Diversidad de bacillus sphaericus en diferentes hábitat y regiones geográficas

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(1)UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. DIVERSIDAD DE Bacillus sphaericus EN DIFERENTES HABITAT y REGIONES GEOGRÁFICAS. JENNY DUSSÁN GARZÓN. TESIS DOCTORAL. BOGOTÁ, JULIO 2006.

(2) DIVERSIDAD DE Bacillus sphaericus EN DIFERENTES HABITAT y REGIONES GEOGRAFICAS. DISERTACIÓN SOMETIDA A LA ESCUELA DE POSTGRADO DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS , FACULTAD DE CIENCIAS COMO REQUISITO PARA OBTENER EL GRADO DE. DOCTORA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS Biología Molecular. JENNY DUSSÁN GARZÓN. FACULTAD DE CIENCIAS UNIVERSIDAD DE LOS ANDES. BOGOTÁ, JULIO 2006. PALABRAS CLAVES: Bacillus sphaericus, Quercus humboldtii, Quercus robur Colombia, España, Proteinas, Proteina-S, Peptidoglicano, RAPDs, RFLPs, 16S rDNA secuencia..

(3) A la memoria de mis padres quienes me enseñaron la constancia por el saber y hacer A la memoria de la doctora Grose quien me dio la libertad de dar vuelo a mi imaginación Amis hijitas Camilita y Juanita fuentes de alegria y amor eterno.

(4) TABLA DE CONTENIDO. RESUMEN ................................................................................................................iv ABSTRACT…………………………………………………………………………viii AGRADECIMIENTOS ……………………………………………………………xii LISTA DE TABLA ………………………………………………………………..xiii LISTA DE FIGURAS ………………………………………………………………xiv. INTRODUCCIÓN ………………………………………………………………......1 I . REVISION LITERATURA Bacillus generalidades contexto organismo modelo ……………........................3 Clasificación y Filogénia ………………………………………...........................4 Pared celular y Proteínas capa-S …………………………………………………9 Ecología del Género Bacillus ………………………………………………………...11 II. MATERIALES Y METODOS Localización de sitios de muestreo y cepas de estudio……………………….14 Aislamiento de bacterias y análisis agrológico de suelo ……………………...18 Sincronización de cultivos : Célula vegetativa y Espora………………………..20 Preparación de peptidoglicano de célula vegetativa y asociado a esporas………………...………………………………………………….……..21 Extracción de proteinas y fracciones celulares …………………………………23 Electroblot y secuencia N-terminal de proteina de la capa - S y toxina 41KD ..................... ……………………………………………………25.

(5) Preparación de DNA total………………………………. ....................................25 Polimorfismo intraespecifico RAPD´s………….. ……………………...............26 Polimorfismo intraespecifico gen r16S rRNA…..........……….....……………....27 Análisis de datos....................................................................................................27 Número Acceso Genbank …………………………………………………..........28 III RESULTADOS Y DISCUSION PROTEINAS TOTALES Y FRACCIONES CELULARES EN CELULA VEGETATIVA Y ESPORAS ………………………………………………….29 PROTEINA ENTOMOTOXIGÉNICA DE 41KD Y DE LA CAPA-S…………38 PEPTIDOGLICANO DE CELULA VEGETATIVA Y ESPORA ……………..41 POLIMORFISMO INTRAESPECIFICO : RAPD`s ............................................48 POLIMORFISMO INTRAESPECIFICO GEN 16S rRNA RFLPs.....................57 SECUENCIACION de GEN 16S rRNA ……………………………………….59 Bacillus sphaericus ASOCIADO A Quercus humboldtii y Quercus robur Linneo…………………………………………………………………………….62 DISCUSIÓN. 65. CONCLUSIONES. 70. BIBLIOGRAFIA. 73.

(6) RESUMEN DIVERSIDAD DE Bacillus sphaericus EN DIFERENTES HABITAT Y REGIONES GEOGRAFICAS JENNY DUSSAN GARZON1 JUAN AYALA, DIRECTOR2 Departamento de Ciencias Biológicas, Universidad de los Andes. Bogotá, Colombia1. Consejo Superior de Investigaciones Científicas. Universidad Autónoma de Madrid, España2. RESUMEN. Bacillus sphaericus ha sido reconocido en cinco grupos de homología con base a la hibridización DNA-DNA. Fundamentalmente, las cepas patógenas se han asociado al grupo IIA y las no patógenas a los grupos I, IIB, III, IV y V. Treinta y dos aislamientos de este taxón de diferentes habitat y regiones geográficas en Colombia y España, fueron evaluados a nivel fenotípico por patrones de perfil de peptidoglicano, perfiles proteicos de fracciones celulares y a nivel molecular por polimorfismos por RAPDs, RFLPs, y secuenciación del gen 16S rRNA Dos clados fueron determinados por secuenciación parcial de 16S DNA en relación a su carácter patógeno y ubicación geográfica con una divergencia superior al 4% Los aislamientos patógenos (6/9) se ubicaron en el clado I relacionados con los grupos de referencia I, IIA y IV. Los aislamientos de España asociados a Quercus robur Linneo (6/9) mostraron una agrupación en el clado II sin relación con grupos de homología. iv.

(7) Los aislamientos no patógenos de Colombia asociados a Quercus humboldtii se relacionaron tanto en el clado I como el II igualmente sin relación con grupos de homología El perfil de muropeptidos de peptidoglicano tanto en célula vegetativa como en espora revelo un patrón similar entre todos los aislamientos. Una tendencia diferenciar se determino en el peptidoglicano de la célula vegetativa por la ausencia de mas de 10 picos de muropeptidos y un patrón más homogéneo en esporas (ausencia de 3 picos). El fenograma comparativo revelo dos grupos claramente definidos en aislamientos patógenos relacionados con las cepas I, IIA y IV y no patógenos tanto de Colombia como de España relacionados con los grupos IIB y V de homología a un nivel de similitud entre el 20% y 50%. El perfil de proteínas en etapas logarítmica, estacionaria y en los extractos de esporas mostraron tres. grupos: Patógenas, no patógenos. asociadas a Quercus humboldtii. (Colombia) y no patógenos asociados a Quercus robur ( España). Se determino que los aislamientos de Colombia se encuentran asociados al grupo IV de homología y los aislamientos de España al grupo V. Los aislamientos patógenos se asociaron al grupo IIA de homología. De igual forma un perfil homogéneo en todos los aislamientos en relación con las fracciones de. membrana y citoplasma fue el patrón establecido en las fracciones. individuales. En 36 (de 39 total) cepas, el N-terminal de la proteína de 125 KD dio una identidad del 91% y 100% con la proteína de la capa – S de B. sphaericus. Diferencias en la posición 10 del aminoácido serina por cisteina se determino en las cepas de España con respecto a las de Colombia.. v.

(8) Tres oligonucleotidos de 37 probados fueron seleccionados para el análisis de los patrones de RAPDs. Los productos de amplificación revelaron. un patrón de bandas. heterogéneo (bandas entre 250 pb y las 1500 pb) en los aislamientos no patógenos tanto de Colombia como de España. En contraste para las cepas patógenas, se evidencio un bandeo homogéneo (bandas entre l00 pb y 900 pb). El Dendograma mostró dos. grupo, uno relacionado con el grupo V de homología correspondiente a cepas no patógenas de España y Colombia. y un segundo agrupamiento de los patógenos. relacionado con el grupo IIA y IV de homología con una disimilitud mayor al 70% Se evidencio por análisis comparativo de los parámetros fenotipicos y genotípicos dos grupos claramente definidos: En el grupo I los aislamientos patógenos relacionados con los grupos de homología I, IIA y IV y en el grupo II, los aislamientos no patógenos de Colombia (subgrupo IIa) y España (subgrupo IIb), estos relacionados con el grupo V de homología El polimorfismo por RFLPs revelo para los 32 aislamientos y los grupos de homología pertenecientes a B.sphaericus patrones homogéneos de restricción correspondientes a lo establecido en el genero Bacillus. Los fragmentos generados por la enzima EcoR1 revelaron bandas fuertes de 850, 450 y 300 pb. Para la enzima Ddel1 se obtuvieron dos productos de digestión de 900 pb y 600 pb. Para la enzima Pst1 no se encontraron puntos de digestión en ninguna de las cepas analizadas En B. globisporus (outgroup) con la enzima Ddel1 no hubo restricción en la secuencia 16S rDNA Una relación ecofisiológica fue establecida en asociación con Quercus humboldtii y Quercus robur Linneo. Se determino un numero alto de bacterias del genero Bacillus y específicamente del taxón B. sphaericus. en la rizosfera de los cuatro bosques. analizados del genero Quercus. Las concentraciones de iones divalentes de Ca, Mn y Fe mostraron una relación directa con el alto porcentaje de esporas (> 70%). vi.

(9) La inducción de la esporulación en medio suelo sitio especifico con concentraciones de 0.06% de Ca, 0.01% de Fe y 0.015% de Mn para el pool de Bacillus formulado de cada bosque fue superior al 70% en relación a los grupos de homología seleccionados (I, IIA, IV), no obstante la cepa IV dio valores cercanos a los determinados en los aislamientos nativos de cada bosque. Bacillus globisporus outgroup mostró el menor porcentaje de esporulación en las condiciones establecidas para los tres iones divalentes probados. Los resultados obtenidos soportan la gran heterogeneidad fenotípica y genotípica del complejo taxón de Bacillus sphaericus, sin embargo tanto los grupos de homología como los 32 de estudio se agruparon en relación con su carácter. no patógenos. separadamente de los patógenos independiente del hábitat y región geográfica. Este es el primer reporte de asociación de Bacillus sphaericus con el genero Quercus robur Linneo.. vii.

(10) ABSTRACT. Bacillus sphaericus Diversity in Different Habitats and Geographic Regions.. JENNY DUSSAN GARZON1 JUAN AYALA, DIRECTOR2 Departamento de Ciencias Biológicas, Universidad de los Andes. Bogotá, Colombia1. Consejo Superior de Investigaciones Científicas. Universidad Autónoma de Madrid, España2. Bacillus sphaericus has been recognized in five groups of homology based on DNADNA hybridization patterns. Mainly, the pathogen strains have been associated with the IIA- group and the non-pathogen strains with the groups I, IIB, III, IV and V. Thirty two isolations of this taxon from different habitats and geographical regions of Colombia and Spain were evaluated at the phenotypical level. by peptidoglycane. patterns, protein patterns of cellular fractions, and at the molecular level by RAPDs and RFLPs polymorphisms and 16S rRNA gene sequence. Using partial sequence of 16S DNA were determined two clades in relation with pathogen character and geographical location with a divergence greater than 4%. The pathogens isolations (6/9) were located in the clade I in relation with the reference groups I, IIA and IV.. viii.

(11) The Bacillus sphaericus isolations from Spain Quercus rubor Linneo (6/9) show a cluster in the clade II without relations with other homology groups. The non-pathogen isolations from Colombia associated to Quercus humboldtii were related with the I and II clades without relations with homology groups. The muropeptides pattern of peptidoglycane made in spore and vegetative cells was similar for all the isolations. A difference tendency was determined in vegetative cell peptidoglycane not having more than ten peaks of muropeptides in contrast with a more homogeneous pattern in spores (without three peaks). The comparative phenogram revealed two groups clearly defined: pathogen isolations related with the strains I, IIA and IV and non-pathogen isolations from Colombia and Spain related with homology groups IIB and V with similarities between 20% and 50%. The protein pattern in stationary and logarithmic stages as well as in the spore extracts showed three groups:. pathogens, non pathogens related to Quercus humboldtii. (Colombia) and non pathogens related to Quercus robur Linneo (Spain). The isolations from Colombia are related with the homology group IV and those from Spain with the group V. The pathogen isolations are related with the homology group IIA. A homogeneous pattern was found in all the isolations in relation with the membrane and cytoplasm fractions. In 36 strains (from a total of 39) the N-end of the 125KD protein give an identity of 91% and for the layer-S protein of Bacillus sphaericus the identity was 100%. The strains from Colombia and Spain have a difference in position 10 aminoacid (serine by cisteine). Three of thirty seven oligonucleotides were selected for RAPDs analyses.. The. amplification products revealed a heterogeneous band pattern (from 250 pb to 1500 pb) in the non-pathogen isolations from Colombia and Spain. ix.

(12) In contrast, for the pathogen strains a homogeneous pattern was founded (band from 100. pb to 900 pb).. The dendogram showed two groups:. one related with the. homology group V and the non- pathogen strains from Colombia and Spain and the pathogen second one related with the homology group IIA and IV with dissimilarities greater than 70%. Using phenotype and genotype comparative analyses two clearly defined groups were identified: In the first on e the pathogens isolations related with the homology groups I, IIA and IV. and in the second group the non-pathogens isolations from Colombia. (subgroup IIa) and Spain (subgroup IIb) related with the homology group V. The RFLPs polymorphisms for the thirty two isolations and the homology groups of Bacillus sphaericus showed homogeneous restriction patterns in correspondence with the established for the genera Bacillus. The fragments generated by the EcoR1 enzyme showed strong bands of 850, 450 and 300 pb. Two digestive products of 900 pb and 600 pb were obtained with the Ddel1 Enzyme. For all the strains analyzed no digestive products were found using the Pst1 enzyme.. For B. globisporus (out group) no. restriction in the 16S rDNA sequence was found using the Ddel1 enzyme. An ecophysiological relationship was established between Bacillus sphaericus, Quercus humboldtii and Quercus robur Linneo.. It was founded a high bacteria. number of the genera Bacillus and mainly of the Bacillus sphaericus taxon in the rhizosphera (Root soil) of the four Quercus forest analyzed. The amounts of Ca, Mn and Fe divalent ions showed a direct relationship with the high percent of spores (higher than 70%).. x.

(13) The induction of sporulation in soil specific site medium with amounts of 0.06% Ca, 0.01% Fe and 0.015% Mn for the prepared pool of Bacillus from each forest was 70% higher than the found in the homology groups selected (I, IIA, IV) although to the IV strain were founded values near to the native strains of each forest.. Bacillus. globisporus showed the smaller percent of sporulation in the established conditions. These results support the high phenotypic and genotypic heterogeneity of the complex Bacillus sphaericus taxon and also show that the homology reference strains as well as the thirty two strains isolated were clustered in relationship with the pathogen and nonpathogen character independent of the habitat and the geographical region. It is showed the first report of association between Bacillus sphaericus and Quercus robur Linneo.. xi.

(14) AGRADECIMIENTOS : Juan Alfonso Ayala Serrano : Director red ALFA y director de mi trabajo doctoral. Gracias Juan no tengo palabras, el apoyo en mi tesis, a mi familia en fin a TODO Gabriel Gutkink : Gestor de la Red ALFA-Biología Molecular. Jurado crítico de mi trabajo doctoral Helena Groot : El apoyo incondicional al doctorado en Ciencias Biológicas Silvia Restrepo : Jurado valioso en el momento decisivo Lucia Lozano : Mil gracias por pertenecer al grupo de Bacillus, de esporulados y por todo su colaboración en diferentes campo del saber en microbiología Martha Vives : Por nuestras disertaciones en ciencia y en otros aspectos CIMIC : Todo un equipo de colaboración : Oscar Bedoya en análisis filogenético, Marcela Castillo en edición clave de diagramas, Carolina Barriga en deposito de secuencias en Genbank Jose Rafael Toro : Su impulso en iniciar el doctorado durante su decanatura en Ciencias Nohra de Sanchez, Carlos Jaramillo y Mauricio Linares : Por su estimulo en mi gestión de desempeño anual del departamento A mi familia : César por la revisión final del documento y a mis hijitas Camilita y Juanita por su colaboración en revision bibliografica y edición de diagramas y se el motor de mi vida Esporas de Bacillus por se mi inspiración en ciencia. xii.

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(16) LISTA DE TABLA. Tabla 1. Aislamientos de Bacillus sphaericus analizados en este estudio y grupos referencia Tabla 2. Análisis Agrológico de rizosfera de Quercus humboldtii y Quercus rubur Linneo…. Tabla 3. Proteínas de 125 KD y 41 KD de las cepas aisladas y relacionadas con B.sphaericus.. xiii.

(17) LISTA DE FIGURAS. Figura 1. Mapa de Colombia y localización de la Reserva Parque Natural Chicaque y Bosque Las Mercedes Figura 2. Mapa de España y localización de Bosque en Tres Cantos y Canto Blanco Figura 3. Quercus humboldtii y Quercus rubur Linneo Figura 4. Bacillus sphaericus sincronizado microscopia luz y electrónica Figura 5. Electroforesis SDS-PAGE de Proteínas fase logarítmica Figura 6. Fenograma de Proteínas fase logarítmica Figura 7. Electroforesis SDS-PAGE de Proteínas fase estacionaria Figura 8. Fenograma de Proteínas fase estacionaria. Figura 9. Electroforesis SDS-PAGE de Proteínas espora madura Figura 10. Fenograma de Proteínas esporas madura Figura 11. Fenograma comparativo de proteínas totales Figura 12. Electroforesis de fracciones de membrana. xiv.

(18) Figura 13. Electroforesis de fracciones de citoplasmáticas Figura 14. Cromotograma de peptidoglicano de célula vegetativa Figura 15. Cromotograma de peptidoglicano de esporas madura Figura 16. Fenograma de peptidoglicano de célula vegetativa Figura 17. Fenograma de peptidoglicano de espora madura Figura 18. Fenograma comparativo de peptidoglicano de célula vegetativa y espora madura Figura 19. Electroforesis productos de amplificación de los oligonucleotido AD-11, AA-15 y AF-17 en los aislamientos no patógenos Figura 20. Electroforesis productos de amplificación de los oligonucleotido AD-11, AA-15 y AF-17 en los aislamientos patógenos Figura 21. Dendograma productos de amplificación oligonucleotido AD-11 Figura 22. Dendograma productos de amplificación oligonucleotido AA-15 Figura 23. Dendograma productos de amplificación oligonucleotido AF-17 Figura 24. Dendograma comparativo oligonucleotidos AD-11, AA-15 y AF-17 Figura 25. Fenograma - Dendograma comparativo Fenotípico – Genotípico xv.

(19) Figura 26. Amplificación del gen 16S rRNA de Bacillus sphaericus Figura 27. Electroforesis de productos de restricción con EcoR1 y Ddel1 Figura 28. Arbol filogenético grupo I de Bacillus sphaericus Figura 29. Árbol filogenético grupo II de Bacillus sphaericus Figura 30. Población de Bacillus en la rizosfera de Quercus humboldtii, Colombia y Quercus rubur Linneo, España. Figura 31. Esporulación de Bacillus sphaericus en iones divalentes. xvi.

(20) CAPITULO I INTRODUCCION Bacillus sphaericus es una bacteria estrictamente aerobia formadora de endosporas, metaboliza una variedad de aminoácidos pero no utiliza azúcares como fuente de carbono, fenotipo tradicional en el género Bacillus para la clasificación por test bioquímicos de la ubicación taxonómica, motivo por el cual los estudios en esta especie de bacteria fueron muy escasos. Sin embargo con el descubrimiento en 1965 de la actividad larvicida de algunas cepas pertenecientes a este taxón y el desarrollo de técnicas a nivel molecular para el diagnóstico de bacterias entomopatógenas, el interés en este microorganismos fue marcado. La clasificación numérica de B.sphaericus mostró una heterogeneidad en todos los parámetros medidos, concepto reforzado por la variabilidad de actividad insecticida entre los diferentes aislamientos a partir de larvas de mosquitos. Usando técnicas de hibridización de DNA, en B.sphaericus se demostraron cinco grupos de homología con una asociación entre el 45% al 75% entre los grupos no patógenos y del 80% en los grupos patógenos para mosquitos. Estudios basados en polimorfismos azarosos como (RAPDs) y polimorfismos de fragmentos de restricción (RFLPs) de DNA total han confirmado algunos de los grupos de homología reportados.. 1.

(21) La distribución cosmopolita del género Bacillus ha mostrado que se encuentra presente en un alto porcentaje en todo tipo se suelos, asociado este porcentaje a la característica de formar endosporas. En Colombia, a partir de diversos hábitats se ha aislado B.sphaericus patógeno para larvas de mosquitos con una variabilidad en su toxicidad . De otra parte, diferentes especies de Bacillus fueron la población dominante en bosques de vegetación heterogénea en la Reserva Parque Natural Chicaque. Fundamentalmente, la especie correspondiente a B. sphaericus fue el grupo dominante encontrado asociado a la rizosfera de bosques de vegetación homogénea de robledales en esta reserva natural. Los aislamientos no presentaron toxicidad para larvas de mosquitos del género Culex. De tal forma que el taxón correspondiente a Bacillus sphaericus es un grupo complejo asociado a diferentes hábitat con características fisiológicas y moleculares fundamentalmente heterogéneas que lo colocan como el taxón modelo de estudio del genero Bacillus en diferentes ecosistemas y particularmente en asociación con el género Quercus.. 2.

(22) I REVISION LITERATURA. Bacillus generalidades y contexto de organismo modelo En 1872, Ferdinand Cohn, un estudiante de Robert Koch, describió y dio el nombre a la bacteria Bacillus subtilis. Este microorganismo es considerado la bacteria modelo del género grande y diverso, Bacillus, género que se encuentra clasificado en la familia Bacillaceae. La característica distintiva de esta familia es la endosporas, las cuales son cuerpos altamente. producción de. refráctiles formados en las células. vegetativas como proceso de diferenciación celular. Desde la descripción de Cohn, todos los miembros del género Bacillus han sido caracterizados como bacilos. Gram-. positivos, aeróbicos o facultativos y formadores de endosporas (Bowditch Ron .D., 2001, Gordon, R. E et al 1973). La ubicuidad de las especies en la naturaleza, la inusual resistencia de sus endosporas a agentes químicos y físicos, el desarrollo del ciclo de formación de endosporas, la producción de antibióticos, la toxicidad de las esporas y del cristal paraesporal para varios insectos, y la patogenicidad de ciertas especies como Bacillus anthracis, han despertado desde los tiempos de Koch el interés por este genero. (Cano, R. J. et al 1995). Hay una gran. diversidad. fisiológica entre los miembros del género, dado que. características colectivas que incluyen degradación de casi todos los sustratos derivados de. plantas y animales , como la celulosa, almidón, pectina, proteínas, agar,. hidrocarburos; producción de antibióticos; nitrificación; desnitrificación; fijación de nitrógeno; litotrofia facultativa; autotrofía; acidofilia; alcalifilia; sicrofilia; termofilia; y parasitismo (Boivin Boivin-Jahns V et al 1995).. 3.

(23) La formación de esporas universalmente encontrada en este género, es considerada una estrategia de sobreviviencia en diferentes ecosistemas donde la bacteria predomina. La distribución y volatilización de las esporas en estado dormante probablemente explican la ocurrencia de las especies de Bacillus aerial en la mayoría de los hábitat examinados (Donovan, W. 1987, Gest, H. et al. 1987). Clasificación y Filogenia Los intentos por clasificar las especies de Bacillus se basaron en un principio en dos características: crecimiento aeróbico y formación de endosporas. El resultado reunió varias bacterias con diferentes características fisiológicas y diferentes habitats en un mismo grupo (Priest F.G., et al 1988). Por consiguiente la heterogeneidad fisiológica, ecológica y genética ha dificultado la categorización del género Bacillus así como la generalización del mismo. En el Manual de Clasificación Sistemática de Bacterias Bergey's (1nd ed. 1986), el contenido G+C de las especies conocidas de Bacillus se encuentra en un rango entre el 32 al 69%. Esta observación, realizada por técnicas de hibridización, reveló la heterogeneidad genética del género. No solamente esta variación fue encontrada de especie a especie, sino también diferencias marcadas en el contenido G+C entre cepas de la misma especie. Por ejemplo, el contenido G+C del grupo de B. megaterium se encuentra en un rango del 36 al 45%. (Claus D. et al. 1986, Riva O.N. et al 2001) En el Manual de Clasificación Sistemática de Bacterias Bergey's (2nd ed. 2001), basado en clasificación filogenética determinó que la organización de este género en dos tipos de grupos predominantes de las bacterias formadoras de endosporas, clostridia y. 4.

(24) bacilli, en dos diferentes "clases" de Gram-positivos, "clostridia" y "bacilli". "Clostridia" incluye. el. Orden Clostridiales and Familia Clostridiaceae con 11. géneros incluyendo a, Clostridium. "Bacilli" incluye el Orden Bacillales y la Familia Bacillaceae. En esta familia hay varios nuevos géneros en el nivel con los Bacillus. Esto explica la heterogeneidad en el contenido G+C observado en 1986 en el "genus" Bacillus. (Claus D. et al 2001) El acercamiento filogenético a la taxonomía de Bacillus ha sido acompañado por extensos análisis de las moléculas 16S rRNA. Esta técnica además de revelar relaciones filogenéticas ente las diferentes especies de Bacillus, sorprendentemente mostró un parentesco con ciertas especies de bacilos no formadoras de esporas como son los géneros Planococcus, Lactobacillus y Staphylococcus (Woese .C 1978., Ursing, J. B et al 1995). En estos primeros estudios, el análisis por secuenciación de oligonucleotidos de 16S rRNA categóricamente mostró que B. subtilis y otras especies de formadores de esporas elipsoidales, como B. cereus, B. megaterium, and B. pumilus, formaban un cluster coherente, pero especies formadoras de endosporas redondas como, B. sphaericus, B. globisporus y B. aminovorans, no entraban en ese cluster En otros estudios de secuenciación de 16S rRNA, tres grupos de cluster taxonómicos mayores de Bacillus fueron definidos determinando la secuencia parcial o completa de 16S RNA (mas de. 1,100 nucleótidos secuenciados) en 35 cepas reconocidas de. referencia. Estos tres grupos de cluster fueron marcadamente diferentes a los reportados previamente.. 5.

(25) Los análisis comparativos de la secuencia del operon rrnB ribosomal de E.coli y B.subtilis ha mostrado una similiaridad mayor al 70%, sin embargo se han demostrado características diferenciales como la perdida de sitios de restricción de la enzimas BalI , BglI , BglII , HaeI , MstI , NaeI , Ncoi , SalI y XbaI. Un sitio único para BamHI y Hind III en el 23 rRNA y para SphI y PstI en el gen 16S rRNA (Brosiur.G., et al 1978, Green.C.J. 1985). Las secuencias determinadas también demuestran por estructuras hipotéticas de estructura secundaria codificantes para tRNA al final del policistrónico, contrario a lo reportado en E.coli codificación para tRNA en el espacio intercistronico de 16S y 23S Bacillus sphaericus este taxón incluye aislamientos patógenos para varias especies de larvas de mosquitos así como aislamientos saprofititos que tiene la característica de no usar glucosa como fuente de carbón para su crecimiento Ha sido aislado de diferentes tipos de suelo, de aguas ( marina y dulce) y sedimentos polucionados (Cokmus C, et al .1993, Mercan. N et al 2003). Las primeras cepas patógenas para mosquitos fueron reportadas en 1965 (Kellen et al., 1965, Myers P, et al 1978, Stahly, D. P et al 1992). Desde entonces un número elevado de aislamientos han sido descritos. pero no relacionadas con su potencial. entomopatógeno (Rippere, K. E et al 2000 , 1997) Por lo tanto ha sido una necesidad de diferenciar entre las diferentes cepas Consecuentemente diferentes métodos se han desarrollados para la clasificación. Los primeros fueron basados en características. morfológicas y bioquímicas, Un avance en la clasificación e identificación lo dio Yousten (Yousten et al., 1984, 1980) desarrollando una combinación de bacteriófagos y usando antigenos para la serotipificación de las cepas (Thanabalu, T. et al .1996).. 6.

(26) Posteriormente los diferentes aislamiento fueron diferenciados por técnicas que incluyeron homologia de DNA-DNA (Krych et al., 1980, Stackebrandt E et al 1994, 1987), análisis de ácidos grasos y actividad bacteriocina (Cokmus et al 1993, Priest. F.G. et al 1994). En el estudio de Krych , las especies fueron ubicadas en al menos cinco grupos distintos de homologia cada uno lo suficientemente separado para ser considerado un taxón independiente .Todos los aislamientos patógenos pertenecen al grupo IIA, sin embargo se han encontrado aislamientos no patógenos cuya estabilidad de asociación DNA-DNA se comparten con el grupo IIA (Alexander. et al 1990., Jahnz, U et al 1996., Johnson, J. L. 1994, 1973) Las cepas representantes de cada grupo han sido examinadas también por análisis del polimorfismos de los fragmentos de restricción del gene rRNA confirmando que B.sphaericus es un grupo complejo distinguible en grupos (Aquino de Muro M et al.1992a; Aquino de Muro et al 1992b) .Posteriores análisis empleando la técnica de RAPDs para polimorfismos azarosos han distinguido claramente grupos de patógenos y no patógenos ( Miteva V, et al 1998, Woodburn, M. A et al 1995). No obstante lo anterior no han sido separados los cinco grupos a status de especie cada uno. El grupo IIA se ha dividido en dos subgrupos en base al nivel de similaridad del hereroduplex y de la estabilidad de los mismos.. Por lo tanto ha sido interesante. determinar que todos los aislamientos patógenos pertenecientes al grupo IIA es toxico para larvas de mosquitos. Por el contrario los aislamientos no patógenos fueron encontrados de pertenecer a cualquier grupo de homologia sin una particularidad. Las bacterias son patógenas porque producen una o mas toxinas .La toxina binaria es característica de las cepas altamente patógenas (Dussán.G.J, et al 2002, Nakamura L.K. 2000). 7.

(27) Un método para diferenciar bacterias del género Bacillus a nivel de diferenciación de cepas de la misma especie es la técnica conocida como random amplified polymorphic DNA (RAPD) ( Aquino de Muro M et al .1994). El uso de genoma total como templado y oligonucleotidos arbitrarios cortos (10 pares de bases) determina polimorfismos entre las cepas como resultado de la adición o perdida del sitio de unión del oligonucleotido y por lo tanto la falta de presencia o ausencia de una banda particular. El patrón de bandeo produce una huella que comparada con otras cepas, cada banda es considerada una caracteriza de la cepa (Dussán et al 1997, Lozano et al 2000) La técnica del RAPD ha sido usada extensivamente para distinguir bacterias, hongo, plantas, y animales y ha resultado ser una técnica mas sensible que la tipificación de proteínas enzimáticas multilocus En algunos casos los RAPD se han correlacionado con los análisis de enzimas de restricción de la subunidad pequeña que codifica para el rRNA (Genilloud et al 1994) El RAPD se ha usado para la diferenciación de aislamientos clínicos de Streptococcus uberis, Klebsiella pneumoniae y Escherichia coli de vacas con mastitis clínica . En control biológico se ha aplicado para diferenciar cepas patógenas y no patógenas de Bacillus sphaericus y para distinguir las cepas comerciales de Bacillus thuringiensis y diferenciarlas de cepas filogenéticamente cercanas y comprometidas en contaminación de alimentos y enfermedades humanas, como Bacillus cereus y Bacillus anthracis. También el RAPD ha sido una alternativa para obtener polimorfismos cuando la utilización de RFLP no produce patrones diferenciales (Yousten. A.A 1984a ). Se han podido crear grupos de patogenicidad en bacterias fitopatógenas, analizando los. 8.

(28) patrones de bandeo obtenidos por RAPD , así como diferenciar cepas de bacilos esporo formadores imposibles de distinguir por análisis bioquímico, de fagotipificación o de ácidos grasos (Yousten. A.A 1994b). Los análisis filogenéticos han demostrado variabilidades en la secuencia 16S y 23S del gen rRNA, así como regiones espaciadoras entre 16S y 23S. Los trabajos de Nakamura revelaron la agrupación del género Bacillus y organismos relacionados en más de siete grupos de homologia (Nakamura L.K. 2000.; Xu D. et al .2003., Yousten. A.A, 1997).. Pared celular y proteínas de la capa –S La variabilidad de la estructura de la pared celular que comúnmente se presenta en la mayoría de bacterias Gram-positivas no ocurre en el género Bacillus. La pared celular de la célula vegetativa de casi todas las especies de Bacillus esta constituida de peptidoglicano que contiene acido meso-diaminopimélico (DAP). Las excepciones son B. sphaericus y especies relacionadas, como B. pasteurii y B. globisporus, que presentan lisina en vez de DAP (Guinand M. et al 1979. Popham D. L.2002.). Esta es la típica estructura de pared universal de las bacterias Gram-negativa, i.e., contienen DAP como diamino acido. En algunos casos, DAP es ligado directamente a la D-alanine, como en las. Enterobacteriaceae; en otros casos, dos. cadenas de. tetrapeptidos de peptidoglicano son unidos por un puente anclador interpeptídico entre DAP y D-alanina, el cual es característico de la mayoría de bacterias Gram-positivas (MJ Vacheron et al. 1999).. 9.

(29) En muchos especies de Bacillus, el puente interpeptídico que conecta la D-alanine al meso-diaminopimelic acid (DAP) esta ausente. El peptidoglicano de B. sphaericus y B. pasteurii contiene L-lisina en lugar de DAP, pero todas las esporas de estas especies de Bacillus tienen el mismo tipo de subunidades de acido murámico en la corteza de la espora (Farrow J.E, et al 1994, Linnett P E et al. 1976. Massie J et al 1985). Típico de la mayoría de especies de Gram-positivos, la superficie de Bacillus es compleja y esta asociada con propiedades de adherencia, resistencia y respuesta quimio táctica. La superficie de la célula es una estructura laminar que consiste de una capsula, una capa superficial protéica (S-layer), varias capas de peptidoglicano y proteínas de la superficie externa de la membrana citoplasmática (Bowditch Ron D et al 2005; Ilk, N., et al 2002, 1999., Mercan N et al. 2004). Capas superficiales cristalinas o subunidades glicoprotéicas, denominadas S-layers, son encontradas en miembros del género Bacillus. Como se ha determinado en otras proteínas de la capa S, su función es desconocida .Sin embargo, se ha demostrado que las S-layers pueden físicamente enmascarar la carga negativa del peptidoglicano y evitar la auto aglutinación en B. stearothermophilus, además se ha propuesto que esta capa juega algún papel en la interacción de la bacteria con metales como uranio (Beveridge, T. J et al 1997, Egelseer, E., et al 2001, 1994., Pollmann , K et al 2005). Proteínas especificas como las toxinas binarias presentes en los aislamientos patógenos y típicas de formación de flagelos , son algunas que se han usado en determinaciones por electroforesis de proteínas en sistemática microbial principalmente como una técnica sensible para la separación y comparación de proteínas celulares de cepas que pertenecen a una misma especie o subespecie (Cokmus. C. et al 1994, Liu, J et al 1996).. 10.

(30) Ecofisiología de Bacillus Las especies de Bacillus. son cosmopolita y en su mayoría, saprofitas; están. ampliamente distribuidas en el suelo y se han aislado especies capaces de crecer en condiciones extremas de temperatura, pH o salinidad, que inhibirían a la mayoría de organismos. Además, poseen esporas que les permite sobrevivir a condiciones adversas para su crecimiento (Driks, A. 1999, Francis, C. A., 2001, 2000, 1999). Los bacilos poseen un rango amplio de características fisiológicas, como producción de antibióticos y de enzimas hidrolíticas que les permiten degradar proteínas, péptidos, aminoácidos, lípidos y polisacáridos como celulosa y lignina. Participan en el ciclo del nitrógeno en procesos de nitrificación, desnitrificación y fijación de este (Hem, J. D. 1978). Han sido ampliamente utilizados en control biológico de insectos: algunas cepas de B. thuringiensis. (para lepidópteros, moscas negras, mosquitos y coleópteros), B.. sphaericus (para mosquitos) y B. popilliae (para coleópteros) (Lacey L .A. et al 1986. Porter, A 1993. Stahly, D. P et al 1992b). Los bacilos también se han reportado y usado exitosamente como promotores de crecimiento en plantas (Brian B. et al in press, Da Silva, J. J.et al 1991. Klein, M. G. 1988). Debido a la resistencia de las esporas en ambientes bajo condiciones de stress como sobrevivencia por tiempos prolongados en otro tipo de condiciones adversas, la mayoría de las especies del género Bacillus son ubicuas y pueden ser aisladas de una amplia variedad de fuentes (Nicholson, W. L et al 2000, Nieto, J. J et al 1989).. 11.

(31) La prevalencia de las bacterias espoformados en ciertos hábitat no necesariamente es indicador de su hábitat, sin embargo es generalmente aceptado que los habitantes primarios de los suelos son los bacilos formadores de endosporas aerobios, lo que comúnmente el gran microbiólogo ruso Winogradsky considero con el termino "flora " del suelo (Clement B.G.1998, Nealson, K. H et al 1980, Potts, M. 1994) En el ambiente suelo las bacterias se encuentran metabolicámente activas cuando hay una disponibilidad de sustratos y teóricamente forman esporas cuando los nutrientes bajan. Esta estrategia es usada por otros microorganismos que incluyen los hongos filamentosos y los actinomicetes que son predominantes en un hábitat aerobio. Esto puede ser un ejemplo de convergencia evolutiva para estos grupos de microorganismos que viven en el suelo, forman esporas y producen antibióticos (Vreeland, R. H et al 2000) Además muchas de las especies de Bacillus pueden efectivamente degradar una serie de biopolímeros (proteínas, almidón, pectina, etc.), ello se asume de tener un papel significativo en los ciclos geobiológicos del carbono y nitrógeno (De Vrind, J. P et al .1998, 1986). Cohn demostró la resistencia al calor de las endosporas en B. subtilis, y Koch describió el desarrollo del ciclo de esporulación en B. anthracis. Endosporas derivan su nombre porque son formadas intracelularmente, no obstante, ellas son liberadas de la célula madre o esporangio como esporas libres. Las endosporas es la estructura más duradera encontrada en la naturaleza por su característico estado criptobiotico en la fase de dormancia, lleva a que permanezca por tiempos prolongados o millones de años en la naturaleza (Chin, K. J 1999, van Waasbergen, L et al 1996).. 12.

(32) Ni las características morfológicas ni los criterios moleculares. han permitido. adecuadamente distinguir los miembros del género Bacillus. Una forma artificial pero conveniente para organizar los miembros de este género es localizarlo en grupos ecofisiologicos como son: fijadores de nitrógeno, denitrificantes, patógenos de insectos, patógenos de animales, termofilos, productores de antibióticos entre otros. agrupación permite especular. Esta. acerca de la historia natural y la ecología de este. importante grupo de bacterias (Caspi. A.G 1997, Dong YH et al 2002, Felske, A., A et al 1998, Gurtner, C et al 2000).. 13.

(33) CAPITULO II. II. MATERIALES Y METODOS. Localización de sitios de muestreo y cepas de estudio. Las cepas objeto de este trabajo se obtuvieron de la colección del Centro de Investigaciones Microbiológicas, CIMIC, Universidad de los Andes, evaluadas en anteriores estudios (Andrade et al 1996, Dussán et al 1997, Lozano et al 2002) por su carácter patógeno para mosquitos y como grupo indicador en bosques nativos de Quercus humboldtii. ubicado en el Parque Reserva Natural. Chicaque vía SAN. ANTONIO DE TEQUENDAMA (N 4°36´ W 74°15´), municipio de Cundinamarca, Colombia, (Fig. 1). Adicionalmente se seleccionaron tres sitios para nuevos aislamientos: Un bosque de Quercus humboldtii en el bosque Natural Las Mercedes vía La MESA (N 4°36´ W 74°26´) , municipio de Cundinamarca , Colombia (Fig. 1 , 3) y dos bosques de Quercus robur Linneo en la localidad de Tres Cantos (N 40°36´ W3°42´) y de Canto Blanco (N 40°32´ W4°42´) al Norte de la Comunidad de Madrid, España ( Fig. 2 , 3 ) . Todas las cepas se relacionan en la Tabla 1. 14.

(34) 1a. 1b. Fig. 1. 1a: Mapa de Colombia. 1b: Localización del Parque Natural Chicaque (N4°36´ W 74°15´) y Parque las Mercedes (N4°36´ W 74°26´) vía la Mesa, Cundinamarca, Colombia. 2a. 2b. Fig. 2. 2a: Mapa de España. 2b: Localización de Bosque de Quercus robur Linneo en la localidad de Tres Cantos (N 40°36´ W3°42´) y Canto Blanco (N 40°36´ W4°42´). Norte Madrid, España. 15.

(35) 3a. 3b. Fig. 3. 3a: Quercus humboldtii (Colombia). 3b: Quercus robur Linneo (España). 16.

(36) Idenificacion. Bs1-I Bs 2a-IIA Bs 3a-IIA Bs 4a-IIB Bs 11b-III Bs 6a-IV Bs 10a-V Bs 10aa Bs 12- 17a Bs 15-15a Bs 17-17b Bs 19-2b Bs 9-4b Bs 14- 13a Bs 20-3b Bs 21-21a Bs 13-13b Bs 18-10b Bs 10-10a Bs 11-11a Bs 16-29a Bs 22-22a Bs 23-22b Bs 24-24a Bs 25-257a Bs 26-27a Bs 27-27b Bs 28-28a Bs 29-29b Bs 30-30b Bs 2E-2ea Bs 3E-3ea Bs 4E-4ea Bs 5E-5eb Bs 8Eg-2eb Bs 8Ep-3eb Bs 10E-4eb Bs 11E-5ea Bs14E-30a. Lugar. B.s grupo homologia I (biótipo I) B.s grupo homologia IIA - (biótipo IIA) B.s grupo homologia IIA - (biótipo IIA) B.s grupo homologia IIB - (biotipo IIB) B.s grupo homologia III - (biotipo III) B.s grupo homologia IV - (biotipo IV) B.s grupo homologia V - (biotipo V) Bacillus globisporus outgroup Chiza Sabana Bogotá Chiza Sabana Bogotá Tierra Sabana Bogotá Tierra Valle , Choco Tierra Valle , Choco Tierra Sabana Bogotá Tierra Sabana Bogotá Chiza Sabana Bogotá Tierra Sabana Bogotá Rizosfera Q. humboldtii Chicaque Rizosfera Q. humboldtii Chicaque Rizosfera Q. humboldtii Chicaque Rizosfera Q. humboldtii Chicaque Rizosfera Q. humboldtii Chicaque Rizosfera Q. humboldtii Chicaque Rizosfera Q. humboldtii Chicaque Rizosfera Q. humboldtii Mercedes Rizosfera Q. humboldtii Mercedes Rizosfera Q. humboldtii Mercedes Rizosfera Q. humboldtii Mercedes Rizosfera Q. humboldtii Mercedes Rizosfera Q. humboldtii Mercedes Rizosfera Q. robur Linneo Tres Cantos Rizosfera Q. robur Linneo Tres Cantos Rizosfera Q. robur Linneo Tres Cantos Rizosfera Q. robur Linneo Tres Cantos Rizosfera Q. robur Linneo Tres Cantos Rizosfera Q. robur Linneo Canto Blanco Rizosfera Q. robur Linneo Canto Blanco Rizosfera Q. robur Linneo Canto Blanco Rizosfera Q. robur Linneo Canto Blanco. Características. Genbank. Kryac et al Kellen et al Kellen et al Kryac et al Kryac et al Kryac et al Kryac et al Andrade et al Andrade et al Andrade et al Dussán et al Dussán et al Dussán et al Dussán et al Dussán et al Dussán et al Dussán et al Lozano et al Lozano et al Lozano et al Lozano et al Lozano et al Lozano et al Lozano et al En este estudio En este estudio En este estudio En este estudio En este estudio En este estudio En este estudio En este estudio En este estudio En este estudio En este estudio En este estudio En este estudio En este estudio En este estudio. DQ860141 DQ860130 DQ860129 DG860131 DQ860113 DQ860119 DQ860127 DQ860116 DQ860132 DQ860128 DQ860125 DQ860124 DQ860126 DQ860143 DQ860133 DQ860134 DQ860135 DQ860144 DQ860136 DQ860137 DQ860142 DQ860138 DQ860139 DQ860114 DQ860117 DQ860120 DQ860123 DQ860115 DQ860118 DQ860121 DQ860122 DQ860140. Table 1. Aislamientos de Bacillus sphaericus analizados en este estudio y grupos Referencia 17.

(37) Aislamiento de bacterias y análisis agrológico de suelo. Cuadrantes de 10 X 10 m y subcuadrantes de 1 X 1 m fueron demarcados para el muestreo en los bosques de Las Mercedes (La Mesa, Colombia), Tres Cantos y Canto Blanco (Madrid, España). Muestras de 500 grs. tomadas a una profundidad de 30 cm. alrededor de la rizosfera de cada uno de los 20 árboles seleccionados en cada sitio fueron depositadas en bolsas y refrigeradas por 4 h. Se homogenizó y se mezcló 50g de cada suelo con 50 mL de agua destilada estéril, se agitó a 150 r.p.m por 30 min. y decantó igualmente por 30 minutos. 10 mL del sobrenadante fueron llevados a choque térmico ( 90°C X 20´) y diluciones seriadas fueron preparadas para siembras en superficie en Agar nutritivo e incubadas a 30°C por 48 h. El material restante fue utilizado para la determinación agrológica del suelo. Los aislamientos seleccionados por observación macroscópica, microscópica y por un análisis discriminatorio de formación de espora terminal deformante de esporangio y bioquímicas selectivas para género y especie. fueron conservados a -80°C (Rosson, R. A.et al 1982.) .. El análisis agrológico del suelo se baso en características de concentración de iones bivalentes de Ca, Mn, Fe, determinación de pH y capacidad de intercambio cationico – CEC (tabla 2).. 18.

(38) Análisis. Parque Chicaque pH 5.5 Textura Franco arenoso % carbono 14,79 % nitrógeno 1,34 Calcio (ppm) 642 Manganeso(ppm) 124 Potasio (ppm) 220 Fósforo ( ppm) 5.5 CEC 66,07 %saturación Ca 70,5 %saturación Mn 35,8 Relación Ca/Mn 5,17. Parque Las Mercedes 5.2 Franco arenoso 10,05 1,07 604 146 193 5.6 62,23 67,7 43,9 4,38. Bosque Tres Bosque Canto Cantos Blanco 5.0 5.3 Arenoso Arenoso 13,92 15,42 1,20 1,34 825 747 148 129 210 242 6.0 5.0 62,00 65,04 89,8 81,2 44,2 38,6 5,57 5,79. Tabla 2. Análisis agrológico de rizosfera de Quercus humboldtii y Quercus robur Linneo. 19.

(39) Sincronización de cultivos: célula vegetativa y espora Un total de 39 morfotipos agrupados como Bacillus sphaericus fueron sincronizados por rondas de temperatura selectiva para célula vegetativa y estados de esporulación en medio agar-suelo y caldo-suelo De un cultivo crecido ON en placa se seleccionó una colonia y se resuspendió en caldo LB , dejando crecer 15 h a 30°C. Erlermeyer con medio base suelo (suelo estéril 1%) fueron inoculados con 1% del cultivo anterior, este se incubó a 30°C durante 72 h. Se repitió cinco veces el mismo procedimiento y se determinó la formación de esporas por 99% de refringencia de los cultivos. Se indujo la germinación por choque térmico a 90°C por 20´ (Fig. 4). 4a. 4b. 4c. Fig. 4. (a) Bacillus sphaericus, microscopia de luz. (b) Estado IV de esporulación . (c) Espora madura , microscopia electrónica. 20.

(40) Preparación de peptidoglicano de célula vegetativa. Cultivos celulares vegetativos fueron herviendo durante 15 min. y centrifugados a 14.000 rpm durante 8 min. a 4°C. Se resuspendió el pellet por adición de SDS al 5% caliente (w/v) y otra vez hervido por 25 min. El material insoluble fue recuperado por centrifugación (14.000 rpm, 8 min., 20°C), resuspendido en SDS al 4% (w/v) y hervido otra vez por 15 min. La preparación de peptidoglicano insoluble fue lavado varias veces con agua destilada caliente (60°C) hasta obtener la solución libre de SDS. Las proteínas asociadas fueron retiradas con pronasa (2mg/mL) incubando a 60°C por 1h. La pared celular obtenida se centrifugó (14.000 rpm, 8 min., 20°C) y se lavó una vez mas con agua destilada caliente, el pellet celular se resuspendió en acido tricloacético (400 µl de una solución 5% v/v) de tal forma que la mezcla fue incubada a 2°C por 24 h. El material insoluble fue centrifugado (14.000 rpm, 8 min., 4°C) y lavado varias veces y resuspendido en buffer Tris-HCL (50mM pH 7). Finalmente fue lavado varias veces con agua destilada fría hasta obtener una solución pH neutro. El material fue conservado a -20°C (Abdelmadjid. A et al. 1999). Preparación de peptidoglicano asociado a esporas maduras. Cultivos esporulados (99% refringencia) fueron centrifugados. (14.000 rpm, 8 min.,. 4°C) y el pellet celular de esporas obtenido fue secado ON a 37°C. 800 mg del material secado se resuspendieron en buffer Tris-HCL-dithiotreitol (50mM pH 8.0, SDS 4%, EDTA 2mM, dithiotreitol 30mM) y hervidos durante 16 min. . La mezcla se dejo reposar a 37°C por 40 min.. 21.

(41) La preparación insoluble fue lavado varias veces con agua destilada caliente (60°C) hasta obtener la solución libre de SDS. Las proteínas asociadas fueron retiradas con pronasa (2mg/ml) incubando a 60°C por 1h y 30 min. La pared celular obtenida se centrifugo (14.000 rpm, 8 min., 20°C) y resuspendido en buffer Tris-HCL-SDS ( Tris 50mM pH 7, SDS 4%, EDTA 2mM) y se calentó de nuevo la mezcla a 100°C por 16 min. Se repitió varios lavados y centrifugados en agua caliente hasta obtener solución libre de SDS. Finalmente se lavó varias veces con agua destilada fría hasta obtener una solución de pH neutro. El material fue conservado a -20°C (Abdelmadjid A et al 1996). Hidrólisis enzimática del Peptidoglicano y separación por RP-HPLC de los muropeptidos solubles. Las muestras que contenían los muropeptidios solubles conservadas a -20°C fueron digeridas con 250 µg de Cellusyl en buffer fosfato de sodio pH 5.6 por 15 horas . La reacción fue detenida calentando la mezcla ( 100°C , 3 min.). Los muropeptidos solubles fueron reducidos con Borohidruro de Sodio al 10%. ( 0.5 M ,pH 8.0). concentración final 1.7 mg en la muestra . La reacción fue detenida después de 15 min. bajando el pH 3.0 con acido fosfórico al 10%. Todas las muestras fueron filtradas por millipore 0.45 µ para retirar el material insoluble y conservadas a – 20°C hasta su uso. Los muropeptidos reducidos fueron separados por. HPLC de fase reversa empleado. una columna de Hipersil octadecilsilane (Sigma) Los buffer de elusión fueron:. 22.

(42) Buffers A : 40 mM fosfato de sódio ( pH 4.25 a 20°C) , Buffers B : 40 mM fosfato de sódio ( pH 4.21 a 20°C) – 20% ( v/v) metanol. La columna fue equilibrada con buffer A (0.60 ml min.-1) a 40°C. Las muestras que contenían los muropeptidos (50 µL) fueron corridos en un gradiente lineal 0 a 100 de buffer B durante 180 min. Los compuestos eluidos fueron monitoreados a A 202 (Abdelmadjid A et al 1998). Extracción de proteínas totales: fase logarítmica y estacionaria. 1% de Cultivos ON (30°C) de las cepas de estudio crecidas en medio LB, se inoculó en erlermeyers con 100 ml de medio LB. Se continuo el crecimiento 3h en las mismas condiciones hasta alcanzar una absorbancia de 0.6 – 0.8 (fase logarítmica) y de 1.0 (fase estacionaria). Luego 1% de los cultivos crecidos hasta fase estacionaria fue transferido a 100 ml de medio inductor de esporulación. Se incubó por 5 días a 30°C o hasta observar un 99% de refringencia. Todos los cultivos se centrifugaron a 14.000 r.p.m a 20ºC por 10 min y se conservó el pellet celular a – 20°C en buffer de conservación de proteínas (Kämpfer P. 1995). Extracción de fracciones: membrana, citoplasma y periplasma. Se sembraron cultivos ON de la cepas de estudio en 30 ml de LB, se centrifugó (14.000 r.p.m. 20ºC .15min) y el botón celular se resuspendió en 1 mL de solución de TrisSacarosa, adicionando 10 µL de EDTA pH 8,0 0,5M, 100 µL de lisozima de una solución fresca de 2,5 mg/ml y se dejo en hielo por 1 hora. Transcurrido este tiempo se adicionó 20 µL de CaCl2 de una solución stock 1 M, 20 µL de NaCl de una solución stock de 5 M y se centrifugó a 12.000 r.p.m por 20 minutos a 4ºC.. 23.

(43) El sobrenadante se transfirió a otro eppendorf y se marcó como fracción periplasmática (P), a este se le adicionaron inhibidores de proteasas (leupeptina a 0.5. g/mL, phenyl-. methyl-sulfonil-fluoride (PMSF) a 170 µg/mL), agentes reductores (dithiothreitol (DTT) a 1mM), glicerol al 10% y se conservó a -20°C. El pellet se resuspendió en 0,5 mL de la solución A (30mM Tris HCl pH 8.0, 5 mM MgCl2) y se centrifugó a 12.000 r.p.m por 20 minutos a 4ºC.. Se recuperó el. sobrenadante y se marco como fracción citoplasmática (C), a este se le adicionaron inhibidores de proteasas y agentes reductores como se describe anteriormente, glicerol (al 10%) y se conservó a -20°C. El pellet resultante se resuspendió en 50 µL de la solución B (30mM Tris HCl pH 8.0, 1mM EDTA pH 8.0) y se marcó como fracción de membrana (M), adicionándole inhibidores de proteasas y agentes reductores como se describe arriba, Tritón 100X (concentración final de 1.5%), KCl (concentración final de 0.15M), glicerol (concentración final 10%) y se conservó a -20°C.. Electroforesis de proteínas en SDS – PAGE. .. A 20 µL de cada muestra ( extractos totales y fracciones celulares) se adicionó 10 µL de buffer de corrida (Laemmli UK. 1970). Todas las muestras fueron sometidas a denaturalización por calentamiento a 94°C por 5 min y separadas en geles poliacrilamida- Dodecil sulfato de Sodio (SDS – PAGE) 45min). de. al 10 % (110 voltios.1h.. con buffers Tris-Glicina .El marcador de peso molecular empleado. fosforilasaB 97,400; Albúmina sérica 66,200; Ovoalbumina 45,000; Anhidrasa carbónica 31,000, inhibidor de tripsina 21,500; Lisozima 14,400. Los geles se tiñeron con Azul de Coomasie (15 min.) en agitación y se decoloraron con acido acético al 10 % por 24h ( Çökmüş C. et al 1994). 24.

(44) Electroblot y Secuencia N-Terminal de Proteína Capa – S y Toxina de 41 KDa Las proteínas corridas en gel de poliacrilamida al 10% fueron transferidas a una membrana de PVDF. La transferencia se realizó en sistema semiseco a 250 mA por 1h. Posteriormente, la membrana fue revelada con Rojo Congo para visualizar el marcador de peso molecular y las proteína de alrededor de 100kDa y 30 KDa que se determinó en los extractos en fase estacionaria como en fracciones de membrana y la proteína de 41 KDa en los cultivos esporulados de los aislamientos patógenos. Las proteínas fueron secuenciadas en su N-terminal en el Laboratorio de Secuencia de proteínas del Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, Universidad Autónoma de Madrid, España La identidad de la proteina fue analizada por el programa. Fast 3.t. European. Bioinformatics Institute. Preparación de DNA total Células crecidas en 100 mL de caldo LB fueron resuspendidas en 10 mL de buffer E ( Tris-HCL pH 8.0 -1 mM EDTA) con 1 mg/ ml de lisozima (sigma) e incubada a 37°C hasta que la solución se torno viscosa. Luego 0.5 mL de una solución de SDS al 10% (w/v) y 1.0 mg de proteinasa K (sigma) fueron adicionada y la mezcla fue incubada por 3h a 50°C. 10 mL de una solución fenol-cloroformo-iso-amil-alcohol (25:24:1) se adicionó, se mezcló y centrifugó. La fase acuosa fue transferida a un tubo y se adicionó isopropanol frío dos veces el volumen original. El DNA total concentrado y secado fue resuspendido en agua milliQ estéril y conservado a – 20°C.. 25.

(45) RAPDs Oligonucleotidos obtenidos de Isogen Bioscience BV fueron resuspendidos en agua milliQ estéril a una concentración de 0.1 ug/ul. Un total de 37 oligonucleotidos fueron probados y 3 repeticiones. escogidos por la reproducibilidad de AD-11. (CAATCGGGTC),. AA-15. patrones de bandeo en tres (ACGGAAGCCC). y. AF-. 17(AACCCGGGAA). Los siguiente reactivos fueron adicionados a cada uno de 25 µL de reacción: 5 µL de buffer 10X, dNTPs a 100 µM, 3 mM de MgCl2, 1.25 µM de cada oligonucleotido, 1.5 µL Taq polimerasa, 20 ng de DNA templado y se completó a 25 µL con agua milliQ estéril. Las condiciones de la amplificación fueron las siguiente: 94°C por 10 min., 65 ciclos de 94°C por 1 min, 36°C por 1 min, 72°C por 2 min. y una extensión final de 72°C por 10 min. Los productos de PCR fueron corridos en gel de agarosa al 1.5% en buffer TAE 1X con bromuro de etidio (0.5 µg/ µL). Los geles fueron analizados en sistema de documentación ChemiDoc.. Amplificación del gen 16S rRNA y secuenciación. La amplificación del gen 16s rRNA fue realizada en 25 µL de reacción que contenían 100 ng de DNA, 10 µL de 10X de buffer, 200 µL de cada dNTPs , 1 µL de cada oligonucleotido y 5 unidades de Taq polimerasa de Boeheringer. Los oligonucleotidos de amplificación fueron 5´ GAGTTTGATCCTGGCTCAG (E.coli posición 9 -27) y 5´ AGAAAGGAGGTGATCCAGCC 3´ (Posición 1525 -1544).. 26.

(46) Las condiciones de amplificación de PCR incluyeron un paso de denaturación inicial a 94°C por 10 min. seguido por 30 ciclos de 94°C por 1 min., 58°C por 2.5 min. luego 72°C por 2.0 min. y una extensión final de 72°C por 10 min. . Los fragmentos amplificados fueron purificados por electroforesis en agarosa al 0.8% y la secuencia del DNA obtenido con el oligonucleotido interno 5´TACGGCTACCTTGTTACGACT3´ (posición 1109 a 1130 ) RFLPs. Las enzimas de restricción EcoR1, Ddel1 y Pst 1. fueron usados en un reacción de 20. µl. Cada enzima fue trabajada con el buffer recomendado por la casa manufacturera, 3U de la enzima y aproximadamente 200 ng del producto de PCR se incubaron a la temperatura optima durante 4h. Los fragmentos de restricción fueron revelados por electroforesis en agarosa al 1% en buffer TAE 1X (110 V 75 mA) .Para la coloración, el gel fue colocado en una solución de bromuro de etidio (0.5ug/ml) durante 20 min. Los geles fueron visualizados y la imagen analizada en un sistema de documentación Chemi doc. Agrupamiento taxonómico fenotípico: Fenogramas Las bandas del perfil de proteínas se transformaron en un perfil utilizando el programa TINA 2.3 (Esen, A.A. 1978). Posteriormente este perfil así como los picos obtenidos en los cromatogramas de muropeptidos del peptidoglicano analizado, se transformaron a datos binarios (1/0) con el fin de realizar una matriz, la cual se analizó por el coeficiente de similitud de Sokal y el método de agrupación de características entre parejas con promedios aritméticos (UPGMA), utilizando el programa SYN-TAX-pc 2000. (Rohlf, F. J. 1994).. 27.

(47) Agrupamiento taxonómico genotípico: Dendogramas Con los productos de amplificación obtenidos con cada uno de los oligonucleotidos evaluados, se realizó una matriz indicando presencia o ausencia de las bandas para cada una de las cepas (1/0), la cual se analizó por el coeficiente de similitud de Jaccard y el método de agrupación de características entre parejas con promedios aritméticos (UPGMA), utilizando el programa SYN-TAX-pc 2000.. Análisis filogenético. Las secuencias del gen. 16S rRNA. fueron alineadas manualmente. usando. Sequencher y comparado los alineamientos con CLUSTAL W y el programa de alineamientos Mac Clade y Ribosomal Database Project Sequence Aligner program. Los árboles filogenéticos fueron generados por máxima verosimilitud o por máxima parsimonia con PAUP (versión 4.0b3). La base de datos en GenBank, EMBL y DDBJ de los Bacillus sphaericus se usaron como referencia para el alineamiento. Número de acceso de secuencia de nucleótidos y N-Terminal de proteínas Las secuencias del gen 16S RNA de las 32 cepas determinadas en este estudio fueron depositadas en GenBank bajo los números de acceso DQ860113 al DQ860144. 28.

(48) CAPITULO III. RESULTADOS. PROTEINAS TOTALES Y FRACCIONES CELULARES EN CELULA VEGETATIVA Y ESPORAS. Las Fig. 5, 7 y 9, presentan el patrón de bandeo de los perfiles protéicos de los cultivos vegetativos y espora madura en gel de poliacrilamida al 10%. Para todos los aislamientos se observa un patrón heterogéneo en el perfil de proteínas en fase logarítmica así como para las cepas controles (fig. 5). El Fenograma del perfil de proteínas mostró dos grupos separados con un nivel de disimilitud de 0.37 en fase logarítmica y tres subgrupos (fig. 6). En el subgrupo III se agruparon la mayoría de las cepas patógenas con los biotipos de referencia I y IIA (2362). En los subgrupo IV y V los aislamientos no patógenos asociados a la rizosfera del género Quercus con similitudes del 100% independiente de la región geográfica de aislamiento y relacionados con los biotipos IIB, III, IV y V Un patrón mas homogéneo de bandeo de los cultivos en fase estacionaria se observo (fig. 7). Para el análisis del perfil de proteínas se determinaron dos grupos con 0.65 de disimilitud y entre un 0.3 y un 0.5 en los cuatro subgrupos en fase estacionaria (fig. 8). Varios aislamientos independientes del carácter patógeno y de la región geográfica presentaron un 100% de similitud. No se relacionaron los aislamientos con biotipos de referencia en particular. 29.

(49) Para el perfil de proteínas de espora madura (fig. 9) se determinó la presencia de bandas especificas en aislamientos patógenos (carril 9, B.s 19-19a) y una homogeneidad de bandas en los no patógenos. El fenograma revelo una disimilitud del 0.8 para los grupos I y II (fig. 10) y un 0.25 0.5 de disimilitud entre los tres subgrupos. La mayoría de los. aislamientos no. patógenos incluidos todos los de la rizosfera de Quercus robur Linneo de España y el biotipo IV de referencia. mostraron un 100% de similitud (subgrupo III).. Los. aislamientos patógenos y los biotipos de referencia IIA no presentaron una agrupación especifica , sin embargo es fundamental resaltar que se ve una tendencia de agrupaciones entre los patógenos de alta, media o baja patogenecidad y el biotipo IIA de referencia (B.s 2a,3a) . El agrupamiento comparativo de. las proteínas sintetizadas por Bacillus sphaericus. durante su ciclo de vida (vegetativa y espora) mostró : 1. Dos grupos con una similitud del 0.45 y cuatro subgrupos distribuidos así : 2 El III relacionado casi todos aislamientos patógenos y relacionados con los biotipos I , IIA y IV de referencia 3. El IV y V relacionó a la mayoría de los aislamientos de la rizosfera de Quercus humboldtii 4. El grupo VI el agrupamiento de los aislamiento de la rizosfera de Quercus robur Linneo. (fig. 11). Se determinó similitud del 100% en las cepas de España para los. extractos de esporas y fase estacionaria. 30.

(50) A. B. Fig. 5. Electroforesis de Proteínas de Fase logarítmica de cultivos sincronizados de B.sphaericus .A. lineas: 1. marcador de peso molecular. 2- 8: Biotipos de referencia, 916 .Aislamientos patógenos. B. 1. Marcador de peso molecular. 2-6: Aislamientos no patógenos de bosques de Colombia, 7-9 aislamientos no patógenos de bosques España. 10 .Bacillus globisporus (outgroup) 31.

(51) Fig. 6 Fenograma de Proteínas Fase Logarítmica de Bacillus sphaericus basado en el coeficiente de similitud de Sneath y Sokal y en UPGMA. 1 (1-I); 2 (3a-IIA); 3 (2aIIA) ; 4 (4a-IIB ) ; 5 (11b-III ) ; 6 (29-29b). 7(10a-V ) ; 8 (6a-IV ) ; 9. (12- 17a ) ; 10. (15-15a) ; 11. (17-17b) ; 12. (19-2b ) ; 13. (20-3b ) ; 14. (9-4b) ; 15. (13-13a) ; 16. (2121a) ; 17. (14- 13a) ; 18. (18-10b) ; 19. (10-10a) ; 20. (11-11a) ; 21. (16-29a) ; 22. (2222a) ; 23. (23-22b) ; 24. (24-24a) ; 25. (25-257a) ; 26. (26-27a) ; 27. B globisporus(10aa) ; 28. (28-28a); 29. (27-27b) ; 30. (30-30b) ; 31. (2E-2ea) ;32. (3E3ea); 33 (4E-4ea ); 34 (5E-5eb) ; 35(8Eg-2eb) ;36 (8Ep-3eb); 37(10E-4eb); 38 (11E5ea); 39 (14E-30a) : Azul :biotipos referencia; rojo : patógenos; verde : no patógenos Colombia, Negro : No patógenos España 32.

(52) A. B. Fig. 7. Electroforesis de Proteínas de Fase Estacionaria de cultivos sincronizados de B.sphaericus. A.Lineas 1: Marcador de peso molecular. 2-5 no patógenos de Parque Chicaque; 6-10 no patógenos Bosque Las Mercedes, Colombia. B.1.marcador de peso molecular; 2-3 no patógenos biotipos de referencia, 4-5 patógenos; 6- 9 no patógenos Bosque Canto Blanco, España. 10. B.globisporus outgroup. 33.

(53) Fig. 8. Fenograma de Proteínas Fase Estacionaria de Bacillus sphaericus basado en el coeficiente de similitud de Sneath y Sokal y en UPGMA. 1 (1-I); 2 (3a-IIA); 3 (2aIIA) ; 4 (4a-IIB ) ; 5 (11b-III ) ; 6 (29-29b). 7(10a-V ) ; 8 (6a-IV ) ; 9. (12- 17a ) ; 10. (15-15a) ; 11. (17-17b) ; 12. (19-2b ) ; 13. (20-3b ) ; 14. (9-4b) ; 15. (13-13a) ; 16. (2121a) ; 17. (14- 13a) ; 18. (18-10b) ; 19. (10-10a) ; 20. (11-11a) ; 21. (16-29a) ; 22. (2222a) ; 23. (23-22b) ; 24. (24-24a) ; 25. (25-257a) ; 26. (26-27a) ; 27. B globisporus(10aa) ; 28. (28-28a); 29. (27-27b) ; 30. (30-30b) ; 31. (2E-2ea) ;32. (3E3ea); 33 (4E-4ea ); 34 (5E-5eb) ; 35(8Eg-2eb) ;36 (8Ep-3eb); 37(10E-4eb); 38 (11E5ea); 39 (14E-30a) .Azul :biotipos referencia; rojo : patógenos; verde : no patogenos Colombia, Negro : No patógenos España 34.

(54) A. B. Fig. 9. Electroforesis de Proteínas de Espora Madura en gel de poliacrilamida al 10% de cultivos sincronizados de Bacillus sphaericus. A. líneas: 1. Marcador de peso molecular; 2-6 Cepas referencia, 7-10 patógenas. B líneas: 1. marcodor de peso molecular 2- 6 no patógenas de Colombia, 7 -10 no patógenos de España. 35.

(55) Fig. 10. Fenograma de Proteínas de Espora madura de cultivos sincronizados de Bacillus sphaericus basado en el coeficiente de similitud de Sneath y Sokal y en UPGMA. 1 (1-I); 2 (3a-IIA); 3 (2a-IIA) ; 4 (4a-IIB ) ; 5 (11b-III ) ; 6 (29-29b). 7(10a-V ) ; 8 (6a-IV ) ; 9. (12- 17a ) ; 10. (15-15a) ; 11. (17-17b) ; 12. (19-2b ) ; 13. (20-3b ) ; 14. (9-4b) ; 15. (13-13a) ; 16. (21-21a) ; 17. (14- 13a) ; 18. (18-10b) ; 19. (10-10a) ; 20. (1111a) ; 21. (16-29a) ; 22. (22-22a) ; 23. (23-22b) ; 24. (24-24a) ; 25. (25-257a) ; 26. (2627a) ; 27. B globisporus(10aa) ; 28. (28-28a); 29. (27-27b) ; 30. (30-30b) ; 31. (2E2ea) ;32. (3E-3ea); 33 (4E-4ea ); 34 (5E-5eb) ; 35(8Eg-2eb) ;36 (8Ep-3eb); 37(10E4eb); 38 (11E-5ea); 39 (14E-30a) Azul :biotipos referencia; rojo : patógenos; verde : no patogenos Colombia, Negro : No patógenos Espana 36.

(56) Fig. 11. Fenograma Comparativo de Proteinas Totales en Celula Vegetativa y Espora maduras de cultivos sincronizados de Bacillus sphaericus basado en el coeficiente de similitud de Sneath y Sokal y en UPGMA. 1 (1-I); 2 (3a-IIA); 3 (2a-IIA) ; 4 (4a-IIB ) ; 5 (11b-III ) ; 6 (29-29b). 7(10a-V ) ; 8 (6a-IV ) ; 9. (12- 17a ) ; 10. (15-15a) ; 11. (1717b) ; 12. (19-2b ) ; 13. (20-3b ) ; 14. (9-4b) ; 15. (13-13a) ; 16. (21-21a) ; 17. (1413a) ; 18. (18-10b) ; 19. (10-10a) ; 20. (11-11a) ; 21. (16-29a) ; 22. (22-22a) ; 23. (2322b) ; 24. (24-24a) ; 25. (25-257a) ; 26. (26-27a) ; 27. B globisporus(10aa) ; 28. (2828a); 29. (27-27b) ; 30. (30-30b) ; 31. (2E-2ea) ;32. (3E-3ea); 33 (4E-4ea ); 34 (5E5eb) ; 35(8Eg-2eb) ;36 (8Ep-3eb); 37(10E-4eb); 38 (11E-5ea); 39 (14E-30a) Azul :biotipos referencia; rojo : patógenos; verde : no patógenos Colombia, Negro : No patógenos España 37.

(57) PROTEINA ENTOMOTOXIGENICA de 41KDa y DE LA CAPA – S EN FRACCIONES DE MEMBRANA Y EXTRACTOS CELULAR Para las fracciones citoplasmáticas y de membrana se determinaron patrones uniformes de bandeo en todos los aislamientos evaluados (Fig. 12,13). Proteínas de 100 KDa en las fracciones de membrana y en extractos totales fueron analizadas por la presencia en 36 aislamientos y proteína de 41kDa por su alta concentración en los aislamientos patógenos (Fig. 9A). La secuencia N-Terminal de la proteína de 100 KDa reveló una diferencia puntual en el aminoácido serina (S) por cisterna ( C) en 9 de los 36 aislamientos evaluados: AQLNDFNKISGY , AQLNDFNKICGY Una identidad del 100% y del 91% en el alineamiento de la secuencia fue obtenido con la proteína completa de 125 KDa de la capa S ( S-layer) especifica de B.sphaericus. (Tabla 3) Las proteínas de 41KDa y 52 KDa se evidenciaron en los aislamientos patógenos correspondientes a la toxina binaria de las cepas patógenos (Fig. 9) .Para la proteína de 41 KDa , presente en algunos de los aislamientos patógenos se obtuvo igualmente una identidad del 100% en el N-terminal. La secuencia N-terminal mostró una homologia con la proteína de los biotipos IIA B.sphaericus 2362 y B.sphaericus 1593 (tabla 3). No se obtuvo homología para la banda de 30 KDa presente en varios aislamientos. 38.

(58) Fig. 12. Electroforesis de Proteínas de Fracciones de Membrana de cultivos sincronizados de Bacillus sphaericus. Líneas: 1. Marcador de peso molecular; 2-3 biotipos de referencia. 4-5 patógenas de Colombia, 6-9 no patógenas de Colombia. 10 no patógenas de España. 100. 32. Fig. 13. Electroforesis de Proteínas de Fracciones de Citoplasma de cultivos sincronizados de Bacillus sphaericus. Líneas: 1. Marcador de peso molecular; 2-4 Biotipos de Referencia. 5-6 patógenas de Colombia, 7-10 no patógenas de Colombia. 39.