Efeitos da radiação ionizante nas proteínas presentes em ossos humanos desmineralizados, liofilizados ou congelados

(1)

w w w . r b o . o r g . b r

Artigo

original

Efeitos

da

radiac¸ão

ionizante

nas

proteínas

presentes

em

ossos

humanos

desmineralizados,

lioﬁlizados

ou

congelados

Uri

Antebi

a,b,∗

_,

_Monica

_Beatriz

_Mathor

b

_,

_André

_Ferreira

_da

_Silva

c,d

_,

Rodrigo

Pereira

Guimarães

e

_e

_Emerson

_Kiyoshi

_Honda

e

a_Irmandade_da_Santa_Casa_de_{Misericórdia}_de_São_Paulo,_São_Paulo,_SP,_Brasil b_Instituto_de_Pesquisas_Energéticas_e_Nucleares_(Ipen),_São_Paulo,_SP,_Brasil c_Instituto_Paulista_de_Cirurgia_do_Quadril_e_Joelho,_São_Paulo,_SP,_Brasil d_Universidade_Nove_de_Julho,_São_Paulo,_SP,_Brasil

e_Faculdade_de_Ciências_Médicas_da_Santa_Casa_de_São_Paulo,_São_Paulo,_SP,_Brasil

informações

sobre

o

artigo

Históricodoartigo: Recebidoem28deabrilde2015 Aceitoem11demaiode2015 On-lineem12deoutubrode2015 Palavras-chave: Ossoeossos Radiac¸ãoionizante Bancodetecidos

Proteínamorfogenéticaóssea2 Proteínamorfogenéticaóssea7

r

e

s

u

m

o

Objetivo:Estudarosefeitosdaaplicaçãodasradiaçõesionizantes(gamaeelétrons)como agentesesterilizantes,nasdosesde15kGy,25kGye50kGy,nostecidosósseos desminera-lizadoscongeladoseliofilizadosparausoemtransplantes.

Métodos:Cincodiáfisesfemoraishumanasdedoadoresdistintosdetecidos musculoesque-léticosforamdesmineralizadasepreservadascomoliofilizadasoucongeladasa−80◦C.As amostrasforamdivididasemgruposnãoirradiados(controle)eirradiadosporraiosgama oufeixedeelétrons.Asproteínasósseasforamextraídasedosadasasconcentraçõesde proteínastotais,BMP2e7.

Resultados:FoiobservadadiminuiçãodasconcentraçõesdeproteínastotaiseBMP2e7. Adiminuiçãodasconcentraçõesde proteínastotais,quandocomparadacomo respec-tivocontrole,foisignificativanosgruposdeamostrasliofilizadasecongeladaseirradiadas nadosede50kGyporradiaçãogamaefeixedeelétronscomreduçãosuperioresa30%. AdiminuiçãosignificativanasconcentraçõesdasBMP2e7tambémfoiobservadanas maioresdoseseprincipalmenteporfeixedeelétrons.

Conclusão:Asreduçõesnasconcentraçõesdasproteínastotaiseemproteínas osteoindu-toras(BMP2e7)foramrelacionadasàdosederadiação,ouseja,aumentamcommaiores doses,tipoderadiaçãoionizanteeaotipodepreservaçãodosossos.Asmaioresreduções dasconcentraçõesforamobservadasnosossosirradiadosporfeixedeelétronsenadosede 50 kGy. Porém esse tipode radiação e essa alta dosenão são práticas usuaispara a esterilizaçãodostecidosósseos.

∗ _Autor_para_{correspondência}_. E-mail:uri@usp.br(U.Antebi).

http://dx.doi.org/10.1016/j.rbo.2015.05.009

(2)

Effects

of

ionizing

radiation

on

proteins

in

lyophilized

or

frozen

demineralized

human

bone

Keywords:

Boneandbones Radiation,ionizing Tissuebanks

Bonemorphogeneticprotein2 Bonemorphogeneticprotein7

a

b

s

t

r

a

c

t

Objective: Theaimwastostudytheeffectsofapplicationofionizingradiation(gammaand electrons)assterilizingagentsatdosesof15kGy,25kGyand50kGy,onlyophilizedorfrozen demineralizedbonetissueforuseintransplants.

Methods: Fivehumanfemoraldiaphysesfromdifferentdonorsofmusculoskeletaltissue weredemineralizedandpreservedaslyophilizedorfrozenat−80◦C.Thesampleswere divi-dedintotwogroups:non-irradiated(control)andirradiatedbymeansofgammaraysoran electronbeam.Theboneproteinswereextractedandusedtodeterminetheconcentrations oftotalproteinandBMP2and7.

Results: DecreasesintotalproteinandBMP2and7concentrationswereobserved.The decreasesintotalproteinconcentrations,incomparisonwiththerespectivecontrolgroups, weresigniﬁcant inthelyophilizedandfrozensamplesthatwereirradiatedatadoseof 50kGyofgammaradiationandelectronbeam,withreductionsofmorethan30%.Signiﬁcant decreasesinthelevelsofBMP2and7werealsoobservedathigherdosesandespecially throughuseoftheelectronbeam.

Conclusion: Thereductionsintheconcentrationsoftotalproteinsandosteoinductive pro-teins(BMP2and7)wererelatedtotheradiationdose,i.e.theyincreasedwithhigherdoses ofionizingradiationtypeandthetypeofbonepreservation.Thelargestreductionsin con-centrationswereobservedinthebonesirradiatedbymeansofanelectronbeamandata doseof50kGy.However,thistypeofradiationandthishighdosearenotusualpracticesfor sterilizationofbonetissue.

Introduc¸ão

Existeumacrescente demandade solicitações deenxertos musculoesqueléticosalógenospara reconstruções ortopédi-caseodontológicasnoBrasil.Destacam-seostecidosósseos com21.681distribuiçõesem2014.

Os bancos de tecidos musculoesqueléticos são organizaçõesqueseresponsabilizampelaseleçãodos doado-res,captação,processamento,armazenamento,distribuição econtroledequalidadedostecidos.

Os tecidosósseos são obtidos de doadoresfalecidos ou vivos.Ostecidosmusculoesqueléticossãousados principal-mentenasrevisõesde artroplastiasdoquadrilejoelho,no tratamentodepacientesportadoresdetumoresósseos,nas reconstruçõesarticularesparatratamentodaslesões ligamen-tares,nolevantamentodoseiomaxilarcomatrofiaeenxertia emmandíbulaparaainstalaçãodeimplantesdentários.1

O material alógeno ideal para ser usado como opc¸ão de enxertiadeve ter as seguintes propriedades: biocompa-tibilidade, nãocausarinfecc¸ão, baixaimunogenicidade, ser osteocondutoreosteoindutor.

Aosteoinduçãoéumprocesso daosteogênese que pro-moveorecrutamentodecélulasindiferenciadaspluripotentes (mesenquimais) e a estimulação para a diferenciação em célulasformadoras de ossos. Um importante grupode gli-coproteínas, extraídas da matriz óssea desmineralizada, é constituídoporproteínasósseasmorfogenéticas(BMPs), res-ponsáveispelainduçãoóssea.2

AsBMPssãoclassificadascomoumasubfamíliadentroda superfamília dosfatoresdecrescimento etransformação-␤ (TGF-␤)esegundoaliteraturaasBMPs2,4e7têmummaior potencialnainduçãodadiferenciaçãoosteoblásticaapartir dascélulasmesenquimaisprogenitoras.

Oprocedimentodedesmineralizac¸ãoemmatrizóssea cor-tical aumenta a disponibilidadebiológica de BMPs etorna essesenxertososteoindutores.3_Existe_uma_{correlac¸ão} posi-tivaentreosconteúdosdeBMPspresentesnosenxertosea osteoindutividade.4

Háumaintensapreocupaçãodegarantiraqualidadedos tecidosepromoverasegurançadospacientesreceptoresde tecidos homógenos em relação à transmissão de doenças infectocontagiosas.

Com o propósito de eliminar possíveis contaminações, é feita,no doador de tecidos ósseos, a triagemsorológica, avaliaçãodohistóricoecomportamentosocial,assimcomo testes de biologia molecular para detecção de RNA viral de HIV e HCV, exames clínicos e controles microbiológi-cos, além de serem aplicadas técnicas assépticas durante os procedimentos.5 _Entretanto, _existe _a _{possibilidade} _de contaminaçãocommicrorganismosduranteacaptação, pro-cessamento,preservaçãoearmazenamentodostecidos.6

Diversosprofissionaisresponsáveispelosbancosde teci-dos consideram importante que tecidos biológicos sejam esterilizadosporummétodoeficaz,comaradiaçãoionizante. A esterilização por radiação ionizante é um método que apresenta vantagens sobre outros, pois proporciona umaumentomínimo da temperaturaenãodeixaresíduos

(3)

tóxicos, o que a torna passível de ser usada, além de ser uma esterilização final.7 _Porém_, _alguns _autores _concluíram que a esterilização por radiação ionizante pode acarretar alteraçõesestruturaisebiológicasemrelaçãoàdosenos teci-dosósseos.5,8

Os diferentes tipos de preservação óssea podem afe-tar tanto a manutenção das proteínas quanto a interação daradiação ionizantecomotecido. Asdiferentesdosesde radiaçãoionizantetambémpodeminfluenciaraintegridade ósseaquantoàmanutençãodopotencialosteoindutivodesses enxertos.

O melhor conhecimento desses parâmetros pode auxi-liarosresponsáveispelosbancosdetecidosnaescolhadas condiçõesdeirradiaçãoepreservaçãodostecidosequalidade dosenxertosusadosnostransplantes.

Oobjetivodestetrabalhofoiestudarosefeitosdaaplicac¸ão daradiac¸ãogamaedefeixedeelétrons,produzidasporfontes de60_Co_e_acelerador_de_elétrons_{respectivamente,}_nas_doses_de

15kGy,25kGye50kGynostecidosósseosdesmineralizados preservadoscongeladoseliofilizados.Eavaliaraspossíveis alteraçõesnaconcentraçãodeproteínastotaisedasBMP-2e BMP-7,demodoadeterminaramelhordosepara proporcio-narasegurançanaesterilidadeeapreservaçãodasproteínas osteoindutivasdosenxertosósseos.

Materiais

e

métodos

Apósaaprovac¸ãodoprojetopeloCEPno_238/12,_a_pesquisa_se

inicioucomaseleçãodasamostrasdecincodiáfisesfemorais obtidasdacaptaçãodetecidosósseosdecincodoadores faleci-dosdistintos,doisdosexomasculinoetrêsdofeminino,entre 39a65anos(médiade52)deacordocomoprotocolodoBanco deTecidosMusculoesqueléticosdonossodepartamento.

Ascorticaisdas diáfisesforam particuladasefoi feita a separaçãodaspartículasmenoresdoque1mme48gde teci-dosósseos(3gporamostra)de cada diáfisefemoralforam necessáriosparaaproduçãode16gruposdistintosparacada doador,totalde80amostrasprovenientesdoscincodoadores. Posteriormentepartedasamostras(42g)foi desminerali-zadaemsolução de 0,5N HCl emumbéquer de vidro, na proporçãode50mldesoluçãoporumgramadetecido,por 90 minutos àtemperatura de 18◦C+2/-2◦C.Foi usado agi-tador mecânico orbital em baixa rotação para a agitação constantedurantetodooprocessodedesmineralização.3 Pos-teriormentepartedasamostrasfoiliofilizadaoucongelada.

Paraadivisãodosgrupos,ostecidosósseos desminerali-zados(TODs)foramdivididosemdoisgrupos:lioﬁlizadosou congelados.

Asamostrasdosgrupos(TODs)liofilizadosecongelados foramirradiadasnasdosesde15,25e50kGyporduas fon-tesderadiação: aceleradordeelétrons(feixedeelétrons) e porCobalto-60(raiosgama).Asamostrasforamclassificadas como:LIO15;25;50AE,LIO15;25;50␥,CG15;25;50AEeCG 15;25;50␥.Duasamostrascontroledetecidosnãoirradiados desmineralizadosforamcriadas.

Airradiac¸ãodasamostrasfoifeitanoInstitutodePesquisas EnergéticaseNucleares(Ipen).Asamostrasdosgruposforam irradiadascomradiac¸ãogamaporfontesde60_Co_do_Irradiador

Multipropósitocomtaxadedosede0,00138kGy/souporfeixe

14 12 10 8 6 4 2 0 Proteínas mg/g T O D

*

_*

*

_*

*

LIO 15 Co-60LIO 25 Co-60LIO 50 Co-60 LIO 15 AE LIO 25 AE LIO 50 AE

CG 15 CO-60CG 25 CO-60CG 50 CO-60 CG 15 AE CG 25 AE CG 50 AE LIO 0 kGyCG 0 kGy

Figura1–Efeitosdaradiaçãoionizantenasproteínasdos TODs.Quantificaçãodasproteínastotaisextraídasda matrizósseaorgânicaemrelaçãoaosgruposirradiadose nãoirradiados(controle).Representaçãodoresultadoda dosagemdeproteínastotaisporgrupos.(*)indicadiferença estatisticamentesignificativaemrelaçãoaocontrole (p<0,05).

deelétronsdoaceleradordeelétronsindustrialcomtaxade dosede3,92kGy/s.Paraevitaravariac¸ãodatemperatura,as amostraslioﬁlizadas econgeladasforamirradiadasa4◦Ce −70◦C,respectivamente.

Para a extração das BMPs e das proteínas totais da matriz óssea, foi usado tampão com Guanidina.HCl, como descrito a seguir: foram adicionados 0,5g de tecido de cada amostra em 5mlda solução fresca de 4M Guani-dina.HCL/0,05MTris.HCLcompHde6.0,comumamisturade inibidoresdeproteases:5mMbenzamidina.HCL/0,1M6-ácido aminohexanoico/0,5mMfluoreto defenilmetilsulfonil/5mM N-etilmaleimida, sob agitação e temperatura de 4◦C por 24horas.Posteriormenteostubosforamcentrifugadosa697g porcincominutos.Osobrenadantefoiretiradoe acondicio-nadoemumsegundotubo.

Foramadicionadosnovamente5mldesoluçãofrescade 4Mguanidina.HCL/0,05MTris.HCLeamisturadeinibidores deproteasesressuspendeuosedimento.Asamostrasficaram sobagitaçãoàtemperaturade4◦Cporcincohoras.3_Após_as amostrasforamnovamentecentrifugadaseossobrenadantes adicionadosaotuboanterioreposteriormentealiquotadose congeladosa−80◦C.

Asproteínas totaiseasBMPs 2e7foram quantiﬁcadas pelosmétodosdeBradfordeElisa,respectivamente.As dosa-gens foram feitas em triplicata e o resultado foi a média aritméticadasmesmas.

Os resultadosde cada grupoforam comparadoscom os seus respectivos controles, assimcomo foram comparados oscontrolesentresi.

Aanáliseestatística dosdados foifeita porcomparac¸ão dosresultadospelométodoone-wayAnovaseguidodoteste deTukeyparadiferenc¸asestatísticasde(p<0,05).

Resultados

Natabela1efigura1,podemosobservamosaquantificação

(4)

Tabela1–Diminuiçãodaconcentraçãomédiadeproteínatotalemporcentagemdosdiferentesgruposestudadoscom relaçãoaocontrole

Gruposliofilizados mg/gTOD Redução(%) Gruposcongelados mg/gTOD Redução(%)

LIOCONTROLE 10,7 --- CGCONTROLE 11,54

---LIO15␥ 9,35 12,5 CG15␥ 9,29 13,1 LIO25␥ 8,79 17,8 CG25␥ 8,74 18,3a LIO50␥ 7,28 31,9a _CG₅₀_␥ _6,44 _39,8a LIO15AE 9,02 15,7 CG15AE 9,24 13,6a LIO25AE 8,52 20,3 CG25AE 8,74 18,3a LIO50AE 6,89 35,6a _CG₅₀_AE _6,83 _36,1a

a _Indica_diferença_{estatisticamente}_{significativa}_em_relação_ao_controle_(p_<_0,05).

(TOD)easreduçõesgradativasnasconcentraçõesmédiasnos gruposirradiadosemrelaçãoaosseusrespectivoscontroles (nãoirradiados).Asalteraçõesestatisticamentesignificativas foramobservadasnosgrupos LIO50␥(31,9%),LIO50 ␥AE (35,6%),CG25␥(18,3%),CG50␥(39,8%),CG15AE13,6%,CG25 AE(18,3%)eCG50AE(36,1%).

As BMPs 2 e 7 foram quantificadas com o objetivo de analisar os efeitos da radiação ionizante e as possíveis alteraçõesnasconcentraçõesdessasproteínas.Osresultados dasconcentraçõesobtidasforamcorrelacionadosemgramas deTODeporgramadeproteínatotal.

Osresultadosobtidosnosgruposanalisadosforam regis-tradosnastabelas2e3,nasquaisobservamososresultados daconcentraçãomédiadeBMP-2eBMP-7,em␮g/geng/g, respectivamente.Nosgruposliofilizadosecongelados nota-mosaredução,emporcentagem,dasconcentraçõesmédias deBMP-2eBMP-7nosdiferentesgruposirradiadosemrelação aocontrole(nãoirradiado).

Natabela2eﬁgura2,podemosnotarosefeitosdaradiac¸ão

ionizante nas concentrações de BMP-2 dos grupos estuda-dos.Asalteraçõesestatisticamentesignificativascomredução dasconcentraçõesmédiasemrelaçãoaorespectivocontrole foramobservadasnosgruposLIO50AE(32,6%),CG50␥(27,2%) eCG50AE(39,4%).

Natabela3eﬁgura3,podemosnotarosefeitosdaradiac¸ão

ionizantenas concentrações de BMP-7, nosdiferentes gru-posestudados.Asalteraçõesestatisticamentesignificativas comreduçãodasconcentraçõesmédiasdeBMP-7emrelação aorespectivocontroleforam observadasnosgruposLIO15 AE (26,9%), LIO 25 AE (32,4%), LIO 50 AE (41,7%), CG 50 ␥

*

4.000 3.500 3.000 2.500 2.000 1.500 1.000 0,500 0,000

LIO 15 yLIO 25 yLIO 50 y LIO 15 AE LIO 25 AE LIO 50 AE CG 15 yCG 25 yCG 50 y CG 15 AE CG 25 AE CG 50 AE

LIO controleCG controle

BMP - 2 μ g/g T O D

Figura2–Efeitosdasradiaçõesgamaefeixedeelétrons nasconcentraçõesdeBMP-2porgramadeTODnosgrupos estudados.(*)indicadiferençaestatisticamentesignificativa emrelaçãoaocontrole(p<0,05).

(44,1%), CG 15 AE (36,4%), CG 25 AE (39,3%) e CG 50 AE (52,6%).

Nas ﬁguras 4 e 5, podemos observar as concentrac¸ões

médiasdeBMP-2emrelaçãoàsproteínastotaisdosadasnos gruposirradiadosenãoirradiados.Houvealteração significa-tivaestatisticamentenosgruposLIO50␥eCG50␥emrelação aocontrole.

Nasﬁguras6e7observamosasconcentrac¸õesmédiasde

BMP-7emrelaçãoàsproteínastotaisdosadasnosgrupos irra-diadosenãoirradiados.Notamosdiferençasestatisticamente significativasnosgruposLIO50␥,CG15AE,CG25AE,CG50 AEemrelaçãoaosrespectivoscontroles.

Tabela2–RegistrodasdosagensdeBMP-2dosgruposestudados.ReduçãodaconcentraçãodaBMP-2dosgrupos irradiadosemporcentagemcomrelaçãoaocontrole(nãoirradiado)

Gruposliofilizados BMP-2␮g/gTOD Redução(%) Gruposcongelados BMP-2␮g/gTOD Redução(%)

LIOCONTROLE 2,82 CGCONTROLE 3,27

LIO15␥ 2,84 0 CG15␥ 2,72 16,8 LIO25␥ 2,83 0 CG25␥ 2,7 17,4 LIO50␥ 2,81 0,3 CG50␥ 2,38 27,2a LIO15AE 2,82 0 CG15AE 2,67 18,3 LIO25AE 2,82 0 CG25AE 2,66 18,6 LIO50AE 1,9 32,6a _CG₅₀_AE _1,98 _39,4a

(5)

Tabela3–ReduçãodaconcentraçãodasBMPs7dosgruposirradiadosemporcentagemcomrelaçãoaocontrole(não irradiado)

Gruposliofilizados BMP-7ng/gTOD Redução(%) Gruposcongelados BMP-7ng/gTOD Redução(%)

LIOCONTROLE 138,66 CGCONTROLE 148,2

LIO15␥ 128,42 7,4 CG15␥ 133,29 10,1 LIO25␥ 125,46 9,5 CG25␥ 122,03 17,6 LIO50␥ 117,33 15,4 CG50␥ 82,85 44,1a LIO15AE 101,25 26,9a _CG₁₅_AE _94,2 _36,4a LIO25AE 93,78 32,4a _CG₂₅_AE _89,97 _39,3a LIO50AE 80,77 41,7a _CG₅₀_AE _70,18 _52,6a

a _Indica_diferença_{estatisticamente}_{significativa}_em_relação_ao_controle_(p_<_0,05).

180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 BMP - 7 ng/g T O D

*

LIO 15 yLIO 25 yLIO 50 y LIO 15 AE LIO 25 AE LIO 50 AE CG 15 yCG 25 yCG 50 y CG 15 AE CG 25 AE CG 50 AE LIO controleCG controle Figura3–Efeitosdasradiaçõesgamaefeixedeelétrons nasconcentraçõesdeBMP-7porgramadeTODnosgrupos estudados.(*)indicadiferençaestatisticamentesignificativa emrelaçãoaocontrole(p<0,05).

Discussão

Oaumentodousodosenxertosdetecidomusculoesquelético emcirurgiasdereconstruçãoeoobjetivodepromoveruma maiorsegurançanostransplantesenaqualidadedostecidos levaramosbancosdetecidosabuscarmelhorestécnicasde processamento,preservaçãoeesterilização.

A radiação gama é a mais usada nos bancos de teci-dos edemonstra ser um método eficaz para proporcionar esterilizaçãoterminaldotecidobiológico,porém hárelatos

600 500 400 300 200 100 0 BMP - 2 Pg/ μ g proteína

LIO 15 y LIO 25 y LIO 50 y

LIO 15 AE LIO 25 AE LIO 50 AE LIO controle

*

Figura4–RelaçãoentreaconcentraçãodeBMP-2ede proteínastotaisespecíficasdecadagrupodetecido liofilizadonãoirradiadoeirradiadocomradiaçãogama efeixedeelétrons.(*)indicadiferençaestatisticamente significativaemrelaçãoaocontrole(p<0,05).

*

600 500 400 300 200 100 0 BMP - 2 Pg/ μ g proteína CG 15 y CG 25 y CG 50 y CG 15 AE CG 25 AE CG 50 AE CG controle Figura5–RelaçãoentreaconcentraçãodeBMP-2ede proteínastotaisespecíficasdecadagrupodetecido congeladonãoirradiadoeirradiadocomradiaçãogama efeixedeelétrons.(*)indicadiferençaestatisticamente significativaemrelaçãoaocontrole(p<0,05).

sobreosefeitosdeletériosdaspropriedadesmecânicase bio-lógicasdostecidos,adependerdadosederadiaçãoaplicada.5 Aradiaçãoporfeixedeelétronséumaopçãopromissora noprocessodeesterilizaçãodostecidosetemalgumas van-tagenscomparadascomaradiaçãogama,taiscomooperação comumsistemarápidodetransferênciadaradiação.A prin-cipal desvantagem é o baixopoder de penetrabilidadedos feixesdeelétronsnosmateriais,quedificultaou impossibi-litaairradiação,adependerdaestruturaedadensidadedos tecidos.

LIO 15 y LIO 25 y LIO 50 y LIO 15 AE LIO 25 AE LIO 50 AE LIO controle BMP - 7 Pg/ μ g proteína

*

18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

Figura6–RelaçãoentreaconcentraçãodeBMP-7ede proteínastotaisespecíficasdecadagrupodetecido liofilizadonãoirradiadoeirradiadocomradiaçãogama efeixedeelétrons.(*)indicadiferençaestatisticamente significativaemrelaçãoaocontrole(p<0,05).

(6)

*

CG 15 y CG 25 y CG 50 y CG 15 AE CG 25 AE CG 50 AE CG controle BMP - 7 Pg/ μ g proteína 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

Figura7–RelaçãoentreaconcentraçãodeBMP-7ede proteínastotaisespecíficasdecadagrupodetecido congeladonãoirradiadoeirradiadocomradiaçãogama efeixedeelétrons.(*)indicadiferençaestatisticamente significativaemrelaçãoaocontrole(p<0,05).

AatividadeeaconcentraçãodasBMPsedosfatoresde cres-cimentopertencentesaosTGF-␤sãoessenciaisparaaeficaz osteoinduçãodosenxertosósseos,porémpodemser degrada-dosduranteoprocessodeesterilizaçãoporradiaçãoionizante e,portanto,comprometerotransplanteósseo.9

A técnica de quantificação das proteínas é um impor-tante parâmetro,pois aosteoindução e aosteogênese são processosfuncionaisdosenxertosósseosedependem quan-titativamentedaexistênciadasproteínasósseasefatoresde crescimento.Existeumacorrelaçãopositivaentreos conteú-dosdeBMPspresentesnosenxertoseaosteoindutividade.4,10 Existemestudoscomresultadoscontroversossobreos efei-tosdaradiaçãogamanopotencialosteoindutivonosenxertos ósseosdesmineralizados.Em1988Muntingetal.11 concluí-ramqueaosteoinduçãoétotalmenteinibidacomdosesde radiação gama superiores a 20 kGy.Os estudos sefizeram coma implantaçãodeTODs nosmúsculos de ratose coe-lhos.Porémtodososenxertosforamirradiadosàtemperatura ambiente,oquepodeexplicarocomprometimentoda quali-dadedostecidos.

Emcontraste,outrosautores12,13_irradiaram_os_TODs_com radiaçãogamaemcondiçõescontroladasdetemperaturacom ousodegelosecoeobtiveramresultadospromissores,oque reforçaahipótesedequeostecidosósseosirradiadosabaixas temperaturassãomenossuscetíveisàradiação.Wientroube Reddi13_concluíram_que_uma_dose_padrão₍₂₅_kGy)_de_radiação gamanãoalterouopotencialosteoindutivodosTODs implan-tadosemmúsculoderatoedosesmaiselevadas(30a50kGy) atéaumentaramessapropriedade.

Damesmaforma,Glowacki14_em₂₀₀₅_relatou_que_os_TODs irradiadoscom dosesde 20kGya40 kGymantiveram80% dasuaatividadeosteoindutiva.Dziedzic-Goclawskaem2002 divulgouosresultadosencontradosdostecidosósseos conge-ladosàtemperaturade−72◦Ceirradiadoscomdosesde35 kGye50kGyeconcluiuquenãohaviadiferençasnopotencial deosteoinduçãoquandocomparadocomos tecidosósseos nãoirradiados.Entretanto,ostecidospreservadosliofilizados eirradiadosatemperaturaambientenasmesmasdosesforam completamentereabsorvidoseperderamacapacidadede pro-duziraosteoindução.

Comosresultadosobtidosdosefeitosdaradiaçãoionizante naconcentraçãodas proteínas osteoindutoras,no presente estudo,conformeregistradosnatabela2efigura2, constata-mosareduçõessignificativasdeBMP-2emrelaçãoaocontrole (nãoirradiado)somentenosgruposirradiadosnasdosesde 50kGy(LIO50AE,CG50␥eCG50AE).Asmaioresreduções (acimade32%)foramencontradasnosgruposirradiadospor aceleradordeelétrons.Nasdosesde15e25kGy,emquaisquer dascondições,nãoobservamosvariaçãodose-dependente.

OsresultadosdadosagemdaBMP-7,conformetabela3e

figura3,evidenciam reduçõessignificativasemrelação aos

respectivoscontrolesemtodososgruposirradiadospor ace-leradordeelétrons(LIO15 AE,LIO25 AE,LIO50AE,CG15 AE,CG25AE,CG50AE)enogrupocongeladoirradiadopor radiaçãogamanadosede50kGy(CG50␥).Nosgruposnos quaisareduçãonãofoisignificativa,pudemosobservaruma tendênciaaumadiminuiçãodose-dependente(de7a18%).

Comparandoosefeitosdaradiaçãonosgruposliofilizados econgeladosestudados,apesardenãoserestatisticamente significativo,osgruposcongeladostiverammaiorreduçãoda concentraçãodasproteínastotais(13,1a36,1%)edas BMP-2(16,8a39,4%)eBMP-7(10,1a52,6%)quandocomparados comosgruposliofilizados(12,5a35,6%;0,0a32,6%;7,4a41,7, respectivamente). Essa evidência pode ser explicada pelos maioresefeitosbiológicosindiretosdaradiaçãoionizantenos tecidosqueapresentamamaiorpresençadeágua,pela radió-lisedamesma,quegeramaioresquantidadesderadicaislivres econsequentementeproduzpossíveisdanosaostecidos.15

Nas ﬁguras 4 e 5 notamos um aumento signiﬁcativo

naconcentraçãomédiadeBMP-2porgramadeproteínana dose de 50 kGy por radiação gama nos grupos, congelado eliofilizado.Nafigura6,notamosaumentosignificativona concentraçãomédiadeBMP-7porgramadeproteínanogrupo liofilizadoeirradiado nadosede50 kGy.Na figura7houve reduçãosignificativanasconcentraçõesmédiasdeBMP-7por gramadeproteínanasamostrasdosgruposcongeladose irra-diadosporfeixedeelétronsnasdosesde15,25e50kGy.Esse fatodeve-seaosdiferentesefeitos dasradiaçõesionizantes nasconcentraçõesdeproteínastotaisenasproteínas especí-ficas(BMP2e7).

Portanto os efeitos da radiação ionizante em provocar danosaosenxertosósseosdependemprincipalmentededois fatores:(1)ascondiçõesdairradiação(dosederadiação,taxa dedose,tipoderadiaçãoionizante,temperaturaderadiação); (2)oestadofísicodasamostras,principalmentenaquantidade deáguapresentenostecidosósseos.15

Conclusão

Aradiaçãoionizanteemaltasdoses(50kGy)causareduções significativas,entre35% a52%,nasconcentrações das pro-teínastotaiseemproteínas osteoindutoras(BMP2e7).Foi observadotambémquearadiaçãoporfeixedeelétrons pro-voca mais efeitos deletérios do que a radiação gama nas quantidadesdeproteínasósseasestudadas.Entretantoessas condiçõesnãosãousualmenteaplicadasnaesterilizaçãodos tecidosósseos.

Nascondic¸ões deesterilizac¸ãodostecidosnormalmente aplicadasaostecidosósseos(15kGya25kGyporraiosgama),

(7)

asreduc¸õesnasconcentrac¸õesdeproteínasosteoindutivas, BMP-2eBMP-7,forammenoresdoque20%.

Conﬂitos

de

interesse

Osautoresdeclaramnãohaverconﬂitosdeinteresse.

r

e

f

e

r

ê

n

c

i

a

s

1. AmatuzziMM,CrociAT,GiovaniAMM,SantosLAU.Banco

detecidos:estruturac¸ãoenormatizac¸ão.RevBrasOrtop.

2000;35(5):165–72.

2. UristMR,HuoYK,BrownellAG,HohlWM,BuyskeJ,LietzeA,

etal.Puriﬁcationofbovinebonemorphogeneticproteinby

hydroxyapatitechromatography.ProcNatlAcadSciUSA.

1984;81(2):371–5.

3. PietrzakWS,AliSN,ChitturiD,JacobM,Woodell-MayJE.BMP

depletionoccursduringprolongedaciddemineralizationof

bone:characterizationandimplicationsforgraftpreparation.

CellTissueBank.2011;12(2):81–8.

4. BlumB,MoseleyJ,MillerL,RichelsophK,HaggardW.

Measurementofbonemorphogeneticproteinsandother

growthfactorsindemineralizedbonematrix.Orthopedics.

2004;27Suppl1:s161–5.

5. NguyenH,MorganDA,ForwoodMR.Sterilizationofallograft

bone:effectsofgammairradiationonallograftbiologyand

biomechanics.CellTissueBank.2007;8(2):93–105.

6. PhillipsGO.Sterilisation.InMultimediadistancelearning

packageontissuebanking(Module5:Processing).Singapore:

InternationalAtomicEnergyAgency(IAEA)/National

UniversityofSingapore(NUS).RegionalCo-operative

AgreementforAsiaPaciﬁc(RCA).1997:47–60.

7. Dziedzic-GoclawskaA.Theapplicationofionisingradiation tosteriliseconnectivetissueallografts.In:PhillipsGO.

RadiationandTissueBanking.Singapore:WorldScientiﬁc; 2000.p.57-99.

8.PekkarinenT,HietalalO,JämsäT,JalovaaraP.Gamma

irradiationandethyleneoxideinthesterilizationofnative

reindeerbonemorphogeneticproteinextract.ScandJSurg.

2005;94(1):67–70.

9.PuolakkainenPA,RanchalisJE,StrongDM,TwardzikDR.The

effectofsterilizationontransforminggrowthfactorbeta

isolatedfromdemineralizedhumanbone.Transfusion.

1993;33(8):679–85.

10.RipamontiU,VanDenHeeverB,SampathTK,TuckerMM,

RuegerDC,ReddiAH.Completeregenerationofboneinthe

baboonbyrecombinanthumanosteogenicprotein-1(hOP-1,

bonemorphogeneticprotein-7).GrowthFactors.

1996;13(3-4):273–89.

11.MuntingE,WilmartJF,WijneA,HennebertP,DelloyeC.Effect

ofsterilizationonosteoinduction.Comparisonofﬁve

methodsindemineralizedratbone.ActaOrthopScand.

1988;59(1):34–8.

12.Dziedzic-GoclawskaA,OstrowskiK,StachowiczW,MichalikJ,

GrzesikW.Effectofradiationsterilizationonthe

osteoinductivepropertiesandtherateofremodelingofbone

implantspreservedbylyophilizationanddeep-freezing.Clin

OrthopRelatRes.1991;(272):30–7.

13.WientroubS,ReddiAH.Inﬂuenceofirradiationonthe

osteoinductivepotentialofdemineralizedbonematrix.Calcif

TissueInt.1988;42(4):255–60.

14.GlowackiKA.Hemiresectionarthroplastyofthedistal

radioulnarjoint.HandClin.2005;21(4):591–601.

15.Dziedzic-GoclawskaA,KaminskiA,Uhrynowska-Tyszkiewicz

I,MichalikJ,StachowiczW.Trendsinradiationsterilizationof

healthcareproducts.Vienna:InternationalAtomicEnergy

Agency;2008.p.231–56.Disponívelemhttp://wwwpub.

iaea.org/MTCD/publications/PDF/Pub1313web.pdf.