Rev peru med exp salud publica 20 (4), 2003
Editorial
La transición epidemiológica significa la disminución en el número de casos de las enfermedades
infecciosas y el progresivo incremento de las enfermedades crónico degenerativas; sin embargo,
la emergencia y reemergencia de las enfermedades infecciosas que se debe a múltiples factores
a alterado esa tendencia, aún persisten y tienen mayor incidencia en países en vías de desarrollo
como el nuestro. Este fenómeno también ocurre con las publicaciones sobre las enfermedades
endémicas y epidémicas en el país.
En este contexto, debemos destacar los artículos referidos a las enfermedades que cursan con
síndrome febril, como la leptospirosis, tifus, dengue y otras arbovirosis, que plantean la
necesidad de tener en cuenta el diagnóstico diferencial de estas infecciones ya sea para la
conducta terapéutica individual o para orientar adecuamente las medidas de prevención y
control. Evidencias de lo anteriormente mencionado se muestran en los hallazgos sobre la
prevalencia de leptospirosis en Madre de Dios, el tifus, dengue y Oropouche en el estudio de la
etiología de síndrome febril en Piura y Loreto, o el de influenza en Pucallpa, Ucayali.
En general cuando observamos un caso de síndrome febril, orientamos nuestro diagnóstico a
enfermedades infecciosas y pocas veces pensamos en otras opciones, particularmente en
niños. Este estilo de pensamiento puede tener sesgos, como lo ocurrido durante el fenómeno
de El Niño 1997-98 en nuestro país, donde luego de una intensa e infructuosa búsqueda de
agentes infecciosos, se comprobó que el síndrome febril en niños en casi toda la costa norte
del país era debido a la inducción de la fiebre por alteraciones bruscas de la temperatura
ambiental en un período corto, como lo sucedido durante dicho fenómeno, hecho que también
es descrito en uno de los artículos de este número.
También debemos destacar los artículos sobre investigaciones experimentales en ratas sobre
el metabolismo de hidrato de cloral, así como la búsqueda de proteínas recombinantes
orientadas al diagnóstico de la fiebre amarilla, la susceptibilidad de bacterias a antibióticos y la
asociación entre el estado nutricional y la malaria en la amazonia, como parte de los esfuerzos
del Instituto Nacional de Salud para contribuir al diagnóstico, tratamiento o prevención de las
enfermedades de elevada magnitud en el país.
Finalmente deseamos evocar los aportes de eximios salubristas de diferentes nacionalidades
que han contribuido a esa noble y abnegada labor en la solución de problemas de salud en
nuestro país, como es el caso del Dr Maxime Kuczynski, quien desarrolló una intensa labor
médica y social en la amazonia peruana. Consideramos que esta nueva sección especial de la
revista, será un espacio que mantenga viva la memoria de aquellos que dedicaron sus vidas
por sus semejantes, y no por el solo hecho de vivir de recuerdos, si no mas bien de ser militantes
con el legado y el ejemplo.
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INTRODUCCIÓN
La leptospirosis es una zoonosis de distribución mundial, es más común en áreas tropicales donde las
condiciones para su transmisión son favorables1,2. Ha sido reconocida como una enfermedad de importancia por sus características clínicas y epidemiológicas 3,4.
Es considerada una enfermedad ocupacional que afecta a personas que se dedican a la agricultura, limpieza de desagües, minería y aquellos que tienen contacto con animales como los matarifes y los veterinarios4. En áreas tropicales las personas están más expuestas a aguas y suelos contaminados con leptospiras haciendo que la infección sea más frecuente1, 4-8.
RESUMEN
Objetivos: Determinar la prevalencia de leptospirosis y los factores de riesgo en personas con antecedentes de fiebre en localidades dedicadas a actividades mineras (lavaderos de oro) y la prevalencia de infección en perros en la provincia de Manu, departamento de Madre de Dios, Perú. Material y métodos: Estudio transversal analítico. Se tomaron 71 muestras de sangre de personas con antecedentes de fiebre, provenientes de cinco localidades dedicados a la actividad minera, en ellos se evaluaron la presencia de anticuerpos IgM e IgG contra leptospiras en suero por el método de ELISA y la prueba de microaglutinación (MAT). Los factores asociados a la infección por leptospiras fue evaluada a partir de una encuesta. Además se tomaron muestras de sangre a 27 perros que evaluados por el método de MAT Resultados: Se enrolaron 71 personas de las cuales 47 (66,2%) fueron mujeres y 24 (33,8 %) varones, 26 (36,6%) pobladores presentaron anticuerpos contra leptospiras. Los factores asociados a la infección por leptospiras en los pobladores fueron: consumo de agua de río en el hogar (OR=9,09 p=0,017), consumo de agua de río en el campo (OR=7,13 p=0,042), nadar en el río (OR=4,60
p=0,13), habitar en una vivienda con techo de plástico y paja (OR=4,04 p=0,013). En canes, 18 (66,6%) tuvieron serología
positiva a leptospiras. Conclusiones: Existe una alta prevalencia de leptospirosis en personas con antecedentes de fiebre y condiciones favorables para la presencia de leptospiras en las localidades estudiadas. En estas zonas se recomienda realizar actividades educativas preventivas, tomando en cuenta los factores de riesgo identificados.
Palabras clave: Leptospirosis; Prevalencia; Factores de Riesgo; Perros; Perú. (fuente: BIREME)
ABSTRACT
Objectives: To determine the prevalence of leptospirosis and its risk factors in persons presenting with fever in mining areas (gold search at the riverbanks), and the prevalence of infection in dogs in Manu province, Madre de Dios department, Peru. Material and methods: Analytic cross-sectional study. 71 blood samples were taken from persons presenting with fever who came from five mining areas. The presence of IgM and IgG antibodies against Leptospira were determined using an ELISA method and a micro-agglutination test (MAT). Results: 71 persons were assessed, 47 (66,2%) were female and 24 (33,8%) were male; 26 (36,6%) had antibodies against Leptospira. The risk factors associated to Leptospira infection in these persons were as follows: to use river water in their household (OR= 9,09, p= 0,017), to use river water in the field (OR= 7,13, p= 0,042), to swim in the river (OR= 4,60, p= 0,13), to live in a house with a plastic and straw roof (OR= 4,04, p= 0,013). In dogs, 18 (66,6%) had a positive serology for Leptospira. Conclusions: There is a high prevalence of leptospirosis in persons presenting with fever and favorable conditions for the development of this infection in the studied areas. It is recommended that preventive educational activities should be performed, taking into account the risk factors identified.
Key words: Leptospirosis; Prevalence; Risk Factors; Dogs; Peru. (source: BIREME)
PREVALENCIA DE LEPTOSPIROSIS Y FACTORES DE RIESGO EN
PERSONAS CON ANTECEDENTES DE FIEBRE EN LA PROVINCIA DE
MANU, MADRE DE DIOS, PERÚ
Manuel Céspedes Z
1, Melvi Ormaeche M
2, Patricia Condori
3, Lourdes Balda J
1, Martha Glenny A
11Laboratorio de Leptospiras, División de Bacteriología, Centro Nacional en Salud Pública. Instituto Nacional de Salud. Lima, Perú.
2Oficina General de Epidemiología. Ministerio de Salud. Lima, Perú
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En el Perú se han encontrado anticuerpos contra leptospiras en humanos y animales en 19 de los 25 departamentos del país9. En la literatura se menciona que los factores asociados a la infección por Leptospira: exposición a distintos suelos y aguas contaminadas, características de las viviendas, eliminación de excretas, además, la exposición con roedores y animales domésticos4. Sin embargo, en el Perú hay pocos estudios orientados a identificar los factores de riesgo asociados a la infección por leptospiras. Durante el mes de mayo del año 2000, nueve pacientes de las localidades de Boca Amigo y Boca Colorado, provincia del Manu, departamento de Madre de Dios, Perú, presentaron un cuadro clínico definido como síndrome febril–ictérico, se tomaron muestras de sangre que fueron enviadas al Instituto Nacional de Salud, Lima, Perú, y confirmadas como leptospirosis mediante las pruebas de ELISA IgM y microaglutinación (MAT). Los pacientes en su mayoría fueron migrantes de la sierra sur del Perú; la actividad que desarrolla esta población era la extracción de oro en las riberas del río Madre de Dios.
Debido a que en años anteriores no se habían registrado casos confirmados de leptospirosis procedentes de esta zona, se decidió realizar una investigación con el objetivo de conocer la prevalencia y los factores de riesgo asociados con la infección por leptospirosis en personas con historia de fiebre en los últimos 3 meses, en cinco localidades de la provincia de Manu, Madre d e D i o s , a s i m i s m o , c o n o c e r l a p re v a l e n c i a d e leptospirosis en canes.
MATERIAL Y MÉTODOS
Estudio transversal analítico realizado en diferentes poblados de la provincia del Manu, departamento de Madre de Dios, Perú. (Figura 1).
DESCRIPCIÓN DEL ÁMBITO GEOGRÁFICO
El departamento de Madre de Dios está ubicado en la región suroriental del Perú (Figura 1), cuenta con una población de 84 500 habitantes, su principal vía de comunicación es la fluvial. Las localidades del estudio pertenecen a la provincia del Manu y se ubican a lo largo del Río Madre de Dios, cuentan con aproximadamente 3 400 habitantes que carecen de servicios básicos como luz, agua potable y desagüe. Las viviendas son de material rústico (caña, paja, madera y plástico), las calles no están asfaltadas y la población en su gran mayoría convive con animales domésticos como perros, cerdos y aves. La principal actividad económica de estas localidades es la extracción de madera y oro, ésta última se realiza principalmente en la ribera del río Madre de Dios. La gran mayoría de personas que se dedican a esta actividad viven en campamentos localizados en zonas cercanas a las localidades donde los habitantes se dedican al comercio de alimentos, bebidas y combustibles.
METODOLOGÍA
Se incluyeron en el estudio a personas que habían presentado fiebre en los últimos 3 meses. Se excluyeron del estudio a niños menores de 5 años.
Para visitar las viviendas de las cinco localidades y campamentos aledaños se conformaron dos brigadas. Previo consentimiento informado se aplicó una encuesta estructurada que contenía datos sociodemográficos, aspectos generales de la vivienda (piso, paredes y techo), presencia de animales domésticos en el intradomicilio y peridomicilio (perros, cerdos, vacunos, cabras y otros), de animales sinantrópicos (roedores y marsupiales), posibles factores de riesgo para leptospirosis. Asimismo, se incluyeron preguntas sobre actitudes y prácticas de las personas hacia la enfermedad. Posteriormente, se tomó una muestra de 7 mL de sangre venosa con tubo al vacío sin anticoagulante
Por otro lado, del total de viviendas de las personas incluidas en el estudio, se seleccionó un can en cada vivienda previa aceptación del dueño, posteriormente, se llenó una ficha de registro de animales domésticos basado en los datos proporcionados por los dueños, y se procedió a tomar una muestra de 5 mL de sangre venosa. Las muestras de las personas y de los canes se transportaron por separado al puesto de salud para realizar la separación del suero, luego las muestras fueron transportadas en cadena de frío al Laboratorio Referencial de Leptospiras del Instituto Nacional de Salud (INS), Lima, Perú para la realización de los exámenes serológicos correspondientes.
EXÁMENES SEROLÓGICOS
Humanos. Se realizaron las pruebas de ELISA IgM e IgG para leptospiras, con la finalidad de relacionar e identificar los casos agudos o convalecientes, asimismo, se realizó la prueba de aglutinación microscópica (MAT) a todas las muestras. Se utilizaron los serovares: andamana (No patógeno), australis, autumnalis, ballum, bataviae,
canicola, celledoni, pomona, hebdomadis, cynopteri, djasiman, mini, grippotyphosa, icterohaemorrhagiae,
Leptospirosis en febriles en Madre de Dios, Perú
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javanica, pyrogenes, sejroe y tarassovi. Se consideraron
como positivas aquellas muestras que resultaron reactivas por ELISA IgM o IgG confirmadas por MAT. El criterio de positividad en el MAT fue que las muestras fueran reactivas a un título 1/200 de dilución de suero.
Canes. Las muestras de suero de los canes se procesaron por la prueba MAT usando los mismos serovares y los criterios de definición de positividad para los humanos.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
La información fue ingresada a una base de datos previamente diseñada, se realizaron los cálculos de frecuencias absolutas y relativas. Mediante análisis bivariado a través de las pruebas no paramétricas (Chi-cuadrado) se evaluaron la existencia de asociación entre la presencia de anticuerpos contra leptospiras y los datos generales, variables epidemiológicas y factores de riesgo asociados; para ello, se consideró un valor p < 0,05 como significativo e intervalos de confianza (IC) al 95%. Para identificar los factores de riesgo se usó el odds radio (OR). Para el procesamiento
y análisis de los datos se utilizó el software SPSS 10,0 para Windows.
RESULTADOS
De un total de 89 personas que presentaron historia de fiebre en los últimos 3 meses, 71 (79,7%) aceptaron participar en el estudio.
Se incluyeron a 47 (66,2%) mujeres, con una edad promedio (24 ± 12) y a 24 (33,8 %) varones con una edad promedio (24 ± 14); 39/71 de las personas tenían entre 30 y 39 años. Se encontraron 26 (36,6%) con serología positiva para leptospiras. La positividad en las mujeres fue 31,9% y en los varones 45,8%, no se encontraron diferencias significativas (OR =0,55; IC 95%: 0,2 - 1,52).
Con respecto a la ocupación, se observó que la positividad fue mayor en los trabajadores de los lavaderos de oro y población preescolar (Tabla 1). La prevalencia por localidad se muestra en la tabla 1.
Céspedes M. y col.
Resultados
Prevalencia Total Positivos Negativos %
(n=71) (n=26) (n=45) Positividad
Sexo
Femenino 47 15 32 31,9%
Masculino 24 11 13 45,8%
Grupo de edad* (Años)
0-9 13 5 8 38,5% 10-19 13 5 8 38,5% 20-29 22 7 15 31,8% 30-39 17 5 12 29,4% 40-49 4 2 2 50,0% 50-59 2 2 0 100,0% Ocupación Minero 13 7 6 54,0% Preescolar 4 2 2 50,0% Estudiante 14 6 8 43,0% Ama de casa 21 7 14 33,0% Comerciante 3 1 2 33,3% Profesora 1 0 1 0,0% Obrero 1 0 1 0,0% Agricultor 1 0 1 0,0% Localidad Boca Amigo 5 4 1 80,0 % Guacamayo Pacal 9 7 2 77,8 %
San Juan Grande 35 11 24 31,4 %
Boca Colorado 16 3 13 18,8 %
San Juan Chico 6 1 5 16,7 %
(*) Rango de edades de casos positivos fue de 6-59 años
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FACTORES DE RIESGO ASOCIADOS
La tabla 2 nos muestra que dentro de las características de la vivienda, el techo de plástico y paja, así como el consumo de agua de río en el hogar, consumo de agua de
río en el campo y contacto con perros, estuvieron asociados a un mayor riesgo de infección por Leptospira. No se encontró asociación en relación con las otras prácticas y características de la vivienda y contacto con animales.
Leptospirosis en febriles en Madre de Dios, Perú
Tabla 2. Factores de riesgo asociados a la infección por Leptospira en pacientes febriles en la provincia de Manu, Madre de dios, Perú. Junio 2000.
Factores de riesgo Valor X2 p Odds Radio Intervalo OR
(O R)
Consumo de agua de río en el hogar 5,738 0,017* 9,09 (1,1 - 74,6)
Consumo de agua de río en el campo 4,142 0,042* 7,13 (0,8 - 60,5)
Contacto con perros 3,740 0,053* 2,63 (0,9 - 07,1)
Natación en el río 2,260 0,130 4,60 (0,5 - 39,7)
Acopio de alimentos en el hogar 2,585 0,109 2,44 (0,8 - 07,4)
Uso de sandalias 0,812 0,368 1,77 (0,5 - 06,2)
Contacto con roedores 0,812 0,367 1,70 (0,5 - 05,4)
Manipulación de tejidos animales 0,235 0,628 1,37 (0,3 - 05,0)
Natación en aguas estancadas 0,142 0,707 1,20 (0,4 - 03,2)
Contacto con animales silvestres 0,088 0,928 1,05 (0,3 - 02,7)
Techo de la vivienda de plástico y paja 6,219 0,013* 4,04 (1,3 - 14,8)
Piso de la vivienda de tierra 0,012 0,914 0,94 (0,3 - 02,6)
Pared de la vivienda de plástico y paja 0,032 0,858 0,90 (0,2 - 03,1)
*Significativos.
De 71 personas, 26 (36,6%) presentaron serología positiva a cualquiera de las pruebas realizadas (Tabla 3). De estos,
En la tabla 4 se muestra la historia de fiebre en días de los pacientes antes de la toma de muestra, se obtuvieron datos en 57(80,3%) de los reclutados, la positividad para
9 presentaron serología positiva para anticuerpos IgM, que sugiere una infección activa por Leptospira.
leptospiras fue mayor en aquellos que tuvieron un tiempo de enfermedad menor o igual a 9 días al relacionarlos con los datos obtenidos por el ELISA IgM.
Mediante la prueba de Microaglutinación (MAT), se determinó la presencia de varios serovares de Leptospira, siendo el serovar georgia el más frecuente seguido de bratislava.
Asimismo, se encontraron anticuerpos para más de un serovar en las personas, los títulos de anticuerpos estuvieron distribuidos entre 1/200 y 1/800 (Tabla 5).
Tabla 3. Resultados según métodos serológicos utilizado para el diagnóstico de leptospirosis en personas con historia de fiebre en la provincia de Manu, Madre de Dios, Perú. Junio 2000.
Prueba serológica Resultado %
Negativo Positivo Positividad
MAT 45 26 36,6
ELISA IgM e IgG 59 12 16,9
ELISA IgM 62 9 12,6
ELISA IgG 66 5 7,0
Tiempo de enfermedad Total Resultado %
(fiebre) en días Positividad
Negativo Positivo 01-09 29 19 10 34,5 10-19 8 5 3 37,5 20-30 11 8 3 27,3 31-60 2 0 2 100,0 61-90 7 3 4 57,1 No recordaron la fecha 14 10 4 28,6 Total 71 45 26 36,6
Rev peru med exp salud publica 20 (4), 2003 Céspedes M. y col.
ESTUDIO EN CANES
De los 27 canes estudiados, 18 (66,7%) tuvieron serología positiva para Leptospira. La positividad por área geográfica fue mayor en Guacamayo Pacal 3 (100%), San Juan Grande 8 (72,72%), Boca Amigo 3 (60,00%) y Boca Colorado 4(50,00%). Los serovares más frecuente fueron georgia (44,4%) y bataviae (33,3%), otros serovares (22,3%) como:
javanica, australis, tarassovi, autumnalis y canicola.
DISCUSIÓN
Este estudio es el primero realizado en el Perú en población dedicada a la extracción de oro de forma rudimentaria (lavadero). Se documenta una alta prevalencia de leptospirosis en personas con antecedentes de fiebre 26 (36,6%) en humanos y 18 (66,7%) en caninos en las riberas del río Madre de Dios en la provincia del Manu. Consideramos que estas localidades son endémicas para la leptospirosis por ser una región tropical con múltiples reservorios de Leptospira y condiciones favorables para su permanencia (climáticas, sanitarias y laborales). En el Perú los estudios orientadas a identificar los factore de riesgo asociados a la infección por
Leptospiras son escasos, no existen trabajos realizados en
localidades cuya actividad económica principal es la búsqueda de oro en los ríos. La mayoría de los estudios fueron realizados en población presuntamente sana. Cabe resaltar que en los estudios realizados por Liceras9 entre los años 1975 y 1981, en el departamento de San Martín, encontró anticuerpos contra Leptospira en 36,6%, seroprevalencias similares se reportaron en Tingo María, departamento de Huánuco. La leptospirosis se puede considerar como una enfermedad ocupacional en la zona. Aunque los varones están más expuestos a contraer la enfermedad dado que tienen más contacto con el agua que podría estar contaminada con leptospiras; sin embargo, la positividad en varones y mujeres fueron similares. La permanencia por períodos largos dentro del agua (8-12 horas), permitiría que el ingreso de las leptospiras sea más fácil por la piel reblandecida, observaciones similares se han reportado en personas que se dedican al cultivo de arroz 4.
Asimismo, la infección por Leptospira tuvo una tendencia homogénea en los distintos grupos etáreos, aunque el
Títulos de anticuerpos Serovar Total 1/200 1/400 1/800 georgia 5 8 - 13 bratislava 1 2 1 4 tarassovi 3 - - 3 cynopteri 1 2 - 3 canicola 2 1 - 3 wolffi 2 - - 2 pyrogenes 2 - - 2 ballum 2 - - 2 autumnalis 2 - - 2 grippotyphosa 1 - - 1 djasiman 1 - - 1 borincana 1 - - 1 bataviae 1 - - 1
Tabla 5. Serovares de Leptospira determinados por la prueba MAT en pacientes con leptospirosis en la provincia de Manu, Madre de Dios, Perú. Junio 2000.
número de positivos fue mayor entre los grupos de 20 y 29 años, población económicamente activa en la zona. Los hallazgos en menores de edad llamó la atención, dado que normalmente ésta no se dedica al trabajo en los ríos, pero en el momento del juego pueden estar en contacto con suelos y aguas contaminadas con leptospiras. Otra posible forma de infección es cuando frecuentan con sus padres las áreas de trabajo, como se ha sugerido en Brasil10. Otro hallazgo significativo fue que los pobladores dedicados exclusivamente a actividades mineras tuvieron mayor positividad, seguido de las amas de casa, comerciantes, estudiantes y otros grupos pero en menor proporción, lo que demostraría que la leptospirosis es una enfermedad ocupacional en esta zona5. Asimismo, los hallazgos en personas con otra actividad, nos permitiría manifestar que cualquier persona que se dedica a cualquier actividad en esta zona podría contraerla, dado que las condiciones de salubridad son deficientes y las características climática y geográficas son favorables para la presencia de leptospiras. Pero cabe recalcar que la actividad minera realizada por sus pobladores constituye un verdadero factor de riesgo para adquirir la enfermedad.
Con respecto a las localidades, todas tienen características geográficas, climatológicas y de saneamiento similares; la actividad económica principal de la población es la minería. La población está compuesta por migrantes que provienen de los departamentos de la sierra: Cusco, Puno, Apurímac, Ayacucho y Huancavelica, donde la leptospirosis no es frecuente9,11; por lo tanto, sería una población susceptible. Respecto a los factores de riesgo asociados, encontramos que aquellos pobladores que tienen techo de plástico y paja en su vivienda, están en mayor riesgo de adquirir la enfermedad, dado que normalmente en los techos hay presencia de roedores y que en la época de lluvias el agua se filtra posiblemente con orina de roedores contaminando las áreas donde transitan las personas. Dichos hallazgos coinciden con los reportados por otros autores quienes mencionan a la infraestructura inadecuada como un factor de riesgo asociado a la infección por leptospiras12-14 El consumo agua de río en el hogar y consumo de agua en el campo también se asociaron a la infección por leptospiras, habitualmente las personas en estas áreas no hierven el agua para consumirla y también la usan para el aseo personal y el lavado de la ropa. La forma de ingreso de la bacteria sería a través de las mucosas oral, nasal u ocular como se ha reportado en los Estados Unidos8,14,15. Otra forma de ingreso
sería por la piel, la cual está relacionada con la actividad de la población, dado que constantemente sufren de abrasiones, haciendo que la vía de ingreso para las leptospiras sea más fácil; hallazgos similares se obtuvieron en brotes relacionados con estas actividades laborales y otros de recreación8,17-22.
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No se encontró asociación con otras características evaluadas como: acopio de los alimentos, manipulación de carne, contacto con animales silvestres, natación en río, natación en aguas estancadas y el contacto con roedores. Aunque en esta población la natación debe ser una causa frecuente de infección por leptospiras5-8,18-20. Esto podría sugerir que la elevada sero prevalencia de infección por leptospiras se explicaría por la exposición a roedores y marsupiales silvestres en áreas donde las personas trabajan, descansan y frecuentan. Las pruebas de laboratorio usadas permitieron discriminar a aquellas personas que habían presentado o estaban desarrollando la enfermedad. Para ello usamos la técnica de ELISA IgM e IgG; mediante estas pruebas se determinaron las personas que estaban cursando la enfermedad al relacionarla con el antecedente de fiebre. Asimismo, se encontraron personas con anticuerpos IgM y IgG al relacionarlas con el tiempo de enfermedad, lo cual nos permitió identificar las pacientes en etapa convaleciente de la enfermedad11.
Mediante la técnica de aglutinación microscópica (MAT) identificamos 13 de 19 serogrupos de leptospiras usados en la prueba. Los serovares estuvieron distribuidos en forma heterogénea en todas las localidades estudiadas, siendo los más frecuentes: georgia (50%), bratislava, tarassovi, cynopteri,
canicola, wolffi, pyrogenes, ballum, djasiman, borincana y bataviae. Dicha distribución es diferente a la encontrada en
otros departamentos del Perú como: San Martín, Tingo María, Piura, Cuzco y Lambayeque11, demostrando la gran variabilidad de serovares entre las distintas regiones del Perú debido principalmente a diferencias ecológicas, ambientales y distribución de reservorios. No se encontraron anticuerpos contra el serogrupo Icterohaemorrhagiae, serogrupo principalmente asociado con formas graves de leptospirosis en otras áreas del país.
En nuestro estudio los serovares identificados en los canes fueron similares a los hallados en humanos, esto nos sugiere que los canes podrían ser potenciales diseminadores de leptospiras en estas poblaciones, ya que actuarían como intermediarios entre los reservorios naturales (roedores y marsupiales silvestres) y el hombre. Esto se podría confirmar a través de aislamientos de leptospiras en humanos y caninos para poder relacionarlos genéticamente.
Nuestro trabajo permitió identificar localidades dedicadas a la actividad minera en la provincia de Manu, departamento de Madre de Dios como zonas de alta endemicidad para leptospirosis. En estos lugares sería una de las causas principales del síndrome febril en la población; por ello, se justifican medidas de prevención, especialmente en brindar educación sanitaria a la población sobre los mecanismos de transmisión de la leptospirosis y los factores de riesgo asociados a la infección identificados en nuestro estudio (consumo de agua de río en el hogar, consumo de agua de río en el campo, contacto con canes y la actividad minera). Lo interesante del estudio es que se identificó el comporta-miento de la leptospirosis en este tipo de población, aunque lamentablemente no pudimos contar con los datos sobre el cuadro clínico al inicio de la enfermedad de cada persona.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen a las autoridades de la Dirección de Salud de Madre de Dios, profesionales de la salud del Centro de Salud Laberinto y a la población de las localidades de la provincia de Manu por su colaboración en el estudio. Al Dr. Víctor Suárez M. por su colaboración en la redacción y la Msc. Nancy Linares por el apoyo con el análisis estadístico. Asimismo, a los doctores Fernando Llanos, Leonid Lecca y José Velásquez por la revisión y corrección del manuscrito.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Vinetz JM. Leptospirosis. Curr Opin Infect Dis 2001; 14(5): 527-38 2. Faine S, Adler B, Bolin C, Perolat P. Leptospira and leptospirosis.
2nd ed. Melbourne: MediSci; 1999.
3. Trevejo RT, Rigau-Perez JG, Ashford DA, McClure EM, Jarquin-Gonzalez C, Amador JJ, et al. Epidemic leptospirosis associated
with pulmonary hemorrhage-Nicaragua, 1995. J Infect Dis 1998; 178(5): 1457-63.
4. O’Neil KM, Rickman LS, Lazarus AA. Pulmonary manifestations
of leptospirosis. Rev Infect Dis 1991; 13(4):705-9.
5. Sejvar J, Bancroft E, Winthrop K, Bettinger J, Bajani M, Bragg S, et al. Leptospirosis in «Eco-Challenge» athletes, Malaysian
Borneo, 2000. Emerg Infect Dis 2003; 9(6): 702-7.
6. Sarkar U, Nascimento SF, Barbosa R, Martins R, Nuevo H, Kalafanos I, et al. Population-based case-control investigation of
risk factors for leptospirosis during an urban epidemic. Am J Trop Med Hyg 2002; 66(5): 605-10.
7. Morgan J, Bornstein SL, Karpati AM, Bruce M, Bolin CA, Austin CC, et al. Outbreak of leptospirosis among triathlon participants
and community residents in Springfield, Illinois, 1998. Clin Infect Dis 2002; 34(12): 1593-9.
8. Haake D, Dundoo M, Cader R, Kubak B, Hartskeerl R, Sejvar J, et al. Leptospirosis, water sports, and chemoprophylaxis. Clin Infect
Dis 2002; 34(9): 40-3.
9. Liceras J, Valdivia S. Higuchi E. Leptospirosis en el Perú. En:
Anales Seminario Nacional Zoonosis y Enfermedad de Transmisión Alimentaria. 1989. p. 7-20.
10. Silva H, Tavares-Neto J, Bina J, Meyer R. Leptospiral infection
and subclinical presentation among children in Salvador, Bahia. Rev Soc Bras Med Trop 2003; 36(2): 227-33.
11. Céspedes M, Glenny M, Felices V, Balda L, Suárez V. Prueba de
ELISA indirecta para la detección de anticuerpos IgM para el diagnóstico de la leptospirosis humana. Rev peru med exp salud publica 2002; 19(1): 24-7.
12. Perra A, Servas V, Terrier G, Postic D, Baranton G, Andre-Fontaine G, et al. Clustered cases of leptospirosis in Rochefort,
France, June 2001. Euro Surveill 2002; 7(10): 131-6.
13. Phraisuwan P, Whitney E, Tharmaphornpilas P, Guharat S, Thongkamsamut S, Aresagig S, et al. Leptospirosis: skin wounds
and control strategies, Thailand, 1999. Emerg Infect Dis 2002; 8(12): 1455-9.
14. Campagnolo E, Warwick M, Marx H Jr, Cowart R, Donnell H Jr, Bajani M, et al. Analysis of the 1998 outbreak of leptospirosis in
Missouri in humans exposed to infected swine. J Am Vet Med Assoc 2000; 216(5): 676-82.
15. Tangkanakul W, Tharmaphornpil P, Plikaytis B, Bragg S, Poonsuksombat D, Choomkasien P, et al. Risk factors associated
with leptospirosis in northeastern Thailand, 1998. Am J Trop Med Hyg 2000; 63(3-4): 204-8.
16. Everard CO, Bennett S, Edwards CN, Nicholson GD, Hasell TA, Carrington DG, et. al. An investigation of some risk factors for
severe leptospirosis in Barbados. J Trop Med Hyg 1992; 95(1): 13-22.
17. Sasaki DM, Pang L, Minette H, Wakida CK, Fujimoto WJ, Manea SJ, et al. Active surveillance and risk factors for leptospirosis in
Hawaii. Am J Trop Med Hyg 1993; 48(1): 35-43.
18. Vanasco NB, Fusco S, Zanuttini JC, Manattini S, Dalla-Fontana ML, Prez J, et al. Outbreak of human leptospirosis after a flood in
Reconquista, Santa Fe, 1998. Rev Argent Microbiol 2002; 34(3): 124-31.
19. Sehgal SC, Sugunan AP, Vijayachari P. Outbreak of leptospirosis
after the cyclone in Orissa. Natl Med J India 2002; 15(1): 22-3.
20. Murhekar M, Sugunan A, Vijayachari P, Sharma S, Sehgal S.
Risk factors in the transmission of leptospiral infection. Indian J Med Res 1998; 107: 218-23.
Leptospirosis en febriles en Madre de Dios, Perú
Correspondencia: Manuel Céspedes Z. Centro Nacional de Salud
Pública.Instituto Nacional de Salud.
Dirección: Calle Cápac Yupanqui 1400, Lima 11, Perú. Teléfono: (511)4719920 Fax(511)4710179
Rev peru med exp salud publica 20 (4), 2003
METABOLISMO DE HIDRATO DE CLORAL EN RATAS CON
INSUFICIENCIA HEPÁTICA INDUCIDA POR
TETRACLORURO DE CARBONO
Luis Moreno E
1, Andrés Herrera C
2, Luz Oyola de Bardales
3, Jorge Arroyo A
4, Liliana Marrufo S
5INTRODUCCIÓN
El hidrato de cloral es un sedante hipnótico no barbitúrico, no benzodiazepínico, que es absorbido rápidamente en el tracto gastrointestinal, en el hígado y en los eritrocitos se convierte en metabolito activo tricloroetanol, el cual puede ser convertido a metabolitos inactivos. También es metabolizado directamente a metabolitos RESUMEN
Objetivo: Determinar el metabolismo del hidrato de cloral en ratas bajo condiciones normales y en ratas con insuficiencia hepática inducida con tetracloruro de carbono. Material y métodos: Se usaron ratas macho de la cepa Holtzman. El proceso de inducción de la insuficiencia hepática se realizó durante 3 días consecutivos; este efecto fue confirmado a través de cortes histológicos del hígado, administrándose luego hidrato de cloral por vía oral en ambos grupos. Posteriormente, se realizó el dosaje en plasma de tricloroetanol - metabolito activo del hidrato de cloral - por el método de cromatografía gaseosa con un detector de ionización de llama, realizándose la validación de dicho método. Resultados: Se encontró una diferencia significativa en la cantidad de tricloroetanol entre los grupos con y sin insuficiencia hepática. Se reporta los períodos de latencia, duración e intensidad del efecto del hidrato de cloral, en todos los grupos en estudio. Conclusiones: El metabolismo del hidrato de cloral se encuentra alterado en los grupos con insuficiencia hepática, el nivel de alteración del metabolismo puede ser cuantificado a través del dosaje de tricloroetanol, el cual fue realizado optimizando un método existente.
Palabras clave: Hidrato de Cloral/metabolismo; Insuficiencia Hepática; Cromatografía de Gases; Ratas. (fuente: BIREME) ABSTRACT
Objective: To determine the metabolism of chloral hydrate in normal rats and in rats with carbon tetrachloride-induced hepatic impairment. Material and methods: Holtzman male rats were used; the process for hepatic impairment induction was performed for three consecutive days, and this condition was confirmed through histological examination of liver samples. After the aforementioned procedure, chloral hydrate was administered orally to both groups. Then, plasma trichloroethanol – an active metabolite of chloral hydrate - was determined using gas chromatography with a flame ionization detector, and this method was validated. Results: There was a significant difference on plasma levels of trichloroethanol in rats with and without hepatic impairment. Latency period, duration and intensity of chloral hydrate effects were recorded in both groups studied. Conclusions: Chloral hydrate metabolism is altered in rats with hepatic impairment; and the level of hepatic impairment may be quantified through thichloroetanol determination, a procedure performed optimizing an available method.
Key words: Chloral hydrate/metabolism; Liver Failure; Gas Chromatography; Rats. (source: BIREME)
inactivos. El inicio de la acción cuando su administración es por vía oral se presenta a los 30 minutos, y dura aproximadamente entre 4 y 8 h. Su eliminación es principalmente a través de la vía renal aproximadamente 40% de la dosis se excreta en 24 h. La vida media del metabolito activo, tricloroetanol, es entre 7 y 10 h. Aproximadamente, entre 35 y 41% se une a las proteínas plasmáticas1.
En la presente investigación se ha estudiado el hidrato de cloral, medicamento utilizado principalmente en la población pediátrica como adyuvante de la anestesia y sedante hipnótico para ciertos procedimientos médicos y dentales. A pesar de las preocupaciones de la seguridad en el uso del hidrato de cloral, este sigue siendo usado en la población pediátrica. Recientemente se intentó desplazar al hidrato de cloral por el uso de benzodiazepinas 1División de Química, Centro Nacional de Control de Calidad,
Instituto Nacional de Salud. Lima, Perú.
2División de Microbiología, Centro Nacional de Control de Calidad, Instituto Nacional de Salud. Lima, Perú.
3Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Lima, Perú.
4Facultad de Medicina, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Lima, Perú.
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(midazolam, diazepam, triazolam, temazepan, lorazepan), de ellas el midazolam es la de mayor uso; sin embargo, se ha demostrado que las benzodiazepinas no son grandes agentes hipnóticos en la población pediátrica2-4. La dosis pediátrica usual, como sedante hipnótico, es entre 30 y 50 mg/kg/peso hasta un máximo de 1 g como dosis única5,6. La razón de utilizar ratas con insuficiencia hepática es porque una de las contraindicaciones para el uso de este medicamento es el daño hepático severo. Con el presente trabajo se pretende obtener datos que ayuden a un mejor conocimiento y manejo de este medicamento, permitiendo realizar un dosaje en fluidos biológicos del metabolito activo, tricloroetanol, en el caso de una sobredosis por hidrato de cloral. El objetivo fue evaluar su metabolismo en ratas bajo condiciones normales y con insuficiencia hepática.
MATERIAL Y MÉTODOS
Es un estudio experimental, controlado.
ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN
Se usaron 56 ratas macho de 12 semanas de edad de la cepa Holtzman provenientes del Centro Nacional de Producción de Biológicos, todos los animales de cada grupo pertenecieron a la misma camada, con un peso promedio de 250 g.
Estas ratas fueron colocadas en jaulas individuales con una temperatura ambiental controlada que osciló entre 16°C y 21°C. El alimento basado en torta de soya proveniente de la Universidad Agraria La Molina y agua a discreción de los animales (ad libitum).
REACTIVOS QUÍMICOS
Hidrato de cloral (100%) (Carlo Erba), tricloroetanol (99%) (Aldrich), 2,2 dicloroetanol (99%) (Aldrich), acetona (Merck), eter dietílico (Merck), tetracloruro de carbono (Merck), ketamina (Abbott), kit de diagnóstico de transaminasas (Diagno Test), kit de diagnóstico de proteínas totales (Wiener Lab.), kit de diagnóstico de bilirrubina (Wiener Lab.), kit de diagnóstico de fosfatasa alcalina (Diagno Test).
EQUIPOS
Se usó un cromatógrafo de gases Hewlett-Packard modelo 5890, equipado con un detector de ionización de llama (FID), una columna Carbowax 30 m x 250mm, un integrador HP 3398A y un espectrofotómetro Spectronic 20D.
DISEÑO EXPERIMENTAL
Se formaron 4 grupos, bajo el esquema de trabajo que se muestra en la tabla 1.
Tabla 1. Grupos de trabajo del diseño experimental.
Grupo Tratamiento Nº Ratas Período de latencia/ duración/ Hidrato de cloral
intensidad del efecto
1 Control sin insuficiencia hepática 8 —- Suero fisiológico
2 Control con insuficiencia hepática 8 —- No recibió
3 Con insuficiencia hepática más hidrato de cloral 8 X Recibió
4 Sin insuficiencia hepática más hidrato de cloral 8 X Recibió
Total 32
Determinación de enzimas hepáticas y proteínas totales
En el grupo 1 se aplicó suero fisiológico (0,8 mL/kg/peso) por 3 días consecutivos. En los grupos 2 y 3 se indujo una insuficiencia hepática inyectándose por vía intraperitoneal tetracloruro de carbono (0,8 mL/kg/peso) durante 3 días consecutivos. En el cuarto día, a los grupos 3 y 4 se les administró por vía oral 50 mg/kg/peso de hidrato de cloral en solución1. Ese mismo día y luego de 1 h de haber administrado el hidrato de cloral a los grupos 3 y 4; a todos los grupos se les aplicaron ketamina (45mg/kg/peso) vía IM, luego se les extrajo sangre por punción cardíaca7, la sangre fue colectada en tubos heparinizados y centrifugada a 3 000 g8. El plasma obtenido de los grupos 1 y 2 fue usado para realizar el perfil hepático que incluyeron las siguientes pruebas: Transaminasas (GOT/GPT) (Método enzimático con 2,4 dinitrofenilhidrazina)9, fosfatasa alcalina (Método enzimático con p-nitrofenil fosfato)10, proteínas totales (Método colorimétrico con EDTA/cobre)11 y bilirrubina (Método colorimétrico con ácido sulfanílico/diazotado)12.
Cortes histológicos
Una vez realizado el perfil hepático, se sacrificaron a los animales del grupo 1 y 2 por el método de desnucamiento, se les extrajo el hígado y se realizaron cortes histológicos de los hígados con y sin insuficiencia hepática. Para su estudio se usó la tinción de hematoxilina-eosina.
Determinación de tricloroetanol-metabolito activo-(Modificado por Humbert, 1994)13
El plasma obtenido de los grupos 3 y 4 se usó para el dosaje del metabolito activo tricloroetanol (TCE) por cromatografía gaseosa13, realizándose modificaciones al método, las cuales se validaron utilizando los siguientes parámetros: precisión, linearidad, sensibilidad y límite de detección14, siguiendo los lineamientos del Internacional Conference Harmonization (ICH), para la validación de procedimientos analíticos15. El análisis se realizó a una temperatura del horno entre 90°C y 180°C en rampa, según el esquema de la figura 1.
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Figura 1. Programación de la temperatura.
Tiempo total : 27 minutos
Flujo : 1,57 mL/min
Gas : Nitrógeno
Límite de detección : 1 ppm (aprox.) 180ºC (10 minutos)
5ºC/minuto 150ºC(1 minutos)
10ºC/minuto 90ºC x 4 minutos
El tricloroetanol puede ser medido en el plasma después de una extracción con éter dietílico usando 2,2 dicloroetanol como estándar interno, el cual fue agregado tanto al estándar como a las muestras desconocidas, para realizar el análisis cromatográfico final.
Antes de iniciar los análisis, se realizaron modificaciones (Figura 2) a las condiciones de trabajo señaladas para asegurar la robustez del método:
210ºC (10 minutos) 10ºC/minuto 150ºC (10 minutos) 10ºC/minuto 35ºC x 7 minutos Columna : Supelcowax 10,6m x 0,25µm Flujo : 1,58 mL/minutos
Figura 2. Modificaciones a las condiciones de trabajo.
Manteniéndose tiempos similares de retención del estándar y de la muestra lo cual demuestra la robustez del método
Figura 4. Cromatograma de la muestra. Tiempo de retención 30,993 minutos.
Figura 3. Cromatograma del estándar. Tiempo de retención 30,928 minutos.
En cromatografía gaseosa los elementos más importantes son: el área del pico y el tiempo de retención. La desviación estándar relativa de las áreas de los picos no deberá exceder el 2% y la desviación estándar relativa de los tiempos de retención no debe sobrepasar el 1%16 (Tabla 2).
para detectar el metabolito, aún cuando se introduzcan modificaciones al método (Figura 3 y 4).
Una vez evaluada la robustez del método, se procedió a determinar otros parámetros para la validación de la técnica: precisión, linearidad, sensibilidad y límite de detección.
Precisión. Los parámetros de calidad de la precisión son
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Tabla 2. Áreas y tiempos de retención del estándar de tricloroetanol.
Parámetros Áreas Concentración Tiempo de retención
del estándar (minutos)
A1 187 0,0025344 mg/mL 30,923 A2 189 idem 30,928 A3 192 idem 30,945 Promedio 189,33 —- 30,932 D.S. Absoluta 2,52 D.S. Absoluta 0,012 D.S. Relativa 1,33 D.S. Relativa 0,037 C.V. 1,33% C.V. 0,037%
Linearidad. La linearidad del área del pico (y) /
concentración de TCE mg/mL (x) de las diluciones fue 0,006 para un área del pico 141, 0,06 para 1266, 0,13 para 2536 y 0,32 para un área de 6 977. Entonces: Sm = 189,33 + 3 (2,52) = 196,89 196,89 - 189,33 Cm = = 7,58 ppm 0,9976 (0,00758mg/mL)
Una vez validado el método, las muestras de plasma de los grupos 3 y 4, se mantuvieron congeladas a - 20°C, para la determinación de tricloroetanol se procesaron a través del siguiente flujo:
0,5 mL plasma
+ 16mg 2,2 Dicloroetanol (Estándar interno) (EI) PLASMA + EI
5mL Éter dietílico. (Mezclar agitando 1') Separar fase orgánica
2 uL (Inyectar en cromatógrafo de gases)
Cálculos
Concentración de Am Cs Tricloroetanol = x x D (mg/mL) As Vm
Donde: Am (área del pico de tricloroetanol en la muestra), As (área del pico de tricloroetanol en el estándar), Cs (Concentración de tricloroetanol en el estándar, mg/mL), D (Factor de dilución), Vm (Volumen de la muestra, mL).
Determinación del período de latencia, duración del efecto e intensidad (Leve, moderado y severo)
Luego de administrar el hidrato de cloral a los grupos 3 y 4 se registró el período de latencia, la duración y la intensidad del efecto, considerándose 3 grados de intensidad: leve, cuando el animal presentó ataxia; moderado, ataxia y salivación excesiva y, severa: ataxia, salivación excesiva y pérdida de movimiento.
La concentración y la señal de medición en el ámbito comprobado están en una relación lineal, ya que todos los puntos están en una recta y el coeficiente de correlación es r = 0,9971 (Figura 5).
Sensibilidad. Por definición, la sensibilidad de calibración,
según la International Union of Pure and Applied Chemists (IUPAC), es la pendiente de la curva de calibración a la concentración de interés.
S = 0,997
Límite de detección. Cantidad mínima posible de ser
detectada fue obtenida a través de la siguiente fórmula: Sm = Sst + KSst
Sm - Sst Cm =
m Donde:
Sm = Mínima señal analítica distinguible Sst = Señal media del estándar
K = 3 (nivel de confianza de la detección mínimo 89%) Sst = Desviación estándar del estándar.
Cm = Límite de detección.
m = Pendiente de la curva de calibración.
Metabolismo de hidrato de cloral en ratas
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RESULTADOS
DETERMINACIÓN DE ENZIMAS HEPÁTICAS Y PROTEÍNAS TOTALES
La determinación de la inducción de insuficiencia hepática es condición previa necesaria para la comparación del
metabolismo en ambos grupos, las tablas 3 y 4 muestran los resultados del dosaje de las enzimas hepáticas y proteínas totales en los grupos 1 y 2 (sin y con insuficiencia hepática), en el grupo con insuficiencia hepática se observa una alteración significativa de transaminasas y fosfatasa alcalina.
Grupo 1 S/INSF Aspartato Amino- Alanina Amino- Bilirrubina total Proteínas Fosfatasa alcalina
Hepática transferasa transferasa mg/dL totales UI/L
(n = 8) UI/L UI/L g/dL
*Valores normales 46 – 81 18 - 30 0,3 - 1,3 4,7 - 8,2 0,8 - 3,0
Promedio 78,02 31,75 0,92 5,93 1,74
Desv.St. 3,02 02,25 0,13 0,43 0,09
Tabla 3. Resultados del grupo 1. Sin insuficiencia hepática.
DETERMINACIÓN DE TRICLOROETANOL
En la tabla 5 se presentan los resultados obtenidos en las muestras ensayadas. Los resultados muestran un mayor metabolismo del hidrato de cloral en las ratas normales frente a las ratas con insuficiencia hepática, evidenciado por la mayor concentración del metabolito activo en el plasma.
Grupo 2 C/INSF Aspartato Amino- Alanina Amino- Bilirrubina total Proteínas Fosfatasa alcalina
Hepática transferasa transferasa mg/dL totales UI/L
(n = 8) UI/L UI/L g/dL
*Valores normales 46 – 81 18 - 30 0,3 - 1,3 4,7 - 8,2 0,8 - 3,0
Promedio 151,00 86,38 1,30 6,50 4,06
Desv. St. 2,51 02,67 0,11 0,45 0,58
*Fuente: Guide to the care and use of experimental animals Vol. 1 - Canadian Council on Animal Care 198417 Tabla 4. Resultados del grupo 2. Con insuficiencia hepática.
Tabla 6. Resultados en los grupos 3 y 4 luego de la administración de hidrato de cloral.
Grupos Dosis de Intensidad
(n=8) hidrato de cloral medida
Edad Sexo Peso (g) Período de Duración del
(meses) latencia (minutos) efecto (minutos)
50 mg/ kg/peso(mL)
3 3 M 251,3 1,26 16 12,5 ++
4 3 M 249,1 1,25 13,4 15,8 ++
Intensidad de efecto: Leve (+) Moderado (++) Severo (+++)
DETERMINACIÓN DEL PERÍODO DE LATENCIA, DURACIÓN E INTENSIDAD DEL EFECTO
En la tabla 6 se presenta un resumen de las observaciones realizadas a los grupos de trabajo 3 y 4, luego de la administración del hidrato de cloral.
Tabla 5. Concentración de TCE en las muestras según grupos de experimentación.
Muestras Concentración TCE mg/mL
Grupo 3
Muestra sin insuficiencia hepática más hidrato de cloral 0,0989 Grupo 4
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CORTES HISTOLÓGICOS (COLORACIÓN CON HEMATOXILINA-EOSINA)
Se realizaron cortes histológicos de los hígados de las ratas sin y con insuficiencia hepática, notándose una diferenciación celular de los hepatocitos entre los hígados sanos y enfermos. En la figura 6, se muestra el hígado sano (control), la figura 7 muestra las células con esteatosis. Estos resultados confirman los resultados de las pruebas bioquímicas y permiten afirmar que las ratas presentaban insuficiencia hepática al momento de dosar el tricloroetanol.
hepática y con insuficiencia hepática, esto tal vez se deberá a que el daño que provoca el tetracloruro de carbono involucra principalmente a los hepatocitos y no a los conductos biliares, presentándose éste último caso con otro tipo de sustancias como, por ejemplo, el paraquat18. En el caso de proteínas totales no hubo diferencia significativa en ambos grupos. El nivel sérico de fosfatasa alcalina se incrementó en el grupo con insuficiencia hepática, con respecto al grupo sin insuficiencia hepática como fue reportado por Verschoyle y colaboradores19 con el 1-Nitronaftaleno.
Se ha observado que usando diclorobenceno como inductor de insuficiencia hepática produce un aumento de transaminasas, bilirrubina, incremento en el peso del hígado además de alteraciones renales22.
En nuestro estudio el incremento significativo de transaminasas, bilirrubina total y fosfatasa alcalina, demuestra una alteración de la función hepática, hecho que es corroborado con los cortes histológicos realizados. Los exámenes de rutina a la función hepática: transaminasas, fosfatasa alcalina, bilirrubina, proteínas, asociados a los cortes histológicos permiten dar un diagnóstico diferencial en enfermedades hepáticas. El incremento de las transaminasas es indicativa de daño hepatocelular y es consistente con varias formas de hepatitis incluyendo la esteatohepatitis. La elevación de bilirrubina es indicativa entre otros de la reacción a medicamentos18. El aumento de los principales parámetros hepáticos es concordante con estudios realizados en ratas19, 21-22.
En los métodos para la determinación de tricloroetanol por cromatografía gaseosa descritos por Ogata y Saeki23 y Breimer24 no se usó el estándar interno, mientras que Garret y Lambert25 usaron dos estándares internos
simultáneamente. El método empleado requiere un estándar interno, se basa en la extracción con éter dietílico, la inyección directa de la capa orgánica y la detección con el detector de llama (Flame Ionization Detector FID), que lo convierte en uno de los métodos más prácticos para ser implementados en los laboratorios analíticos. Otros métodos usan la técnica cromatográfica head - space24 o requieren
varias extracciones con éter dietílico23 o también éter25.
El procedimiento fue específico, no hubo interferencia de picos en la misma región. El límite de detección para tricloroetanol se encuentra muy cercano al reportado por Ogata y Saeki23.
El procedimiento es rápido y suficientemente sensible para medir en plasma los niveles de tricloroetanol luego de la administración de hidrato de cloral. También puede ser aplicado a la medición de los metabolitos de tricloroetileno, en el caso de una intoxicación aguda. El ensayo de cromatografía gaseosa (GC) muestra buena sensibilidad, reproducibilidad y selectividad. Tiene la ventaja de ser conveniente, rápido y sensible al usar un detector de tipo universal - responde a todos los compuestos.
DISCUSIÓN
Con respecto al dosaje de enzimas hepáticas y proteínas totales, los niveles séricos de transaminasas glutámico pirúvica (TGO) y transaminasas glutámico oxalacética (TGP) en las ratas sin insuficiencia hepática, se encuentran en el límite superior de los valores normales, y en las ratas con insuficiencia hepática, se encuentran aumentados, esto ocurre con sustancias como la D-galactosamina que induce insuficiencia hepática20. Los valores de bilirrubina total en ambos grupos estuvieron dentro de los valores normales, pero se observa una diferencia significativa entre el grupo sin insuficiencia Figura 6. Corte histológico de hígado de rata, muestra células normales que rodean tanto a la vena periportal (VP) como a la vena central (VC). Coloración con hematoxilina 115X.
Figura 7. Corte histológico de hígado de rata, muestra la esteatosis a nivel central, inducido por tetracloruro de carbono. Coloración con hematoxilina 115X.
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6. American Academy of Pediatrics Committee on Drugs and Committee on Environmental Health. Use of chloral hydrate for sedation in children. Pediatrics 1993; 92(3): 471-3 7. Working Group European Associations on Animal Health
in the Laboratory. Blood extraction in mammals and birds in the laboratory. United Kingdom: FELASA; 1995.
8. Lynch MJ, Rápale SS, Mellor LD, Spare PD, Inwood MJH. Métodos de laboratorio. 3a ed. México, D.F: Interamericana; 1991.
9. Bishop M, Duben-von Laufen J, Fody E. Clinical chemistry: principles, procedures, correlations. Philadelphia: J.B Lippincott Co; 1985.
10. Bauer J. Clinical laboratory methods. Saint Louis: Mosby Co; 1982.
11. Doumas BT, Watson WA, Biggs HG. Albumin standards and the measurement of serum albumin with bromocresol green. Clin Chim Acta 1971; 31(1): 87-96.
12. Botwell J. Bilirrubin quantification. Clin Chem 1964; 10(3): 197 13. Humbert L. Determination of chloral hydrate and its metabolites (trichloroetanol and trichloroacetic acid) in human plasma and urine using electron capture gas chromatography. Biomed Chromatogr 1994; 8(6): 273-7
14. Skoog L. Análisis Instrumental. 4a ed. Madrid. Mc Graw Hill; 1994.
15. International Conference on Harmonization. Harmonised tripartite guideline: Validation of analytical procedures: Methodology topic Q 2B. CPMP/ICH/281/95 Adopted december 1996; Step 4, Consensus Guideline.
16. Colin F, Sheila A. Contemporary practice of Chromatography. 2a ed. Madrid: Mc Graw Hill; 1995.
17. Canadian Council on Animal Care. Guide to the care and use of experimental animals. Vol. 2 2nd ed. Ontario: CCAC; 1993.
18. Sternberg S. Non neoplasic liver disease. Philadelphia. J.B Lippincott Co; 1999.
19. Verschoyle R, Carthew P, Wolf C, Dindsdale D. 1-Nitronaphthalene toxicity in rat lung and liver: effects of inhibiting and inducing cytochrome P450 activity. Toxicol Appl Pharmacol 1993; 122(2): 208-13.
20. Maezono K, Mawatari K, Kajiwara K, Shinkai A, Maki T. Effect of alanine on D-galactosamine - induced acute liver failure in rats. Hepatology 1996; 24(5): 1211-6.
21. Valentovic MA, Lo H, Brown P, Rankin G. 3,5-Dichloroaniline toxicity in Fischer 344 rats pretreated with Inhibitors and inducers of Cytochrome P450. Toxicol Lett 1995; 78(3): 207-14.
22. Valentovic MA, Ball JG, Anestis D, Madan E. Modification of p450 activity and its effect on 1,2 - dichlorobenzene toxicity in Fischer 344 rats. Toxicology 1993; 24; 79(3): 169-80. 23. Ogata M, Saeki T. Measurement of chloral hydrate,
trichloroethanol, trichloroacetic acid and monochloroacetic acid in the serum and the urine by gas chromatography. Int Arch Arbeitsmed 1974; 33(1): 49-58.
24. Breimer DD, Ketelaars HCJ, van Rossum JM. Gas chromatographic determination of chloral hydrate, trichloroethanol and trichloroacetic acid in blood and in urine employing head-space analysis. J Chromatogr 1974; 88: 55-63.
25. Garrett ER, Lambert HJ. Gas chromatographic analysis of trichloroethanol, chloral hydrate, trichloroacetic acid, and trichloroethanol glucuronide. J Pharm Sci 1966; 55(8): 812-7. Este método puede ser aplicado a los análisis de muestras
de pacientes intoxicados con hidrato de cloral o tricloroetileno, además puede ser aplicable a estudios farmacocinéticos en humanos.
Los resultados obtenidos muestran una diferencia significativa en los niveles de tricloroetanol en los grupos sin insuficiencia hepática y con insuficiencia hepática, lo cual puede deberse a un mejor metabolismo en el primer grupo de animales. El período de latencia, duración del efecto e intensidad el promedio de duración del efecto de hidrato de cloral fue ligeramente superior en el grupo sin insuficiencia hepática con respecto al grupo con insuficiencia hepática. La intensidad moderada del efecto fue similar en ambos grupos. El promedio del período de latencia fue más corto en el grupo sin insuficiencia hepática frente al grupo con insuficiencia hepática. Entonces podemos afirmar que en el grupo sin insuficiencia hepática el metabolismo del hidrato de cloral es el más óptimo y rápido.
El tetracloruro de carbono (TCC) provoca daño al hígado desde un simple cambio graso a cirrosis. La manifestación más temprana y común es un cambio graso macrovesicular reversible. El cambio más importante es el esteatohepatitis no alcohólica (NASH). El tetracloruro de carbono provoca una esteatosis, acumulación de grasa, que tiende principalmente a ser centrilobular, en oposición a una localización periportal en proceso como cirrosis biliar primaria u obstrucción biliar. El predomino central o centrilobular del daño hepatocelular con tricloroetanol puede originar una fibrosis centrilobular, y finalmente una cirrosis18. Se demostró insuficiencia hepática en las ratas al administrárseles tetracloruro de carbono por vía intraperitoneal durante 3 días evidenciado por un perfil hepático alterado y por lesiones histológicas. Se observó que existe diferencia en el metabolismo del hidrato de cloral en las ratas con y sin insuficiencia hepática, notándose mayores niveles séricos de tricloroetanol - metabolito activo del hidrato de cloral - en las ratas normales. Los períodos de latencia más cortos y la duración del efecto más prolongado son característicos de las ratas normales. La intensidad del efecto fue la misma en las ratas con y sin insuficiencia hepática.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. United States Pharmacopeia Dispensing Information (USP DI). Drug information for the health care professional Vol. 1. 13th ed. Englewood (US): Micromedex, Inc; 1993.
2. Steinberg AD. Should chloral hydrate be banned? Pediatrics 1993; 92(3): 442-6
3. Malis DJ, Burton DM. Safe pediatric outpatient sedation: the chloral hydrate debate revisited. Otolaryngol Head Neck Surg 1997; 116 (1): 53-7
4. Mc Carver-May DG, Kang J, Aouthmany A, Elton RE, Mowery JL, Slovis TL, et al. Comparison of Chloral hydrate and midazolam for sedation of neonates for neuroimaging studies. J Pediatr 1996; 128(4): 573-6.
5. United States Pharmacopeia Dispensing Information (USP DI). Approved drug products and legal requirements Vol. 3. 19th ed. Englewood (US): Micromedex, Inc; 2000.
Correspondencia: Luis Moreno E. Centro Nacional de Control de Calidad.
Instituto Nacional de Salud.
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Rev peru med exp salud publica 20 (4), 2003
RESUMEN
Objetivo: Evaluar serológicamente una proteína recombinante de 66 kDa (Er66) de una cepa del virus de la fiebre amarilla aislada en el Perú usando anticuerpos inmunoreactivos. Material y métodos: La proteína Er66 fue expresada in vitro en la bacteria Escherichia coli y enfrentada a títulos de 1/100, 1/50 y 1/25 de anticuerpos monoclonales, y a sueros con anticuerpos IgM e IgG inmunoreactivos contra el virus de la fiebre amarilla mediante ensayos de Western blot (WB). Asimismo, se evaluaron proteínas totales de las cepas de referencia del virus dengue (DEN) y fiebre amarilla como controles de antigenicidad. Resultados: La proteína recombinante Er66 presentó antigenicidad contra títulos de 1/50 y 1/25 de anticuerpo monoclonal (MAB8701); sin embargo, no se observó inmunoreactividad en sueros positivos para fiebre amarilla y dengue. Los ensayos con extractos crudos de la cepa de fiebre amarilla Asibi 17D (PTFA) revelaron que la antigenicidad de las proteínas virales comprendidas entre 60 y 80 kDa fue afectada negativamente a temperaturas desnaturalizantes de 100°C. En cambio, tratamientos con ß-mercaptoetanol sin calor generó un aumento de la antigenicidad de dichas proteínas. Siguiendo este mismo principio, la proteína Er66 fue sometida a tratamientos desnaturalizantes con ß-mercaptoetanol sin incluir calor y fue enfrentada nuevamente a los sueros reactivos. El resultado final reveló que la proteína Er66 generó inmunoreactividad frente a sueros con altos títulos de anticuerpos IgM e IgG para fiebre amarilla mientras que en otras muestras se observó una débil señal. Conclusiones: Los datos obtenidos en este trabajo demuestran que la Er66 pudo ser reconocida por anticuerpos IgM e IgG específicos para fiebre amarilla presentes en sueros de pacientes infectados. Los datos presentados en este artículo sugieren el uso de proteínas recombinantes como posibles candidatas de valor diagnóstico para la FA.
Palabras clave: Virus de la fiebre amarilla; Serología; Proteínas Recombinantes; Anticuerpos Monoclonales; Perú (fuente: BIREME)␣
ABSTRACT
Objective: To assess a 66kDa (Er66) recombinant protein of yellow fever (YF) virus using immunoreactive antibodies. Material and methods: Er66 was expressed in Escherichia coli and then it was challenged against 1/100, 1/50 and 1/25 monoclonal antibodies containing dilutions, and against clinical sera containing specific IgM and IgG antibodies against YF virus using western blot assay. Likewise, total protein content from yellow fever virus and Dengue (DEN) virus were also tested as antigenicity control. Results: Er66 recombinant protein showed antigenicity against 1/50 and 1/25 titers of monoclonal antibodies (MAB8701); however, no immunoreactivity was observed in sera positive for yellow fever and dengue infections. Serological assays with crude extracts of 17D Asibi yellow fever virus strain revealed that antigenicity of 60 – 80 kDa viral proteins was abrogated at 100 °C (denaturizing temperature). In contrast, when total protein was subjected to b-mercaptoethanol treatments without heat, the antigenicity increased. Using this principle, ER66 protein was reduced under b-mercaptoethanol treatment and it was newly challenged to reactive sera. The final result revealed that Er66 generated immunoreactivity in sera with high titers of IgM and IgG antibodies for yellow fever, while other samples showed a weak immunoreactivity signal. Conclusion: This study shows that Er66 was recognized by specific IgM and IgG yellow fever antibodies from clinical samples of infected patients. The data presented in this study suggest the use of recombinant proteins as possible candidates with a diagnostic value for yellow fever.
Key words: Yellow fever virus; Serology; Recombinant Proteins;␣ Monoclonal Antibodies; Peru (source: BIREME)
EVALUACIÓN SEROLÓGICA DE UNA PROTEÍNA RECOMBINANTE A
PARTIR DE UNA CEPA AISLADA DEL VIRUS DE LA FIEBRE AMARILLA
EN EL PERÚ: UN ESTUDIO PILOTO
Carlos Yábar V
1, Juana Choque P
1, Ysabel Montoya P
2INTRODUCCIÓN
La fiebre amarilla (FA) es una enfermedad febril hemorrágica de origen viral transmitida al hombre a través de la picadura de mosquitos vectores de los géneros
Aedes, Sabethes o Haemagogus1.
El agente causal es un virus de ARN que presenta un genoma de aproximadamente 11 Kb, el cual codifica 10 proteínas diferentes2. Las tres primeras proteínas conocidas como C, M y E son de tipo estructural y forman
parte de la envoltura y la cápside del virus. Las siete últimas, son de tipo no estructural y están involucradas en procesos de ensamblaje, maduración y replicación del virus3, 4,5. Con respecto a la proteína de la envoltura (E) del virus se han reportado distintos pesos moleculares que bordean entre 49 KDa6, 7, 54 KDa 8, 9 y 65 KDa10. Estos tamaños podrían deberse al número variable de glicosilaciones entre aislamientos de diferentes regiones, y al grado de maduración de la proteína durante el ensamblaje del virus8. De otro lado, es importante señalar que la proteína E es la primera proteína viral reconocida por los anticuerpos del hospedero durante la primera etapa de la infección viral11. 1División de Biología Molecular. Centro Nacional de Salud Pública.
Instituto Nacional de Salud. Lima, Perú.
Rev peru med exp salud publica 20 (4), 2003 Yábar C. y col.
Así, diversos trabajos han demostrado que esta proteína tiene características antigénicas e inmunogénicas muy importantes6. Estas propiedades guardan relación con la presencia de los tres dominios epitópicos A, B y C que fueron encontrados en diferentes flavivirus12. Adicionalmente, dos epítopes discretos fueron localizados en el dominio I (posiciones 155 y 158) de la proteína E de la cepa 17D13.
Si bien es cierto que las características antigénicas de la proteína E anteriormente mencionadas corresponden netamemente a la proteína nativa, se ha visto que la forma recombinante de la proteína expresada mediante ingeniería genética, conserva la misma naturaleza antigénica e inmunogénica14. De hecho, algunos autores han realizado la expresión de esta proteína en combinación con otras proteínas del virus con el fin de realizar ensayos de protección inmunológica en animales de experimentación. Dichos estudios se llevaron a cabo en sistemas de vaccinia y baculovirus demostrando que los niveles de protección generados principalmente por la proteína E recombinante fueron muy similares a los obtenidos con el virus 17D atenuado15,16. Estas mismas propiedades fueron detectadas a partir de proteínas recombinantes no estructurales de la cepa 17D17, 18.
La antigenicidad de la proteína E recombinante de diferentes flavivirus también fue evaluada frente a sueros de pacientes mediante ensayos serológicos. Al respecto se demostró que la proteína truncada de la envoltura (E) del serotipo dengue 4 carente de la porción carboxiterminal, había presentado mayor especificidad para inducir reactividad frente a sueros de pacientes con dengue que con pacientes con encefalitis japonesa19. Otro trabajo demostró que antígenos recombinantes de prM y E del virus de la encefalitis japonesa habían generado inmunoreactividad por anticuerpos de pacientes voluntarios en ensayos de ELISA de captura de IgM (MAC-ELISA), de manera tal, que estos antígenos podían reemplazar a las proteínas nativas normalmente usadas en este tipo de ensayo serológico20. Posteriormente, se encontró un dominio B de la E a partir del serotipo dengue 2, el cual había sido fuertemente reconocido por anticuerpos de sueros de pacientes peruanos e indonesios21.
Se debe considerar que actualmente se encuentra disponible un reactivo de diagnóstico para dengue basado en ensayos de inmunocromatografía. Esta prueba usa la porción N-terminal de la proteína recombinante de la envoltura de los cuatro serotipos de dengue y presenta una sensibilidad y especificidad de 90% y 86%, respectivamente22.
En síntesis, estos trabajos demuestran que la proteína recombinante E de dengue y encefalitis japonesa presenta características antigénicas con valor diagnóstico serológico específico para dichas enfermedades.
Es importante señalar que para el caso del virus de la fiebre amarilla, no se han reportado trabajos similares en los cuales se haya evaluado las propiedades antigénicas de la proteína recombinante de la envoltura como potencial herramienta de diagnóstico. Asimismo, no existen informes en los que se haya expresado y evaluado serológicamente alguna proteína recombinante a partir de aislamientos virales realizados en el Perú.
En ese sentido, el objetivo de este trabajo es realizar la evaluación serológica de una proteína recombinante denominada Er66 utilizando un panel de sueros inmunológicamente reactivos a fiebre amarilla. Este trabajo es el primer reporte en el que se evalúa una proteína recombinante expresada in vitro a partir de aislamientos de cepas del virus de la fiebre amarilla realizados en el Perú.
MATERIAL Y MÉTODOS
PROTEÍNA RECOMBINANTE
El presente trabajo es un estudio piloto, de diseño descriptivo en el que se evaluó una proteína recombinante correspondiente al antígeno de la envoltura (Er66) del virus de la fiebre amarilla proveniente del departamento de San Martín en el año 1999. De acuerdo con los análisis previos realizados en la secuencia de aminoácidos, la proteína Er66 correspondió a la porción carboxiterminal de la proteína de la envoltura abarcando aproximadamente 337 aminoácidos23. La cepa viral de la cual se sintetizó la proteína fue proporcionada por la División de Virología, Centro Nacional de Salud Pública del Instituto Nacional de Salud.
ANTÍGENOS TOTALES
Se evaluaron proteínas totales de la cepa Asibi 17D del virus de la fiebre amarilla. También fueron incluidos en el estudio, lisados de cultivo viral de la cepa viral aislada en Ayacucho en el año 1978. Por otro lado, proteínas totales del serotipo dengue 1 de referencia (cepa Singapur) y serotipo dengue 1 aislado en Tumbes fueron evaluados como controles de especificidad.
ANTICUERPOS MONOCLONALES Y FLUÍDO ASCÍTICO DE RATÓN HIPERINMUNIZADO
El fluído ascítico de ratón hiperinmunizado (FARH) y dos anticuerpos monoclonales: MAB984 (Chemicon) y 2D12, proporcionado por el Naval Medical Research Institute Detachment (NAMRID), fueron usados para la determinación de la antigenicidad de las proteínas totales del virus de la cepa vacunal Asibi 17D y Er66. Asimismo, se usó como control el anticuerpo monoclonal MAB8701 (Chemichon) específico para el serotipo dengue 1.
SUEROS CONTROLES
Un panel de veinte (n = 20) muestras serológicas humanas fueron empleados para la evaluación de la proteína Er66 (Tabla 1B). Ocho (n=8) de los sueros correspondieron a pacientes con altos títulos de anticuerpos IgM contra fiebre amarilla según ensayos previos de MAC-ELISA, mientras que cuatro (n=4) tuvieron títulos altos tanto para IgM e IgG. Es importante resaltar que una de las muestras positivas perteneció a un paciente con antecedente de vacunación antiamarílica con la cepa 17D. Los sueros controles de especificidad correspondieron a muestras con títulos altos de anticuerpos IgM (n=3) e IgG (n= 1) para dengue.
