22
Tabla 2. Clasificación de la formación de biopelícula de C. albicans ATCC 10231 en relación a la DO490 en los diferentes tratamientos del extracto hidroetanólico de V. corymbosum L. ………..………..…30
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RESUMEN
El objetivo de la presente investigación fue evaluar el efecto in vitro del extracto hidroetanólico de Vaccinium corymbosum L. “arándano” sobre el crecimiento y algunos factores de virulencia de Candida albicans ATCC 10231.
Se utilizó las concentraciones de 25%, 50% y 75% del extracto para evaluar el efecto sobre el crecimiento con la metodología de Kirby Bauer (método del cilindro). La morfogénesis se evaluó, mediante los porcentajes de formación de tubo germinativo a las 2h. de incubación y la elongación de hifa a las 4h. En la evaluación del efecto en las biopelículas, se midió la actividad metabólica con el método colorimétrico producto de la reducción de TTC (2, 3, 5 – Trifenil Tetrazolio Cloruro) y la formación de biopelículas se clasificó según los niveles de DO490. La fase exponencial de la curva de crecimiento fue entre las 4 y 14 h.
a una velocidad de crecimiento 0,899 generaciones/hora. No se observaron halos de inhibición del crecimiento, formación de tubo germinativo, ni elongación de hifa de C. albicans ATCC 10231 a las concentraciones del extracto empleadas.
Respecto a la actividad metabólica de la biopelícula se observó que las tres concentraciones presentaron una DO490 de 0,078±0.021; 0,080±0.016 y 0,074±0.015 respectivamente, siendo mayores al control positivo (0.034±0.013) y negativo (0.057±0.010), y en todos los tratamientos presentaron una formación moderada de biopelícula. Se concluye que, las concentraciones a 25%, 50% y 75% del extracto de V. corymbosum L. “arándano” frente a C. albicans ATCC 10231 no tuvieron efecto inhibidor sobre el crecimiento y la formación de biopelícula; sin embargo, si tuvieron efecto en la morfogénesis al inhibir la formación de tubo germinativo y la elongación de hifa.
Palabras clave: Candida albicans ATCC 10231, Vaccinium corymbosum, morfogénesis, biopelícula.
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ABSTRACT
The objective of the present investigation was to evaluate the in vitro effect of the hydroethanolic extract of Vaccinium corymbosum L. "blueberry" on the growth and some virulence factors of Candida albicans ATCC 10231. The concentrations of 25%, 50% and 75% of the extract were used to evaluate the effect on growth with the Kirby Bauer methodology (cylinder method).
Morphogenesis was evaluated by germ tube formation percentages at 2h.
incubation and hypha elongation at 4h. In the evaluation of the effect on biofilms, the metabolic activity was measured with the colorimetric method as a result of the reduction of TTC (2, 3, 5 - Triphenyl Tetrazolium Chloride) and the formation of biofilms was classified according to DO490 levels. The exponential phase of the growth curve was between 4 and 14 h. at a growth rate of 0.899 generations / hour.
No growth inhibition halos, germ tube formation, or hypha elongation of C.
albicans ATCC 10231 were observed at the extract concentrations used.
Regarding the metabolic activity of the biofilm, it was observed that the three concentrations presented an OD490 of 0.078 ± 0.021; 0.080 ± 0.016 and 0.074 ± 0.015 respectively, being higher than the positive control (0.034 ± 0.013) and negative (0.057 ± 0.010), and in all the treatments they presented a moderate biofilm formation. It is concluded that the concentrations at 25%, 50% and 75%
of the extract of V. corymbosum L. "cranberry" against C. albicans ATCC 10231 did not have an inhibitory effect on growth and biofilm formation; however, they did have an effect on morphogenesis by inhibiting germ tube formation and hypha elongation.
Keywords: Candida albicans ATCC 10231, Vaccinium corymbosum, morphogenesis, biofilm.
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I. INTRODUCCIÓN
En la actualidad, las enfermedades infecciosas son un problema serio para la salud de las personas. La incidencia de infección y/o colonización de bacterias y hongos han ocasionado un aumento de morbimortalidad en las últimas décadas 1, 2. Los microorganismos patógenos más comunes en el hombre son Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Salmonella no-typhi, Neisseria meningitidis 3, 4, 5, Candida albicans, C. parapsilosis, C. tropicalis, C.
glabrata, Aspergillus sp., Fusarium sp.,Chlamydia sp., Scedosporium sp., Pneumocystis jiroveci 4, 6.
C. albicans es un hongo microscópico, comensal, patógeno y oportunista 7, 8 y presenta dimorfismo, forma filamentosa (micelio) y la forma de levadura 9. Causa dos tipos principales de infecciones:
infecciones superficiales (candidiasis oral o vaginal), e infecciones sistémicas 10.
Esta especie de levadura, coloniza e infecta la boca, el tracto gastrointestinal, piel y el tracto genitourinario, como la vagina en las superficies epiteliales 11, 12. Es un microorganismo que forma parte del microbiota vaginal, no obstante, puede expandirse y causar una infección sistémica, sobre todo en personas inmunosuprimidas 13.
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C. albicans no solo vive de forma planctónica de vida libre, sino que también forma biopelículas en los tejidos del huésped 11, 14. Forman comunidades sésiles en tejidos vivos, como las superficies mucosas y superficies abióticas, como los dispositivos de prótesis, los catéteres y otros dispositivos médicos permanentes 11, 15. Puesto que, en la superficie de la pared celular se han definido estructuras fibrilares que participan en la adhesión del hongo a las células del hospedador, similares a las fimbrias de algunas bacterias 16.
Las biopelículas o biofilms son asociaciones que pueden estar formadas por una sola especie de bacteria u hongo o por varias especies microbianas y para su formación, inicia con la adherencia sobre una superficie abiótica o en un tejido de acuerdo con sus diferentes fases de desarrollo: acondicionamiento, adhesión, síntesis de matriz extracelular inducida por quorum sensing, maduración y dispersión. 17.
Las biopelículas de C. albicans están formadas por una capa basal de blastosporas, hifas y pseudohifas ordenadas en una estructura de doble capa, dentro de una matriz extracelular; también, esta especie produce farnesol y tirosol, dos moléculas de comunicación intercelular o quórum sensing que aceleran y bloquean la transición morfológica de levadura a hifa 18.
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Desde 1970 la incidencia de las infecciones fúngicas ha aumentado de 3 a 20 veces como consecuencia del uso de antimicóticos, corticoterapia y tratamientos con inmunosupresores 19. Por otro lado, personas que tienen linfocitos por debajo del umbral como los pacientes con VIH/SIDA, han provocado un incremento de infecciones oportunistas como el género Candida 20. Estas infecciones fúngicas están asociadas con las altas tasas de mortalidad, lo cual se evidencia las limitaciones de la terapia antifúngica 21.
Las infecciones causadas por hongos y la mortalidad en seres humanos han aumentado, el 20% a 50% de los casos es causada por el género Candida, 40% a 80% por Aspergillus 22. En el hospital en los Estados Unidos la tasa de mortalidad es hasta el 50% por Candida spp al provocar infecciones sistémicas 10. En Brasil, un estudio multicéntrico halló 712 casos de candidemia con una tasa de 2,49 casos por cada 1000 admisiones, siendo C. albicans la especie más común 23.
En el Perú, se realizó un estudio en el Hospital Nacional Guillermo Almenara Irigoyen en los años 2004-2006 y menciona que las infecciones del torrente sanguíneo causada por Candida corresponden al 11.6% 24. Otro estudio realizado en nueve hospitales de Lima, identificaron 153 aislamientos recolectados entre 2009-2011, siendo la especie C. albicans aislada con mayor frecuencia (39,9%) 25 y uno realizado en tres hospitales de Lima-Callao donde en los años 2013-2015 la incidencia por cada centro
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osciló entre 1,01 y 2,63 casos de candidemia por cada 1000 ingresos, siendo C. albicans el de mayor frecuencia (27,8%) 26. En el Instituto Especializado de Salud del Niño durante un periodo de tres años se registró 823 hospitalizaciones y la frecuencia de gérmenes para el género Candida sumaron 6,8%, siendo el 3% para Candida albicans 27.
En la ciudad de Trujillo-Perú se realizó un estudio sobre la distribución anatómica y susceptibilidad antifúngica de especies de Candida en tres hospitales: Regional Docente, Belén y Víctor Lazarte Echegaray, donde las muestras estaban conformadas por secreción vaginal y de pie, orina, esputo, sangre, aspirado traqueal, mucosa bucal y uñas;
teniendo como resultados: C. albicans es de mayor frecuencia (64,1%) seguida por C. tropicalis (17%), C. glabrata (7%), C. krusei (7%), C.
parapsilosis (3,1%) y C. guilliermondii (1,8%) 28.
Las especies Candida son oportunistas y puede conducir a una candidemia, es decir, una enfermedad del torrente sanguíneo que causa del 10 al 15 % de las sepsis nosocomiales 19. Las especies de Candida son el tercer grupo de microorganismos que se relacionan con infecciones en el torrente sanguíneo 21.
El 65% de las infecciones humanas están relacionadas con la formación de biopelículas 29. Su forma de desarrollo confiere a los microorganismos ganar resistencia frente a los antimicrobianos, es debido
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a esto, que los fármacos fracasen regularmente 30. Estas infecciones son un desafío para el tratamiento antimicótico, una estrategia para poder combatirlo es el análisis de los componentes derivados de las plantas 31, 32,
33.
Para combatir a estos agentes patógenos se prescriben fármacos antimicrobianos en todo el mundo, como consecuencia del mal uso de estos, la tasa de resistencia a los antimicrobianos está en aumento 34 y para tratar de controlar esta resistencia se buscan nuevas drogas 32. Por ejemplo, el uso prolongado del fluconazol ha elevado la resistencia de los hongos, así como la caspofungina, causando resistencia en algunas cepas de C.
albicans debido a la mutación del gen FKS1P 35. Según Saravia y Guillinta (2012) 36, mencionan que los fármacos antifúngicos tienen una toxicidad importante y llegan a causar resistencia en los hongos.
Hace más de 2500 años los chinos usaron la cáscara mohosa de soya como tratamiento de los forúnculos, carbuncos 37, 38. Desde la antigüedad el hombre ha controlado ciertas enfermedades infecciosas, problemas de resistencia de los microorganismos y los efectos colaterales que poseen los antimicrobianos, utilizando las plantas 39.
En la actualidad, distintas especies de plantas de uso etnofarmacológico son fuentes de moléculas con importante actividad biológica, que han alcanzado un gran interés por sus diferentes
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aplicaciones medicinales, alimenticios, cosméticos 40 e incluso para la conservación de alimentos 41.
Los extractos vegetales y productos naturales son fuente de agentes anti-infectivos, por lo que muchos países se han involucrado en la obtención de medicamentos a partir de estos 42. Por ejemplo, el extracto etanólico de Origanum vulgare “orégano”, Tagetes elliptica “chincho” y Tagetes minuta “huacatay” tienen propiedades antimicrobianas 43. Las especies Arctostaphylos uva-ursi “gayuba” y Vaccinium macrocarpon
“arándano” se usan para tratar infecciones del tracto urinario 44. Esto se debe, a la presencia de diferentes moléculas conocidas como metabolitos o principios activos 45.
Los metabolitos secundarios se agrupan en terpenos (fitohormonas, pigmentos o aceites esenciales), compuestos fenólicos (cumarinas, flavonoides, lignina y taninos), glicósidos (saponinas, glicósidos cardiacos, glicósidos cianogénicos y glucosinolatos), alcaloides 46. Estos metabolitos naturales tienen funciones defensivas frente a microorganismos e insectos 47.
Vaccinium corymbosum L., es una planta nativa del Este de Norteamérica, conocida como “arándano”, “arándano alto”, “arándano americano blueberry” o “highbush” 48, 49, 50. Esta especie pertenece a la familia Ericaceae y cuenta con 450 especies aproximadamente 51.
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En los frutos del género Vaccinium, dentro del grupo de los flavonoides y ácidos fenólicos, se ha encontrado metabolitos secundarios como: quercetina, miricetina y ácido cáustico 52, 53. También, se ha encontrado antocianinas y proantocianidinas dentro del grupo de los flavonoides 54, 55.
En los frutos de V. corymbosum L., se encontró antocianinas, proantocianidinas (prodelfinidinas y procianidinas), flavonoles (miricetina y quercetina) y Ácidos hidroxicinámicos (ác. p-cumárico y ác. cafeico) 56. La composición de los metabolitos secundarios del arándano depende del genotipo de la planta y otros factores 57.
Los metabolitos secundarios del arándano tienen efecto antioxidante, antimicrobiano capaz de prevenir una infección a nivel renal
58, astringente, antiescorbútico, desinfectante 48 y para prevenir la gripe 59. Es importante mencionar que el ácido fenólico inhibe el crecimiento microbiano 55. Por ejemplo, los compuestos fenólicos han mostrado acción antibacteriana frente Helicobacter pylori 60.
Por otro lado, se ha demostrado que el extracto de V. corymbosum L. tiene un efecto inhibidor en el crecimiento de L. monocytogenes y S.
Enteritidis 61. En las especies Candida glabrata, C. lusitaniae, C. krusei y Cryptococcus neoformans, hubo inhibición de su crecimiento, debido a las
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proantocianidinas del arándano, con excepción de C. albicans y C.
tropicalis que no tuvieron una inhibición significativa 62.
El arándano puede reducir la adherencia de S. aureus, P. mirabilis, K. pneumoniae, Enterococcus sp., P. aeruginosa y Salmonella sp 63, 64. El pretratamiento con el extracto del arándano sobre la superficie del medio de cultivo, tiene una actividad antiadherente contra C. glabrata y una actividad de antibiopelícula contra C. albicans65.
Para inhibir la adhesión, el arándano tiene dos compuestos: la fructuosa inhibe las fimbrias tipo 1 (manosa sensible) y las proantocianidinas, las fimbrias tipo P (manosa resistente) 66. La proantocianidina de tipo A inhibe las fimbrias de tipo P y tipo 1 de E. coli
60. Las proantocianidinas son taninos condensados, las de tipo A son las responsables de la acción antiséptica, antibacteriana 67 y antimicótica 62.
C. albicans tiene la capacidad de invadir y causar infecciones que puede llevar a las personas a un cuadro de sepsis, y para combatirlo se utilizan antimicóticos. Sin embargo, el uso inadecuado de estos medicamentos y la automedicación, este microorganismo ha adquirido resistencia. Una alternativa para solucionar este problema es el uso de extractos vegetales, es por eso, que el objetivo de este trabajo fue determinar el efecto del extracto hidroetanólico de Vaccinium corymbosum L. “arándano” a las concentraciones de 25%, 50% y 75%
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sobre el crecimiento y algunos factores de virulencia de Candida albicans ATCC 10231 en condiciones de laboratorio.
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II. MATERIAL Y METODOS
1. Material Biológico
Los frutos de V. corymbosum L. “arándano” procedieron del vivero
“ANDEAN BERRIES PERÚ”, del Distrito de Jesús, Provincia de Cajamarca, Región Cajamarca (7°14´40.23´´S, 78°23´42.44´´W) (Anexo 1).
La cepa de C. albicans ATCC 10231 fue proporcionada por el laboratorio de Inmunología del Departamento de Microbiología y Parasitología de la UNT.
2. Procedimiento
2.1. Identificación Taxonómica
Se tomó un ejemplar (planta) de V. corymbosum L. y fue llevada para su identificación taxonómica en el Herbarium Truxillense (HUT) de la Universidad Nacional de Trujillo, esta fue determinada mediante el código 60456 (Anexo 2).
2.2. Recolección de los frutos Vaccinium corymbosum L.
“arándano”
Los frutos de arándanos se recolectaron en fase madura, en buen estado y libre de mohos. Posteriormente, se transportaron al laboratorio de Inmunología de la Universidad Nacional de Trujillo (Anexo 3).
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2.3. Obtención del extracto hidroetanólico de los frutos de Vaccinium corymbosum L. “arándano”
2.3.1. Selección de los frutos de arándano
Los frutos recolectados fueron seleccionados con diámetro entre 13.30 – 16.30 mm y en buen estado.
2.3.2. Lavado y desinfección de los frutos de arándano
Los frutos seleccionados de arándano, se lavaron con agua destilada y se desinfectaron con hipoclorito de sodio al 3.0%
durante 2 minutos. Luego, se enjuagaron con suficiente agua destilada estéril para retirar los residuos de hipoclorito de sodio (Anexo 3).
2.3.3. Obtención del extracto
Para la obtención del extracto hidroetanólico se usó la metodología de Carvajal y col.68 Se pesaron 500 g de fruto de Vaccinium corymbosum, se colocó dentro de una licuadora comercial y se agregó etanol 96° en cantidad suficiente hasta cubrir el material vegetal para ser licuados.
Posteriormente, se vertió en un envase estéril de vidrio ámbar de boca ancha de 1 litro de capacidad y se dejó macerar por una semana, agitándose dos veces por día. Transcurrido el tiempo de maceración, se filtró con papel de filtro N° 3, la
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fase líquida se llevó a perpavorar por un tiempo necesario hasta que se evaporó el etanol 96°. Después de la pervaporación quedó una fase sólida y se almacenó en un envase estéril de vidrio ámbar de boca ancha bajo refrigeración (4 °C), hasta su posterior empleo (Anexo 4 y 5).
2.4. Identificación cualitativa de metabolitos secundarios del extracto.
Una porción del extracto se llevó al laboratorio de Fitoquímica del Departamento de Química Biológica y Fisiología Animal de la Facultad de Ciencias Biológicas de la UNT, para la identificación de metabolitos secundarios (Anexo 6 y 7).
2.5. Reactivación, verificación y obtención de cultivos puros de C.
albicans ATCC 10231
La cepa de C. albicans ATCC 10231 se resuspendió en solución salina fisiológica estéril (SSF) y se sembró por estrías en placas petri conteniendo Agar Sabouraud (ASb), se incubó a 37°C por 24h. Luego, se aisló una colonia y se realizó la coloración Gram para su verificación. Posteriormente se sembró en ASb e incubó a 37°C por 24 horas para la obtención de cultivos puros (Anexo 8).
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2.6. Cinética de crecimiento de Candida albicans ATCC 10231 2.6.1. Preparación de inóculo de C. albicans ATCC 10231
A partir de los cultivos puros, se tomaron algunas colonias para preparar una suspensión de 5 mL de solución salina fisiológica estéril 0.9% (SSF) a una concentración de 6x106 UFC/mL.
2.6.2. Elaboración de la curva de crecimiento de C. albicans ATCC 10231
Se preparó 75 mL de caldo Brain Heart Infusion (BHI) en un matraz Erlemeyer y se adicionó un volumen de 1.0 mL (6x106 UFC/mL) del inóculo preparado de C. albicans ATCC 10231 69. Luego se llevó a incubar a 37 °C. Durante el desarrollo, se tomaron muestras cada dos horas por un periodo de 24 h y se realizaron diluciones sucesivas en SSF, considerando el aumento de la población de levaduras. Se determinó la concentración celular (levaduras/mL) con la cámara de Neubauer (Anexo 9).
2.6.3. Procesamiento de datos
Se graficó la curva de crecimiento de C. albicans ATCC 10231 en Excel, con los datos obtenidos del crecimiento celular (levaduras/mL) en relación al tiempo de incubación.
(Anexo 10). Luego se realizó los cálculos necesarios para
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determinar el valor de la velocidad de crecimiento (K=generaciones/hora) de C. albicans ATCC 10231, a partir de la constante específica de velocidad de crecimiento de la fase exponencial o logarítmica (Anexo 11).
2.7. Determinación del efecto del extracto hidroetanólico de Vaccinium corymbosum L. sobre C. albicans ATCC 10231
2.7.1. Evaluación del efecto del extracto hidroetanólico de V.
corymbosum L. sobre el crecimiento de C. albicans ATCC
10231
Se siguió la metodología establecida de difusión en agar por Kirby Bauer (método del cilindro)70.
2.7.1.1. Estandarización de inóculo de C. albicans ATCC 10231 A partir de los cultivos puros se tomó una colonia para ser suspendida en 5mL de solución salina fisiológica estéril 0.9% (SSF) agitándose manualmente hasta alcanzar una concentración equivalente al grado de turbidez del tubo N° 0.5 de la escala de Mac Farland (1,5 x 108 UFC/mL). Luego, se sembró en agar Sabouraud, se incubó a 37 °C por 24-48 horas y se verificó el número de unidades formadoras de colonia (Anexo 12).
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2.7.1.2. Preparación del extracto
Las concentraciones del extracto se prepararon en agua destilada estéril. Luego, cada concentración del extracto se esterilizó por filtración, usando filtros de membrana de 0.22 µm. Finalmente, las concentraciones preparadas del extracto hidroetanólico, se colocaron en viales ámbar estériles de 10 mL (Anexo 12).
2.7.1.3. Procedimiento del método de difusión en pozo.
Se realizó una siembra por diseminación agregándose 100 µl de la muestra estandarizada a cada placa con agar Sabouraud. Luego se dejó secar de 3 a 5 minutos a temperatura ambiente. Con un sacabocado se hicieron pozos de 6 mm de diámetro equidistantes y se colocaron 50µL de cada concentración (25%, 50% y 75%) del extracto hidroetanólico de Vaccinium corymbosum L., como control positivo se usó Nistatina y control negativo, SSF estéril. Posteriormente, las placas se incubaron a 37°C por 12 horas (Anexo 12).
2.7.1.4. Lectura de resultados
Se midió el diámetro de los halos de inhibición en milímetros, con una regla milimetrada.
Se realizó 10 repeticiones para cada prueba.
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2.7.2. Evaluación de la morfogénesis de C. albicans ATCC 10231.
2.7.2.1. Crecimiento y estandarización del inóculo C. albicans ATCC 10231.
Se realizó una suspensión en SSF estéril de C. albicans ATCC 10231 y se sembró por estrías en agar Levadura Peptona Dextrosa (YPD) e incubó a 37 °C por 24 horas.
Posteriormente se resuspendió en PBS estéril hasta obtener una concentración aproximada de 1.5 x108 células/mL con el nefelómetro de Mac Farland tubo N°
0.5.
2.7.2.2. Determinación del efecto del extracto hidroetanólico de V. corymbosum L. en la formación de tubos germinativos y la elongación de hifas de C. albicans ATCC 10231.
La evaluación se realizó en una microplaca de cultivo, el cual se dividió en cinco grupos:
Grupo A: 25% extracto hidroetanólico de V.
corymbosum L.
Grupo B: 50% extracto hidroetanólico de V.
corymbosum L.
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Grupo C: 75% extracto hidroetanólico de V.
corymbosum L.
Grupo D: 0.2 mg/mL de Nistatina (Control Positivo).
Grupo E: Suero humano 50% (Control Negativo).
Se preparó el extracto hidroetanólico de V. corymbosum L. a concentraciones de 25%, 50% y 75% en suero humano 50%. Luego, se agregó 500 µL del extracto hidroetanólico a 25% a cada pocillo de la microplaca del grupo A, de la misma manera para los pocillos del grupo B (50%) y C (75%). En los pocillos del grupo D se agregó sólo 500 µL de suero humano 50% como control negativo. En el grupo D, se agregó suero humano 50% y nistatina para 0.2 mg/mL haciendo un volumen final de 500 µL. Luego, se agregó 3,3 µL del inóculo estandarizado en los pocillos de todos los grupos (A, B, C, D y E) para obtener un valor aproximado de 1x106 UFC/mL. Posteriormente, se incubó a 37 °C durante 2 h.
para la evaluación de formación de tubos germinativos y 2 h. adicionales, para evaluar la elongación de hifas de C.
albicans ATCC 10231 71 (Anexo 15).
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2.7.2.3. Lectura de resultados
Para la evaluación de la formación de tubos germinativos se tomó en cuenta lo siguiente: el ancho del tubo germinativo debe ser la mitad de la célula progenitora y su longitud tres o cuatro veces mayor 72. Las células se observaron microscópicamente y se calculó los porcentajes de formación de tubos germinativos y la elongación de hifas en comparación con el control negativo mediante la siguiente fórmula 71:
FTG: Porcentaje de formación de tubos germinativos.
TGP: Número de tubos germinativos promedio.
EH: Porcentaje de elongación de hifa.
LHP: Longitud de hifa promedio.
Se realizó 10 repeticiones para cada prueba.
FTG (%) = (TGP en el tratamiento
TGP del grupo control ) 𝑥 100
EH (%) = ( LHP del tratamiento
LHP del grupo control) 𝑥 100
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2.7.3. Determinación del efecto del extracto hidroetanólico de V. corymbosum L. sobre la biopelícula de C. albicans ATCC 10231.
2.7.3.1. Distribución de los grupos de trabajo.
Grupo A: 25% extracto hidroetanólico de V.
corymbosum L.
Grupo B: 50% extracto hidroetanólico de V.
corymbosum L.
Grupo C: 75% extracto hidroetanólico de V.
corymbosum L.
Grupo D: Nistatina 0,2 mg/mL (Control Positivo).
Grupo E: Medio MEM (Minimun Essential Medium)
2.7.3.2.Crecimiento y estandarización del inóculo C. albicans ATCC 10231.
A partir de un cultivo puro se realizó una suspensión en SSF estéril de C. albicans ATCC 10231 y se sembró por estrías en agar Levadura Peptona Dextrosa (YPD) e incubó a 37 °C por 24 h. Luego, se tomó una colonia y se sembró en un matraz que contenía 100 mL caldo YPD y se incubó durante 24 h. en un agitador orbital (100 rpm) a 37 °C. Posteriormente, las células se lavaron tres veces por centrifugación (5 min, 2500 rpm) con PBS estéril, pH
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7. Después, se resuspendió en medio MEM (Minimun Essential Medium, pH 7) y se estandarizó a una concentración de 1x107 UFC/mL mediante el recuento de células en la cámara Neubauer 73 (Anexo 18).
2.7.3.3. Formación de biopelículas de C. albicans ATCC 10231.
Se colocó 100 µL del inóculo estandarizado en cada pocillo seleccionado en las placas de microtitulación. En la fase de adhesión, las placas se incubaron a 37 °C a 100 rpm durante 90 min. y las células no adheridas se eliminaron lavando por triplicado los pocillos con PBS estéril. Luego, se agregó 200 µL del medio de cultivo MEM a cada pocillo seleccionado y las placas se incubaron a 37 °C durante 48 h., después de la fase de adhesión (Anexo 19).
2.7.3.4. Distribución del extracto
En seguida, se eliminó el medio de cultivo MEM de cada pocillo y se lavó tres veces con PBS estéril. En el grupo A se agregó 200 µL de extracto hidroetanólico de V.
corymbosum L. al 25% preparado en medio MEM, de la misma manera para los grupos B (50%) y C (75%). En el grupo D se agregó 200µL de nistatina 0,2 mg/mL y en el grupo E, sólo se agregó 200 µL del medio MEM. Se
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incubó durante 48 horas y luego fueron procesadas y lavadas con PBS estéril (Anexo 20).
2.7.3.5. Cuantificación de la actividad metabólica de las células en las biopelículas con 2, 3, 5 – Trifenil Tetrazolio Cloruro (TTC)
Se agregó una alícuota de 100 μL de la solución TTC 0.5g/L (se esterilizó usando filtros de 0,22 µm) a cada biopelícula prelavada y a los pocillos de control (para la medición de los niveles colorimétricos de TTC de fondo). Las placas se cubrieron con papel de aluminio para evitar la penetración de la luz y se incubó en oscuridad por 2h. a 37°C. TTC se redujo efectivamente por las células vivas de levadura, la solución originalmente transparente se transformó en un color rojo. Después de la incubación de las placas de microtitulación, se retiró 75 μL de TTC de cada pocillo y se transfirieron a los pocillos de una placa de microtitulación nueva (sin biopelículas) 73 (Anexo 21).
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2.7.3.6. Lectura de la actividad metabólica de las células en la biopelícula y clasificación de la formación de biopelícula.
Los cambios colorimétrico producto de la reducción de TTC por la actividad metabólica de C. albicans ATCC 10231 se midieron a una densidad óptica de 490 nm (DO490), utilizando un lector de placas de microtitulación74 y la clasificación de la formación de biopelícula se realizó según lo mencionado por Pannanusorn y col. en relación a la DO490 (Tabla 1)75.
Tabla 1. Clasificación de la formación de biopelícula en relación a las lecturas de densidad óptica a 490 nm (DO490).
Lecturas de DO Formación de Biopelícula
DO490 ≥ 0.100 Fuerte
0.025 ≤ DO490 < 0.100 Moderada
DO490 < 0.025 Sin formación
Se realizó 10 repeticiones para cada prueba.
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3. Análisis de resultados.
Los datos obtenidos de las diferentes evaluaciones, fueron sometidos al Análisis de Varianza de un factor (ANOVA) para hallar la diferencia significativa entre las medias y la prueba de TUKEY para comparar las diferentes concentraciones de los tratamientos con un nivel de significancia de 0.05% y con un intervalo de confianza de 95%. Para este análisis se utilizó el Programa IBM SPSS Statistics versión 25.
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III. RESULTADOS
Se determinó la velocidad de crecimiento (K) de C. albicans ATCC 10231 a partir de la fase exponencial entre las 4 y 14 horas con un valor de 0,899 generaciones/hora (Anexo 10 y 11).
El efecto del extracto hidroetanólico de V. corymbosum L. a las concentraciones de 25%, 50% y 75% sobre el crecimiento de C. albicans ATCC 10231, no se observaron halos de inhibición del crecimiento. Al emplear nistatina, se obtuvo halos de inhibición del crecimiento con un promedio de 19.5 ± 0.5 mm (Figura 1 y Anexo 14).
En la evaluación del efecto en la morfogénesis, no se observaron formación de tubo germinativo, ni elongación de hifas en las tres concentraciones del extracto empleadas. Por otro lado, Nistatina (control positivo) inhibió la formación de tubo germinativo y la elongación de hifa.
Y en el suero (control negativo), se encontró un 94% de formación de tubo germinativo y una longitud promedio de hifa de 17.6 ± 1.4 nm (Figura 2, 3 y Anexo 16, 17).
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El efecto del extracto hidroetanólico de V. corymbosum L. a las concentraciones de 25%, 50% y 75% sobre la actividad metabólica de la biopelícula de C. albicans ATCC 10231, presentaron una DO490 de 0.078
± 0.021; 0.080 ± 0.016 y 0.074 ± 0.015 respectivamente; al hacer el análisis estadístico, se encontró que no hubo diferencia significativa en los tres tratamientos (p>0.05). Al emplear Nistatina (control positivo) se obtuvo una DO490= 0.034 ± 0.013 y el medio MEM (control negativo), una DO490
= 0.057 ± 0.010 (Figura 4).
En todos los tratamientos de acuerdo a la actividad metabólica de la biopelícula se encuentra dentro del rango de formación moderada (Tabla 2).
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Figura. 1. Efecto de las concentraciones de 25%, 50% y 75% del extracto hidroetanólico de V. corymbosum L. sobre el crecimiento de Candida albicans ATCC 10231 (a), (b) Controles: C+(Nistatina) y C-(SSF). Método de difusión en agar Kirby Bauer (en cilindro)70.
A. Presencia de halo de inhibición del crecimiento B. Ausencia de halos de inhibición del crecimiento A
B B
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Figura. 2. Efecto del extracto hidroetanólico de V. corymbosum L. sobre la formación del tubo germinativo de C. albicans ATCC 10231. a) 25%, b) 50%, c) 75%, d) Suero y e) Nistatina.
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Figura. 3. Efecto del extracto hidroetanólico de V. corymbosum L. sobre la elongación de la hifa de C. albicans ATCC 10231. a) 25%, b) 50%, c) 75%, d) Suero y e) Nistatina.
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Figura. 4. Densidad Óptica a 490 nm (DO490) en la determinación de la actividad metabólica de la biopelícula de C. albicans ATCC 10231 frente a concentraciones de 25% (T1), 50% (T2) y 75% (T3) del extracto hidroetanólico de V. corymbosum L., medio MEM (CN) y Nistatina (CP).
a, c p>0.05, b p<0.05.
0.057
0.034
0.078 0.080
0.074
0.000 0.010 0.020 0.030 0.040 0.050 0.060 0.070 0.080 0.090
CN CP T1 T2 T3
DO490
Tratamientos a
a, c
a, c
b
c
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Tabla 2. Clasificación de la formación de biopelícula de C. albicans ATCC 10231 en relación a la DO490 en los diferentes tratamientos del extracto hidroetanólico de V. corymbosum L. (Según Pannanusorn y col., 2013)75.
Tratamiento DO490 Formación de
Biopelícula
CN 0.057 ± 0.010 Moderada
CP 0.034 ± 0.013 Moderada
T1 0.078 ± 0.021 Moderada
T2 0.080 ± 0.016 Moderada
T3 0.074 ± 0.015 Moderada
CN=control negativo, CP=control positivo, concentraciones del extracto T1=25%, T2=50% y T3=75%.
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IV. DISCUSIÓN
Los microorganismos pueden multiplicarse produciendo biomasa bajo condiciones ambientales favorables y en un medio de cultivo con los nutrientes necesarios 76. A medida que esta población de microorganismos crece, se forma una curva de crecimiento que consta de cuatro fases: latencia (lag), exponencial o logarítmica, estacionaria y declinación 77.
Para estudiar el crecimiento de un microorganismo bajo diferentes condiciones, es necesario evaluar ciertos parámetros de la curva de crecimiento 78. En la curva de crecimiento de C. albicans ATCC 10231, se observó que la fase exponencial comenzó a partir de las 4 hasta las 14 horas de evaluación con una población de 1.25 x 104 levaduras/mL y aumentó hasta 6.08 x 106 levaduras/mL, con una velocidad de crecimiento de K=0,899 generaciones/hora (Anexo 9, 10 y 11).
Teniendo en cuenta que, la reproducción de las células logra una actividad máxima durante la fase exponencial y el tiempo de generación, llega a un valor mínimo constante 79. También, mencionar que la temperatura, el pH, los nutrientes y el cloruro sódico pueden afectar los parámetros cinéticos, como la velocidad de crecimiento, biomasa y desarrollo 80, 81, 82 y otros factores como la identidad y el fenotipo del microorganismo 83.
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Los resultados obtenidos, evidencian que las concentraciones de 25%, 50% y 75% del extracto hidroetanólico de V. corymbosum L., no tuvieron efecto sobre el crecimiento de C. albicans ATCC 10231 (Figura 1a). Estos resultados coinciden con Silva y col. (2013) 84, quienes al evaluar el efecto del extracto acuoso de hojas y frutos de V. corymbosum sobre el crecimiento de C. albicans y bacterias de ácido láctico (BAL), encontraron que no inhibían el crecimiento; así mismo, Burdulis y col.
(2009) 85 demostraron que el crecimiento de Candida parapsilosis no fue inhibido.
Patel y col. (2011) 62, encontraron que las proantocianidinas del arándano inhiben el crecimiento de Candida glabrata, C. lusitaniae, C.
krusei y Cryptococcus neoformans, con excepción de C. albicans y C.
tropicalis. Estas investigaciones concuerdan con los resultados obtenidos, donde se demuestra que la especie C. albicans ATCC 10231 muestra una resistencia al extracto hidroetanólico de V. corymbosum L.
Es importante mencionar que los polifenoles como las antocianinas (cianidina-3-O-glucósido, peonidina-3-O-glucósido, delfinidina-3-O-glucósido, petunidina-3-O-glucósido, malvidina-3-O- glucósido) de V. corymbosum L. 86 están en forma glicosilada, y para que puedan ser metabolizadas, debe romperse el enlace con ayuda de las enzimas ß-glucosidasas 87; no obstante, algunos aislados de C. albicans no presentan esta enzima 88. Otro grupo de compuestos fenólicos como
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las proantocianidinas, necesitan ser metabolizadas por la microbiota colónica 89. Por ejemplo, las BAL pueden metabolizar los compuestos fenólicos 90 y los restos de azúcar de las antocianinas pueden usarlo como fuente de energía 84. Probablemente, C. albicans ATCC 10231 también podría degradar algunos polifenoles del extracto, por lo que su crecimiento no ha sido afectado por estos compuestos 91. Esto puede estar relacionado con algunas especies de levaduras de Candida, que tienen la capacidad de degradar compuestos fenólicos, como C. tropicalis 92; posiblemente, C. albicans ATCC 10231 tenga el mismo mecanismo, debido que, ambas especies no fueron inhibido por las proantocianidinas del arándano 62.
Un estudio realizado por Cueva y col. (2010) 93, indican que el crecimiento de C. albicans MY1055 fue inhibido con ácido benzoico (16% a una concentración de 1000 mg/mL) y ácido fenilpropiónico (29%
a una concentración de 1000 mg/mL) de 13 ácidos fenólicos evaluados.
Se ha comprobado que el género Vaccinium presenta el compuesto lipídico ácido benzoico 94; sin embargo, el extracto hidroetanólico de V.
corymbosum L. no afectó el crecimiento de la cepa C. albicans ATCC 10231, probablemente porque los niveles de este metabolito son bajos y no lograron afectar la estructura de la célula, debido a la presencia de manoproteínas en la pared celular de C. albicans. Estas manoproteínas, juegan un papel importante en la permeabilidad de moléculas antifúngicas 95.
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Las células de C. albicans presentan algunas propiedades inherentes, llamados también factores de virulencia, por lo que se debería tener en cuenta la producción de enzimas hidrolíticas, la transición dimórfica (de levaduras a formación de filamentos o hifas), variabilidad antigénica, adhesión a sustratos inertes y biológicos e inmunomodulación de mecanismos de defensa del huésped 96, 97.
La morfogénesis se refiere a la transición entre las levaduras (blastosporas) y la forma de crecimiento filamentosa (hifa o pseudohifa), que puede convertirse en forma reversible 98. En esta investigación se evaluó la morfogénesis de C. albicans ATCC 10231, mediante el porcentaje de la formación de tubo germinativo de las levaduras y el porcentaje de elongación de hifas, expuestas a diferentes concentraciones del extracto hidroetanólico de V. corymbosum L.
A las 2 horas de evaluación, no se observó formación de tubo germinativo de C. albicans ATCC 10231 en las concentraciones de 25%, 50% y 75% del extracto hidroetanólico de V. corymbosum L., ni en Nistatina, pero, en el suero se encontró un 94% de formación de tubo germinativo (Figura 2 y Anexo 16).
El extracto hidroetanólico empleado de V. corymbosum L., ha demostrado tener un efecto inhibitorio en la formación de tubo
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germinativo; sin embargo, se pudo observar que las levaduras se encontraban en gemación. Es probable que C. candida ATCC 10231 haya activado mecanismos de defensa frente al extracto, ya que, este patógeno presenta una plasticidad cuando hay cambios en su entorno, lo que conlleva a una alteración de su fenotipo y/o desarrollo 99. Esta plasticidad morfológica, está regula por la expresión y represión de genes, confiriéndole la virulencia a C. albicans 100.
Existen rutas o vías de transducción de señales que están involucradas en la morfogénesis, por ejemplo, dentro de las rutas MAKPs, existe la ruta HOG (High Osmolarity Glycerol) mediada por MAKP Hog1 que puede ser activada por estrés osmótico y oxidativo 101,
102, la ruta de integridad celular mediada por MAKP Mkc1 que puede ser activada por cambios osmóticos, por estrés oxidativo, en la formación de biopelículas, daños en la pared celular, presencia de antifúngicos, entre otras condiciones 103 y la ruta de crecimiento vegetativo mediada por MAKP Cek1 que puede ser activada por la presencia de compuestos extracelulares que dañan la pared celular, suero, el farnesol (molécula reguladora de transición dimórfica del quorum sensing), entre otros 104 (Anexo 26).
Otra ruta como cAMP-PKA, se activa durante la morfogénesis de C. albicans cuando hay un aumento de cAMP y funciona en paralelo con la señalización mediada por Cek1 y PKA fosforila el factor de
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transcripción Efg1 (regulador morfogenético); este factor se regula por Tpk1, Tpk2, Cdc35, Pde2, Cap1 y Bcy1 95, 105.
C. albicans forma tubo germinativo cuando está expuesta a la combinación de suero humano y a temperatura de 37 °C, activando la ruta del crecimiento vegetativo mediada por MAPK Cek1 y/o la ruta de cAMP-PKA, que también se ve implicada 106, tal como se observó en el control negativo. Estas rutas activan los factores de transcripción Cph1 y Efg1 que regulan la formación de hifas 107, este proceso transcripcional complejo es importante para el crecimiento del tubo germinativo 108 (Anexo 27).
No obstante, en los tratamientos con el extracto, es probable que algunos fitoconstituyentes hayan estimulado la activación de alguna ruta importante de la morfogénesis, inhibiendo la formación de tubos germinativos de C. albicans ATCC 10231. Por ejemplo, el ácido gálico, tanino condesado en el arándano V. corymbosum L. 109, ha mostrado tener acción inhibitoria en la formación de tubo germinativo de C. albicans 110.
Sadowska y col. (2017) 111, demostraron que el extracto de Hippophae rhamnoides L. “espino amarillo”, con mayor contenido de proantocianidinas, inhibió la formación del tubo germinativo de C.
albicans ATCC 10231, después de 1 a 2 horas de incubación. También, es probable mencionar que las proantocianidinas presentes en V.
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corymbosum L. 56, hayan tenido el mismo efecto inhibidor en la cepa ATCC 10231.
El efecto inhibidor de estos fitoconstituyentes, podrían ejercerse a través de la ruta cAMP-PKA, así como el farnesol, que también tiene efecto inhibidor sobre la formación de tubos germinativos de C. albicans.
El farnesol es una molécula de detección de quórum 112 y se ha comprobado que algunas cepas de C. albicans las produce, como ATCC 10261, MEM, A72, CAI-4, SC5314, LGH 1095 y SG 3314 113. Sin embargo, investigadores trabajando con la cepa C. albicans ATCC 10231 demostraron que no produce farnesol; por la tanto, esta molécula no está involucrada en la inhibición del tubo germinativo 113, 114.
Otra característica de la cepa ATCC 10231, es que produce mayor cantidad de tubos germinativos 115. Por tanto, el extracto hidroetanólico de V. corymbosum L., ha demostrado tener efecto inhibidor en la formación de tubo germinativo de C. albicans ATCC 10231. Es importante mencionar que todos los tratamientos se encontraban bajo las mismas condiciones: concentración de levaduras, suero y temperatura.
En la evaluación del porcentaje de elongación de hifa, C. albicans ATCC 10231 tuvo una longitud promedio de hifa de 17.6 ± 1.4 nm en presencia de suero. Por otro lado, Nistatina inhibió la elongación de hifas.
Y en los tres tratamientos del extracto no se observaron elongación de
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hifas, pero si, la presencia de agrupaciones de blastosporas a las 4h (Figura 3 y Anexo 17).
Respecto a estas agrupaciones, se observó que las células permanecían unidas después de la citocinesis formando cadenas ramificadas; a diferencia de las hifas que tienen forma alargada con lados paralelos y las células están divididas por septos, es decir no hay constricción 95. Sin embargo, ambos son estados cualitativamente distintos 116 (Figura 3).
Según Berman J. (2006) 117, menciona que las diferentes morfologías (levadura, pseudohifa e hifa) de C. albicans a menudo se tratan como diferentes estados de desarrollo y estas a la vez difieren entre sí, en la velocidad y el orden de las fases del ciclo celular (Anexo 28).
Para entender los cambios morfológicos de C. albicans ATCC 10231 frente a los diferentes tratamientos, se debe tener en cuenta, que esta levadura tiene la capacidad de convertir diferentes estímulos extracelulares en una señal intracelular, generando una respuesta específica en la modificación de la expresión de genes 95, 118, 119.
Otros grupos de fitoconstituyentes en el extracto también podrían haber estimulado los cambios morfológicos de C. albicans ATCC 10231.
Shashina y col. (2018) 120, mencionan que los terpenoides, fenoles y aldehídos del aceite esencial de Cinnamomum zeylanicum “canela”,
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alteran la estructura de la pared celular, la fluidez de la membrana y el ciclo celular de C. albicans RSY150 y otros aislados de Candida, induciendo a cambios morfológicos debido al estrés provocado por los fitoconstituyentes.
Se ha demostrado que los flavonoides pueden alterar la membrana plasmática y a menudo inhibir el crecimiento de los hongos, la formación de la pared celular, división celular, síntesis de ARN y proteína 121. Por ejemplo, la apigenina induce cambios morfológicos en C. albicans, alterando el potencial de membrana celular 122. Otro flavonoide como la isoquercitrina, induce daño en la membrana plasmática, aumentando así la permeabilidad en C. albicans 123.
Por otro lado, se ha demostrado que los frutos de V. corymbosum presentan altas concentraciones de isoquercitrina 124, así como el ácido gálico 109 y las proantocianidinas 56, que pueden alterar la morfología de la pared celular y el número de yemas de C. albicans 125. Es probable que la inducción específica de uno o varios fitoconstituyentes flavónicos presentes en el extracto hidroetanólico de V. corymbosum L. hayan alterado la estructura de C. albicans ATCC 10231, inhibiendo la formación de tubo germinativo y la elongación de hifa.
Sadowska y col. (2017) 111,demostraron que el efecto de las proantocianidinas (mayor concentración), taninos y flavonoides del
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extracto de H. rhamnoides L. sobre C. albicans ATCC 10231, forman pseudohifas alargadas durante el transcurso de 24 horas. Este efecto se parece a los resultados obtenidos en los tres tratamientos con extracto hidroetanólico de V. corymbosum L. Por otro lado, Berman J. (2006) 117 menciona que es común que la levadura C. albicans forme pseudohifas cuando experimenta estrés en su estructura.
Estos fitoconstituyentes pudieron activar una o varias rutas importantes implicadas en la morfogénesis de C. albicans ATCC 10231.
Fuchs y Mylonakis (2009) 126, mencionan que cuando la estructura de Candida se encuentra alterada por agentes perturbadores, la ruta de integridad celular (MAKP Mkc1) se activa para compensar el daño, mediando la biosíntesis de la pared celular y regulando la progresión del ciclo celular. Otra ruta que podría ser activada por la presencia de compuestos extracelulares que dañan la pared celular es el de crecimiento vegetativo mediada por MAKP Cek1 104.
Cuando existe una comunicación cruzada entre las rutas MAKPs y los puntos de control del ciclo celular, producto del estrés de C.
albicans, resulta una mezcla de blastosporas y células pseudohifales y un ciclo celular retrasado 120, 127. Se ha mencionado que el factor de transcripción Efg1 está relacionado con la ruta cAMP-PKA y que regulan la formación de hifas 107;sin embargo, la sobreexpresión de este factor no forma hifas de C. albicans 110.
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Existen otras rutas supresoras de la filamentación relacionadas con el factor Tup1p o Rbf1p, pero aún no se conoce bien los sistemas de transducción de señales 128, 129. Pero, se sabe que el correpresor Tup1p forma un complejo asociado con el represor de transcripción Nrg1p y si las células carecen uno de los dos factores, crecen como pseudohifas 130,
131. Existen otros factores de transcripción como Fkh2p, Tcc1p, Ssn6p, Ace2p y Rap1p que reprimen la expresión de los genes específicos de hifa y se relacionan también, con el estado de crecimiento de levadura a pseudohifa 107, 132, 133.
Por otro lado, no se descarta que el extracto hidroetanólico de V.
corymbosum L., también, haya alterado el ciclo celular de C. albicans ATCC 10231, teniendo en cuenta que un ciclo celular retrasado o detenido da como resultado un crecimiento polarizado de pseudohifas 107,
134. De ser así, Crampin y col. (2005) 135 mencionan que las blastosporas y las pseudohifas de C. albicans, tienen un polarisoma que dirige el crecimiento polarizado de manera dependiente del ciclo celular y desaparece en la mitosis o antes; y en las hifas, tienen un Spitzenkörper o “cuerpo de la punta” (estructura dinámica que solo se asocia con puntas de hifas en crecimiento activo) y un polarisoma en forma de casquete.
En las blastosporas y las células pseudohifales se forma un anillo de septina, iniciando la emergencia de yemas dirigidas por una proteína
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polarisoma Mlc1p y duplicando el cuerpo del polo del huso y a medida que los sitios de crecimiento se distribuyen alrededor de la yema en una levadura, el crecimiento se vuelve menos polarizado; pero en células pseudohifales, el polarisoma persiste por más tiempo y las células pasan más tiempo en la fase G2, volviéndose similar en tamaño a las células madre y las células no se separan después de la citocinesis, es decir, la Mlc1p desaparece de la punta de la yema y se localiza en el cuello 117 (Anexo 29).
Las sales de tetrazolio permiten medir la actividad metabólica de las células y es utilizado como indicador de densidad, viabilidad y proliferación celular 136. Para la evaluación de biopelículas, se utilizó la sal 2, 3, 5 – Trifenil Tetrazolio Cloruro (TTC). Esta sal es reducida por los sistemas de deshidrogenasa presentes en la cadena transportadora de electrones de C. albicans, formando un precipitado de color rosado-rojo llamado formazán137.
La actividad metabólica de las biopelículas de C. albicans ATCC 10231 frente a las concentraciones de 25%, 50% y 75% del extracto hidroetanólico de V. corymbosum L., mostraron una DO490 promediode 0.078 ± 0.021, 0.080 ± 0.016 y 0.074 ± 0.015 respectivamente y en relación a los controles, Nistatina una DO490 promedio de 0.034 ± 0.013 y en medio MEM, 0.057 ± 0.010 (Figura 4).
