DETERMINACIÓN DE BACTERIAS AEROBIOS MESÓFILOS VIABLES

Microbiología de los Alimento I

DETERMINACIÓN DE BACTERIAS AEROBIOS MESÓFILOS

VIABLES

I.

Introducción:

El análisis de los alimentos está catalogado por diversas técnicas y métodos para determinar microorganismos que se encuentran viables en los alimentos ya sean sólidos como las carnes, verduras y frutas, o líquidos ya sea leche y jugos de frutas; entre estos métodos tenemos la numeración de microorganismos aerobios mesófilos, la cual nos permite determinar cuántos microorganismos contaminantes presenta un alimento sobre su superficie o en su interior. Según la norma técnica Peruana para la leche cruda (NTP 202.086:2001) y la norma técnica Peruana para jugos de frutas (NTP 203.002:1979) establecen que el numero de microorganismos aerobios mesófilos y facultativos deben ser hasta un máximo de 1000000 ufc/ml, para que puedan ser consumidos por la población.

Por otro lado las técnicas para poder encontrar la numeración de aerobios mesófilos viables son: el recuento de colonias en placa por profundidad, superficie o por goteo; otro el Método del número más probable (MPN) de gérmenes como cálculo estadístico del número de células viables.

El recuento total de bacterias en placa es un método útil para obtener una idea del grado de frescura o pronta alteración de los alimentos, dependiendo de la cantidad de bacterias presentes. La mayoría de los alimentos deben ser considerados como inadecuados para el consumo cuando contienen un gran número de microorganismos, aun cuando estos microorganismos no sean conocidos como patógenos y no hayan alterado de forma apreciable los caracteres organolépticos del alimento. (Thatcher y Clark, 1973)

La presencia de microorganismos aerobios mesófilos en los alimentos puede ser relacionada directamente con la manipulación, el estado de frescura o de descomposición del producto y la temperatura de conservación del producto. Un número relativamente bajo de estas bacterias no es sinónimo de buena calidad bacteriológica del alimento, ya que puede contener microorganismos que producen enterotoxinas o son patógenos. (Venegas y col., 1990).

Microbiología de los Alimento I La aplicación de este método se basa fundamentalmente en que, si el recuento es efectuado luego de un profundo conocimiento de la manipulación antes del muestreo (temperatura, empaque y otros), puede proporcionar una medida comparativa del grado general de contaminación bacteriana e higiene aplicada (FAO, 1998).

En el grupo de los mesófilos aerobios se incluyen todas las bacterias, mohos y levaduras capaces de desarrollarse a 30º C en las condiciones establecidas. En este recuento se estima la microflora total sin especificar tipos de microorganismos.

Refleja la calidad sanitaria de un alimento, las condiciones de manipulación, las condiciones higiénicas de la materia prima.

Un recuento bajo de aerobios mesófilos no implica o no asegura la ausencia de patógenos o sus toxinas, de la misma manera un recuento elevado no significa presencia de flora patógena. Ahora bien, salvo en alimentos obtenidos por fermentación, no son recomendables recuentos elevados.

Un recuento elevado puede significar: Excesiva contaminación de la materia prima. Deficiente manipulación durante el proceso de elaboración. La posibilidad de que existan patógenos, pues estos son mesófilos. La inmediata alteración del producto.

El recuento de mesófilos nos indica las condiciones de salubridad de algunos alimentos.

II.

Objetivos:

 Conocer el número de microorganismos aerobios mesófilos que contiene un alimento

 Familiarizarse con métodos directos para la obtención de microorganismos utilizando el método de recuento de colonias en placa.

 Determinar si el producto alimenticio que se analiza está en condiciones aptas para el consumo humano.

 Determinar cuántos microorganismos presenta la muestra que analizamos.

III. Materiales:

Microbiología de los Alimento I  Jugo de Soya.

 Material de laboratorio:

 Medio de cultivo: Agar Plate Count  Diluyente: Agua peptonada 0.1 %  Pipetas: (1ml y 10 ml).  Micropipeta.  11 Placas Petri.  Ansa calibrada  Mechero.  Balanza.  Estufa (29º - 31 ºC).  Tubo de dilución.  Espátula de Drigalsky

IV.

Procedimiento:

i) Si es muestra liquida se deberá guardar en refrigeración antes de el análisis correspondiente, para disminuir el metabolismos bacteriano. Y se deberá medir en mililitros.

ii) Si a muestra es solida o semisólida y está congelada, debemos esperar a que se descongele a medio ambiente.

iii) Si la muestra solida o semisólida se encuentra a Tº ambiente, se procederá con el análisis.

iv) Para diluir las muestras solidas es necesario licuarlas, tal es el caso de las verduras. Y luego se pesara.

Microbiología de los Alimento I v) Las diluciones se deberán preparar de la siguiente manera:

 Para muestras liquidas:

 De la muestra madre sacar 3 ml y diluirlos en 27 ml de agua Peptonada.

 Luego pasar un 1 ml a cada tubo con 9 ml de agua Peptonada, hacer progresivamente hasta llegar a la dilución

10

b) Técnicas empleadas:

i) Método de placa vertida - Profundidad:  Primero se diluye la muestra a analizar.

 Luego se saca con una pipeta 1 ml de todas las diluciones y se vierten en dos placas por dilución.

 Después de esto rápidamente agregamos el Agar Plate Caunt, homogenizamos con 5 movimientos lentos de arriba hacia abajo y de derecha – izquierda.

 Para fines de la práctica solo trabajaremos con la dilución 10-3.

Por lo que solo utilizaremos 6 placas.

Microbiología de los Alimento I

10

10

10

Microbiología de los Alimento I 3 ml de jugo de soya

+ 27 ml de Agua Peptonada al 0.1%

Agregamos el Agar Plate Count, sobre el mililitro y homogenizamos

B 10-1

A 10-1 B 10

-2

A 10-2 A 10-3 B 10-3

Procedimiento del método a Profundidad

Placas con Agar Plate Count, con las diluciones de 10-1 has 10 a la10-6.

Microbiología de los Alimento I ii) Método de Superficie:

 De la dilución 10-

_¹,

sacamos 1 ml y hacemos las diluciones hasta 10-6.  Luego en una placa servida con Agar Plate Count, agregamos 1 ml sobre

la superficie.

 Inmediatamente procedemos a expandir el mililitro sobre la superficie con la espátula de Drigalsky.

 Con fines de la practica solo se trabaja hasta la dilución 10-3

y con tan solo 1 placa por dilución

10

10

10

Se extiende el mililitro sobre la superficie de la placa con

la espátula de Drigalsky A 10-1

B 10-2

Microbiología de los Alimento I

Procedimiento del método a Profundidad

De la dilución 10-

¹

Del tubo con la dilución 10--2

sacamos 1 ml y lo pasamos al tubo siguiente

Hasta la dilución 10--3

Dilución 10--3

Agregamos 1ml de cada dilución a sus respectivas

placas coma Agar plate count.

Con la espátula de Drigalsky extendemos la

muestra sobre toda la superficie de la placa

A 10-1

B 10-2

Microbiología de los Alimento I iii) Método de Goteo:

 Con una micropipeta sacamos 20 ul, y dejamos caer a manera de gota sobre un lado de la placa con Agar Plate Caunt. Este procesdimiento se realiza dos veces en la misma placa en lados opuestos.

Microbiología de los Alimento I

V.

Resultados:

MÉTODO

CONTEO x TIEMPO

24 H

48 H

Total

Promedio

Total

Promedio

En Profundidad

10

A

Incontable

---

Incontable

---

10

B

Incontable

Incontable

10

A

Incontable

---

Incontable

---

10

B

Incontable

Incontable

10

A

154

138 146

135

198

170 184

189

10

B

140

105 123

220

165 193

Por Goteo

10

160

160

198

198

10

140

140

188

188

Por superficie

10

Incontable

---

Incontable

---

10

Incontable

Incontable

10

111

118

115

143

150

147

Microbiología de los Alimento I  De los resultados obtenidos se interpretó de la siguiente. manera:

 Para el método de conteo por profundidad:

 Como se puede observar en el cuadro solo se pudo realizar el conteo en la dilucion10-3, de las diluciones se sacó el promedio por horas y cuadrantes.

 En la dilución 10-3

se obtuvo (en promedio) a las 24 h. 135 colonias y a las 48 h. 189 colonias. Ufc/gr de muestra = Nº de colonias x Factor de dilución Ufc/gr de muestra = 189 x 103 = 19 x 104 ufc/gr

 El recuento de bacterias aerobias mesófilas viables es igual de 19 x 104ufc/gr en la muestra liquida de jugo de soya.

 Para el método de conteo por Goteo.

 Se realizo el conteo en las dos diluciones 10-2

y 10-3, de los cuales se obtuvo el promedio por horas.

 En la dilución 10-2

se obtuvo (en promedio) a las 24 h. 160 colonias y a las 48h. 198 colonias.

 En la dilución 10-3

se obtuvo (en promedio) a las 24 h. 140 colonias y a las 48 h. 188 colonias.

 Para que los resultados de las diluciones estén bien la dilución menor debe contener a la mayor en 2 veces, así que dividimos:

A las 24 h. A las 48 h. 10-2 → 160 = 1.15 10 -2 → 198 = 1.05 10-3 → 140 10-3 → 188

 La solución más cercana a 2 es la de 24h, y se tomaría la dilución más alta (10-2 ). Entonces el número de UfC/ ml de muestra es: 160 x 10-2 = 16 x 10-3. ufc/ml

Microbiología de los Alimento I  Por lo tanto el número de M.O aerobios mesófilos viables de jugo de

soya es: 16 x 10-3.ufc/ml.

 Para el método de Superficie:

 En este método se obtuvo que a las 24 horas se contaron un promedio de 115 colonias y a las 48 h un promedio de 147.

 El promedio de ambos conteos es de 131. Entonces el numero de UFC/ml de muestra es 13 x 10- 4

.

 Por lo tanto el número de microorganismos aerobios mesófilos obtenidos por este método equivale a 13 x 10- 4

.

VI.

Conclusiones:

VII. Cuestionario:

a. ¿Qué otras sustancias se utilizan como diluyentes para realizar los análisis microbiológicos en alimentos?

Además del Agua de Peptona Tamponada (BPW), es muy común el uso del Diluyente Agua de Triptona (Tryptone Water: TW) y la Solución Tinger ¼, cuyas composiciones son las siguientes:

Tryptone Water Solución Tánger ¼ BPW

Triptona 10 g Cloruro sódico 9 g Peptona 10 g

Cloruro de sodio

5 g Cloruro cálcico

anhidro

0.42 g Cloruro sódico 5 g

Agua destilada 1 000 mL Hidrógeno carbonato sódico

0.20 g Fosfato sódico 9 g

Agua destilada 1 000 mL Fosfato potásico 1.5 g

Agua destilada 1 000

mL

También se podría usar el Solución Salina Fisiológica (SSF) como diluyente, esta solo contiene 0.900 g de cloruro de sodio para 100 mL de agua destilada.

Microbiología de los Alimento I b. ¿Por cuánto tiempo y a cuántas revoluciones por minuto se debe tratar una

muestra sólida para ser homogenizada?

Para tratar una muestra sólida hay que licuarla o triturarla en un vaso esterilizado de licuadora a una velocidad aproximada de 14.000 rpm y en un tiempo medio de 60-90 segundos.

c. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de los tres métodos usados?  Ventajas:

 Se obtienen resultados rápidos de un día para otro.

 Hace un recuento “total” que incluye todas las bacterias, mohos y levaduras capaces de desarrollarse a 30 ºC en las condiciones establecidas, además refleja la calidad sanitaria de un alimento, las condiciones de manipulación y las condiciones higiénicas de la materia prima.

 Se puede aplicar para productos sólidos como carnes, verduras, mariscos.

 Desventajas

 solo son susceptibles del contaje aquellos microorganismos capaces de crecer en las condiciones establecidas, además se estima la microflora total sin especificar los tipos de microorganismos y por último, si tener un recuento bajo de aerobios mesófilos eso no nos asegura la ausencia de patógenos o sus toxinas; de la misma manera que un recuento elevado no significa presencia de flora patógena.

 No diferencia microorganismos patógenos de la flora común.  El procedimiento está sujeto a error.