Cabras de cuatro cuernos
Una deleción en un gen incrementa
la prolifi cidad de la Rasa Aragonesa
Vol. 9 núm.2 julio 2008
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SUMARIO
FOTOGRAFÍA DE PORTADA A. ABECIA EDITA SEOC COORDINADORALFONSO ABECIA MARTÍNEZ
MAQUETACIÓN, PUBLICIDAD Y DISTRIBUCIÓN
PASAJE MERCADER, 15 - 08008 BARCELONA TEL. 93 446 02 33 - FAX 93 215 51 15 [email protected] DEPOSITO LEGAL B-48160-2005 ISSN 1888-4865
4
SEOC informa
ARTÍCULOS TÉCNICOS
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Factores que afectan a los análisis físico-químicos y al diag-
nóstico en las muestra de leche de cabra
J. AMORES; A. SÁNCHEZ; D. SIERRA ; C. LUENGO ; A. GÓMEZ; J.C. CORRALES; C.DE LA FE; A. CONTRE-RAS; C. GONZALO
21
Las Indicaciones Geográfi cas Protegidas en el sector de los
pe-queños rumiantes españoles: Ternasco de Aragón
CONSEJO REGULADOR DE LA INDICACIÓN GEOGRÁFICA PROTEGIDA TERNASCO DE ARAGÓN
ARTÍCULOS DE INVESTIGACIÓN
24
Una deleción de 17 pares de bases en el gen BMP15 (ligado al
cromosoma X) incrementa la prolifi cidad en la raza ovina Rasa
Aragonesa
L. V. MONTEAGUDO, R. PONZ, M. T. TEJEDOR, A. LAVIÑA, I. SIERRA
32 Cabras de cuatro cuernos
(Cabras Políceras o “Multihorned goats”)
I. SIERRA; M. HERRERA; M.T. TEJEDOR; L.V. MONTEAGUDO
ESTUDIOS DE INTERÉS
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NOTAS DE PRENSA
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RESUMEN FOTOGRÁFICO
DE LAS
JORNADAS
TÉCNICAS SEOC
Primer grupo de Barbastro
Antonio (Felixcan) explicando en la explotacin de Colungo, cerca de Barbastro (Rasa Aragonesa)
Segundo grupo de Barbastro
Alguno de los asistentes a Barbastro
Juan Pedro (CEVA) hablando a los asistentes a Olmedo
Carlos Palacios en accin
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SEOC INFORMA
Los asistentes al primer grupo, en el CERSYRA de Valdepeas
En la explotacin de AGRAMA
Asistiendo a la demostracin prctica en el IFAPA de Hinojosa
Juan Pedro y Carlos explicando en Valdepeas
El segundo grupo de Valdepeas
Hinojosa del Duque, grupo 1
Concentrados en la charla
Colegas
Carlos Palacios con el segundo grupo de
Hinojosa
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XXXIII JORNADAS CIENTÍFICAS Y XII JORNADAS
INTERNACIONALES DE OVINOTECNIA Y CAPRINOTECNIA
X JORNADAS CAPRINO Y OVINO DE ALMERÍA
Almería, 24, 25, 26 y 27 de Septiembre de 2008
BOLETÍN DE INSCRIPCIÓN
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VIAJES EL CORTE INGLÉS, S.A. DIVISION DE CONGRESOS TENIENTE BORGES, 5. 41002 SEVILLA
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CUOTA DE INSCRIPCION CONGRESISTA ANTES DEL 31 DE JULIO DESPUÉS DEL 31 DE JULIO
SOCIOS 160,00 € 210,00 € NO SOCIOS 220,00 € 300,00 € ESTUDIANTES * 105,00 € 125,00 € ACOMPAÑANTES * 120,00 € 140,00 € * La condición de estudiante deberá ser acreditada mediante certifi cación académica de estar matriculado en curso de grado * Cuota Acompañante: Incluye visitas guiadas, comidas y cena de gala
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EL CORTE INGLÉS AMERICAN EXPRESS VISA MASTER CARD DINNERS CLUB TITULAR DE LA TARJETA: _________________________________________________________ NUMERO TARJETA DE CREDITO ____________________________________________________ FECHA DE CADUCIDAD: _____________________
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BANCO : SANTANDER CENTRAL HISPANO. OFICINA DE EMPRESAS DIRECCION: PLAZA DE CANALEJAS, 1. 28014. MADRID. ESPAÑA
NUMERO DE CUENTA: 0049 1500 03 2810355229 GASTOS DE CANCELACIÓN
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De acuerdo con lo establecido en la regulación LO 15/99 referente a la protección de datos personales, les informamos que la información facilitada será incorporada a una base de datos bajo la responsabilidad de la Sociedad SEOC. Dicha información sólo será utilizada para promoción y otras actividades relacionadas con las Jornadas. Está en su derecho de modifi car o cancelar sus datos. Si este es el caso, debe remitir un escrito a nuestras ofi cinas.
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HORARIO MIÉRCOLES 24 JUEVES 25 HORARIO VIERNES 26 SÁBADO
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8:30-9:30 Acreditación y documentación 9:00-10:00 3ª Sesión
de comunicaciones
9:30-11:00 1a Ponencia: Situación
epide-miológica actual de la Lengua Azul
10:00-11:00 2a Ponencia: La leche líquida
de pequeños rumiantes: ca-lidad y objetivos de mercado en alimentación humana
11:00-12:00 Saludo de bienvenida e
inau-guración
11:00-11:30 Café
12:00-12:30 Café 11:30-12:30 3a Ponencia: Avances en
inmunología y métodos de diagnostico en la tuberculosis caprina 12:30-13:00 Acciones de la CAP-Andaluza 12:30-13:30 13:30-14:00 14:00-14:30
Directrices Plataforma FABRE Presentación Comercial Exopol
Presentación Comercial Zotal
13:00-14:00 1a Sesión comunicaciones
14:00-15:00 Comida de trabajo 14:30-15:30 Comida de trabajo
15:00-16:00 Acreditación y
documentación
Sesión explicativa de póster 15:45-16:45 4a Sesión de comunicaciones
16:00-17:00 Jornada
Satélite
2a Sesión de comunicacio-nes
17:00-19:00 Mesa Redonda: Marcas de
calidad en Productos cárni-cos de pequeños rumiantes: Realidad o mito
17:00-18:00 Asamblea General socios
18:00-19:00
21:00 Recepción Ciudad Cena de Fraternidad SEOC
Visita técnica
PROGRAMA PROVISIONAL DE LAS
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XXXIII JORNADAS CIENTÍFICAS Y XII JORNADAS
INTERNACIONALES DE OVINOTECNIA Y CAPRINOTECNIA
Almería, 24, 25, 26 y 27 de Septiembre de 2008
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* PRECIOS POR HABITACION Y POR NOCHE, DESAYUNO E IVA INCLUIDOS
ALOJAMIENTO HABITACIÓN DOBLE HABITACIÓN DUI
HOTEL VINCCI MEDITERRANEO 4* 77,00 € 72,00 € HOTEL TORRELUZ III 3* 70,00 € 64,00 € HOTEL TRYP ÍNDALO 4* 70,00 € 63,00 € HOTEL SOL ALMERÍA 2* 65,00 € 46,00 € HOTEL ELBA ALMERÍA 4* 62,00 € 62,00 € HOTEL TORRELUZ II 2* 60,00 € 53,50 € HOTEL CITYMAR INDÁLICO 3* 46,00 € 42,00 € PREFERENCIA DE HOTELES: 1º___________________________ 2º_____________________
3º___________________________ 4º_____________________ FECHA DE LLEGADA: ___ ___________________ FECHA DE SALIDA_____________________________
Nº HABITACIONES DOBLES _________ x _________NOCHES x ___________Euros = ________ Euros Nº HABITACIONES SINGLE _________ x _________NOCHES x ___________ Euros = ________ Euros
TOTAL ALOJAMIENTO: ____________Euros
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ARTÍCULOS TÉCNICOS
El seguimiento de los distintos paráme-tros medidos en las muestras de leche representa el pilar fundamental de los programas de mejora productiva y sani-taria desarrollados en el ganado caprino lechero. Habida cuenta de las diferentes posibilidades de manejo y conservación de las muestras, el presente trabajo revi-sa el efecto de las condiciones analíticas de las mismas sobre las determinaciones obtenidas en las muestras de leche de cabra mediante los métodos instrumen-tales utilizados en los laboratorios lacto-lógicos. Entre los factores que contribu-yen de forma signifi cativa a la variación de los valores del recuento de células somáticas y composición físico-química de la leche se han identifi cado la tempe-ratura de almacenamiento (refrigeración o congelación), el conservante utilizado (sin conservante, bronopol o azidiol) y la interacción de dichos factores en relación con el tiempo de almacenamiento. No obstante, y a efectos de la interpretación práctica de dichos valores, las diferencias obtenidas permiten un amplio abanico de posibilidades de conservación y alma-cenamiento de las muestras de leche de cabra. En cualquier caso, las diferentes condiciones analíticas citadas deberán defi nirse, de forma precisa, para cada uno de los parámetros a considerar en los en-sayos intercolaborativos y de control de calidad, que desarrollen los laboratorios lactológicos. La posibilidad de utilizar las diferentes muestras de leche que se to-man de forma regular en la explotación
con fi nes diagnósticos. supone un incre-mento en el valor añadido de las mismas. Previamente a la utilización de las mues-tras de leche adicionadas con conservan-tes para su aplicación diagnóstica, debe defi nirse el umbral de detección de cada agente patógeno (i.e. Mycoplasma spp.) para cada una de las posibles condiciones
de conservación y almacenamiento en re-lación con la técnica a aplicar. De cara al diagnóstico individual de la infección in-tramamaria subclínica, la viabilidad de los principales patógenos en las muestras de leche congeladas permite optimizar tanto la recogida como el análisis bacteriológi-co de las mismas.
Factores que afectan a los análisis físico-químicos
y al diagnóstico en las muestras de leche de cabra
J. AMORES1; A. SÁNCHEZ*1; D. SIERRA2; C LUENGO2; A. GÓMEZ1; J.C. CORRALES1;
C. DE LA FE1; A. CONTRERAS1; C. GONZALO3
1Grupo de investigación Sanidad Caprina. Departamento de Sanidad Animal. Facultad
de Veterinaria. Universidad de Murcia.
2Laboratorio Agroalimentario y de Sanidad Animal, Consejería de Agricultura y Agua,
Comunidad Autónoma de la Región de Murcia.
3Departamento de Producción Animal. Facultad de Veterinaria. Universidad de León.
*e-mail: [email protected] pR 9, núm. 2: 11-20 (2008) Fo to: Grupo de I n vestigación Sanidad C aprina
12
INTRODUCCIÓN
En los rebaños caprinos de aptitud láctea se recogen muestras de leche tanto para los programas de control lechero (mues-tra individual de cada animal, periodicidad de 42 días) como para los programas de pago por calidad (muestra de leche de tanque, periodicidad de 1-2 muestras por semana), además de las muestras de con-trol ofi cial gestionadas por las administra-ciones públicas y los programas de control de mamitis establecidos a nivel colectivo o individual por los productores. En la ma-yoría de las Comunidades Autónomas, las muestras de leche de cabra correspon-dientes al Control Lechero Ofi cial se adi-cionan con bronopol (BR), mientras que en las muestras de leche de tanque desti-nadas a los programas de pago por calidad y en las destinadas al control ofi cial se uti-liza como conservante el azidiol (AZ). Por el contrario, desde el punto de vista del diagnóstico microbiológico, la muestra de leche de elección debe permanecer libre de conservantes. Las diferentes condicio-nes de almacenamiento y conservación posibles obligan a establecer el efecto de las mismas sobre cada uno de los proce-dimientos analíticos a aplicar, permitiendo así defi nir su infl uencia en la precisión de las distintas determinaciones. Al mismo tiempo, la posibilidad de ampliar el rango de determinaciones sobre una muestra de leche en condiciones de conservación conocidas, supone incrementar el valor añadido de dicha muestra, optimizando así el esfuerzo logístico y económico que representa su recogida.
Por todo ello, el presente trabajo preten-de revisar el efecto preten-de los diferentes con-servantes, así como de la temperatura y el tiempo de almacenamiento, sobre las principales determinaciones analíticas a realizar en las muestras de leche de cabra mediante los equipos instrumen-tales utilizados en los laboratorios lacto-lógicos. Además, se comentan diferentes estrategias de toma y conservación de las muestras de leche que tienen interés desde el punto de vista diagnóstico en el ganado caprino.
RECUENTO DE CÉLULAS
SOMÁTICAS
Entre los factores que contribuyen de forma significativa a la variación de
los valores del recuento de células so-máticas (RCS), determinados en leche de cabra mediante contadores celula-res basados en la citometría de flujo (Fossomatic FC, Foss Electric, Hillerød, Denmark), se han identificado la tem-peratura de almacenamiento, el con-servante utilizado y la interacción de dichos factores en relación con el tiem-po de almacenamiento (Sánchez et al.,
2005). En relación con los conservan-tes, las muestras adicionadas con BR presentaron valores de RCS superiores a los obtenidos en las muestras sin conservante (SC) y en aquellas trata-das con AZ, que son las que arrojaron los valores más bajos de RCS (Tabla 1). Para explicar dicho efecto, observado previamente en leche de oveja (Gonza-lo et al., 2003, 2004), se ha propuesto
Azidiol Bronopol Sin conservante
MMC ES MMC ES MMC ES Log RCS 5,803a 0,0018 5,877b 0,0018 5,858c 0,0020 RCS1 635 753 721 Grasa (%) 5,352a 0,0045 5,396b 0,0045 5,396b0051 0, Proteínas totales (%) 3,541a 0,0010 3,574b 0,0010 3,565c 0,0011 Lactosa (%) 4,655a 0,0012 4,686b 0,0012 4,673c 0,0014 Sólidos totales (%) 14,538a 0,0056 14,622b 0,0056 14,6034600c, 0
a,b,c Medias con distinto superíndice en una misma fi la difi eren signifi cativamente (P <
0,05).
1 Media geométrica (x103/ml).
RCS: Recuento de Células Somáticas
Tabla 1. Media de mínimos cuadrados (MMC) y error estándar (ES) de los diferentes componentes de leche de cabra según los conservantes utilizados (Sánchez et al., 2005).
La utilización generalizada de los métodos instrumentales de análisis de leche en los laboratorios lactológicos hace necesario conocer el efecto de las condiciones analíticas sobre los valores obtenidos
Fo
to: Grupo de I
n
vestigación Sanidad C
14
que el BR permite una mayor penetra-ción del bromuro de etidio en el interior de las células, determinando señales fluorescentes de mayor intensidad en los contadores fluoro-opto electrónicos (Ardö, 1982).
Aunque la congelación determinó una reducción signifi cativa del RCS (Tabla 2), dicho efecto se encontró modifi cado por el conservante utilizado. Así, al siderar la interacción del efecto del con-servante y la temperatura de almacena-miento, se evidenció que la congelación reduce el RCS en las muestras que han sido tratadas con AZ y en aquellas SC, pero los resultados no se modifi caron cuando el conservante empleado fue el BR (comportamiento ya observado en leche de oveja; Martínez et al., 2003). Cuando las muestras se almacenaron a temperatura de refrigeración se obtuvie-ron RCS similares en las muestras SC y con BR, siendo superiores en ambos ca-sos a las adicionadas con AZ. En relación con el tiempo de almacenamiento, en las muestras SC almacenadas en refrigera-ción no se observaron variaciones signi-fi cativas en el RCS durante los primeros 13 días. Las muestras refrigeradas adi-cionadas con conservantes aumentaron su vida útil, si bien el RCS fue disminu-yendo durante el tiempo de almacena-miento (Figura 1). Esta reducción fue mayor al utilizar como conservante el AZ frente al BR (reducción del 15,2% y del 6,9% a los 25 días en refrigeración para las muestras adicionadas con AZ y BR, respectivamente). Por el contra-rio, la estabilidad de los valores de RCS observada en las muestras adicionadas con BR, permite el almacenamiento en refrigeración de las mismas hasta los 25 días post-recogida, así como su con-gelación durante períodos superiores de tiempo (Figura 2).
En la práctica, las muestras suelen ser procesadas a las 24-48 horas post-reco-gida. No obstante, si por cuestiones logís-ticas las muestras tuvieran que ser proce-sadas el mismo día de la recogida, se ha observado que ni la adición de BR, ni el incremento de la temperatura de análisis de 40ºC a 60ºC, mejora los valores de RCS obtenidos en los contadores celulares ba-sados en la citometría de fl ujo (Sierra et al., 2006). Congelación ES Refrigeración ES Log RCS 5,830a 0,0017 5,862b 0,0013 RCS1 676 728 Proteínas totales (%) 3,563a 0,0009 3,556b 0,0007 Lactosa (%) 4,675a 0,0012 4,668b 0,0009 Sólidos Totales (%) 14,577a 0,0054 14,599b 0,0040
a,b Medias con distinto superíndice en la misma fi la difi eren signifi cativamente
(P < 0,001).
1 Media geométrica (x103/ml).
RCS: Recuento de Células Somáticas
Tabla 2. Medias de mínimos cuadrados y error estándar (ES) de los diferentes componentes de la leche de cabra según la temperatura de almacenamiento (Sánchez et al. 2005). Muestras de leche con diferentes formas de conservación.
De izquierda a derecha: azidiol, bronopol y sin conservante
Fo to: Grupo de I n ve stigación Sanidad C aprina
El colorante a utilizar en las fórmulas de los diferentes conservantes se decide en cada laboratorio, con la excepción del azidiol que incluye el azul de bromofenol (según la fórmula del R.D. 1728/2007) Fo to: Grupo de I n ve stigación Sanidad C aprina
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ARTÍCULOS TÉCNICOS
COMPOSICIÓN FÍSICO-QUÍMICA
Grasa, proteína, lactosa y sólidos totales
La adición de conservantes ha resultado ser uno de los factores más relevantes que modifi can los valores de los compo-nentes de la leche de cabra, determina-dos por el método basado en tecnología FTIR (Fourier transform infrared analy-sis) de espectro completo (MilkoScan FT 6000, Foss Electric, Hillerød, Denmark) (Sánchez et al., 2005). Así, los mayores porcentajes de proteína, lactosa, y sóli-dos totales se observaron en muestras con BR, frente a las muestras SC y con AZ, las cuales obtuvieron los valores más bajos. Los porcentajes de grasa obteni-dos en las muestras adicionadas con BR y en las muestras SC no presentaron dife-rencias signifi cativas, y fueron mayores que los obtenidos en las muestras con AZ (Tabla 1).
Al considerar el efecto de la temperatura de almacenamiento, se obtuvieron valo-res signifi cativamente más elevados en el porcentaje de lactosa para las mues-tras congeladas frente a las refrigeradas, si bien dicho efecto no se observó en las muestras adicionadas con conservantes. Por el contrario, los valores de grasa no se vieron afectados por la temperatura de almacenamiento, mientras que el porcen-taje de proteína total fue superior en las muestras congeladas, obteniéndose el efecto contrario en los valores de sólidos totales (Tabla 2). En las muestras con-servadas con BR, los valores de grasa, proteína, lactosa y sólidos totales perma-necieron estables, frente al valor de refe-rencia (obtenido a las 24 horas), durante los 42 y 105 días almacenados en refri-geración y congelación, respectivamente (Sánchez et al., 2005).
Si bien los diferentes factores comenta-dos modifi can, de forma signifi cativa, los valores de RCS y composición obte-nidos por los métodos instrumentales, a efectos de la interpretación práctica de dichos valores las diferencias obtenidas permiten un amplio abanico de posibili-dades de conservación y almacenamien-to de las muestras de leche de cabra. Al mismo tiempo, hay que considerar que, las muestras conservadas con AZ (18 g de azida sódica y 0,75 g de cloranfeni-col en 1 litro de conservante a razón de
133 µl de AZ/40 ml de leche, de acuerdo con la fórmula del AZ defi nida en el Real Decreto 1728/2007), permiten la deter-minación del recuento total de bacterias mediante la técnica de citometría de fl u-jo (Bactoscan FC, Foss Electric, Hillerød, Denmar) y la detección de residuos de antibióticos mediante los métodos mi-crobiológicos de cribado. En este senti-do, existen evidencias en leche de otras especies (i.e. oveja) de que la utilización
de AZ con mayores concentraciones de azida sódica y cloranfenicol disminu-ye la especifi cidad de los test de criba-do (Molina et al., 2003, Montero et al., 2005). En cualquier caso, las diferentes condiciones analíticas citadas deberán defi nirse, de forma precisa, para cada uno de los parámetros a considerar en los ensayos intercolaborativos y de con-trol de calidad que desarrollen los labora-torios lactológicos.
Figura 2. Media de mínimos cuadrados del logaritmo del Recuento de Células Somáticas (RCS) en función del tratamiento de conservación (AZ: azidiol, BR: bronopol, SC: sin con-servante) en muestras de leche almacenadas a temperatura de congelación (Sánchez et al., 2005).
Figura 1. Media de mínimos cuadrados del logaritmo del Recuento de Células Somá-ticas (RCS) en función del tratamiento de conservación (AZ: azidiol, BR: bronopol, SC: sin conservante) para muestras de leche almacenadas a temperatura de refrigeración (Sánchez et al., 2005).
Tiempo de almacenamiento
Log RCS
Tiempo de almacenamiento
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Punto crioscópico
El seguimiento de los valores del pun-to criocóspico (PC) a nivel de tanque, permite evaluar la presencia de agua añadida a la leche, resultante tanto de operaciones de manejo del orde-ño como de actividades fraudulentas. En este sentido, se ha determinado experimentalmente que, por cada uni-dad porcentual de agua añadida el PC, se incrementa en 6 mºC (Sánchez et al., 2007), coincidiendo con las esti-maciones matemáticas previamente obtenidas en leche de cabra (Szijarto y Van de Voort, 1983). Los cambios provocados en la osmolaridad de la leche determinan que la adición de conservantes, así como la concentra-ción de estos utilizada, sean factores importantes de variación en la deter-minación del PC de la leche de cabra utilizando el método instrumental (MilkoScan FT 6000) y el método de referencia (crioscopia con termistor, The Advanced Cryoscope. Advanced Instrument Inc. Massachusetts, USA) (Sánchez et al., 2007). Así, las meno-res diferencias en el PC se han obteni-do en las muestras SC y en las mues-tras conservadas con BR20 (0,020 g de BR/100 ml de leche) y BR40 (0,040 g de BR/100 ml de leche). Por el
con-trario, los menores valores de PC fueron obtenidos en las muestras conservadas con AZ18 (azidiol con 0,018 g de azida sódica/100 ml de leche) y AZ6 (azidiol con 0,006 g de azida sódica/100 ml de leche). Los resultados obtenidos mues-tran que el aumento en la concentra-ción de azida sódica en la fórmula del AZ provoca un importante descenso en los valores del PC. Al mismo tiempo, el efecto de los distintos conservantes y sus concentraciones sobre el PC de la leche de cabra, fue similar en los dife-rentes niveles de agua añadida (Figura 3). Por lo tanto, con el objetivo de evi-tar que la utilización de conservantes pueda enmascarar la presencia de agua extraña en la muestra de leche, el tipo de conservante y la concentración utili-zada debe tenerse en cuenta en la inter-pretación de los valores de FP.
OPCIONES DIAGNÓSTICAS
Muestras de leche de tanque
La disponibilidad de muestras de las ex-plotaciones lecheras, como consecuen-cia de los programas de calidad de leche antes aludidos, permite extender su apli-cación para la vigilancia epidemiológica de otras enfermedades infectoconta-giosas, pues, además de agentes como en el caso de la agalaxia contagiosa, se
pueden detectar anticuerpos inducidos por diferentes enfermedades de interés. En el ganado bovino lechero se realizan desde la última década programas de vi-gilancia de determinadas enfermedades, siendo validados diferentes métodos de diagnóstico, sobre leche de tanque, de agentes como Brucella abortus, Coxiella burnetti, Fasciola hepatica, Leptospira hardjo, Neospora caninum, Salmonella dublin, y diversos virus (herpesvirus bovino-1; diarrea vírica bovina; fi ebre aftosa, leucosis bovina). Aunque esta tendencia ha sido menos desarrollada en los pequeños rumiantes, la muestra de leche también ha sido empleada con fi nes serológicos. En el ganado caprino se han realizado estudios enfocados a la detección de anticuerpos mediante la técnica ELISA, utilizando la muestra de leche para el diagnóstico de diferentes infecciones, como Brucella melitensis (Funk et al., 2005) o Mycobacteruim avium subsp. paratuberculosis (Salgado et al., 2005). En relación con el diagnós-tico serológico del virus de la artritis-en-cefalitis caprina (VAEC), Motha y Rals-ton (1994) demostraron la validez de muestras de leche individuales para la detección de cabras infectadas por VAEC. El uso de la muestra de suero lácteo, en vez de la muestra de leche, aún mejora los resultados anteriores (Plaza et al., 2007), y se demuestra la ausencia de falsos positivos y la buena concordan-cia entre los resultados de la muestra de sangre y la de suero lácteo para el diag-nóstico del VAEC.
Agalaxia contagiosa
En la práctica, una de las posibilidades diagnósticas de mayor interés que pre-senta la muestra de leche de tanque es la detección de Mycoplasma spp. en el rebaño. En el entorno de la cabra Murcia-no-Granadina, el análisis bacteriológico de las muestras de leche de tanque (re-frigeradas y SC), ha permitido realizar el seguimiento de los rebaños frente a la principales especies de micoplasmas responsables de la agalaxia contagiosa (Corrales et al., 2004; Contreras et al., 2008). En los rebaños crónicamente infectados, el aislamiento de micoplas-mas en una única muestra de leche de tanque durante la lactación presenta una baja sensibilidad (16,37%). En este
Figura 3. Media de mínimos cuadrados del punto crioscópico de la leche de cabra según el agua añadida y el conservante utilizado (SC: sin conservante; BR20: bronopol con 0,020 g de BR/100 ml de leche; BR40: bronopol con 0,040 g de BR/100 ml de leche; AZ6: azidiol con 0,006 g de azida sódica/100 ml de leche; AZ18: azidiol con 0,018 g de azida sódica/100 ml de leche) (Sánchez et al., 2007).
P u nt o criosc ópic o (mºC ) Agua añadida (%)
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sentido, habida cuenta de la excreción intermitente de Mycoplasma spp. y de la dinámica de la infección en el rebaño, el seguimiento de dichas infecciones, uti-lizando la muestra de leche de tanque, debe establecerse con un muestreo continuado en el tiempo, y debe utili-zarse como información adicional para la toma de decisiones sobre la acredi-tación como rebaño libre o la aplicación de un programa de lucha. De forma com-plementaria al análisis microbiológico, en los últimos años se están aplicando nuevos métodos de detección basados en el ADN (la reacción en cadena de la polimerasa o PCR) que tienen a su favor la rapidez en la emisión del diagnóstico y la alta sensibilidad y especifi cidad de estas pruebas (Sachse, 2003). Algunas de estas técnicas, combinadas con pro-cedimientos de extracción de ADN basa-dos en las propiedades del sílice y de las sales caotrópicas, ya han sido utilizadas satisfactoriamente para la detección de Mycoplasma agalactiae (Tola et al., 1996, 1997) o del grupo M. mycoides
(De la Fe et al., 2003) directamente de muestras de leche.
Tanto el análisis bacteriológico específi co como la detección de micoplasmas por PCR en muestras de leche de tanque SC, están siendo aplicados en los programas de vigilancia de la agalaxia contagiosa en los rebaños caprinos del Núcleo de Con-trol Lechero de la Región de Murcia. Por otra parte, la posibilidad de utilizar las muestras de leche de tanque adicionadas con conservantes para el aislamiento y la detección de Mycoplasma spp. está sien-do estudiada en la actualidad (Proyecto AGL2006-03105GAN, fi nanciado por la Dirección General de Investigación del Ministerio de Educación y Ciencia). Los resultados preliminares muestran dife-rencias en el efecto de los conservantes citados sobre la viabilidad de las diferen-tes especies de micoplasmas en la mues-tra de leche. No obstante, hasta que no se defi nan los umbrales de detección de las diferentes técnicas diagnósticas (análi-sis microbiológico específi co y PCR) para
cada una de las condiciones analíticas y de conservación posibles, no se podrán defi nir con precisión sus posibilidades diagnósticas.
Diagnóstico individual de la infección intramamaria subclínica
En los programas de control de mami-tis, el diagnóstico bacteriológico de las muestras individuales de leche repre-senta una herramienta insustituible tanto para la vigilancia de las diferentes especies patógenas presentes en los rebaños como para la toma de decisio-nes sobre los tratamientos de secado a aplicar. El diagnóstico correcto de la infección intramamaria subclínica en una glándula mamaria, requiere el ais-lamiento del mismo patógeno, como mínimo, en dos muestras consecutivas de leche separadas al menos 24h (Sears et al., 1993). Sin embargo, por razones prácticas y económicas se suele utili-zar una única muestra de leche. En el ganado caprino es conocida la mayor frecuencia, así como la capacidad de
per-Fo to: Grupo de I n ve stigación Sanidad C aprina
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ARTÍCULOS TÉCNICOS
AGRADECIMIENTOS
Parte de los trabajos citados se han desarrollado en el Proyecto AGL2006-03105GAN, fi nanciado por la Dirección General de Investigación del Ministerio de Educación y Cien-cia. Joaquín Amores Iniesta disfruta de una beca de F.P.I del Ministerio de Educación y Ciencia asociada al pro-yecto de referencia.
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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
sistencia, de las infecciones por estafi lo-cocos coagulasa negativos. Para dicho grupo bacteriano, la utilización de una única muestra de leche tomada antes del ordeño, presenta unos parámetros de validez adecuados que permiten su utilización (sensibilidad: 95,9%, especi-fi cidad: 97,4%, valor predictivo positivo: 67,6%, valor predictivo negativo: 99,8%) (Contreras et al., 1997). No obstante, ante la presencia de falsos positivos, se ha recomendado realizar el diagnóstico utilizando muestras de leche únicas to-madas después del ordeño ya que pre-senta valores superiores de especifi ci-dad (99,4%) (Sánchez et al., 2004).La posibilidad de agrupar y seleccionar las muestras de leche individuales que serán sometidas al análisis bacteriológico, per-mite reducir el coste fi nal de los programas de control de mamitis. En este sentido, la viabilidad de los diferentes patógenos in-tramamarios (estafi lococos coagulasa ne-gativos y bacilos Gram nene-gativos) en las muestras de leche de cabra congeladas durante períodos de tiempo superiores a la lactación (Sánchez et al., 2003), permi-te la congelación doméstica de las mues-tras sospechosas y su selección posterior considerando otros parámetros como son el RCS (Luengo et al., 2004) o el número de parto (Sánchez et al., 1999).
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Summary
Monitoring the diff erent parameters studied in milk samples represents the main base of productive and healthy improve-ment programs developed in dairy goat herds. Taking into account the diff erent storage and preservation procedures, the present study reviews the eff ect of the diff erent conditions in the analysis of goat milk samples by instrumental methods used in milk laboratories. Among the factors that contribute signifi cantly to the Somatic Cell Count and composition variation, can be identifi ed the storage temperature (refrigeration or freezing), preservative (no preservative, bronopol or azidiol) and the interaction of both factors with time. Nevertheless, in a practical interpretation of these values, the diff erences allow a wide range of preservation and storage. However, diff erent analytical conditions for each milk parameter should be taken into account for intra- and inter-laboratory quality control schemes in milk laboratories. The possibility of using the diff erent milk samples for diagnostic increases their value. Previously to the use of preserved milk samples for diagnosis purposes, the de-tection limit of each pathogen should be defi ned (i.e. Mycoplasma spp.) for each preservation and storage condition according to the diagnosis method. For the diagnosis of subclinical intramammary infection in the udder halves, the viability of the main pathogens in frozen milk samples optimize the sampling strategy and the bacteriological analysis of these samples. - PLAZA M., SÁNCHEZ, A., CORRALES, J.C., DE LA FE, C., HERNÁNDEZ BALSERA, F., MARTÍNEZ-PARRA, J., CONTRERAS, A. 2007. Using goat milk samples to diagnosed Caprine Arthritis Encephalitis Virus by ELISA. 5th International Symposium on the Chal-lenge to Sheep and Goats Milk Sectors. Alghero/Sardinia, Italy.
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ARTÍCULOS TÉCNICOS
¿QUÉ ES LA INDICACIÓN
GEO-GRÁFICA PROTEGIDA
TERNAS-CO DE ARAGÓN?
“Ternasco de Aragón”, garantía de origen y calidad
En Aragón, la importancia de la produc-ción ovina es muy elevada, tanto desde el punto de vista social, económico y bio-lógico, como del cultural y ecológico. En Aragón, más de 1.000 explotaciones ga-naderas pertenecen al Consejo Regulador, con más de 555.000 ovejas productoras, distribuidas en más de 370 poblaciones del medio rural enclavadas en la Comuni-dad Autónoma de Aragón.
El Ternasco de Aragón fue la primera carne fresca que fue aceptada en España como Denominación Específi ca, amparada por la Diputación General de Aragón el 10 de julio de 1989 y ratifi cada por el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación el 22 de septiembre de 1992. En 1996 fue reconocido en el ámbito europeo como Indicación Geográfi ca Protegida. Las razas admitidas para la producción de Ternasco de Aragón son la Rasa Aragone-sa (Figura 1), Ojinegra de Teruel (Figura 2) y Roya Bilbilitana (Figura 3), todas ellas razas autóctonas de Aragón. El Ternasco de Aragón es alimentado desde su nacimiento con leche materna y cereales naturales, y sacrifi cado con una edad inferior a 90 días y peso en canal de entre 8,0 y 12,5 kg. Todo ello, se conjuga en un producto cárnico que ha obtenido reconocimientos a su cali-dad gastronómica y alimentaria, como ser considerado el mejor cordero en un estudio comparativo entre corderos de
diferentes razas de Europa realizado por la Universidad de Zaragoza.
El primer estudio comparativo de la cali-dad sensorial de distintas canales de cor-deros de varios países del mundo ya se realizó en 1992. El laboratorio de Calidad de la Canal y la Carne de la Facultad de Veterinaria de Zaragoza fue el encargado
Las Indicaciones Geográfi cas Protegidas en el
sec-tor de los pequeños rumiantes españoles:
Ternasco de Aragón
Consejo Regulador de la Indicación Geográfi ca Protegida Ternasco de Aragón Ctra. de Cogullada, s/n - Mercazaragoza. Edifi cio Centrorigen. [email protected]
pR 9, núm. 2: 21-23 (2008)
Figura 2: Raza Ojinegra de Teruel
Figura 3: Raza Roya Bilbilitana
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de realizar dicho estudio, entre corderos franceses, ingleses, neozelandeses, ar-gentinos y Ternasco de Aragón, quedando en segundo lugar.
Posteriormente, se puso en marcha el pro-yecto OVAX de la Unión Europea, coordinado por la universidad de Bristol (UK), en el que expertos españoles y consumidores del área mediterránea (españoles, italianos y griegos), consideraron la carne del ternas-co de Aragón ternas-como la más valorada entre doce tipos de corderos de seis países. En estudios realizados por el laboratorio de Producción Animal de la Facultad de Veterinaria de Zaragoza, se ha compro-bado que la grasa del Ternasco de Aragón presenta un mayor porcentaje de ácidos grasos insaturados y menor colesterol, por lo que ofrece una calidad dietética muy superior a la indicada por los inves-tigadores clásicos, en general, de países anglosajones. Como consecuencia, la calidad de la carne del Ternasco de Ara-gón es muy saludable desde el punto de vista alimenticio.
CONTROLES DE CALIDAD
El Consejo Regulador garantiza que conlos distintivos del Ternasco de Aragón lle-gan al mercado sólo las canales de mejor calidad, controlando desde el origen tanto la genética del animal como sus condi-ciones de cría y alimentación, y hasta su sacrifi cio y manipulación hasta llegar al punto de venta, donde se puede identifi -car por las siglas “TA” marcadas en todos los despieces.
TRAZABILIDAD TOTAL
Procesos de Certifi cación del Ternasco de Aragón (EN 45011)
1. Finca ganadera registrada Visita Control una vez al año: – Control de conformidades. – Estándar racial del ganado: ovejas y se-mentales.
– Control del manejo productivo. – Control del alimento suministrado al ganado.
– Control de nacimientos por el ganadero. 2. Centros de tipifi cación registrados Visita Control una vez cada 2 meses: – Control del futuro T.A.
– Identifi cación de su procedencia. – Control de alimentación.
3. Mataderos autorizados – Control de conformidades. – Control pre mórtem: procedencia del cordero, condiciones de estancia y sa-crifi cio.
– Control individual de cada canal, asigna-ción de identifi caasigna-ción individual (código de barras).
– Control post mórtem: condiciones de conservación de la canal (temperatura, humedad, etc.).
4. Inspecciones a los puntos de venta Evitan el fraude al consumidor fi nal por medio de la identifi cación del auténtico Ternasco de Aragón, gracias a las siglas TA en la carne y a las etiquetas con có-digos de barras, que permiten rastrear la canal de Ternasco de Aragón hasta el punto de producción.
Ternasco de Aragón al horno Resultados apreciación global de canales de países mediterráneos. Estudio coordi-nado por los profesores de la Universidad de Zaragoza Isidro Sierra y Carlos Sañudo.
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ARTÍCULOS TÉCNICOS
RAZONES POR LAS QUE ES
IMPORTANTE EL SECTOR
OVINO Y LA INDICACIÓN
GEOGRÁFICA PROTEGIDA
TERNASCO DE ARAGÓN
Las razones por las que defender y preservar el sector ovino radican en unos principios básicos como son la sostenibilidad del territorio y el me-dio ambiente, el mantenimiento de la población y su asentamiento. Así, la ganadería ovina ejerce una in-fl uencia muy positiva sobre el medio ambiente, siendo la única especula-ción de tipo ganadero que aprovecha recursos alimenticios no competi-tivos con la alimentación humana, como son los recursos pastables situados en las zonas de monte (ac-ción de limpieza de éstos, evitando, así, posibles incendios), rastrojos, barbechos, etc. Podemos decir, como afi rman algunos estudiosos del sec-tor, que se trata de un “ganado de carácter ecológico”. Por ello, facilitar que los ganaderos de producción ovi-na se mantengan en nuestro medio rural redunda de forma muy benefi -ciosa en el medio ambiente. Asimismo, es fundamental dar a conocer la IGP Ternasco de Aragón y la importancia de estas figuras de carácter jurídico, que protegeny facilitan una mayor valorización de las producciones endógenas de los diferentes territorios rurales, lo cual aporta unos mayores ingresos en las explotaciones ganaderas, y así, esta mayor viabilidad empresa-rial anima a seguir con su actividad a los ganaderos ya existentes, y a los jóvenes los incentiva en una ac-tividad empresarial como es la de ser ganadero de ovino. Todo ello ge-nera puestos de trabajo y repercu-te en un manrepercu-tenimiento del repercu-tejido social en el mundo rural, evitando la despoblación creciente en nues-tras comarcas.
DATOS DE INTERES:
- Durante el año 2007 las ventas de la I.G.P. Ternasco de Aragón se incre-mentaron en un 13,27 % respecto al año 2006, llegando al mercado 160.623 canales con el marchamo de la Indicación Geográfi ca Protegida. - Mercados de referencia en las ven-tas de la IGP Ternasco de Aragón: fun-damentalmente Aragón y Cataluña, y, en menor cuantía, Madrid, Islas Ba-leares, Levante y norte de España. Más información en nuestra página web: www.ternascodearagon.es o en www.megustaelternascodearagon.com Carne en fresco
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RESUMEN
La prolifi cidad es un carácter de gran im-portancia económica para mejorar la pro-ductividad numérica y en consecuencia la rentabilidad de los rebaños ovinos de aptitud cárnica. Sin embargo, nuestras rústicas razas ovinas suelen presentar niveles bajos o medios de este carácter, a pesar de los esfuerzos de mejora reali-zados. Este es el caso de la Rasa Aragone-sa, donde la selección por vía materna en busca de algún gen mayor podría propi-ciar resultados más rápidos y de interés. Así, los estudios realizados en razas ovi-nas extranjeras, han demostrado que di-ferentes mutaciones del gen BMP15 (Bone Morphogenetic Protein 15) y del gen GDF9 (Growth Diff erentiation Factor 9) elevan las tasas de ovulación en las ovejas. De hecho, causan incrementos de partos dobles y tri-ples en las hembras heterocigotas. Presen-tamos en este trabajo una nueva mutación del gen BMP15 encontrada en la raza Rasa Aragonesa. Consiste en una deleción o pér-dida de 17 pares de bases que desplaza la ventana de lectura del gen y origina codo-nes de parada prematuros.
Las ovejas portadoras de esta deleción en heterocigosis han presentado una muy alta prolifi cidad media (2,6 corderos/par-to) en comparación con el resto de ove-jas de su misma explotación (media de 1,36 corderos/parto). La deleción causa una completa falta de funcionalidad del
Una deleción de 17 pares de bases en el gen
BMP15 (ligado al cromosoma X) incrementa la
prolifi cidad en la raza ovina Rasa Aragonesa
pR 9, Núm. 2: 24-31 (2008)
LUIS V. MONTEAGUDO 1, RICARDO PONZ2, M. TERESA TEJEDOR1, ADOLFO LAVIÑA2, ISIDRO SIERRA3.
1Departamento de Anatomía, Embriología y Genética. Facultad de Veterinaria de la Universidad
de Zaragoza. C /Miguel Servet 177. 50013 ZARAGOZA.
2Asociación Nacional de Criadores de Ganado Ovino de la Raza “Rasa Aragonesa”. (ANGRA).
Caba-ñera Real, s/n. 50800 ZUERA (ZARAGOZA).
3Departamento de Producción Animal y Ciencia de los Alimentos. Facultad de Veterinaria de la
Universidad de Zaragoza. C /Miguel Servet 177. 50013 ZARAGOZA. e-mail: [email protected]
segundo exón de BMP15, comparable a la que originan otras mutaciones del mis-mo gen, por lo que, al igual que ocurre en otras razas, las ovejas homocigotas para la deleción presentarán fallo ovárico pri-mario y, en consecuencia, esterilidad.
INTRODUCCIÓN
La mayoría de nuestras razas ovinas pre-sentan unos niveles de prolifi cidad bajos o medios, a pesar de la mejora ambiental y los esquemas de selección realizados. En el caso de la Rasa Aragonesa, este era un hecho preocupante, pues infl uía nota-blemente en la productividad numérica y por ende en los resultados económicos (Figura1).
Figura 1: La rusticidad de la raza Rasa Aragonesa le permite aprovechar los recursos alimenticios de una amplia variedad de medios naturales.
Palabras clave: Ovejas; BMP15; GDF9; Prolifi cidad; Rasa Aragonesa
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ARTÍCULOS DE INVESTIGACIÓN
Los datos reales observados en 1970 (24.036 partos en diferentes comarcas de la cuenca media del Ebro), ofrecían en la Rasa Aragonesa una prolifi cidad (nacidos vivos y muertos) de 1,161 para los partos procedentes de cubriciones de otoño (máximo de 1,205 en montas de octubre), frente a 1,097 para cubri-ciones de primavera (mínimos de 1,088 en mayo).
Curiosamente, pudieron comprobarse ya en aquellos años, un total de 27 partos triples, sin tratamientos hormonales y en condiciones ambientales poco propicias (Sierra, 1972).
A partir de entonces, y trabajando en se-lección sobre vía materna, se consiguie-ron elevar los resultados de prolifi cidad en un amplio núcleo ovino hasta 1,2 y 1,4 según la época de cubrición. Se utilizaron unos sencillos índices de selección para las hembras, fácilmente aplicables en la mejora de este carácter, considerando el nivel, repetibilidad e incluso el intervalo entre partos (Sierra, 1979).
Por aquellos años se iniciaba el conoci-miento de la existencia de genes de trans-misión mendeliana, los llamados genes mayores o “major genes”, con efectos so-bre el ámbito reproductivo de la especie ovina, por ejemplo el gen Booroola (Piper y Bindon, 1982).
En este sentido, se tuvo ocasión de ob-servar en la raza Salz la presencia de un
gen mayor ligado al color, de forma que las hembras manchadas presentaban una prolifi cidad superior a las blancas (Sierra, 1990).
Parecía que la búsqueda de genes ma-yores ligados a la prolifi cidad en la espe-cie ovina podría ser una buena línea de trabajo. Sin embargo, en aquellos años existían algunas difi cultades ya que, por una parte, la información de los fondos de la Asociación Nacional de Criadores de Ganado Ovino de la Raza “Rasa Arago-nesa” (ANGRA) no era todavía lo bastante amplia y a la vez, los sistemas analíticos de ADN, no se hallaban sufi cientemente preparados para la identifi cación del po-sible gen.
En la actualidad, el fondo de datos de ANGRA es muy abundante, y al mismo tiempo, las técnicas de análisis se hallan sufi cientemente desarrolladas y extendi-das, existiendo ya estudios precedentes sobre el tema en otras razas (Galloway et al., 2000; Montgmomery et al., 2001; Hanrahan et al., 2004; Davis, 2005; Bo-din et al., 2007). Por ello nos planteamos la posibilidad de desarrollar el trabajo de identifi cación de posibles genes mayores favorecedores de la prolifi cidad en la Rasa Aragonesa, habida cuenta, por otra parte, que en principio el presupuesto económi-co de la búsqueda inicial no sería elevado y, a la vez, el tiempo para su realización relativamente breve. Por ello nos decidi-mos con la expresa ayuda y colaboración
de ANGRA, a iniciar la búsqueda de tales genes mayores, comenzando por dos candidatos que ya habían demostrado su interés en razas extranjeras: BMP15 y GDF9.
Aunque no se ha llegado a esclarecer com-pletamente el papel biológico de los genes BMP15 (Bone Morphogenetic Protein 15), y GDF9 (Growth Diff erentiation Factor 9), se sabe que intervienen en la regulación de las funciones de las células de la capa granulosa ovárica, por lo que ciertas va-riantes de estos genes originan en algu-nos casos superovulación (Bodensteiner et al., 1999; McNatty et al., 2005). BMP15 se sitúa en la región no recombi-nante del cromosoma X, por lo que está totalmente ligado al sexo: Los machos (por su dotación XY) sólo pueden presen-tar una copia del gen, por lo que se de-nominan hemicigotos, mientras que las hembras (XX) presentan dos, y pueden por lo tanto portar las variantes de BMP15 en homocigosis o en heterocigosis. Anteriormente se habían descrito cinco mutaciones de este gen que afectan a la prolifi cidad ovina. Originan o bien susti-tuciones de aminoácidos (caso de FecXI,
FecXB y FecXL), o bien codones de parada
prematuros (caso de FecXG y FecXH).
To-das las mutaciones de este tipo han re-cibido nombres que comienzan con las siglas FecX, por modifi car la fecundidad y por situarse BMP15 en el cromosoma X. La última letra, con formato de supe-ríndice, corresponde a la inicial de la raza en la que se hallaron: Inverdale, Belclare, Lacaune, Galway y Hanna. En todos los casos, los efectos fenotípicos de estas mutaciones en las ovejas dependen de la dosis génica: mientras que las tasas de ovulación se incrementan notablemente en las heterocigotas, las hembras homo-cigotas presentan fallo ovárico primario que origina esterilidad completa. (Gallo-way et al., 2000; Davis et al., 2001; Mont-gomery et al., 2001; Hanrahan et al., 2004; Davis, 2005; Bodin et al., 2007). Por su parte, el gen GDF9, se localiza en el cromosoma 5. Una mutación en su se-cuencia (denominada FecGH) origina la
sustitución de un aminoácido, con efec-tos sobre la prolifi cidad que dependen de la dosis génica, iguales a los de las mutaciones de la serie FecX (Hanrahan et al., 2004).
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La Asociación Nacional de Criado-res de Ganado Ovino de la Raza ”Rasa Aragonesa”(ANGRA) desarrolla desde hace años un programa de mejora gené-tica en el que, a pesar de las difi cultades derivadas de la baja heredabilidad del carácter, el incremento de la prolifi cidad es uno de los principales objetivos. De hecho, desde 1990, ANGRA ha reco-pilado los datos de más de 1,5 millones de partos en diferentes explotaciones de todo Aragón. Como ya se ha indicado, de resultas de este esfuerzo, se dispone de una base de datos informatizada que ha resultado clave en la ejecución del pre-sente trabajo.
Teniendo en cuenta la disponibilidad de una base de datos tan amplia, y de las metodologías de laboratorio, además de las publicaciones disponibles en otras ra-zas, el objetivo del presente trabajofue lo-calizar posibles mutaciones de GDF9 y de BMP15 con efecto sobre la prolifi cidad en la raza Rasa Aragonesa. La experiencia de la raza francesa Lacaune fue muy orien-tadora en esta tarea, ya que tras décadas de mejora genética de la prolifi cidad, una elevada proporción de las ovejas Lacaune más prolífi cas portaban la mutación de BMP15 que se denominó FecXL (Bodin et
al., 2007).
Así, el punto de partida del trabajo debía ser, por tanto, una exhaustiva revisión de la base de datos que permitiera enfocar nuestra atención sobre ejemplares con alta probabilidad de presentar un gen mayor con efectos sobre la prolifi cidad. De este modo se pretendía optimizar el esfuerzo personal y económico que requería esta tarea, manteniendo la posibilidad de obte-ner resultados signifi cativos en un periodo de tiempo relativamente breve. La base del trabajo inicial de gabinete con-sistía en elegir aquellas hembras que, de manera natural, presentaran un singular nivel de prolifi cidad y a la vez elevada re-petibilidad en los registros. Como compro-bación de la posibilidad de portar un gen mayor prolífi co, era también lógico obser-var la prolifi cidad de sus hijas, en las que deberían existir igualmente valores eleva-dos y repetibles.
De acuerdo con esta idea, se seleccio-naron en la base de datos de ANGRA un total de 12 ovejas de alta prolifi cidad y cinco moruecos, pertenecientes a
explo-taciones de toda la geografía aragonesa. Entre ellas estaba la oveja con la máxima prolifi cidad en la historia del programa de mejora, con una media de 3,67 corderos/ parto a lo largo de tres partos, junto a cua-tro de sus hijas.
La recopilación de las muestras de sangre comenzó a fi nales de Noviembre de 2006 y en Enero de 2007 estaba completada. Mientras tanto, se optimizaron los proto-colos de análisis de ADN publicados en la bibliografía y se diseñaron otros con vistas a aumentar la efi ciencia de los pro-cesos de secuenciación de DNA en los dos genes objeto del estudio.
La información obtenida del gen GDF9 fue de escasa trascendencia. Por el contrario, a mediados de febrero del 2007 habíamos identifi cado, en la oveja que ostentaba el record de prolifi cidad en la referida base
de datos y en tres de sus hijas, la pre-sencia de una deleción en el gen BMP15. Precisamente, en los partos de primavera nació un macho, nieto de aquella, por-tador de la mutación, que nos permitió determinar con total precisión el tamaño y posición exacta de la deleción. La infor-mación obtenida propició el diseño de un procedimiento de laboratorio, simple y económico, para testar la presencia de la deleción en otros ejemplares del rebaño, lo que facilitó la localización de otras tres ovejas portadoras. Precisamente un hijo de una de éstas posibilitó contrastar y confi rmar plenamente la secuencia de la variante obtenida en el primer macho. Tras elaborar todos los datos y confi r-mar los resultados experimentales, en la segunda mitad de mayo se disponía ya de toda la información que el día 7 de junio
Figura 2: Amplifi cación por PCR del se-gundo exon del precursor de BMP15 uti-lizando los cebadores MP15F y MP15R (gel de agarosa al 2.5% teñido con bro-muro de etidio). Calles 1, 2, 3 y 8: Tipo salvaje, con banda de 312 pares de bases. Calles 4, 5, 6 y 7: Ovejas hetero-cigotas FecXR/tipo salvaje (nótense las
bandas de 312 bp y de 295 bp, además de una banda heteroduplexa más lenta). Calle C: Control negativo de PCR. Calle W: Marcador de Peso Molecular.
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de 2007 los autores transmitieron perso-nalmente al Director del Esquema de Me-jora Genética de la Rasa Aragonesa. Inmediatamente se remitió el oportuno trabajo científi co a la revista Animal Re-production Science, de la editorial Elsevier, que confi rmó la recepción del mismo con fecha 19 de Julio de 2007. El día 20 de agosto se disponía ya de la opinión favo-rable del primer evaluador (referee), pero hubo que esperar otros cuatro meses, hasta el 21 de diciembre, para que el se-gundo emitiera su dictamen. Lo que pro-pusieron ambos referees fueron correc-ciones menores, fundamentalmente de estilo, que se cumplimentaron rápidamen-te. Finalmente, el 13 de enero de 2008 el trabajo estaba ofi cialmente aceptado, y cinco días después era accesible a toda la comunidad científi ca desde Internet, ha-biendo recibido la identifi cación electróni-ca doi:10.1016/j.anireprosci.2008.01.005 (Monteagudo et al., 2008).
Durante esos meses se programó la difu-sión del alelo mediante tandas de montas controladas de machos portadores lleva-das a cabo sobre diversos lotes de ovejas. Describiremos ahora esta variante de BMP15, totalmente distinta de las ha-lladas en otras razas, por lo que, con-tinuando con los criterios científi cos ya establecidos, se denominará FecXR
puesto que se ha localizado en la raza Rasa Aragonesa.
MATERIAL Y MÉTODOS Material animal.
Como ya se ha indicado, se partió de un grupo de 12 ovejas y 5 moruecos seleccio-nados por su alto rendimiento reproducti-vo. Cuatro ovejas de rendimientos medios se incluyeron también como control.
Extracción de DNA nuclear.
El DNA se obtuvo por procedimientos standard a partir de muestras estériles de sangre periférica.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR ) previa a la secuenciación.
El primer exon de GDF9 se amplifi có de acuerdo a la reacción propuesta por Hanra-han et al. (2004). Para el segundo exon se diseñaron dos parejas de cebadores cuyos productos se solapaban y facilitaban una buena cobertura de toda su secuencia. El segundo exón de BMP15 se amplifi có de acuerdo a la propuesta de Hanrahan et al. (2004). Una vez que se detectó la posible deleción de 17 pares de bases, se diseñó un segundo juego de cebadores que incluía la zona afectada dentro del producto de PCR esperado. Los cebadores se denominaron MP15F (5-CTCTGAGAC-CAAACCGGGTA) y MP15R (5’-CATGCCACCA-GAACTCAAGA-3’).En este caso la PCR re-quería 57ºC de temperatura de annealing y 2,5 mM Mg2+. El producto esperado tenía
una longitud de 312 pares de bases en el caso del alelo salvaje, y de 295 en el caso del alelo con deleción, lo que permitía una sencilla diferenciación en electroforesis.
Secuenciación de DNA y análisis de se-cuencias.
La secuenciación de DNA se llevó a cabo en el Servicio de Secuenciación de DNA de la Universidad de Zaragoza, por medio de un equipo automático MegaBACE 500 (Amersham Biosciences). Las secuencias se analizaron por medio de los softwares BLASTn (Altschul et al., 1997) y Bioedit (Hall, 2004).
RESULTADOS
El análisis de la secuencia GDF9 no reveló datos de especial interés.
Por el contrario, el segundo exón del pcursor de BMP15 ofreció interesantes re-sultados. En todos los animales excepto cuatro, las secuencias podían alinearse con la depositada en GenBank bajo el có-digo AF236078S2 (Galloway et al., 2000). Sin embargo, en la oveja con record de prolifi cidad y en tres de sus hijas, los cro-matogramas presentaban una imagen similar a la esperada en individuos hete-rocigotos para una mutación de alrededor de 17 bp.
Usando los cebadores MP15F arriba descritos, se esperaba de la secuencia salvaje un producto de 312 bp y otro de 295, de la secuencia portadora de la deleción. La electroforesis de agarosa confi rmó que las cuatro ovejas indicadas eran heterocigotas (Figura 2). Un segun-do rastreo entre los animales adultos del rebaño, permitió localizar otras tres ovejas heterocigotas para la deleción, y lo que es más importante, dos corderos machos recién nacidos, que la portaban en hemicigosis y facilitaron la obtención de la secuencia. Uno de los corderos era hijo de una de las cuatro ovejas hetero-cigotas detectadas en primer lugar, y el otro de una de las que se acababan de Figura 3: Amplifi cación por PCR del
segun-do exon del precursor de BMP15 utilizansegun-do los cebadores MP15F y MP15R (gel de aga-rosa al 2.5% teñido con bromuro de etidio). Calles 1, 3, 4 y 5: Moruecos hemicigotos de tipo salvaje. Calles 6, 7 y 8: Ovejas homoci-gotas de tipo salvaje. Calle 2: Oveja hetero-cigoto FecXR/tipo salvaje (nótense las
ban-das de 312 bp y de 295 bp, además de una banda heteroduplexa más lenta). Calle 9: Cordero hemicigoto FecXR mostrando una
banda única de 295 pares de bases.
... ...I. . . I . . . I . . .
525 535 545
Macho 1
GTGGAGCCC
-
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AACC
Tipo salvaje
GTGGAGCCCT
GGGTCCAGAA AAGCCCAACC
Macho 2
GTGGAGCCC
-
---
---
AACC
Figura 4: Alineamiento parcial del segundo exón del gen BMP15, mostrando la deleción
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ARTÍCULOS DE INVESTIGACIÓN
localizar. En principio, no hay evidencias directas de parentesco entre las cuatro primeras ovejas halladas y las otras. Nin-guno de los sementales de la explotación era portador de la deleción, por lo que la transmisión de la misma se ha producido por vía materna, cosa que ya era evidente en el caso de los corderos machos, que lógicamente habrían heredado de sus pa-dres el cromosoma Y (Figura 3). Los corderos machos, portadores
he-micigotos de la deleción, facilitaron la muestra de DNA ideal para obtener, sin margen de dudas, la secuencia de la zona implicada en la variante. Se pudo así comprobar que la deleción afectaba a 17 nucleótidos del segundo exón de BMP15, precisamente los situados entre la posición 525 y 541 (ambas incluidas) en la numeración original de la secuencia AF236078S2, depositada por Galloway et al. (2000) (Figura 4).
Por los motivos ya expuestos, decidimos continuar con la tradición científi ca al res-pecto y denominar esta mutación con las siglas FecXR.
DISCUSIÓN
Las secuencias obtenidas de los dos cor-deros hemicigotos sin parentesco cer-cano fueron totalmente coincidentes, lo que implica la existencia de un ancestro común. Como quiera que en uno de los
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5 15 25 35 45 55
FecX
RGSWHIQTLDF PLRPNRVAYQ LVRATVVYRH QLHLTHSHLS CHVEPNQSLS FFRKRLLKAF
Salvaje
GSWHIQTLDF PLRPNRVAYQ LVRATVVYRH QLHLTHSHLS CHVEPWVQKS PTNHFPSSGR
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65 75 85 95 105 115
FecX
RPVAQNLDRDG YHGTCWAKAL ESQGAQGSTT PLRVSAAKR* *
GS*VLVAWH FIIGHCLLV T
Salvaje
GSSKPSLLPK TWTEMDIMEH VGQKLWNHKG RRVLRLRFVC QQPRGSEVLE FWWHGTSSLD
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125 135 145 155 165 175
FecX
RVFQ*HSECSE DQTSP*RPER VYRKRPFSSL EEGSSSRQYC IGSSWPLQGA *WA*K*PVFP
Salvaje
TVFLLLYFND TQSVQKTKPL PKGLKEFTEK DPSLLLRRAR
QAGSIASEVP GPSREHDGPE
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185 195 205 215 225 235
FecX
RPPFSSQLPAA GLGSLDHCSP SLYPKLL*GS MSSGTTLWSQ FSQSCHHPEP CQ*AGGSECP
Salvaje
SNQCSLHPFQ VSFQQLGWDH WIIAPHLYTP NYCKGVCPRV LHYGLNSPNH AIIQNLVSEL
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I
245 255 265 275 285
FecX
RSAFLCPL*VC SH*HPSD*GK WEYLVQGV*G YDCPVLHMQV TAK V
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Salvaje
VDQNVPQPSC VPYKYVPISI LLIEANGSIL YKEYEGMIAQ SCTCR
*RQRC
Figura 5: Alineamiento de la cadena peptídica producida por el segundo exón del precursor de BMP15 en caso de portar la deleción
FecXR y la producida por la secuencia salvaje. Los 45 aminoácidos conservados se presentan subrayados. Nótese la aparición de
codones de parada prematuros (estrellas) en las posiciones 100, 101 y 104, antes de que la traducción pueda alcanzar la región conservada en el péptido BMP15 maduro (señalada con letras de color verde en la secuencia salvaje). Se señalan con letras azules
todos los aminoácidos que no llegarán a incorporarse al péptido en la variante FecXR. Al no poseer la zona que debería mantenerse en