Comparación entre el potencial de las regiones variables del 16S rRNA para la identificación de Lactobacillus spp
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(2) Son utilizados como probióticos la mayorı́a de cepas de Lactobacillus spp. pertenecientes al phylum Firmicutes, clase Bacilli, orden Lactobacillales [4]. En el cuerpo humano pueden encontrarse en el intestino, cavidad oral, leche y vagina. En el intestino, superando de diez a veinte veces las células de todos los tejidos del cuerpo [5]. En el tracto vaginal superan el 70% de la microbiota actuando como protectoras de la mucosa mediante adherencia al epitelio, producción de agentes antimicrobianos y coagregación con patógenos, se han aislado cepas de Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus amylivorus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus jensenii y Lactobacillus iners [6,7]. En la leche pueden encontrarse confiriendo propiedades anti-infecciosas a neonatos y niños lactantes menores de un año. Han sido aisladas cepas de Lactobacillus gasseri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus plantarum y Lactobacillus fermentum [8, 9].. y tkt4 [12] mostrando su poder altamente discriminatorio. La subunidad ribosomal 16s se utiliza comúnmente para análisis filogenéticos y clasificación ya que es fundamental para el desarrollo de los microorganismos y la tasa de cambios evolutivos permite la diferenciación a nivel de especies; sin embargo, se ha encontrado que pueden existir de 1 a 15 copias de los operones rrn en un genoma microbiano de las cuales aproximadamente solo el 40% tienen una copia idéntica [13]. Por otro lado, el RNA ribosomal se caracteriza por la conservación de su estructura secundaria (figura 1), ya que esta determina interacciones a corto y largo alcance que organizan la molécula en dominios y son responsables de su papel biológico [14]. Todo esto permite agrupar las secuencias nucleotı́dicas basándose en la estructura secundaria que resulta más conservada que la estructura primaria, este análisis se puede realizar usando programas que emplean algoritmos que incluyen modelos de covarianza de las estructuras como Infernal (Inference of RNA alignments) [15]. Algunas herramientas computacionales desarrolladas incluyen análisis de secuencias de 16S rRNA teniendo en cuenta la estructura secundaria: RDP (Ribosomal Database Project Classifier) [16] que utiliza el algoritmo de naı̈ve Bayesian classifier dando información hasta género de la secuencia de interés con un porcentaje de confianza del 98%; y STAP (ss-RNA Taxonomy Assigning Pipeline) [17] cuyo algoritmo funciona generando alineamientos y rutas evolutivas tomadas por el gen a lo largo del tiempo.. Sin embargo, a pesar de la alta frecuencia de Lactobacillus spp. en humanos, las técnicas clásicas de detección no son suficientes para establecer su contenido total en el cuerpo, esto es dado que algunas especies no se pueden cultivar en el laboratorio y en aquellas que son cultivables las técnicas bioquı́micas no llegan a distinguir cepas de una misma especie, por lo cual se han desarrollado técnicas moleculares para su identificación y/o clasificación [3]. Se han realizado estudios filogenéticos comparando diferentes especies comerciales utilizando genes como 16s rRNA, groEL, rpoA, que codifican para una subunidad ribosomal, una chaperona y subunidad de la RNA polimerasa, respectivamente, con lo cual se ha comprobado que este es un grupo monofilético. También se han genotipado lactobacilos por análisis de ERIC (Secuencias repetitivas consenso de enterobacterias) dado que cada una presenta una marca de repeticiones similar a los STR en humanos [4], i.e., altamente discriminantes. Además se han hecho estudios utilizando la técnica MLST (Multilocus Sequence Typing) la cual consiste en secuenciar regiones de genes house-keeping de aproximadamente 450pb asignando números aleatorios para cada secuencia única, de este modo se determina un perfil alélico para cada cepa con el cual se pueden establecer dendogramas [10]; ası́ se han logrado diferenciar cepas de L. casei con base en los genes fusA, ileS, lepA, leuS, pyrG y recG [11] y L. paraplantarum con base en los genes pgm, ddl, gyrB, purK1, gdh, mutS. INFERNAL tiene varios programas con los cuales se logran construir modelos de covarianza de alineamientos con base en las estructuras, permite calibrarlos por homologı́a y buscar en las bases de datos por homologos. Finalmente con estos modelos establecidos alinea homólogos definidos por el usuario [15]. RDP classifier se basa en la taxonomı́a de procariotas de Bergeys, asume que todas las secuencias son independientes y establece priors para la clasificación de género que serán utilizados para el cálculo de la probabilidad posterior según el teorema de Bayes. Adicionalmente hace un bootstrap de 100 repeticiones, asignando por consenso de la mayorı́a cada taxa [16].. 2.
(3) Secondary Structure: small subunit ribosomal RNA A A U G U U G C G C G C U GC A G CA A U A G C A AG U U G U CC G U A CGA GU CCUUG UCAUUAG CC CAU U A UG A A A A UGC G GCG A UA UGGA A GA A C G G A A A GUA A UC GG GU G U G UGCUCG G A AG G G G U U G C U UGUA CCUC GG G C GG U GGCG A A U U AA C A A U G G U G G C G C G G C A U A A G A U A G C A GU C G C G G C U A U U G U A GA G C G C A G U U A U G G C U A U A A G G C G C A C G UC G A C G G C G UC U G U A C G A G C C G C G G A U CU A U C G U A A G U A C G A C G ACA G C G A C U A G U CA G A U A UA CGGNGU U G G G C A U A G C A C G A C G C G C G A U G C C U A AC G U U U U A AG U AA G C G U G G G G CU U GG A C A U A U C A U AA G C C A C C U A A A CCGA GGAA UGCA UCGGA C U GUUUUUC U A U U A U U G C U UC GU C C G C U U U C GGCUCCC G A U A GUGUA GUCU G A UA A GA A GG C CG G G C A C G G C C G U A G A A A G CG A A A G C G G A G C C A G A U AG U U N U G CN A C GC C C UA C G U U G A C U C G A C G A G G G A U C G G C G UA U G G A AA U G U G A G U G C U CG A A C A CU GCC A G UU UG A G CC A A U A C G C G G A U AAU A A A U C G CUCACG C UG G C G CA C G GA C A C C A G G A A G U A G CG C A G G C U G C U U A A C A G C G G G UA C G U U G C GA G C A A U G C C U A U A C G C A G G G A G AU U A A U A U C G U U C C CA A U C G A U U AA A GUA G G U A C G A C G C U A U A U GGG U GA CCG A U U CA G CGG G C G U U A G A U G C C A GA G G AA A G CAA A A C U C A U A C U U G G A U U G A U A A A G A A A G U G AU U A A U A C G UA C G A G U G U A G GG C G C G A C CG G A G A A A G G C U U U U G A C G GGN C C C G AC A C G U C A C C C A U U G C A CGGU CCU C U G U A C G C G G U G U A C U G U U C C G G G C UG GA A G U G U G G U A C A U C U C U U U GA A G G A U C U C UAA GA G G C G U CU A A G A A C G N C A U G A G GA UC GCUC G U A G C C A A G A G C A G A A C A U A C C G U C A A U U G G U G A G G U G U U A C G U G C A G G C C C U A G AGAA C G G C A G A G G A A C A CG N C C C G C C A G G A C GU G G A C N C G NNNNNNNNNN N G G N U C A GUCUG A UGGA G G G A N U A C C U U N U G A G A A C N C NNNNNNGUCC A C C A G G U A C C U C N G U G C A A G U U AAC 5’ G C A C G C NN A A C A N U U A CA A C N C G C N A C G C A N C C G U N UA U G N A U A C G C A U C G A CA G U A G U U N C G G U A U G C G U A G C C U C A G C G A G U C G A U A C A U G C C A GA C G CA CG GA U A GA A U A A A G GCC C U G U C G C G A G C C C A A C U C A C 3’ A A A G G U U A A C GU CA GGGUU G C CGG CGA UCG GGUUG A GUGG G AG C G C U G C AC GA A G AG AA A C G U U C C G G A CG A UU A GC C A A GA G A G G U U U GC A G CG C G A U C A G U G C U A C G A C G C G ACA UG G U G U AU G G C C G A C G A G A U UA G U G C C C G G G A C G C G G A AU C C G A A U AC A C GA G A C U C G C G CA U G A U G G G C U G UC U C U U C G G A N G G C G N C C G G C A A U G C U A A U U A A U A C G U C U G GG CCACUUGG A GCUGUC G A A A U GGCC CGUGGA C A G CGGCGG A U A A U A A U A A A A A U G A A U A U A C G G C A A C G U A A U G C U G Citation and related information available at http://www.rna.icmb.utexas.edu AC. Lactobacillus acidophilus. (M58802) 1.cellular organisms 2.Bacteria 3.Firmicutes 4.Bacillus/Clostridium group 5.Bacillus/Lactobacillus/Streptococcus group 6.Lactobacillaceae 7.Lactobacillus July 2001. Figura 1.Estructura secundaria del 16s rRNA en Lactobacillus acidophilus . Tomado de la base de datos de Comparative RNA web site and project [18]. Por otro lado, STAP tiene un flujo de trabajo establecido en el cual se asigna a la secuencia de interés un dominio mediante alineamientos con ClustalW y Phyml, posteriormente se restringe el grupo de trabajo con un BlastN contra la base de datos del dominio calculado. Los grupos con los mejores evalue se toman y se hacen nuevamente alineamientos. con ClustalW y paquetes de R dando como resultado un subgrupo de secuencias de alta identidad. Finalmente estas secuencias se extraen y se repite el procedimiento anterior refinando la filogenia y asignando a la secuencia de interés la clasificación correspondiente a la especie mas cercana en el árbol [17].. 3.
(4) En este trabajo se estudian las regiones variables del gen 16s rRNA para postular la región necesaria que permita hacer una clasificación correcta de género y/o especie de Lactobacillus spp. utilizando herramientas bioinformáticas como RDP, STAP e inferencia filogenética por máxima verosimilitud utilizando el software RAxML. También se busca implementar herramientas de clasificación eficiente en aplicaciones web de fácil acceso.. tabla 1.. Análisis de regiones variables Los fragmentos de mayor tamaño (desde v1 a v8), se analizaron en CD-HIT-EST, agrupando por similaridad del 100%. Posteriormente todos los fragmentos de las regiones variables fueron clasificados taxonómicamente mediante RDP para el 16s rRNA teniendo en cuenta su estructura secundaria. Se clasificaron como Verdaderos positivos (TP) aquellos que asignaban cada uno de los niveles taxonómicos correctamente, falsos negativos (FN), aquellos que clasificaban incorrectamente asumiendo la correcta clasificación de las cepas tomadas de la web; y NA aquellas regiones que no tuvieron amplicones in silico para los pares de primers especificados o que no daban información de todos los niveles taxonómicos.. Materiales y Métodos Interfaz web de programas de clasificación Se desarrolló una interfaz web en lenguaje XML en la plataforma Mobyle@Pasteur (mobyle.pasteur.fr y projets.pasteur.fr) anclada a la página web del Grupo de Biologı́a Computacional y Evolutiva en el servidor de la Universidad de los Andes y se implementaron para los programas RDP multiclassifier y STAP disponibles para correr localmente en http://rdp.cme.msu.edu/misc/ resources.jsp y http://bobcat.genomecenter.ucdavis. edu/mediawiki/index.php/STAP download, respectivamente.. Alineamientos Los alineamientos de las diferentes regiones se hicieron utilizando el software Infernal [15] el cual utiliza un modelo de covariaza de estructuras secundarias. Se eliminaron las copias de 16s rRNA de cada cepa que presentaban 100& de similaridad y se seleccionó aleatoriamente una copia de cada cepa para hacer el alineamiento, y esta fue la misma para todas las regiones variables. El modelo se generó con el modulo cmaln de Infernal a partir del alineamiento disponible en la base de datos de RDP http://rdp.cme.msu.edu el cual incluı́a 508 especies bacterianas. Se tuvo en cuenta que el alineamiento solo tomara los hits entre las secuencias y el modelo sin incluir aquellos presentes únicamente en el modelo de covarianza, de igual manera se especificó que las regiones eran truncadas. El formato de salida por defecto es Stockholm por lo cual se utilizaron scripts disponibles en la web (http://blog.mckuhn. de/2010/08/convert-stockholm-sequence-format-to. html) para convertirlo a Phylip relajado.. Selección de datos Se descargaron los genomas completos clasificados como Lactobacillus de NCBI Genomes (http://www. ncbi.nlm.nih.gov/sites/genome), los cuales tenı́an un tamaño entre 2 y 3 millones de pares de bases. Se tomaron genomas pertenecientes a Lactobacillus iners, L. acidophilus, L. amylovorus, L. amylolyticus, L. buchneri, L. plantarum, L. ruminis, L. reuteri, L. casei, L. sakei, L. salivarus, L. coryniformis, L. crispatus, L. delbrueckii, L. brevis, L. rhamnosus, L. fermentum, L. gasseri, L. helveticus, L. jensenii, L. johnsoni, L. rhamnosus. Los números de acceso, cepas y número de copias del 16s rRNA se describen en la tabla suplementaria 1.. Extracción de regiones variables de 16s rRNA Se diseño un script en Perl (Disponible en http: //bce.uniandes.edu.co/node/65 ) utilizando BioPerl con el cual se extrayeron fragmentos de 16s rRNA de cada una de las cepas pertenecientes a diferentes combinaciones de regiones variables. Los primers utilizados para la amplificación in silico fueron tomados de un estudio de secuenciación de nueva generación, y anillan para la mayorı́a de genomas bacterianos. Los primers se describen en la. Análisis filogenético Se realizó inferencia filogenética usando métodos de máxima versosimilitud como RAxML, se realizó un bootstrap de 1000 y se tomo como modelo de substitución el S7A según el manual de Phase [19] que incluye 21 parámetros y permite hacer una regresión acertada en el tiempo. 4.
(5) Tabla 1. Primers especı́ficos para regiones variables del 16s rRNA [20]. Primer v1-forward v2-reverse V2-forward V3-reverse V3-forward V4-reverse V4-forward V5-reverse V5-forward V6-reverse V7-forward V8-reverse. Secuencia 5’-AGAGTTTGSTCCTGGCTCAG 5’-CTGCTGCCTYCCGTA 5’-AGYGGCGNACGGGTGAGTAA 5’-ATTACCGCGGCTGCTGG 5’-ACTCCTACGGRAGGCAGCAG 5’-TACNVGGGTATCTAATCC 5’-AYTGGGYDTAAAGNG 5’-CCGTCAATTYYTTTRAGTTT 5’-RGGATTAGATACCC 5’-CGACRRCCATGCANCACCT 5’-GYAACGAGCGCAACCC 5’-GACGGGCGGTGWGTRC. En el trabajo de laboratorio se estandarizó PCR para las regiones variables 1-3 del 16s rRNA con cepas de un tampón comercial.. Nombre 8F/19 BSR357/15 F101/19 R534/17 F338/19 R802/18 F563/16 BSR926/20 BSF784/15 R1064/18 BSF1099/16 BSR1407/16. Los ciclos de PCR fueron: denaturación a 94o C por 2min, luego 35 ciclos de denaturación a 94o C por 45segs, anillaje a 53o C por 45segs y elongación a 72o C por 1min. Finalmente se dejó un ciclo a 72o C por 10 mins para extension final. Se obtuvo la secuencia de los amplı́meros usando quı́mica de Sanger en la compañı́a Macrogen (http://www.macrogen. com/).. Muestras Se tomó un tampón comercial con probióticos de marca Ellen para determinar que cepas tenı́a presente. Se tomó el tampón y se sembró en caldo MRS por dos dı́as a 30o C. Posteriormente se numeraron las colonias de morfologı́a caracterı́stica (colonias blancas cremosas) y se sembraron por aislamiento en agar MRS. Las colonias fueron numeradas como T1, T2 y T3. Se describieron morfológicamente las colecciones por microscopı́a de luz (tinción de gram) y observación de las colonias en MRS, se caracterizaron de acuerdo a la prueba bioquı́mica de catalasa.. Resultados Los programas empleados para clasificación (RDP y STAP) quedaron disponibles para cualquier tipo de usuario mediante una interfaz web fácil de manipular en el servidor de la Universidad de los Andes y se puede acceder a ellos por la página web del grupo de Biologı́a Computacional y Evolutiva de la Universidad de los Andes http://bce.uniandes.edu.co/ cgi-bin/mobyle/portal.py.. Extracción de ADN y PCR Se sembró cada una de las cepas en 2ml de MRS caldo y se incubó a 33o C Over Night. Se hizo extracción de ADN por boiling: se centrifugaron los tubos 5 minutos a 1500rpm y se descartó el sobrenadante. Se agregó 1 ml de agua desionizada estéril y resuspendió el pellet. Se pasó a un tubo eppendorf de 1,5ml y se microcentrifugó a 2000rpm durante cinco minutos. Se descartó el sobrenadante y se repitió el lavado dos veces. Se resuspendió el pellet en agua desionizada estéril en un volumen de 100 µl. Para la lisis de la célula y separación del material genético se calentó por veinte minutos en baño de agua a 100o C. Se tomó como templado para la reacción de PCR una alı́cuota de 4.5 – 7.5 µl.. Análisis de regiones variables El número de copias del operón rrn varió entre 1 y 9 para los microorganismos de estudio. Para estas copias los primers utilizados anillaron en la mayorı́a de los casos, dando un número máximo de amplicones para cada región variable de 204, con base en el cual se calculó el número de datos faltantes. De los genomas analizados se encontró que 10 no presentaban región para el 16s rRNA y dos fueron clasificados como cianobacterias por lo cual se excluyeron del análisis filogenético, adicionalmente una cepa fue clasificada como Enterococcus con todas las regiones variables evaluadas.. 5.
(6) Figura 2.Agrupación de cepas por CD-HIT (16s rRNA completo). 6.
(7) La figura 2 muestra una gráfica de mosaico con los datos obtenidos para CD-HIT. Se observan patrones de colores únicos por cluster y agrupaciones diversas entre copias de 16s de una misma cepa. De igual manera se observan clusters que incluyen copias de diferentes cepas que en general pertenecen a la misma especie. Los clusters 32 y 39 tienen el máximo de copias, incluyendo cepas de L. iners. La mayorı́a de los clusters se organizan por cepa o por especie. Las cepas reportadas como cianobacterias no presentan agrupación en ninguno de los clusters.. tivos. Las figuras 3 y 4 muestran la distribución de verdaderos positivos (TP), falsos negativos (FN) y datos ausentes (NA) para los fragmentos analizados por RDP y STAP para diferentes niveles en la jerarquı́a taxonómica.. En la figura 3 se observan las tasas de acierto y error de RDP. Para dominio, phylum, orden y clase, (A) el mayor número de amplı́meros los presenta la región v5v6 y las regiones v1v4, v1v5, v1v6 y v1v8 presentan la menor cantidad; el fragmento con mayor proporción de falsos negativos comprende las regiones v2v5; para la familia y el género (B y C), v5v8 presenta el mayor número de amplimeros, y la menor cantidad la tienen las mismas regiones que A.. Programas de clasificación RDP y STAP Todas las regiones variables presentan ausencia de datos para ciertas secuencias y además falsos nega-. Figura 3. Clasificación por RDP de las regiones variables obtenidas. En verde las regiones que no amplificaron o no dieron un resultado, en rojo falsos negativos y en azul verdaderos positivos. En A. se muestra la clasificación obtenida para Dominio, Phylum, Orden y Clase; B. muestra la clasificación para familia; C. muestra la clasificación para género.. Ultilizando STAP, tenemos que, como muestra la figura 4, para dominio y phylum, la región v1v2 es la que presenta un mayor número de amplı́meros con los primers diseñados y v2v3 la que presenta el mayor número de datos ausentes. La región con. mayor número de falsos negativos es v5v6. Para orden, clase y familia se observa que v1v2 continúa presentando el mayor número de amplicones, v2v3 el mayor número de datos ausentes pero para este caso la región con mayor error es v5v8. Para género se. 7.
(8) pierde gran cantidad de datos ya que los fragmentos no logran resolver hasta esta categrı́a taxonómica; se observa que v3v5 tiene el mayor número de amplicones, y v1v8 el que presenta menor número de datos. Sin embargo, aunque v3v5 tiene una gran cantidad de fragmentos, su tasa de error es aproximadamente del 50%. Las regiones v1v5, v1v6 y v4v6 presentan las mayores tasas de error en comparación con los vedaderos positivos.. Si se busca una clasificación hasta género es confiable hacerla utilizando la región v3v5 es la mejor, tiene un mayor cubrimiento y tasa de error muy baja, pero si se desea llegar a una aproximación de especie o de grupo la región v1v3 presenta la menor tasa de falsos negativos aunque su cubrimiento no es el mayor.. Figura 4. Clasificación por STAP de las regiones variables obtenidas. En verde las regiones que no amplificaron o no dieron un resultado, en rojo falsos negativos y en azul verdaderos positivos. En A. se muestra la clasificación obtenida para Dominio y Phylum, B. muestra la clasificación para orden, clase y familia; C. muestra la clasificación para género y D. la clasificación para especie.. El análisis filogenético mostró que todas las regiones dan topologı́as diferentes, sin embargo, como se observa en la figura 5, hay grupos que se conservan en loas análisis hechos para todas las regiones y pertenecen a un mismo grupo de Lactobacillus. Se observan 4 grupos definidos en todas las regiones variables, los cuales en corresponden a primero L. oris, L. reuteri y L. fermentum; segundo L. plantarum, L. casei, L. rhamnosus y L. salivarus; tercero L. gasseri y L. iners y cuarto L. acidophilus, L. delbrueckii, L. amylovorus, L. amylolyticus, estos tienen buen soporte de clado, sin embargo, para las. regiones variables v7v8, v5v8, v5v6 se pierden estos grupos totalmente. Los grupos formados presentan algunas diferencias en la topologı́a que no se tuvieron en cuenta dado que no tenı́an buen soporte. Las regiones que presentan las mismas relaciones entre grupos son v1v8, v2v8, v4v8, v1v3, v2v5 y v1v5. No se pueden indicar relaciones de ancestrı́a por falta de datos de muestreo por lo cual el árbol fue enraizado en el punto medio. Se asumió buen soporte como mayor a 70. En cuanto al análisis de laboratorio, las colonias. 8.
(9) óptimo en MRS pH 6.2 a 33o C. Las colonias aisladas presentan una morfologı́a macroscópica redonda, cremosa, de bordes irregulares y olor caracterı́stico. La cepa T3 es pequeña con un diámetro de 0.05mm, T2 es mediana con diámetro 0.15mm y T1 es grande con diámetro 0.2mm.. caracterı́sticas aisladas del tampón se muestran en la figura 6. Las tres cepas aisladas al igual que el control (Lactobacillus plantarum LAC-185), presentaron coloración violeta en la tinción de Gram indicando que son gram positivas y son bacilos no esporulados. Las pruebas bioquı́micas reflejaron que son catalasa negativo y presentaron crecimiento. Figura 5. Topologı́a obtenida de Lactobacillus con las regiones v1-v8 del 16s rRNA.. 9.
(10) Figura 6. Colonias caracterı́sticas de Lactobacillus aisladas de tampón. A. colonias aisladas del MRS caldo, B. Colonia pequeña (T3), C. Colonia grande (T1), D. Colonia mediana (T2). La estandarización de PCR mostró que el perfil descrito en los métodos era eficiente. Los primers anillaban correctamente y se obtenı́a una banda mejor que la resultante de la amplificación con los primers universales disponibles. El amplicón tenı́a un tamaño de aproximadamente 550pb (figura 7) que incluı́a las regiones variables 1-3, y los primers universales presentaron un amplicón de aproximadamente 1200pb que incluı́an una región mayor del 16s rRNA. Los resultados de la secuenciación para los amplicones de ambos pares de primers mostraron que la calidad de las secuencia obtenida con los primers universales que amplificaron todo el 16s tienen muy baja calidad (inferior al 60% en todas las posiciones, por el contrario las secuencias de las regiones v1v3 presentan calidades mayores al 80% en la mayorı́a de las posiciones, lo cual se debe al tamaño del amplicón. La mayorı́a de secuencias obtenidas para el 16s completo no pudieron ser ensambladas dada la calidad. Utilizando RDP tanto para la región v1v8 como para la v1v3 todos los amplicones clasificaron como Lactobacillus para género. Con el análisis de STAP se obtuvo que la cepa T1 era L. fermentum, la cepa T2 clasificó como L. casei y la cepa T3 L. delbrueckii. La cepa LAC-185 clasificó como Lactobacillus casei.. Figura 6. Gel de amplicones de las regiones variables 1-3 del 16s rRNA de Lactobacillus aislados del tampón. El control positivo es LAC185.. Discusión Los resultados de este estudio muestran la importancia de conocer las regiones más variables e informativas del 16s rRNA para la identificación de cepas bacterianas dado que no siempre una región más grande va a representar un resultado mejor, y para todas las especies no se va a dar el mismo patrón de variación. Los resultados de CD-HIT en la figura 2, mostraron agrupación por clusters entre copias de una misma cepa y copias de diferentes cepas por lo cual no fue posible establecer un patrón de agrupación. En estudios anteriores fue reportado que alrededor del 40% de las secuencias bacterianas tiene al menos una copia idéntica en el genoma y en el 38% de los genomas todas las copias del operón son idénticas entre si [13]. 10.
(11) especie y L. rhamnosus LN113 [23] el cual se aisló y clasificó hasta el grupo L. casei del cual L. rhamnosus es una subespecie [24]. La clasificación fue igual para el 16s completo que para la región v1v3 con lo cual se comprobó que esta región mı́nima obtenida in silico mediante el análisis en STAP tambien es valida in vivo. Este flujo de trabajo puede ser útil para cualquier tipo de procariotas para definir las regiones mı́nimas para su clasificación las cuales pueden ser empleadas en diferentes tecnologı́as de secuenciación y para análisis de metagenómica. Sin embargo, para una clasificación más especı́fica pueden realizarse otros tipos de análisis entre los cuales se incluyan más genes y caracteres fenotı́picos relevantes en cada grupo.. La clasificación por STAP mostró diferentes regiones candidatas para clasificación dependiento el grado de discriminación al que se pretenda llegar con el estudio. Anteriormente se habı́a determinado que las regiones v1-v3 son las más variables por lo cual pueden dar una mejor resolución al identificar especies [21], lo cual tiene relación con el resultado de este ensayo al tomar los datos de clasificación de especie. Para RDP, se observó un patrón diferente para la clasificación, las regiones de v1v4-8 presentan el mayor error y por ende pueden presentar bastante ruido en la identificación de cepas al igual que la región v5v6 que antes habı́a sido reportada como la mejor región para identificación de bacterias [20]. Fue reportado anteriormente que el menor error se daba en bacterias en la clasificación hecha con las regiones v2v4, dando el mejor resultado (88.7%) para regiones superiores a 400pb [16].. Como continuación de este trabajo se deben establecer los clusters proteicos en los cuales haya un solo representante de proteı́na por cepa y buscar genes house-keeping candidatos para hacer un estudio de MLST que permita una mayor discriminación mediante la asignación de alelos por diferencias de un nucleótido en la secuencia.. Los árboles debieron ser comparados entre si para cada combinación posible de copias del 16s rRNA, con lo cual se tendrı́a un resultado más acertado que por la escogencia al azar dado que pudieron haberse elegido las copias más similares entre cepas. Además se deberı́a evaluar en el laboratorio cual de las copias esta siendo expresada o si todas se expresan al mismo tiempo, lo cual podrı́a explicar problemas de clasificación, dado que los sitios mas variables se perderı́an como errores de secuenciación. Sin embargo, se obtuvo una organización en grupos similar a la obtenida por Canchaya et al quienes hicieron la filogenia con el 16s rRNA de 111 cepas disponibles en la base de datos de RDP [22]. Han sido descritos 5 grandes grupos de Lactobacillus los cuales son L. acidophilus que incluye a L. acidophilus, L. amylovorus y L. amylolyticus, L. johnsonii que incluye a L. gasseri y L. iners, L. sakei, L. plantarum y L. salivarus. Estos mismos grupos a excepción de L. sakei se encuentran conservados Por medio de la validación experimental se obtuvo que las cepas aisladas del tampón correspondı́an a las indicadas por el tampón aunque no se obtuvo su clasificación especı́fica hasta subespecie. Las cepas indicadas por la casa comercial son L. gasseri LN40 [23] el cual peude corresponder a la cepa aislada que clasificó como L. delbrueckii ya que son muy cercanos y sea un error de los métodos de clasificación que no son 100% efectivos, L. fermentum [23] LN99 el cual se asiló y clasificó hasta 11.
(12) References. 12. de Las Rivas B, Marcobal A, Munoz R: Development of a multilocus sequence typing method for analysis of Lactobacillus plantarum strains. Microbiology 2006.. 1. Guerzoni ME: Human food chain and microorganisms: a case of co-evolution. Frontiers in microbiology 2010, 1:106. 2. Reid G, Jass J, Sebulsky MT, McCormick JK: Potential uses of probiotics in clinical practice. Clinical microbiology reviews 2003, 16(4):658–672. 3. Sarmiento LA: Influencia del consumo de sorbitol en la microbiota intestinal de un modelo animal. PhD thesis, Universidad Politécnica de Valencia 2008. 4. Berger B, Pridmore RD, Barretto C, Delmas-Julien F, Schreiber K, Arigoni F, et al: Similarity and differences in the Lactobacillus acidophilus group identified by polyphasic analysis and comparative genomics. Journal of bacteriology 2007, 189(4):1311–1321. 5. Suau A, Bonnet R, Sutren M, Godon JJ, Gibson GR, Collins MD, et al: Direct analysis of genes encoding 16S rRNA from complex communities reveals many novel molecular species within the human gut. Applied and environmental Microbiology 1999, 65(11):4799–4807. 6. Anukam KC, Osazuwa EO, Ahonkhal I, Raid G: 16S rRNA gene sequence and phylogenetic tree of Lactobacillus species from vagina of healthy Nigerian women. African Journal of Biotechnology 2005, 4(11):1222–1227. 7. Martı́n R, Soberóna N, Vázqueza F, Suáreza JE: La microbiota vaginal: composición, papel protector, patologı́a asociada y perspectivas terapéuticas. Enfermedades Infecciosas y Microbiologı́a Clı́nica 2008, 26(3):160–167. 8. Martı́n R, Heilig GH, Zoetendal EG, Smidt H, Rodriguez JM: Diversity of the Lactobacillus group in breast milk and vagina of healthy women and potential role in the colonization of the infant gut. Journal of applied microbiology 2007, 103(6):2638–2644. 9. Olivares M, Diaz-Ropero MP, Martin R, Rodriguez JM, Xaus J: Antimicrobial potential of four Lactobacillus strains isolated from breast milk. Journal of applied microbiology 2006, 101:72–79. 10. Maiden M, Bygraves J, Feil E, Morelli G, Russell J, et al: Multilocus sequence typing: A portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms. Proc Natl Acad Sci USA 1998, 95(6):3140–3145. 11. Diancourt L, Passet V, Chervaux C, Garault P, Smokvina T, Brisse S: Multilocus sequence typing of Lactobacillus casei reveals a clonal population structure with low levels of homologous recombination. Applied and environmental microbiology 2007, 73(20):6601– 6611.. 13. Acinas S, Marcelino LA, Klepac-Ceraj V, Polz MF: Divergence and Redundancy of 16S rRNA Sequences in Genomes with Multiple rrn Operons. Journal of Bacteriology 2004, 186(9):2629–2635. 14. Macke TJ, Ecker DJ, Gutell RR, Gautheret D, Case DA, Sampath R: RNAMotif, an RNA secondary structure definition and search algorithm. Nucleic Acids Research 2011, 29(22):4724–4735. 15. Nawrocki EP, Kolbe DL, Eddy SR: Infernal 1.0: Inference of RNA alignments. Bioinformatics 2009, 25:1335–1337. 16. Cole JR, Wang Q, Cardenas E, Fish J, Chai B, Farris RJ, et al: The Ribosomal Database Project: improved alignments and new tools for rRNA analysis. Nucleic Acids Research 2009, 37(Database issue):D141–145. 17. Wu D, Hartman A, Ward N, Eisen JA: An automated phylogenetic tree-based small subunit rRNA taxonomy and alignment pipeline (STAP). • 2008. 18. Comparative RNA Web Site and Project [http: //www.rna.ccbb.utexas.edu/]. 19. RNA 7A model [http://intranet.cs.man.ac.uk/ai/ Software/phase/manual/node108.html]. 20. Claesson M, Wang Q, O’Sullivan O, Greene-Diniz R, Cole J, Ross P, O’Toole P: Comparison of two nextgeneration sequencing technologies for resolving highly complex microbiota composition using tandem variable 16S rRNA gene regions. Nucleic Acids Research 2010, 38(22):e200. 21. Hypervariable regions bioinformatics-toolkit.org/Help/Topics/ hypervariableRegions.html].. [http://www.. 22. Canchaya C, Claesson M, Fitzgerald G, van Sinderen D, O’Toole P: Diversity of the genus Lactobacillus revealed by comparative genomics of five species. Microbiology 2006, 152(11):3185–3196. 23. Ellen: The probiotic company [http://www.ellenab. se/en/]. 24. L P, A W: The role of Lactobacillus casei rhamnosus Lcr35 in restoring the normal vaginal flora after antibiotic treatment of bacterial vaginosis. BJOG 2008, 115(11):1369–1374.. Tablas suplementarias Tabla Suplementaria 1 Cepas utilizadas en este estudio. Se describe el número de copias del 16s rRNA, número de accesión, especie y cepa.. 12.
(13) 13.
(14)
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