Producción de biomasa y escalamiento de microorganismos ruminales con potencial probiótico

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(1)Capítulo 3 Producción de biomasa y escalamiento de microorganismos ruminales con potencial probiótico Diana Marcela Alfonso Porras. I.Q. Angélica Bermúdez Villanueva. I.Q Fernando Rodríguez. PhD. Fredy Orlando Carvajal. I.Q., M.Sc.. RESUMEN Debido a la incidencia de diarreas en bovinos en la sabana de Bogotá, la empresa privada, Alquería y el Centro de Investigación de CORPOICA han encontrado la oportunidad de generar un producto para solucionar o prevenir este problema. Con base en esto, se estructuró un proyecto de investigación con el apoyo financiero de Colciencias, el cual contempla el desarrollo de este bioproducto y de su proceso de producción, con un escalamiento a nivel piloto (100 L). El presente capítulo presenta un estado del arte y una aproximación a las bases conceptuales y fundamentos teóricos que, a nuestro criterio, son relevantes en el proceso de producción y escalamiento de un microorganismo ruminal con potencial probiótico. Para este caso específico se tomó como modelo la bacteria Ruminococcus flavefaciens, un microorganismo anaerobio obligado de elevada actividad celulolítica dentro del rumen. Durante el capítulo se muestran algunos resultados experimentales de la producción a escala de 3 y 14 litros en biorreactores Bioflo New Brunswick, de manera que ejemplifiquen y fundamenten los conceptos que se van desarrollando. El proceso de escalamiento de la cepa bacteriana en mención mostró niveles óptimos de producción a 39° C, temperatura a la cual se obtuvo una concentración de biomasa de 61.

(2) 1.445 g/L. El valor de pH con el cual se obtuvo la mejor concentración de biomasa, 1.485 g/L, fue de 6,5. Estos niveles de producción de la biomasa microbiana fueron alcanzados en una atmósfera de CO2 libre de O2, a una velocidad de agitación de 200 rpm y en un tiempo de fermentación de aproximadamente 4,5 horas. Un acercamiento hacia el escalamiento del proceso en biorreactores de 3 L se realizó por medio del criterio de la relación de potencia entregada al medio por unidad de volumen constante (P/V), la cual consiste en definir las condiciones más adecuadas de proceso (temperatura, pH, agitación), calcular la potencia entregada al medio por unidad de volumen a estas condiciones y mantener constante este parámetro para su respectiva operación a la siguiente escala. Al final del capítulo se ofrece un glosario técnico que le permitirá al lector contar con elementos teóricos para interpretar los fundamentos y resultados experimentales aquí expuestos. Palabras Claves: Escalamiento, bioprocesos, fermentación anaerobia, microorganismos ruminales, Ruminococcus flavefaciens, biorreactor. I. INTRODUCCIÓN Durante las últimas dos décadas la producción lechera en Colombia se ha caracterizado por una persistente tendencia de crecimiento, hasta el punto que el país ha pasado de una situación crónica de déficit permanente de oferta a una de autosuficiencia, e incluso, a generar excedentes. La producción de leche genera más de 470.000 empleos directos en forma permanente durante los 365 días del año y demanda mano de obra familiar, permitiendo la ocupación de personal con diversidad de género y nivel de capacitación. La ganadería de leche aporta el 3,18% del empleo total nacional, equivalente al 13,92% de los empleos generados por el sector agropecuario. La eficiencia de los sistemas de producción especializada de leche en Colombia se fundamenta en el buen estado de salud del ganado, especialmente de los animales jóvenes, los cuales son susceptibles de sufrir enfermedades que ocasionan, en algunos casos, una alta tasa de mortalidad en sus primeros meses, lo cual disminuye la productividad de la ganadería lechera (Martínez, 2005). Alquería, como una de las empresas más importantes en producción de leche en el país y dentro de uno de los proyectos de investigación que está llevando a cabo junto con COR62. POICA, con financiación de Colciencias, se encuentra desarrollando un probiótico para terneros. Uno de los objetivos del proyecto es el desarrollo del proceso de producción de este producto a escala piloto a partir de cinco microorganismos de origen ruminal. En la actualidad se han incrementado las investigaciones a nivel mundial para obtener nuevos conocimientos en productos y/o tecnologías que beneficien a la industria de producción lechera. En los países desarrollados, la biotecnología y la industria de las fermentaciones han hecho posible el desarrollo a gran escala de productos microbianos, basados principalmente en cultivos de levaduras, pero se ha encontrado que existe gran potencial de productos basados en microorganismos de origen ruminal. Existen en Colombia numerosos casos de escalamiento a nivel industrial de productos microbianos como bioplaguicidas, productos alimenticios para consumo humano y producción de levaduras, entre otros; sin embargo, no se reportan escalamientos de procesos para producir suplementos microbianos destinados al bienestar animal. Por consiguiente, este trabajo contribuye a la generación de conocimiento por medio de la investigación científica al ser parte del desarrollo de un producto innovador, el cual tendrá un gran impacto económico para las entidades promotoras de la investigación y para la cadena productora de leche en el país. En el presente capítulo se toman algunos resultados experimentales obtenidos durante el desarrollo del proceso de producción de un microorganismo anaerobio de origen ruminal, como una estrategia para ejemplificar los fundamentos teóricos que son relevantes dentro del proceso de producción de un microorganismo anaerobio ruminal con potencial probiótico. También se definen y proponen criterios para extrapolar los resultados experimentales de procesos de producción a 3 L dentro de modelos teóricos de simulación, a escalas superiores (14 L). Este estudio se realizó en el marco del proyecto de investigación titulado “Desarrollo y escalamiento piloto de un inductor microbiano para incrementar el peso corporal y disminuir la incidencia de diarreas en terneros Holstein en sistemas de lechería especializada del trópico alto colombiano”, y constituye la fase inicial del desarrollo del proceso de producción de varios microorganismos y el punto de partida para realizar un escalamiento a nivel piloto (100 L), etapa previa al escalamiento a nivel industrial. II. MICROORGANISMOS INDUSTRIALES En la naturaleza existen fundamentalmente dos clases de células: las procariotas y las eucariotas, ambas utilizadas en los procesos de fermentación industrial; las procariotas como 63.

(3) bacterias y algas verde-azules, y las eucariotas como hongos (mohos y levaduras), algas y protozoos.. en metionina y por eso en algunas dietas animales se agrega este aminoácido, lo que aumenta su calidad y, por tanto, su eficiencia de conversión.. Las células eucariotas tienen un núcleo diferenciado rodeado por una membrana. Su ADN nuclear está asociado a proteínas y se encuentra en estructuras definidas denominadas cromosomas; además, tienen otras estructuras u organelos con funciones bioquímicas o fisiológicas específicas. Por el contrario, las procariotas carecen de un núcleo bien definido, de tal modo que el material genético en forma de ADN doble hélice no está separado de los otros constituyentes de la célula por una membrana. Estas células también carecen de otros orgánulos especializados existentes en las eucariotas, como las mitocondrias.. • Velocidad de crecimiento para un sustrato determinado: el tiempo de duplicación de la biomasa es un factor determinante en la productividad del sistema. La velocidad de crecimiento depende de la facilidad con que el microorganismo pueda hidrolizar un sustrato determinado.. Los microorganismos se distinguen en función de sus necesidades de oxígeno, catalogándose como aerobios estrictos aquellos que pueden llevar a cabo su metabolismo y crecimiento únicamente en presencia de oxígeno atmosférico; anaerobios estrictos, los que únicamente pueden crecer en ausencia de oxígeno; y los facultativos, que pueden crecer en situaciones de aerobiosis y de anaerobiosis (Owen, 1991).. • Eficiencia de conversión del sustrato: se requiere optimizar las condiciones del cultivo para lograr la mayor eficiencia posible, pues ello implica –además del ahorro por disminución de la cantidad de sustrato– que se tendrá que suministrar menos oxígeno al fermentador y que la carga térmica que deba eliminarse sea menor (Quíntero, 1981).. El concepto de biomasa microbiana, independiente de su condición anaerobia o aerobia, corresponde a la cantidad de materia viva producida en un área determinada de la superficie terrestre o por organismos de un tipo específico. Las posibilidades de su uso industrial son tan amplias como la misma naturaleza, aunque se destaca el uso de la energía proporcionada por la biomasa que procede de la madera, residuos agrícolas y estiércol. En términos energéticos, se utiliza como energía renovable, como es el caso de la leña, el biodiesel, el bioalcohol, el biogas y el bloque sólido combustible. En lo referente a biorremediación, se resalta el uso de biomasa como absorbente de metales pesados para la destoxificación y recuperación de metales tóxicos o valiosos presentes en aguas residuales industriales. Así mismo, se utiliza en el desarrollo de probióticos orientados a contribuir con el equilibrio de la flora bacteriana intestinal del hospedero y potenciar su sistema inmunológico (Vlkovà et al., 2006).. II. MICROORGANISMOS RUMINALES. • Toxicidad: se debe probar que el microorganismo no sea patógeno o tóxico y que no exista riesgo de que esta condición se presente en un largo periodo de tiempo.. Los rumiantes tienen características de morfología y fisiología digestivas que los diferencian de los demás animales. Los principales contrastes ocurren en la porción anterior del tracto digestivo, en los órganos responsables del proceso de degradación de los alimentos. En los rumiantes la boca tiene funciones como la prensión, masticación, insalivación, deglución y la rumia. El rumen, retículo y omaso son órganos que anteceden el abomaso, y es en la función de estas tres estructuras que está sustentada la capacidad de los rumiantes para aprovechar los carbohidratos fibrosos de la dieta. La superficie exterior del rumen y retículo está rodeada por pliegues (pilares) que se proyectan al interior, separan al órgano en sacos y contribuyen con los movimientos de contracción de los sacos y el mezclado de la ingesta (Mora, 1972).. • Contenido proteico de las células: gran parte de la producción de proteína unicelular está orientada a la sustitución de las fuentes de proteínas para animales monogástricos. También puede producirse para el consumo del hombre.. A diferencia del resto del tracto digestivo, las superficies internas del rumen, retículo y el omaso son epiteliales y no mucosas, es decir, que no se producen secreciones en dichos órganos. El líquido ruminal es muy dinámico, ya que existe un intercambio constante a través de la pared del órgano. Igualmente, hay enriquecimiento por saliva y agua de bebida, y la salida de líquido a través del omaso. En cuanto a los sólidos, la rapidez de su paso a través del rumen está afectada por el tamaño y el peso específico de las partículas, la digestibilidad y la cantidad de alimento consumido.. • Perfil de aminoácidos (aminograma): representa la cantidad relativa de aminoácidos, es decir, la calidad de la proteína. En general, la proteína unicelular es deficiente. El rumen es una cámara de fermentación predominantemente anaeróbica, dominada por tres grandes poblaciones de bacterias, protozoarios y hongos. Se encuentra a tempe-. Los criterios para la selección primaria de microorganismos para la producción de biomasa destinada a uso animal son:. 64. 65.

(4) ratura promedio de 39 a 40° C y presenta un pH variable, producto de la misma fermentación microbiana y del metabolismo corporal, lo que provee un ambiente apropiado para el crecimiento y reproducción de microorganismos. Es una fuente continua de sustratos (alimento, saliva, metabolitos microbianos, entre otros) con una continua remoción de productos por medio de absorción, crecimiento microbiano y paso a otros compartimentos (Mora, 1972).. En un estudio realizado por Hungate, donde se aislaron dos cepas celulolíticas de morfología de coco, R. flavefaciens y R. albus, estas fueron distinguidas originalmente por la pigmentación. Las aisladas (blancas) incoloras fueron R. albus, y las aisladas amarillo-naranja R. flavefaciens. Algunas cepas de Ruminococcus presentan un color distinto, como amarillo-limón.. La presencia de microorganismos en el rumen, favorecida por la ausencia de oxígeno, es lo que proporciona al animal sus características diferenciales respecto a otros mamíferos domésticos; estas son: la posibilidad de digestión de carbohidratos complejos (celulosa, hemicelulosa, lignina y pectina) para producir azúcares sencillos como la glucosa, el aprovechamiento de nitrógeno no proteico para su conversión en aminoácidos y en proteínas, la síntesis de la gran mayoría de las vitaminas hidrosolubles, y la producción y posterior utilización de ácidos grasos de cadena corta (AGVs) como fuentes de energía metabólica (Mora, 1972).. El pH y la temperatura podrían considerarse como los factores más influyentes en el crecimiento, producción de biomasa y capacidad fermentativa de un microorganismo (Gómez, 2004; Ramkrishna et al., 2005).. Físicamente los microorganismos ruminales pueden estar ubicados en uno o en varios de tres nichos: la interfase líquida, la fase sólida y la pared ruminal. La interfase líquida está constantemente agitada y homogenizada por las contracciones ruminales, y está expuesta a la mayor tasa de dilución y pasaje hacia el abomaso. Los microorganismos asociados a este espacio usualmente tienen tiempos cortos de división, así como metabolismo y regeneración celular acelerados. Por su parte, la fase sólida, principalmente compuesta por partículas alimenticias como fibra y granos, alberga una población microbiana usualmente organizada en complejas biopelículas, y por su misma naturaleza física presenta mayores tiempos de retención dentro del saco ruminal. Finalmente está el nicho asociado a las vellosidades y papilas de la pared ruminal, en el que las poblaciones microbianas están frecuentemente adheridas y mantienen complejas interacciones entre microorganismos y con las células del epitelio que reviste el interior del rumen (Czerkaeski, 1980).. Condiciones y características de crecimiento. Las oscilaciones desfavorables en el pH del medio podrían afectar directamente la estructura conformacional y función de las enzimas de los microorganismos, además de alterar los gradientes de fuerza protón-motiva y síntesis de ATP a nivel de la membrana celular. Los cambios en el pH también podrían tener efectos desfavorables en el balance y tipo de productos finales de la fermentación, al igual que en las características organolépticas del medio de cultivo (Ramírez, 2001). R. flavefaciens ha sido clasificada como una bacteria mesófila, o sea, que su rango de temperatura de crecimiento se encuentra entre 15-41° C. Varios autores reportan que para R. flavefaciens la temperatura óptima está entre 39° C y 45° C, mientras que el pH óptimo se encuentra entre 6,4 y 6,6 (Pettipher y Latham, 1979). Otro factor relevante en el crecimiento de R. flavefaciens es la utilización de AGVs como combustible para función y actividad celular (Slyter y Weaver, 1969). Estudios realizados para bacterias celulolíticas (Bryant y Robinson, 1960; Allison et al., 1958) del género Ruminococcus, indican que estas requieren cierta cantidad de ácidos grasos volátiles para su crecimiento. Actividad fermentativa de R. flavefaciens G8. Ruminococcus flavefaciens cepa G8 Su nombre fue otorgado por Sijpesteljn (1951). El género Ruminococcus comprende un grupo de bacterias ruminales anaerobias, celulolíticas. Se trata de un coco Gram-positivo, es decir, tiene una membrana celular interna rodeada por una pared celular gruesa de peptidoglicano, cuya función es dar rigidez al cuerpo celular y permitir el paso de nutrientes, enzimas y sustancias de desecho (Bryant et al., 1953). Su movilidad es nula. No se ha reportado efecto patógeno para este microorganismo y ha sido catalogado por la Agencia de Protección Ambiental Americana (EPA) como de categoría toxicológica IV, a saber, prácticamente no tóxico. El diámetro de la célula es de 0,8-0,9 μm (Stewart, 1997). 66. R. flavefaciens obtiene la energía a través de la hidrólisis de nutrientes como la celulosa, la cual esta presente de manera abundante dentro del sistema digestivo del ruminate. De la misma forma, puede fermentar otros carbohidratos, como celobiosa, glucosa y xilosa. No fermenta maltosa ni lactosa. Estas características pueden variar según la dieta del animal hospedador (Bryant et al., 1958). La mayoría de Ruminococcus sp no pueden crecer sobre pentosa, aunque muchos pueden utilizar las hemicelulosas como fuente de energía, sugiriendo una capacidad de crecer en productos oligoméricos de la hidrólisis enzimática (Dehority y Scott, 1967). En la producción de R. flavefaciens la mayor fuente de energía es la glucosa, que es absorbida en el citosol y se incorpora a la glucólisis, principal ruta metabólica para la conver67.

(5) sión de glucosa en piruvato y dióxido de carbono (Campbell, 2004), y AGVs como ácido fórmico, acético, succínico y láctico (Stewart et al., 1997). La bacteria utiliza los AGVs para sintetizar aminoácidos y otras biomoléculas que ingresarán a diversas rutas metabólicas y catabólicas de la célula. La eficiencia metabólica de la célula bacteriana se expresa finalmente en ATP acumulado, al igual que en el poder reductor expresado como moles de NADH reducido. El ATP será principalmente invertido en reacciones de fosforilación y activación de kinasas y fosfatasas, pero también como fuente de energía para activar y poner en funcionamiento las bombas symporters y antiporters, o finalmente para realizar transporte activo de nutrientes hacia el interior de la célula (Dehority, 1993). III. CRECIMIENTO CELULAR El crecimiento de los microorganismos es una parte integral en todos los sistemas de fermentación, debido a que estos son los encargados de metabolizar los nutrientes proporcionados en el sustrato para generar los productos de interés, como metabolitos o biomasa. Las bacterias se reproducen por fusión binaria produciendo dos células hijas del mismo tamaño, y en general cumplen modelos de crecimiento exponencial que se ajustan a una curva sigmoidea. A diferencia de las bacterias, los hongos crecen por extensión de sus hifas (Owen, 1991), exceptuando a la mayoría de las levaduras, para las cuales su crecimiento y generación de biomasa se relacionan a mecanismos de gemación. Una vez que se inoculan en un medio de cultivo, las células bacterianas se activan a nivel molecular y en su proceso de crecimiento presentan generalmente cuatro fases (Figura 14): • Fase de latencia: en esta fase las células ajustan su metabolismo celular a las nuevas condiciones del medio en que se encuentran. Los genes involucrados en la síntesis activa de proteínas y en la misma organización de los ribosomas se preparan para ser activados. La célula alista sus sistemas de transporte de nutrientes y activa sus sistemas de intercambio iónico.. A: Fase de latencia. B: Fase de crecimiento acelerado. C: Fase de crecimiento exponencial. D: Fase de crecimiento desacelerado. E: Fase estacionaria. F: Fase de muerte.. Fuente: LEE, J. (2002). Biochemical Engineering. Washington: Prentice- Hall, p. 6-5.. Figura 14. Curva de crecimiento de un microorganismo en cultivo batch.. celular se liberan nuevos sustratos, que pueden servir como fuente de energía para el crecimiento lento de los supervivientes. • Fase de muerte: aquí las reservas de energía de las células se agotan. Cuando el número de supervivientes se representa en forma semi-logarítmica frente al tiempo, se obtiene una línea recta, lo que indica que las células mueren a una velocidad exponencial. En los procesos comerciales de producción de biomasa la fermentación frecuentemente se interrumpe al final de la fase logarítmica o antes que comience la fase de muerte, puesto que económicamente ya no es viable mantener el fermentador en funcionamiento y el producto requerido –bien sea biomasa o algún metabolito– ya ha sido generado (Crueger, 1993). Cinética de crecimiento de los microorganismos. • Fase logarítmica: cuando los microorganismos ya se han adaptado al medio, ingresan a esta fase. El crecimiento de la masa celular puede ahora ser descrito cuantitativamente en función de la duplicación del número de las células por unidad de tiempo o por la duplicación de la biomasa por unidad de tiempo. Este modelo de crecimiento de las bacterias obedece a un modelo exponencial, donde para obtener una recta debe graficarse primero el logaritmo natural de la unidad de crecimiento contra el tiempo.. A medida que el microorganismo crece y consume el sustrato algunos nutrientes se agotan, a la par que nuevos metabolitos se acumulan. Los cambios en concentración que se dan en conjunto para el sustrato, el producto y la biomasa celular generada durante el crecimiento microbiano, se denominan “cinética de fermentación”. Existen técnicas analíticas que permiten estudiar y cuantificar los parámetros de esta cinética [concentración celular (X), sustrato (S) y producto formado (P)] en función del tiempo (t).. • Fase estacionaria: en esta fase, una vez el sustrato se agota o se han formado sustancias tóxicas el crecimiento desciende o se detiene completamente. Debido a la lisis. La velocidad de crecimiento varía con el tipo de célula microbiana y también en función de las condiciones medioambientales físicas y químicas. En general, el tiempo para que se du-. 68. 69.

(6) plique la biomasa aumenta con la complejidad del organismo, de forma que los tiempos de duplicación medios para las células animales y vegetales son sustancialmente mayores que los de los mohos y las levaduras, que a su vez son mayores que los de bacterias (Owen, 1991). La velocidad específica de crecimiento máxima (µmáx) se puede determinar en la fase logarítmica, ya que el crecimiento de la masa celular puede ahora ser descrito cuantitativamente en función de la duplicación del número de células por unidad de tiempo o por la duplicación de la biomasa por unidad de tiempo. A pesar de la continua degradación de sustrato y de la acumulación de productos que se da durante la fase logarítmica, su tasa de crecimiento permanece constante. Mientras exista exceso de sustrato, la µmáx no se verá alterada. A medida que la velocidad específica de crecimiento (µ) se incrementa, lo hace también la acumulación de biomasa de acuerdo al modelo exponencial. En la industria las µmáx son consideradas como un criterio de elevada importancia, no solamente por la relación costo-beneficio del proceso sino por los rendimientos alcanzados en un producto de interés en particular (Doran, 1999). Cinética de crecimiento de microorganismos ruminales Las bacterias ruminales presentan diferentes velocidades máximas específicas de crecimiento (µmáx) dependiendo del tipo de sustrato que degraden. Hay especies como S. bovis con µmáx que no supera los 0,15 h-1 cuando crecen sobre carbohidratos solubles y con tiempos equiparables de duplicación a los de un microorganismo como E. coli. En contraste, algunas bacterias predominantemente celulolíticas podrían alcanzar velocidades incluso superiores a 1 h-1. En la medida que el fermentador ruminal recibe más carbohidratos solubles a través de la dieta que el animal consume, los microorganismos incrementan de manera significativa sus velocidades específicas de crecimiento (Bauchop y Elsden, 1960). Microorganismos ruminales como S. ruminantium y S. bovis pueden alcanzar rendimientos de producción de biomasa in vitro muy similares a los de E. coli cuando crecen anaeróbicamente (26 g mol-1 glucosa); no obstante, en la medida en que interactúan con otros microorganismos en el ambiente ruminal, estos rendimientos podrían ampliar su rango desde 29 hasta 100 g mol-1 glucosa. Aún a pesar de que la disponibilidad de nutrientes llegue a su agotamiento, una bacteria ruminal podría continuar creciendo, aunque a una velocidad desacelerada, y esto gracias a las reservas de polisacáridos que mantiene y que le permiten adaptarse y competir en el ambiente ruminal (Russell, 1992).. El primero en establecer una relación entre la concentración de sustrato limitante y la velocidad de crecimiento, así como el efecto de la composición de un medio de cultivo libre de sustancias inhibitorias sobre la velocidad específica de crecimiento, fue Monod. La velocidad específica de crecimiento de las células durante las fases de crecimiento y desaceleración de un cultivo discontinuo, depende de la concentración de nutrientes existentes en el medio. A menudo, un único sustrato ejerce el efecto dominante sobre la velocidad de crecimiento, o simplemente actúa como sustrato limitante del crecimiento. Las ecuaciones básicas que describen la interacción entre el crecimiento de los microorganismos y el sustrato limitativo del mismo de acuerdo a Monod son:. Donde s = concentración del sustrato limitante (g/L). µ x = velocidad específica de crecimiento (1/h). µ M = velocidad específica máxima de crecimiento (1/h). K s = constante de saturación de sustrato (g/L). Se han presentado diferentes modelos con modificaciones del modelo de Monod, como: Moser, Cotois-Fujimoto, Teissier, Konak y Kargi-Shuler (Duarte, 1998). Por otro lado, el modelo exponencial relaciona la concentración de biomasa en función del tiempo y únicamente es válido si la velocidad específica de crecimiento µmáx no varía. Para determinar su valor, se representa el Ln de la concentración de biomasa frente al tiempo en la fase exponencial, en donde se obtiene una línea recta cuya pendiente es la velocidad específica de crecimiento máxima µmáx.. X = X 0 * e µ máxt. Donde: µ máx = velocidad específica máxima de crecimiento, h-1 X = concentración celular en cada momento, g/L X 0 = concentración celular en el tiempo 0, g/L (Doran, 1999).. Modelos cinéticos para el crecimiento de biomasa Los modelos cinéticos se plantean con el objeto de describir el crecimiento de los microorganismos involucrados en un proceso fermentativo. Existen numerosos modelos cinéticos, entre los cuales se destacan el exponencial, de Monod, de Moser, de Cotois y Fujimoto, y Kargi-Shuler, entre otros. 70. Modelos para estudiar el crecimiento microbial de bacterias ruminales En concordancia con los modelos de crecimiento formulados para bacterias anaeróbicas como E. coli, la tasa de crecimiento específico de las bacterias celulolíticas ruminales como R. flavefaciens es un reflejo de su propia actividad metabólica, y por ende estará directa71.

(7) mente influenciada por el pH y la temperatura del ambiente. Rosso et al. (1995) explicaron cómo el modelo de Ratkowsky (1982) combina valores de pH y de temperatura por debajo del óptimo para describir el crecimiento microbiano. Con el ánimo de acercarse a un mejor entendimiento del crecimiento microbial, se han propuesto otros modelos combinados, como el de Wijtzes y el de Zwietering (1991), los cuales han ampliado los rangos de temperatura y pH a valores considerados subóptimos. IV. INFLUENCIA DE LAS CONDICIONES AMBIENTALES SOBRE EL CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS Temperatura El crecimiento celular varía en función de la temperatura. La mayoría de los microorganismos crecen entre 25 y 30° C, aunque en un sentido estricto la temperatura real a la que crece un microorganismo particular depende de su naturaleza: psicrofílica (0-25° C), mesofílica (15-41° C), termofílica moderada (38-70° C) y termofílica extrema (65-105° C). La velocidad de crecimiento aumenta con la temperatura hasta un máximo, por encima del cual la velocidad cae rápidamente debido al incremento de la tasa de muerte microbiana por desnaturalización de proteínas (pared celular, membrana, nucleosoma), es decir, hay una lisis de todas las membranas y se produce la muerte (Owen, 1991). La temperatura afecta la velocidad de las reacciones celulares, la naturaleza del metabolismo, los requerimientos nutricionales y energéticos, y la composición de la biomasa (Owen, 1991).. metros importantes que permiten conocer mejor un sistema de crecimiento microbiano y su escala. El factor de rendimiento proporciona una primera aproximación a la factibilidad económica del proceso, puesto que la producción de biomasa depende principalmente del costo de la materia prima y un microorganismo con un elevado rendimiento de biomasa a partir de sustrato favorece la productividad de dicho proceso. Adicionalmente, la velocidad específica de crecimiento se constituye en una medida de la eficiencia del sistema enzimático responsable de la transformación del sustrato durante la fase exponencial de crecimiento del microorganismo (Duarte, 1998). Por esta razón es que el impacto de cualquier variable de operación debe calcularse con base en el efecto que ésta tenga sobre el rendimiento del proceso y sobre la velocidad de crecimiento del microorganismo que se encuentra realizando el proceso fermentativo. Los resultados que a continuación se presentan tienen el objeto de ilustrar la respuesta de cinética de crecimiento y rendimiento de una bacteria ruminal R. flavefaciens G8, evaluados para diferentes condiciones de temperatura y de pH: Las fermentaciones para establecer la cinética de crecimiento y determinar el tiempo total de cultivo se realizaron en un biorreactor New Brunswick BIOFLO 110 de 3 L, con un volumen de trabajo de 2,2 L (Figura 15). Este biorreactor está diseñado para cultivos de microorganismos y células.. Temperatura del saco ruminal No existen hasta ahora reportes de la existencia de microorganismos psicrófilos o termofilícos en el ambiente ruminal. La tendencia principal para un habitante microbiano ruminal es el ser mesófilo. Las temperaturas óptimas en el interior del compartimento ruminal alcanzan los 39° C, y únicamente en condiciones metabólicas alteradas como la acidosis ruminal sus valores caen, afectando no solo el crecimiento microbiano sino la misma motilidad de los músculos responsables de la contracción del saco ruminal (Owens et al., 1998). Si este fermentador natural no se agita, se rompe entonces el normal movimiento que permite la distribución y agregación de partículas alimenticias y de sus comunidades microbianas asociadas. Condiciones óptimas de temperatura para el crecimiento y producción de biomasa de R. flavefaciens El rendimiento de biomasa o de producto –que es calculado en función de la cantidad de sustrato consumido–, así como la máxima velocidad específica de crecimiento, son pará72. Figura 15. Biorreactor New Brunswick BIOFLO 110 de 3 L.. 73.

(8) En la Tabla 4 y Figura 16 se muestra la concentración máxima de biomasa, los rendimientos de biomasa en sustrato observados (Y’x/s), la velocidad máxima específica de crecimiento (µmáx) y el tiempo de duplicación obtenidos cuando R. flavefaciens G8 crece a diferentes condiciones de temperatura.. En un estudio realizado por Shi y Weimer (1996) se encontró que la cepa R. flavefaciens FD-1 presentaba una velocidad máxima de crecimiento de 0,44 a 0,48 h-1. Esta cepa mostró un mejor crecimiento en celopentosas o en celotriosas, que en celobiosa o glucosa. El trabajo en mención se realizó en tubos anaerobios, atmósfera de CO2 con 5 mL de medio de cultivo, a 39° C de temperatura y agitación constante de 150 rpm en un agitador orbital.. Tabla 4. Parámetros cinéticos para R. flavefaciens cepa G8 a diferentes temperaturas. Tratamiento. X máx (g/L). Y’x/s (g biomasa/g sustrato). µmáx(h-1). td (h). 37° C. 1,125. 0,211. 0,626. 1,108. 39° C. 1,445. 0,329. 1,425. 0,487. 41° C. 1,509. 0,498. 0,989. 0,701. µmáx. Rendimiento. Figura 16. Promedio de las medias, con sus respectivas desviaciones estándar, para los parámetros cinéticos determinados para R. flavefaciens cepa G8 creciendo a diferentes temperaturas.. En la Tabla 4 se observa que el mayor rendimiento de sustrato en biomasa se obtiene para el tratamiento en el que también se presenta la mayor producción de biomasa, es decir, en la fermentación realizada a 41° C, pH 7,2 y agitación constante de 200 rpm. La mayor velocidad específica de crecimiento (µmáx) se obtiene cuando la fermentación se realiza a 39° C, seguida por los tratamientos de 41° C y 37° C. La velocidad específica de crecimiento (µmáx) se ve favorecida por la temperatura promedio del hospedador de los microorganismos (rumen), que es 39° C (Ayers, 1958), por lo que se observa un aumento de 44% con respecto al obtenido con el tratamiento de 41° C. Según Thurston et al. (1994), el rendimiento para R. albus fue de 0,154 g proteína/g celobiosa y de 0,141 g proteína/g glucosa, mientras que la velocidad máxima de crecimiento varió entre 0,4-0,8 h-1 para ambos sustratos. Las condiciones de este estudio fueron las siguientes: pH 6,7 a 39° C en un fermentador New Brunswick Multigen (345 mL). 74. El mayor rendimiento observado de biomasa a partir de sustrato y la velocidad máxima de crecimiento para R. flavefaciens G8 en este trabajo, son superiores a las reportadas en los estudios referenciados anteriormente. Probablemente R. flavefaciens G8 presenta una afinidad superior al sustrato glucosa, que la afinidad de R. albus para consumir la celobiosa o glucosa suministrada. Por otro lado, el valor de µmáx dependerá del microorganismo, de las condiciones de fermentación, y se considera mayor para sustratos sencillos que para moléculas de cadenas largas (Crueger, 1993). Las velocidades de crecimiento celular se expresan generalmente en términos de tiempo de duplicación (td). Los resultados aquí presentados indican que el mayor tiempo de duplicación (td) para R. flavefaciens G8 es 1,1 horas cuando la temperatura de la fermentación es 37° C, mientras que para los tratamientos de 39° C y 41° C el tiempo de duplicación es significativamente menor, especialmente para el tratamiento de 39° C. Este comportamiento se explica, posiblemente, debido a que la temperatura óptima de crecimiento de R. flavefaciens se encuentra en el rango de 39° C y 44° C (Ayers, 1958). Shi y Weimer (1992) en un estudio anterior al mencionado, realizaron una investigación dirigida a bacterias ruminales celulolíticas y reportaron que la mayor concentración de biomasa obtenida para F. succinogenes S85 fue 0,45 g/L. Este estudio se realizó en tubos anaerobios con tapones de goma. Los tubos contenían atmósfera de CO2 con 5 mL de medio de cultivo de concentración de 4 a 5,5 g de celodextrinas/L a 39° C de temperatura y agitación constante de 150 rpm en un agitador orbital. Como se observa en la Tabla 4, la mayor concentración de biomasa obtenida, 1,509 g/L, es superior a la obtenida en el trabajo de Shi y colaboradores; esto quizá debido a que cada microorganismo tiene una fisiología característica que le permite degradar más fácilmente un sustrato a unas condiciones determinadas de temperatura y pH. pH En bacterias el pH óptimo varía entre 6,5 y 7,5; en levaduras entre 4,0 y 5,0; y en mohos entre 5,0 y 7,0. Sin embargo, el valor óptimo del pH será aquel valor para el cual la velocidad de crecimiento es máxima. Es importante resaltar que los valores intracelulares del pH pue75.

(9) den diferir considerablemente de los valores extracelulares (Rehm y Reed, 1981). El pH del medio de cultivo cambia durante una fermentación como respuesta a la actividad microbial (Duarte, 1998). Estos cambios en el valor del pH del medio pueden afectar la composición y la naturaleza de la superficie microbiana al disociarse ácidos y bases, lo que puede afectar la floculación de la biomasa o su adhesión al vidrio. La dependencia de los diferentes componentes celulares del pH influye en la velocidad de crecimiento y tiene una gran influencia en los productos finales del metabolismo anaerobio (Quíntero, 1981). pH ruminal y velocidad de crecimiento Normalmente el pH del rumen es cercano a la neutralidad; no obstante, cuando la concentración de carbohidratos solubles en la dieta se incrementa, el pH cae a niveles incluso por debajo de 6,0, alcanzando en algunas instancias valores críticos de 5,0 o inferiores. De forma similar a como ocurre en un fermentador de laboratorio, el saco ruminal regula su propio pH a través del ingreso de sustancias amortiguadoras. El fermentador ruminal amortigua el descenso de pH mediante el ingreso de saliva carbonatada que proviene de la boca en el correspondiente proceso de rumia. Estas fluctuaciones del pH tienen efecto sobre el metabolismo de las diferentes poblaciones microbianas presentes en el rumen, especialmente sobre su velocidad de crecimiento. Entre las bacterias ruminales que más declinan sus velocidades de crecimiento por efecto de descensos críticos del pH, están las celulolíticas. Las bacterias celulolíticas, y en general las fibrolíticas, muestran dificultades fisiológicas cuando los valores de pH ruminal caen por debajo de 6,0, debido principalmente a que reducen ostensiblemente la actividad de sus hidrolasas y aún de complejos más sofisticados, como los propios celulosomas. En contraste con el detrimento que causa un bajo pH ruminal, con las bacterias que degradan la pared celular, estos mismos valores pueden generar un incremento en la velocidad de crecimiento de otros microorganismos ruminales. Es el caso de S. bovis, en el cual se ha demostrado que a valores de pH inferiores a 5,75 y paralelo a una alta acumulación de ácido láctico en el fermentador ruminal, esta bacteria alcanza sus más altas velocidades de crecimiento y de acumulación de biomasa microbial (Russell y Dombrowski, 1980). Condiciones óptimas de pH para el crecimiento y producción de biomasa de R. flavefaciens G8 Experimentalmente, bajo las condiciones ajustadas en el laboratorio se ha determinado que el mayor rendimiento de sustrato en biomasa para la bacteria R. flavefaciens G8 coincide con el tratamiento en el que se presenta la mayor producción de biomasa. Este valor se obtiene de fermentaciones que se llevaron a cabo a pH 6,5, 39° C y agitación constante de 200 rpm en fermentador New Brunswick BIOFLO 110 (Tabla 5, Figura 17). 76. Tabla 5. Parámetros cinéticos, rendimientos de biomasa en sustrato (Y’x/s), velocidad específica de crecimiento máxima (µmáx) y tiempo de duplicación para R. flavefaciens cepa G8 bajo diferentes condiciones de pH. Tratamiento. Xmáx (g/L). Y’x/s (g biomasa/g sustrato). µmáx(h-1). td (h). pH 6,5. 1,485. 0,382. 1,651. 0,420. pH 6,9. 1,424. 0,323. 1,088. 0,637. pH 7,2. 1,445. 0,365. 1,425. 0,487. µmáx. Rendimiento. Figura 17. Promedio de las medias, con sus respectivas desviaciones estándar, para los parámetros cinéticos determinados para R. flavefaciens G8 a diferente pH.. En un estudio realizado por Russell (1980), se evaluó el efecto del pH en la eficiencia del crecimiento de cepas ruminales puras en cultivo continuo. Se estableció que a pH bajos puede existir inhibición del crecimiento, ya que se presenta escasa energía, lo cual impide la generación de un gradiente para el movimiento de protones a través de la membrana. El pH intracelular puede decaer bruscamente cuando el pH del medio que lo rodea decrece, a consecuencia de que algunas enzimas son sensibles al pH, especialmente las celulasas, y podrían causar efectos en los componentes celulares y hacer que la afinidad por el sustrato se encuentre disminuida. Para R. flavefaciens C94 el rendimiento se ve fuertemente afectado a pH menores de 6,5, siendo el máximo 0,130 g células/ g celobiosa a pH 6,5. La concentración celular permanece constante en un rango de pH de 7 a 6,5, y decrece a pH menores. Shi y Weimer (1992) reportaron que los valores típicos de los rendimientos observados para R. flavefaciens FD-1 son cercanos a 0,2 g células / g celulosa. El rendimiento de sustrato en biomasa, 0,382 g biomasa /g sustrato, logrado bajo las condiciones de operación de este trabajo (pH 6,5, 39° C y 200 rpm) es mayor que el obtenido en el estudio realizado por Russell (1980). Esto indica que R. flavefaciens G8 77.

(10) probablemente logró metabolizar de forma más eficiente el sustrato para producir mayores cantidades de biomasa bajo las condiciones mencionadas. El mayor valor de la velocidad específica de crecimiento (µmáx) se obtuvo cuando la fermentación se desarrolló a pH 6,5; 39° C y 200 rpm. Mientras tanto, la velocidad específica de crecimiento máxima (µmáx), 1,425 h-1, que se obtiene con el tratamiento a pH 7,2; 39° C y 200 rpm es similar al mayor valor obtenido con el tratamiento a pH 6,5; 39° C y 200 rpm. Russell (1979) también evaluó el efecto del pH en la velocidad específica de crecimiento y la posible influencia de éste en el rol de competencia en el rumen. Las bacterias estudiadas por Russell fueron S. bovis, B. ruminicola, S. ruminantium y B. fibrisolvens. Dichas bacterias se cultivaron en un rango de pH de 4,7 a 6,7. Los resultados sugieren que el pH puede ser un factor que determina la competencia de las bacterias en el rumen. Para el caso, la fuente de energía empleada fue glucosa (0,5 g/L) y la temperatura de incubación 39° C, con tiempo de cultivo de 12 horas; posteriormente, el cultivo se transfirió a un medio con el mismo pH pero con una concentración de glucosa de 4 g/L, monitoreado cada 30 minutos. La velocidad específica de crecimiento para bacterias ruminales varió de 0,3 a 1,78 h-1. Estos estudios concluyeron que, a pH bajos, el valor de la velocidad específica de crecimiento disminuye para las bacterias del rumen. Los valores de velocidad específica de crecimiento de 1,424 h-1 / 1,485 h-1 obtenidos para la cepa colombiana de R. flavefaciens (Tabla 5) pueden considerarse como buenos al compararlos con los valores reportados para otras bacterias ruminales. Los valores logrados para R. flavefaciens G8 son similares a los más altos reportados en el estudio de Russell (1979), pero se logran en un tiempo de fermentación total de apenas 4,5 horas. El tiempo de duplicación (td) es una expresión de la velocidad específica de crecimiento (µmáx), por esto, los resultados obtenidos para estos parámetros son consistentes. Así, el tratamiento que produjo la mayor velocidad específica de crecimiento (pH 6,5; 39° C y 200 rpm) presenta el menor tiempo de duplicación (td), 0,420 h. No obstante, los tiempos de duplicación obtenidos presentan valores cercanos, aunque se haya trabajado a diferentes condiciones de pH, lo que sugiere que este parámetro cinético es relativamente independiente del factor evaluado, al menos dentro del intervalo de estudio. Como se observa en la Tabla 6, la mayor producción de biomasa, 1,485 g/L, se obtiene cuando se evalúa la fermentación a pH 6,5; 39° C y 200 rpm. Los valores obtenidos con los demás tratamientos son similares a los obtenidos con este tratamiento. Actividad de agua (Aw) El agua es el compuesto más importante para los organismos vivos. La actividad de agua hace referencia a la cantidad de agua disponible no enlazada químicamente que un microor78. ganismo puede tomar. Cuando un microorganismo se encuentra en un sustrato con actividad de agua menor que la requerida, su crecimiento se detiene. Existe una adaptación y tolerancia de los microorganismos al estrés hídrico, lo cual conlleva a un cese en el crecimiento pero no a la muerte celular inmediata. Se conoce de un valor mínimo de Aw para cada tipo de microorganismos. Así, por ejemplo, bacterias, levaduras y hongos tienen Aw superiores a 0,9; 0,85 y 0,8, respectivamente (Duarte, 1998). Efecto de agua en el funcionamiento ruminal A través del consumo permanente de agua, el rumiante diluye las cantidades de sólidos contenidos en su interior, pero sin alcanzar un efecto suficiente como para alterar su osmolaridad ni el consumo voluntario de materia seca. El oxígeno que ingresa en el agua es rápidamente tomado por las bacterias microaerófilas que habitan las paredes del rumen, y la tensión superficial desciende como efecto directo de las sustancias reductoras del contenido ruminal y, en menor proporción, por acción de las mismas células bacterianas. Oxígeno y potencial redox Uno de los factores más críticos en la operación de las fermentaciones a gran escala es el intercambio eficiente de gases. El oxígeno es el sustrato gaseoso más importante para el metabolismo microbiano y el anhídrido carbónico es el producto metabólico más importante en las fermentaciones anaerobias. El oxígeno no es un gas muy soluble: una solución saturada de oxígeno contiene aproximadamente 9 mg/L de este gas en agua. Por tanto, en las fermentaciones aerobias la provisión de oxígeno debe ser lo suficientemente alta para satisfacer la demanda requerida por los microorganismos y compensar la insolubilidad de este gas. En el caso de fermentaciones anaerobias, se debe mantener el sistema completamente libre de O2, para lo cual se suministra al fermentador CO2 y/o N2 en forma gaseosa buscando crear una atmósfera libre de oxígeno (Hungate, 1950). Potencial redox en el rumen El balance entre los gradientes de concentración de oxígeno y de CO2, al igual que el pH en el rumen, determina su potencial redox. Cuando la proporción de concentrado aumenta en la dieta, el pH desciende afectando directamente el potencial redox (Eh = E0-0,06 pH). Al fermentador ruminal llegan grandes volúmenes de oxígeno a través de la irrigación sanguínea que inerva sus paredes. La primera reducción ocurre por medio de las mismas poblaciones microbianas que predominan en estos ambientes, como Lachnospira sp. Aunque Lachnospira y otras especies favorecen que el gradiente anaeróbico generalizado del saco ruminal se mantenga y por consiguiente un bajo potencial de óxido reducción, es la acu79.

(11) mulación de sustancias reductoras asociadas al metabolismo lo que más afecta el potencial redox del contenido ruminal, mientras que la contribución reductora de las células bacterianas se considera relativamente pequeña. (Baldwin y Emery, 1960). V. FERMENTACIÓN La fermentación es un proceso catalítico y bioquímico que provoca la transformación o descomposición de ciertas sustancias orgánicas debido a la acción de enzimas elaboradas por organismos diversos (hongos y bacterias). Probada por Pasteur, la íntima relación de estos fenómenos con las actividades vitales de estos organismos sentó la teoría vitalista de la fermentación, que más tarde fue sustituida por la teoría química –plenamente comprobada hoy– según la cual el agente provocador es la sustancia elaborada por el microorganismo, que actúa catalíticamente. El proceso de la fermentación es ampliamente usado en la industria en procesos tales como: elaboración de vino, vinagre, cerveza, queso, pan y alcoholes, entre otros. Actualmente, la fermentación es tema central de investigación en áreas científicas como bioingeniería, biotecnología, ingeniería de alimentos e ingeniería de procesos, con la intervención de otras disciplinas científicas y tecnológicas. • Fermentación aerobia: es el proceso de fermentación que requiere de la presencia de oxígeno para llevar a cabo la reacción de transformación. • Fermentación anaerobia: la reacción no necesita la presencia de oxígeno para favorecer el proceso de fermentación. Los organismos anaerobios en sus reacciones metabólicas utilizan algunas sustancias diferentes del oxígeno atmosférico para fijar el hidrógeno. Los fijadores de hidrógeno pueden ser compuestos o elementos como el azufre, el carbono y el nitrógeno, que son reducidos a ácido sulfhídrico, metano y amoniaco (Mateus, 1997). Proceso de fermentación Un proceso de fermentación convencional puede resumirse en las siguientes etapas: 1. Preservación de microorganismos Un pilar esencial de un proceso fermentativo es la calidad y pureza de la cepa microbiana con la que se trabaja. Los microorganismos, por su elevada tasa de crecimiento y división, presentan una probabilidad muy alta de sufrir mutaciones, las cuales pueden afectar negati80. vamente el rendimiento en el fermentador o la calidad y nivel de producción de un metabolito de interés. La conservación de los microorganismos a temperaturas bajas o ultra bajas, y a través de procesos de deshidratación controlada (liofilización), permitirá mantener cepas puras por periodos que van desde meses hasta años. Durante largos espacios de tiempo de conservación se deben hacer controles frecuentes de la calidad fisiológica y molecular. Estos procedimientos de control de calidad incluyen monitorear, por ejemplo, una actividad enzimática en particular, su viabilidad, su bioactividad e incluso la realización de “Bar Codes” genéticos que garanticen la pureza del microorganismo (Crueger, 1993). Las técnicas frecuentemente utilizadas para la preservación son: • Almacenamiento a baja temperatura (2 a 6° C): es fácil pero no es seguro. Los microorganismos son mantenidos sobre agar o en cultivo líquido a 4° C. Existe un alto riesgo de contaminación y de mutación reversa por frecuentes transferencias. • Almacenamiento por congelación (-18 a -80° C): puede existir también conservación celular en congeladores a -80° C o a -196° C en nitrógeno líquido. La congelación debe hacerse gradualmente (1° C/min), aunque puede ser utilizada la congelación rápida si se añaden sustancias criopreservantes que eviten la formación de cristales reduciendo la interacción molecular con el agua (Crueger, 1993). Los criopreservantes, por su naturaleza no ionizable y de bajo peso molecular, tienen la capacidad de ocupar los espacios destinados originalmente a las moléculas de agua, con lo cual los procesos naturales que se dan a bajas temperaturas son reemplazados por una solidificación amorfa y vítrea. Entre las sustancias criopreservantes más conocidas se encuentran: azúcares como la sacarosa, polietileno-glicol, glicerol, lactosa, DMSO (dimetilsulfóxido); leche en polvo, suero, extracto de carne, albúmina y macromoléculas no proteicas como PVP (polivinilpirrolidona) y dextranos. • Liofilización: es un método de congelación/desecación posterior de su cultivo, en medios adecuados. En el proceso de liofilización, después que la muestra ha sido congelada, la presión del sistema se baja y se aplica un nivel de calor suficiente para llevar el agua de su fase sólida a la fase gaseosa. La adición de agentes protectores (leche descremada o sacarosa) reduce la letalidad durante el proceso de liofilización. 2. Preparación del inóculo Todo fermentador requiere para su arranque del suministro de un inóculo en las concentraciones y condiciones fisiológicas adecuadas. La cantidad recomendada se encuentra entre 81.

(12) el 1% al 5% del volumen del fermentador y una condición celular del rango de crecimiento exponencial del cultivo donador del inóculo. Para la preparación del inóculo, el cultivo preservado se reaviva inicialmente mediante crecimiento en un cultivo líquido agitado o en un medio sólido a condiciones que dependerán del proceso específico. A fin de obtener suficiente volumen de inóculo para agregar a un fermentador, normalmente se produce una segunda serie de cultivos agitados en matraces adicionales. El cultivo apropiado del inóculo es de vital importancia para obtener buenos resultados en el proceso posterior a una escala de producción mayor. La calidad del cultivo estará determinada por la concentración de células, el medio nutritivo utilizado para el inóculo, la temperatura de crecimiento y la edad del inóculo. 3. Fermentación del producto Una vez que se agrega el inóculo al medio de cultivo fresco, comienza el proceso de fermentación con consumo del sustrato y generación de productos y biomasa. El éxito de la fermentación no solo está asociado al tipo de reactor y a la calidad del inóculo, sino también al tipo de formulación del medio de crecimiento, a la calidad de sus ingredientes y finalmente al modo de preparación. Dentro de los factores que más influencian un proceso de fermentación se encuentra el pH, la temperatura, el nivel y tipo de agitación, la aireación y la actividad de agua (Aw) (Crueger, 1993). Por esto, se hace necesario monitorear estas variables desde el inicio de la fermentación y durante todo el proceso, controlando su desviación de las condiciones de trabajo establecidas. VI. CLASIFICACIÓN DE LOS PROCESOS DE FERMENTACIÓN Fermentación discontinua o en lote (batch). secundario) no se separan una de la otra. La reacción puede ser expresada de la siguiente forma (Crueger, 1993): Sustrato A ó, Sustrato A. →. B. → →. Producto C. →. Producto. Fermentación en lote alimentado (fed-batch). Al contrario de la fermentación en batch, en una fermentación en lote alimentado la concentración de sustrato se mantiene por adición constante de medio de cultivo fresco durante un periodo de tiempo en particular, hasta que el volumen de trabajo del tanque de fermentación lo permita. Normalmente en este tipo de fermentaciones el producto o los productos de interés en la fermentación se derivan de vías alternas al metabolismo primario, como se muestra a continuación: Sustrato A → B → . ↓. E →. F →. C → D → Metabolismo primario Producto. En las fermentaciones continuas alimentadas hay dos máximos: en el primero se produce un buen crecimiento, acompañado por alto consumo de sustrato y poca o ninguna formación de producto; luego el crecimiento decrece y comienza la formación de producto, acompañada por una alta velocidad de consumo de sustrato. La tropofase y la ideofase están separadas en el tiempo (ver Figura 18).. En una fermentación en batch, todos los insumos se colocan previamente en el tanque del reactor estéril, se agrega el inóculo y se cierra el fermentador hasta su finalización. Muchos de los biorreactores permiten hoy día hacer una esterilización in situ del medio, con lo cual solo es necesario un paso adicional de ajuste de pH, de suministro de aireación y de la inyección del inóculo microbiano. El producto, que puede ser la propia biomasa, deriva directamente del metabolismo primario utilizado para la producción de energía. El crecimiento, el catabolismo del carbohidrato y la formación del producto se llevan a cabo casi siempre en paralelo, y la trofase (fase de crecimiento logarítmico) y la ideofase (fase en la cual se produce el metabolismo 82. Figura 18. Comportamiento del crecimiento microbiano con metabolitos primarios y secundarios.. 83.

(13) VII. FACTORES RELEVANTES EN LOS PROCESOS DE FERMENTACIÓN. Fermentación continua En la fermentación continua se establece hacia el interior del reactor un suministro continuo del sustrato o medio de crecimiento, de tal manera que a medida que ingresa el sustrato también se permita una fase de evacuación del medio ya fermentado. En la Tabla 6 se distinguen dos tipos básicos de fermentaciones continuas. Tabla 6. Tipos básicos de fermentaciones continuas Reactor continuo de tanque agitado (CSTR). Reactor de flujo tapón (PFR). Es un tanque de producción con agitación constante, que mantiene el crecimiento bacteriano en la fase de crecimiento exponencial.. La solución de cultivo fluye a través de un reactor tubular sin mezclado. La composición del número de nutrientes, el número de células, la transferencia de masa y la productividad varían a lo largo del reactor. Las células deben añadirse a la entrada del reactor continuamente junto con la solución de nutrientes.. Agitación del medio de cultivo La energía de transferencia, el sustrato y los metabolitos dentro del biorreactor, deben ser puestos en contacto mediante un mecanismo apropiado de mezcla. La eficiencia del transporte del sustrato hacia las células es fundamental para la eficiencia de toda la fermentación, y la agitación del medio de cultivo permite una distribución equitativa de nutrientes y del líquido a toda la biomasa microbiana, al igual que una transferencia de calor homogénea. La transferencia de masa, así como la transferencia de calor al interior del fermentador, es directamente dependiente del tipo de agitación, que facilita dicha transferencia a nivel gas-líquido, líquido-líquido y líquido-sólido. A través de la agitación también se facilita la disminución de agregados o micelios microbianos y la suspensión de partículas sólidas o la misma dispersión de líquidos (Mc. Cabe et al., 2008). Sistemas de agitación El sistema de agitación de un fermentador consiste en un rodete acoplado a un eje y un sistema de generación de movimiento. El patrón de flujo homogéneo generado por la turbina se rompe con elementos disruptores denominados ‘bafles’, ubicados en la pared del tanque. Con esta combinación de acciones se logra un movimiento turbulento que facilita la mezcla de los ingredientes del medio, la reducción de la tensión superficial del gas que está siendo suministrado, y la mezcla continua y homogénea de microorganismos y sustrato. Tipos de agitadores. Fuente: Fogler, S. (2001). En la fermentación continua, el metabolismo primario y la formación de productos se producen en tiempos completamente separados. El producto no se deriva del catabolismo sino de las vías anfibólicas; éstas son aquellas que se usan en procesos anabólicos y en procesos catabólicos, como el ciclo del ácido cítrico. En este tipo de fermentación opera primero el metabolismo primario, acompañado por el consumo de sustrato y el crecimiento. Después, se forma el producto mediante la reacción del metabolismo intermedio. Muchos antibióticos y vitaminas son producidas por este tipo de fermentación (Crueger, 1991). 84. Los tres principales tipos de rodetes utilizados para la agitación de fermentadores son las hélices, paletas y turbinas (Tabla 7). Otros rodetes especiales resultan también útiles en situaciones específicas, pero los tres tipos principales mencionados resuelven la mayoría de los problemas de agitación de líquidos. Para los procesos microbiológicos se han desarrollado algunos tipos específicos de agitadores, que generan bajas fuerzas de corte y por ende bajo impacto en el crecimiento de los microorganismos. Para bacterias es común utilizar hélice, ancla de reja, turbina tipo Rushton o tornillo helicoidal. La turbina Rushton, que consiste en un disco del que salen 4 a 8 paletas radiales, es el tipo más común. Comparado con este agitador, el tipo hélice marina requiere 50% menos de aire para el mismo consumo de energía y rendimiento (Owen, 1991). 85.

(14) Tabla 7. Algunos tipos de rodete que operan en reactores a diferentes escalas Tipo de rodete. Esquema. Hélice: eficiente en la agitación de productos de baja viscosidad, en la que se alcanzan rotaciones de hasta 2000 rpm, dependiendo del volumen y profundidad del tanque. Mueven los productos hacia arriba o hacia abajo, y su eficiencia está relacionada con el grosor y número de cuchillas. Puede requerirse más de una hélice cuando el tanque es muy profundo o muy grande.. Paleta: la paleta, por su disposición vertical, impulsa los fluidos radial y tangencialmente. Las fuerzas de corte que entrega al medio son bastante altas, por lo que son preferidas en reactores que requieren una agitación suave y velocidades bajas (20-150 rpm).. Turbina: consiste de un rodete dotado de paletas o de hélices dispuestas de acuerdo a su tipo en diferentes grados de inclinación. Con un agitador tipo turbina la viscosidad no resulta un factor limitante, y los fluidos se desplazan radial y tangencialmente. Las corrientes tangenciales generan remolinos que son neutralizados por placas deflectoras o por medio de anillos difusores.. Donde. η. = viscosidad del fluido F/A = fuerza de cizalla o fuerza por unidad de área dv/dx = velocidad de cizalla o gradiente de velocidad. Las soluciones de nutrientes pueden ser subdivididas en dos grupos, de acuerdo con la forma en la que se comportan cuando se les agita: soluciones viscosas con propiedades newtonianas y no newtonianas, y soluciones visco- elásticas, en las que no se observan propiedades normales de estado líquido en recipientes agitados. La mayor parte de las soluciones caen en la primera categoría, pero las soluciones no inoculadas y los cultivos bacterianos se comportan como líquidos newtonianos. En estos líquidos la viscosidad es constante a temperatura constante y su viscosidad no dependerá de la fuerza del rodete o de la velocidad de agitación. Durante la agitación de fluidos no newtonianos, el líquido no fluye tangencialmente sino que se levanta a lo largo del impulsor, un comportamiento conocido como ‘efecto Weissenberg’. Con tales soluciones, es difícil hacer el cálculo de salto de escala. La naturaleza de algunos medios de crecimiento con componentes específicos y de algunos microorganismos, hacen que la mezcla se comporte como fluidos de reología pseudoplástica o plásticos de Bingham, y por tanto demandan condiciones de agitación diferentes (Doran, 1999). • Transferencia de masa. La masa que se transfiere en un reactor se constituye en la mezcla de nutrientes y metabolitos, los cuales fluyen entre el ambiente extra e intracelular y a través de las interfaces líquido-líquido, gas-líquido y líquido-sólido. La facilidad de transferencia dependerá de las condiciones fisicoquímicas del medio de cultivo, de la reología del medio y, por ende, del tipo y eficiencia del sistema de agitación (Owen, 1991).. Fuente: Mc. Cabe et al. (2008). Para mantener una agitación efectiva durante el desarrollo de una fermentación se deben tener en cuenta algunos factores relevantes referentes a la reología del medio de cultivo y las características del equipo, entre ellos: • Dinámica de fluidos. Las leyes de Newton rigen la dinámica de los fluidos. La resistencia de un fluido a moverse es definida por su grado de viscosidad y se traduce en una fuerza que es definida como: 86. • Transferencia de energía. A fin de obtener rendimientos óptimos, las fermentaciones se deben llevar a cabo a temperatura constante. La velocidad de producción de calor causada por la agitación y la actividad metabólica de los microorganismos, debe ser balanceada por las pérdidas de calor que resultan de la evaporación y la radicación más la eliminación de calor debida al sistema de refrigeración. Las exigencias netas de calentamiento o enfriamiento externo del fermentador se determinarán realizando un balance entre los procesos que generen y consuman calor, siendo necesario usualmente utilizar intercambiadores de calor. 87.

(15) De forma general, los procesos biotecnológicos pueden ser considerados isotérmicos, es decir, no hay acumulación de calor en el interior del reactor, excepto para casos donde ocurre una programación del perfil de temperatura con la finalidad de optimizar el proceso (Owen, 1991). Sin embargo, en el metabolismo se produce energía metabólica, que se disipa en forma de calor y tiende a elevar la temperatura del caldo de fermentación. Los coeficientes de producción de calor para algunas bacterias pueden ser diferentes según el sustrato; para los sustratos más fuertemente oxidados se produce menos calor por biomasa que con los sustratos más reducidos. En general, los coeficientes de producción de calor aumentan linealmente en relación a la velocidad específica de crecimiento de los cultivos (Crueger, 1993). Igualmente, se puede generar calor como resultado de la energía mecánica, necesaria para los procesos de agitación y aireación. Cuando estos procesos elevan la temperatura del biorreactor por encima de su temperatura de operación, es necesario proveer un sistema para retirar calor. De forma similar, si la fermentación consume energía y la temperatura del sistema decae por debajo de la temperatura de operación, es necesario proveer un sistema de calentamiento para mantener la temperatura. La producción de calor durante la agitación puede ser calculada a partir del consumo de energía del motor menos las pérdidas a través de las juntas, los cojinetes y el eje del motor. En los fermentadores, la transferencia de calor se hace mediante circulación de agua a través de una camisa por el exterior del recipiente o mediante serpentines situados dentro de los reactores. La agitación permite mayor eficiencia de transferencia de calor y homogeneidad de la temperatura en todo el fluido. • Potencia necesaria en el fermentador. En los fermentadores con agitación provistos con deflectores se consigue una mezcla eficaz mediante un flujo totalmente turbulento, que puede ser caracterizado por el número adimensional de Reynolds (NRe): (> 10-5 para las turbinas Rushton) Donde D = diámetro del agitador (m) N = velocidad de rotación del agitador (s-1) ρ = densidad del líquido (Kg/m3) η = viscosidad dinámica del fluido (kg/m*s) Cuando se agita un líquido newtoniano no gasificado en un recipiente provisto de deflectores, la entrada de potencia al líquido (la potencia absorbida por el líquido) puede representarse por otro número adimensional, el número de potencia NP: 88. NP =. P ρ * N 3 * D5. Donde P es la potencia externa del agitador (no gasificado). En un fermentador agitado equipado con deflectores, el número de potencia está relacionado con el número de Reynolds, mediante la ecuación:. Donde C es una constante dependiente de la geometría de la vasija e independiente de su tamaño y Z es un exponente. Por tanto,  (D 2 * N P ) Z  P = C   η ρ * N 3 * D5  . De forma que los valores de P a distintos valores de N, D, η y ρ pueden determinarse experimentalmente, lo que permite tener un estimado de los parámetros para realizar un escalamiento (Owen, 1991). Esterilización En todos los procesos de fermentación es necesario mantener condiciones asépticas; por tal razón, es necesario que el fermentador y los sistemas de alimentación del medio de cultivo y otras sustancias sean esterilizados también. La esterilización permite asegurar que una vez el fermentador ha sido inoculado con un cultivo de un organismo específico, éste sea el único en crecer, de lo contrario el medio puede ser consumido con la consecuente formación de otros productos, efecto de la actividad de microbios contaminantes (Wisseman, 1986). Los fermentadores pequeños (volumen 3 a 15 L) se esterilizan en autoclave, mientras que los fermentadores a escala piloto y escala industrial son esterilizados in situ, es decir, que tienen un sistema de esterilización que provee vapor proveniente de una caldera (Krahe, 2007). Esterilización térmica Consiste en llevar al sistema a una temperatura elevada durante un tiempo suficiente para destruir los organismos vivos, hasta alcanzar la esterilidad, enfriando luego a la temperatura del cultivo. Puesto que la velocidad de exterminio de los organismos vivos aumenta rápidamente con la temperatura, cuanto mayor sea ésta menor será el tiempo requerido para la 89.