UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE INGENIERÍA
Proyecto de Grado para Ingeniería Ambiental Nombre: Diana Catalina Múnera Parra
Código: 200912382
Fecha: Agosto 14 del 2014
Degradación del polietileno de baja densidad por
Aspergillus niger
Resumen
La biodegradación del polietileno de baja densidad podría ser una solución a la acumulación de desechos plásticos en el medio ambiente. En el presente estudio se muestran los resultados de la capacidad degradante del hongo Aspergillus niger sobre dos tipos de muestras de polietileno de baja densidad (bolsa plástica común y manguera para riego) bajo condiciones controladas de laboratorio, donde la mitad de estos materiales fue expuesta a rayos UV por un tiempo de 13 horas; la biodegradación de las muestras se monitoreó con microscopía electrónica. Se realizaron observaciones de las muestras antes de ser expuestas a cualquier tratamiento, luego de la irradiación a UV, un mes y dos meses después de haber sido inoculadas con el microorganismo. Después de dos meses de exposición se encontró una preferencia de Asperigllus niger hacia la manguera, en la que se presentaron biopelículas de hifas penetrando la superficie de este material además de una pérdida de dureza y cambios macroscópicos; en las muestras de bolsa plástica no se presentaron estas biopelículas pero si aparece un desgaste y rugosidad en la superficie que no es tan claro como en la manguera. Finalmente aunque la irradiación UV facilita inicialmente la degradación del polietileno, en la microscopia electrónica no se observaron diferencias en la acción de Aspergillus niger sobre las muestras expuestas y no expuestas a rayos UV.
Abstract
The biodegradation of low-density polyethylene could be a solution to the accumulation of plastic waste in the environment. This paper reports the capability of the fungus
Aspergillus niger to degrade two samples of low density polyethylene under controlled laboratory conditions, namely a common plastic bag and a watering hose. Half of the materials was exposed to UV irradiation for a period of 13 hours, and the other half was unexposed; the biodegradation of the samples was monitored with electron microscopy. Observations were made of the samples before exposure to any treatment, after UV irradiation, one month and two months after being inoculated with the microorganism. After two months of exposure it was found a preference of Aspergillus niger to the hose, where biofilms of the fungus were found penetrating the surface of the material, accompanied by a loss in hardness and macroscopic changes. Fungi biofilms were not found in the samples of plastic bags, but there was a wear and roughness in the surface, that was not as clear as in the hose. Finally, although UV irradiation initially facilitates polyethylene degradation there were not differences in the action of Aspergillus niger
on exposed and unexposed samples of UV radiation as observed by electronic microscopy.
1. INTRODUCCIÓN
En la actualidad la industria del plástico se encuentra en constante crecimiento debido a
que es un material muy utilizado en todo el mundo (Shah et al., 2008). Los plásticos
están formados por polímeros sintetizados a partir de compuestos orgánicos, y se
caracterizan por tener una alta relación de resistencia/densidad, por lo que son útiles
para el aislamiento térmico y eléctrico, además de ser muy usados como empaques
(Frias, Lema, & Gavilan, 2001). El polietileno (PE) es el termoplástico más utilizado en
la actualidad, se caracteriza por ser un polímero compuesto por monómeros de oleofinas
muy resistente a la degradación (Méndez et al., 2013); por su inercia química y
biológica son muy adecuados para la fabricación de bolsas plásticas, tuberías,
envolturas, películas, botellas de bebidas gaseosas; así como para la construcción de
tanques de almacenamiento de combustibles (Mathur et al., 2011; Méndez et al., 2013
& Restrepo-Flórez et al., 2014).
Debido a la acumulación de desechos plásticos en el medio ambiente y a su mala
disposición, desde el punto de vista ecológico hay una preocupación cada vez más
grande; ya que el ritmo de fabricación de plásticos es de más de 280 millones de
toneladas al año y este material no se degrada fácilmente (Matavulj & Molitoris, 1992
Méndez et al., 2013; & Restrepo-Flórez et al., 2014). Por ello se han adelantado
estudios cuyo objetivo es el de mitigar este tipo de contaminación, dirigidos a la
búsqueda de nuevas alternativas de degradación o reutilización. En los últimos años se
han generado nuevos plásticos que contienen polímeros biológicamente degradables o
pro-oxidantes (Uribe et al, 2011; Shah et al., 2008), también se han incrementado las
investigaciones de microorganismos capaces de degradar o alterar las propiedades
físicas y químicas de los polímeros de los plásticos (Zahra et al., 2010; Mathur et al.,
años recientes se ha encontrado evidencia de la capacidad de algunos hongos para
biodegradar el polietileno de baja densidad (LDPE) entre ellos el Aspergillus niger cuya
tasa de degradación es una de las más altas (Mathur et al., 2011). El presente estudio
tenia como objetivo observar la capacidad degradante del hongo A. niger sobre LDPE
en condiciones controladas de laboratorio.
2. MARCO TEÓRICO
2.1 Hongos involucrados en la degradación de polietileno
La biodegradación del polietileno es un tema que aún no se ha entendido totalmente
debido a su gran complejidad, sin embargo se han adelantado diversos estudios con el
fin de lograr una mayor comprensión sobre los procesos usados por los diferentes
microorganismos para degradar este tipo de plástico; en la literatura se encuentran dos
estrategias diferentes para el estudio de estos mecanismos (Restrepo-Flórez et al.,
2014). En la primera la degradación se llevó a cabo utilizando sepas puras, puesto que
este método permite un mejor entendimiento de las rutas metabólicas y también permite
observar el efecto de exponer los microorganismos a diferentes condiciones ambientales
con el fin de encontrar las condiciones óptimas para la degradación del polietileno
(Yamada-Onodera, K. et al., 2001; Gilan et al., 2004; Shah a. et al., 2008; Mathur et al.,
2011; Santo, M. et al.,2013 Restrepo-Flórez et al., 2014). Sin embargo una desventaja
de este método es que se ignora la posibilidad que la degradación del LDPE sea el
resultado de un proceso de cooperación entre diferentes especies. Por esto la segunda
estrategia consiste en utilizar comunidades microbianas en ambientes complejos para
estudiar la biodegradación; algunos ejemplos de esto son estudios realizados con
microorganismos de suelos, compost y aguas marinas (Matavulj, M. et al., 1992;
al., 2011; Sindujaa, P. et al., 2011; Uribe, D. et al., 2011; Chatterjee, S. et al., 2013;
Harshvardhan, K. et al., 2013; Kumar, S. et al., 2013; Méndez,C. et al., 2013;
Restrepo-Flórez et al., 2014).
En los últimos cincuenta años se han identificado algunas sepas de hongos con la
capacidad de interactuar con el polietileno causándole algún tipo de deterioro. En la
tabla 1. se encuentran una lista con el género y la especie de algunos de estos hongos.
Aunque solo se encuentran 9 géneros de hongos reportados en la literatura, se espera
que este número aumente debido a las recientes técnicas de secuenciación molecular
(Restrepo-Flórez et al., 2014).
Tabla 1. Hongos asociados con la degradación del polietileno Tomado de (Restrepo-‐Flórez et al., 2014, Pag. 85)
Genero Especie
Acremonium Kiliense
Aspergillus Niger
Versicolor Flavus
Chaetomium spp
Cladosporium Cladopsprioides
Fusarium Redolens
Gliclodium Virens
Mortierella Alpina
Mucor Cicinelloides
Penicillum Simplicissimun Pinophilum Frequentans
Phanerochaete Chrysosporium Verticillium Lecanni
El género Aspergillus pertenece al phylum ascomycota y está compuesto por
aproximadamente 200 especies, de las cuales 20 son consideradas como patógenas
oportunistas en humanos, siendo aspergilosis la enfermedad más reconocida. Los
hongos pertenecientes a este género son filamentosos, cosmopolitas y comúnmente se
aíslan de suelo, restos vegetales y el aire. Algunas especies son de interés industrial ya
que se emplean para la conservación de algunos alimentos. Su reproducción asexual se
Aspergillus niger es una de las especies más común de este género, con apariencia
filamentosa y de textura suave. Crece en vegetales como la lechuga y el tomate y es de
gran importancia industrial debido a la producción de ácido cítrico y glucónico. Sus
colonias inicialmente son de color blanco, pero pronto se vuelven de color negro en la
parte superior, mientras que la parte inferior permanece amarillo pálido; las colonias son
granulosas y de crecimiento rápido (Cepero de García, et al., 2012).
Imagen 1. Colonias de Aspergillus niger
Imagen 2. Estructuras de reproducción asexual de Aspergillus niger, se observa la cabeza aspergilar, el conidióforo, las vesículas y fiálides
2.2 Polietileno de baja densidad (LDPE)
El polietileno (PE) es el termoplástico más utilizado en la actualidad, su producción
2010). El polietileno es químicamente el polímero más simple, su estructura
fundamental es (-CH2-CH2-)n y se obtiene de la polimerización del etileno (CH2=CH2)
del cual deriva su nombre (The University of York, 2014). Estos polímeros fueron creados para ser utilizados como aislamiento eléctrico, pero debido a sus propiedades se
les encontró diversas aplicaciones especialmente como películas y envases (Amo, et al.,
2002). El PE puede clasificarse según su grado de densidad: Polietileno de baja
densidad, cuando la densidad se encuentra entre 0.915 - 0.925 g/cm3, el cual se produjo comercialmente por primera vez en el Reino Unido en 1939; de Media Densidad con
densidad entre 0.926 - 0.940 g/cm3; y de Alta Densidad con densidad entre 0.941 -
0.960 g/cm3 (Ecopetrol, sf). Algunas de las propiedades que hacen del polietileno una
materia prima tan utilizada son: su estabilidad, ya que son inertes a una gran variedad
de compuestos químicos, su resistencia a oxidantes suaves y agentes reductores, la
flexibilidad, tenacidad y propiedades eléctricas sobresalientes (Amo et al., 2002).
2.3 Degradación del polietileno
Se considera degradación del polietileno cualquier cambio químico o físico en el
polímero, resultado de factores ambientales como: humedad, calor, actividad biológica
o condiciones químicas suaves. La degradación se refleja en cambios de las
características mecánicas, ópticas y eléctricas del material, así como en grietas,
rajaduras, erosión, decoloración, separación de fases y cambios en las propiedades del
material (Shah, A. et al., 2008). La degradación puede ser foto, térmica, oxi y biológica,
ver tabla 2.
La sensibilidad de los polímeros a la fotodegradación se debe a la habilidad que poseen
estos para absorber buena parte de la radiación troposférica; esta incluye la radiación
visible y la radiación infrarroja también contribuyen acelerar la degradación del
polímero debido al calentamiento (Shah, A. et al., 2008).
La degradación térmica de los polímeros es un deterioro molecular, que resulta del
sobrecalentamiento a temperaturas elevadas. Esto lleva a que los componentes de la
cadena principal empiecen a separarse y reaccionen entre ellos cambiando las
propiedades del polímero. Este tipo de degradación implica cambios en el peso
molecular y en sus propiedades como: cambios en el color, grietas, reducción en la
ductilidad, fragilidad y reducción en la mayoría de propiedades deseables (Shah, A. et
al., 2008).
La oxi-degradación utiliza dos métodos, la fotodegradación y la oxidación. El primero
utiliza luz UV para degradar el producto final, mientras que la oxidación utiliza el
tiempo y el calor para descomponer el plástico; estos dos métodos tienen como
consecuencia la reducción del peso molecular facilitando una posterior biodegradación
(Shah, A. et al., 2008).
Por último la biodegradación de los plásticos se puede presentar de forma aerobia,
anaerobia o anóxica, esto se puede ver en la naturaleza en: sedimentos, vertederos en el
compost o el suelo. Dióxido de carbono y agua resultarán de la biodegradación aerobia,
mientras que dióxido de carbono, metano y agua serán productos de una biodegradación
anaerobia (Shah, A. et al., 2008).
Tabla 2. Rutas degradación del polímero tomado de (Shah, A. et al., 2008, pag 250)
Factores
(Requerimientos) Foto-degradación
Degradación
termo-oxidativa Biodegradación
Agentes activos Luz UV o radiación con
alta energía Calor y oxigeno Agentes microbianos Requerimiento de
calor no se requiere
Mayor a la temperatura del
ambiente no se requiere
Tasa de degradación
Al inicio es lento, pero la
propagación es rápida Rápida Moderada
Otras consideraciones
Amigable con el ambiente, si no se utilizan radiaciones
Aceptación global Aceptable pero costosa No aceptada Costos bajos y muy aceptada
2.3.1. Biodegradación del polietileno
Microorganismos tales como bacterias y hongos juegan un papel importante en la
descomposición de diferentes materiales, sin embargo el mayor obstáculo en la
biodegradación del LDPE es la resistencia a los ataques biológicos debido a que es un
compuesto altamente hidrofóbico, tiene un alto peso molecular, y carece de grupos
funcionales reconocidos por la mayoría de las enzimas de los microorganismos (Shah,
A. et al., 2008). Por esta razones se suelen utilizar tratamientos previos como la
foto-oxidación, la termo-oxidación y la oxidación química con el fin de aumentar los grupos
funcionales y la tasa de degradación (Yamada-Onodera, K. et al., 2001; Shah, A. et al.,
2008; Zahra, S. et al., 2010; Mathur et al., 2011; Nowak et al., 2011; Santo et al., 2012;
Harshvardhan & Jha, 2013; Restrepo-Flórez et al., 2014;).
La biodegradación se rige por diferentes factores como, el tratamiento previo, el tipo de
microorganismo y las características del polímero tales como: cristalinidad, tactilidad,
peso molecular, grupos funcionales y plastificantes o aditivos añadidos al polímero
(Shah, A. et al., 2008).
2.3.2 Mecanismo de biodegradación del LDPE
El proceso de degradación consiste en el paso de polímeros a monómeros, para que
estos puedan ser mineralizados, debido al tamaño de la mayoría de los polímeros y a
que un aumento en el peso molecular significa una menor tasa de degradación del
polímero por parte de los microorganismos, ya que no pueden pasar a través de las
dímeros y oligómeros para poder ser absorbidos o biodegradados dentro de células
microbianas más fácilmente (Shah, A. et al., 2008; Restrepo-Flórez et al., 2014).
Aunque hay un buen número de evidencia que prueba la biodegradación del polietileno,
aún hay una falta de conocimiento sobre las rutas metabólicas completas que participan
en el proceso y las enzimas implicadas (Restrepo-Flórez et al., 2014). Se ha encontrado
la presencia de dos enzimas activamente implicadas en la degradación biológica de
polímeros: despolimerasas extracelulares e intracelulares (Shah, A. et al., 2008;
Chatterjee, S. et al., 2013; Méndez et al., 2013; Santo, M. et al.,2013). Otras enzimas
también fueron reportadas por estar implicadas en el proceso de biodegradación del
polietileno como: la enzima alcano monoxigenasa (Uribe et al, 2011), las enzimas
oxidasas y catalasas (Kapri, A. et al., 2010) y la enzima lacasa extracelular (Santo, M. et
al.,2013). En otros estudios se menciona degradación catalizada por enzimas pero no se
especifican cuales (Yamada-Onodera, K. et al., 2001; Nowak et al., 2011;
Harshvardhan & Jha, 2013).
Estas enzimas ayudan a descomponer polímeros complejos en moléculas más pequeñas
de cadena corta, haciéndolas lo suficientemente pequeñas para pasar por las membranas
bacterianas exteriores semipermeables, para posteriormente ser utilizados como fuentes
de carbono y de energía. Este proceso de degradación enzimática de polímeros se da por
hidrólisis en dos pasos: primero la enzima se une al sustrato del polímero para
posteriormente catalizar un rompimiento hidrolítico; como se dijo el LDPE puede ser
degradado ya sea por la acción de enzimas despolimerasas extracelulares e
intracelulares. La degradación intracelular es la hidrólisis de un depósito de carbono
endógeno debido a la acumulación de los propios microorganismos, mientras que la
extracelular consiste en utilizar una fuente de carbono exógeno y no necesariamente
Cuando los productos finales son CO2, H2O o CH4 la degradación es llamada
mineralización y ya que la degradación de este sustrato rara vez llega al 100%, una
pequeña parte del polímero se incorpora en la biomasa microbiana, humus u otros
productos naturales (Shah, A. et al., 2008).
Los grupos dominantes de los microorganismos y las vías degradadoras asociadas con
la degradación del polímero son determinadas por las condiciones ambientales y la tasa
hidrofóbica de los microorganismos. Respecto a la primera cuando hay O2 disponible en
el ambiente los microorganismos aerobios serán los principales responsables de la
destrucción de materiales complejos, generando CO2, H2O y biomasa microbiana como
productos finales. Por otra parte en condiciones anóxicas, los microorganismos
anaerobios serán los responsables de la degradación del polímero y en condiciones
metanogénicas los productos primarios serán el CO2, H2O, CH4 y la biomasa
microbiana (Shah, A. et al., 2008). En cuanto a la tasa hidrofóbica debido a que el
polietileno es un material altamente hidrofóbico no es fácil la formación de biopelículas,
por lo que un microorganismo con una alta hidrofobicidad de la superficie celular podrá
adherirse mejor a la superficie del plástico y formar una biopelícula (Mathur et al.,
2011).
2.3.3 Métodos para medir la degradación
Los microorganismos capaces de colonizar la superficie del polietileno generan
diferentes efectos en las propiedades de este. A continuación se explican los métodos
más utilizados para establecer el grado de degradación del polímero (Restrepo-Flórez et
al., 2014 & Shah, A. et al., 2008):
1. Visual: se busca observar cambios en la topografía de la superficie, tales como:
el color, aumento en la cristalinidad o formación de biopelículas. Aunque estos
cambios no demuestran la presencia de un proceso de degradación, los cambios
visuales pueden ser utilizados como un primer indicador de ataque por
microorganismos
2. Microscopía: es un buen método para obtener información sobre el mecanismo
de degradación, suele utilizarse cuando se han encontrado cambios visualmente;
las mejores observaciones se obtienen al utilizar microscopia de barrido de
electrones (SEM) o microscopía de fuerza atómica (AFM). Aunque en la
literatura se encuentran diversas técnicas para evaluar el grado de
biodegradación del polímero como; transformación de Fourier de la Radiación
infrarroja (FTIR), espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN),
colorimetría diferencial de barrido (DSC), espectroscopia de fotoelectrones de
rayos X (XPS, difracción de rayos X (DRX).
3. Cambios en las propiedades mecánicas y de masa molar: debido a que la
resistencia a la tracción es muy sensible a los cambios en la masa molar de los
polímeros, fluctuaciones en esta propiedad se utilizan como indicador de
degradación. Además en estudios enfocados en películas delgadas, cambios en
la carga de rotura serán un buen indicador para la degradación, mientras que en
películas gruesas el efecto del microorganismo es muy superficial y no se
alcanzan a presentar cambios mecánicos.
4. Producción CO2/Consumo de O2: Cuando las condiciones son aerobias los
carbono como uno de los mayores productos metabólicos finales. Por esta razón
la producción del CO2 medida con el ensayo de sturm y el consumo de oxígeno
medido con pruebas respirométricas, se han convertido en buenos indicadores
para la degradación del polímero, siendo unos de los métodos más utilizados
para medir la biodegradación en los laboratorios.
5. Grupos funcionales en la superficie: En estudios se ha encontrado una relación
entre los cambios en algunos grupos funcionales y presencia de actividad
biológica; para esta prueba se utiliza la transformación de Fourier de la
Radiación Infrarroja (FTIR), técnica para medir los siguientes grupos
funcionales: carbonilo, ésteres, vinilos y enlaces dobles. Sin embargo no se ha
llegado a un consenso con los resultados, ya que en algunos estudios se
encuentra una disminución en los grupos carbonilos y un incremento en los
enlaces dobles. Pero en otros estudios los grupos carbonilos han aumentado y la
cantidad de dobles enlaces disminuido.
6. Distribución del peso molecular: Luego de un ataque microbiano se ha
observado un aumento en el peso molecular promedio debido al consumo de las
cadenas de peso molecular inferior (Yamada-Onodera et al, 2001), sin embargo
este resultado no es universal ya que algunos autores no han encontrado cambios
en la distribución del peso molecular. Otros aseguran que son los factores
abióticos como la irradiación UV quienes realmente afectan el peso molecular
más no un ataque microbiano. Para medir la distribución del peso molecular se
utilizan dos técnicas diferentes, la más común es el uso de cromatografía de
mediciones reológicas, que se relacionan indirectamente con la distribución del
peso molecular.
7. Formación de zonas claras: Este método suele utilizarse para saber si un
microorganismo es capaz de degradar un polímero específico, aunque también
sirve para obtener resultados semi-cuantitativos. Esta prueba se realiza en una
caja de Petri con un agar sintético, dispersando el polímero en partículas muy
finas dentro del medio dándole una apariencia opaca al agar. Luego se inocula el
microorganismo; la formación de un halo claro alrededor de la colonia indicará
la capacidad de los microorganismos para despolimerizar el polímero, siendo
este el primer paso de la biodegradación.
3. METODOLOGÍA
3.1 Medios y cultivos
Una muestra del hongo A. niger fue otorgada por el laboratorio de micología y
fitopatología de la Universidad de los Andes (LAMFU). A los ocho días se realizó un
pase a una caja de Petri con agar papa dextrosa (PDA-Pronadisa) y se llevó a la
incubadora a 30ºC. Después de 15 días se sembró el hongo en un caldo de PDA, a 30ºC
por dos semanas. A este medio fue necesario adicionarle un antibiótico para inhibir el
crecimiento de las bacterias con el fin de obtener solamente A. niger; en este caso se
Imagen 2. Biomasa de Aspergillus niger en PDA Imagen 3. Biomasa Aspergillus niger en caldo PDA
3.2 Ensayo de biodegradación de polietileno
Para este ensayo se utilizó el medio M9 (ver tabla 3) , ya que permite estar seguro que
la única fuente de carbono que tienen los microorganismos es el polietileno. Se
utilizaron dos muestras de LDPE, una bolsa plástica (común) y una manguera para riego
(comprada en una ferretería). La mitad de estos materiales fue expuesta a rayos UV con
longitud de onda de 254nm por un tiempo de 13 horas; posteriormente las muestras
fueron cortadas en trozos pequeños. Se realizaron cinco montajes: 1. Control: medio M9
al que se le inoculó el hongo 2. Blanco del LDPE expuesto a UV: medio M9 con los dos
tipos de plástico que fueron expuestos. 3. Blanco del LDPE sin exposición: medio M9
con los dos tipos de plástico que no fueron expuestos. 4. Montaje UV: medio M9 con
inóculo del hongo y los dos tipos de plástico expuestos a UV. 5. Montaje sin
exposición: medio M9 con inóculo del hongo y los dos tipos de plástico que no fueron
expuestos. Finalmente estos montajes fueron llevados a un shaker a 30ºC y 150 rpm por
un periodo de tiempo de 2 meses.
Tabla 3. composición medio M9
Compuesto Cantidad por litro Na2HPO4 7.25g
KH2PO4 3.0g
NaCl 0.71g
NH4Cl 2g/4ml
MgSO4 1ml
CaCl2 0.09g
Imagen 4. montajes de ensayos de degradación
3.3 Análisis de degradación del LDPE
Se utilizó el método de microscopia electrónica de barrido (SEM) para observar los
cambios en la superficie del polietileno de baja densidad durante la degradación. Para
esto se prepararon las muestras siguiendo el proceso de fijación con glutaraldehido,
deshidratación, secado de punto crítico, recubrimiento con oro para posteriormente
realizar las observaciones. Se realizaron tres observaciones, en la primera se observaron
las muestras del LDPE expuestas a UV y las no expuestas sin ser sometidas al hongo,
en la segunda se observo el plástico después de haber sido sometido al hongo por un
4. RESULTADOS
4.1 Macroscópicos
Después del primer mes de biodegradación se observó perdida de dureza de manguera
tanto para la muestra expuesta a UV como para las que no lo estuvieron, además se
observaron algunos hilos desprendiéndose y hongos adheridos a la superficie de las
muestras. Por otro lado en las muestras de las bolsas plásticas después del mismo
periodo de tiempo no se observaron cambios visibles. En la imagen 5 se encuentran
muestras de manguera después de dos meses de biodegradación, tanto en (a) y (b) se
vieron hilos desprendiéndose de los pedazos de plástico, sin embargo había una
degradación aparente mayor en la muestra que fue expuesta previamente a rayos UV.
Después de dos meses tampoco se evidenciaron cambios aparentes en las bolsas
plásticas.
Imagen 5 fotografías de la manguera dos meses después de la biodegradación: (a) manguera sin exposición a rayos UV. (b) manguera con exposición a rayos UV.
4. 2 Análisis SEM de las muestras de manguera
En la imagen 5 se observan fotografías de SEM de la manguera, antes y un mes después
de la biodegradación y de los blancos; tanto de las muestras que fueron o no expuestas
a la radiación UV. La microscopía electrónica de barrido mostró como el solo hecho de
algún deterioro a la misma. En la muestra (b) se observó una ranura mucho más grande
que las que poseía la muestra (a) que no fue expuesta a tratamientos. Con la muestra (c)
se pudo ver como el medio M9 no generó degradación ni cambios visibles en la textura
ni superficie de la manguera; mientras que en la (d) que fue expuesta a rayos UV se
presenta una textura más rugosa que podría deberse a algunas arrugas generadas en la
bolsa al momento de ser dispuesta en el porta-muestras para microscopia, sin embargo
no se presentaron ranuras en la superficie. Después de 30 días de exposición de las
muestras al hongo A. niger en el medio M9 las fotografías (e) y (f) mostraron la
formación de biopelículas sobre las muestras, lo cual podría ser interpretado como un
signo de presencia de biodegradación. Por esta razón se realizó un acercamiento a estas
muestras donde en las imágenes (g) y (h) se observó rompimiento de la manguera, lo
que significaría biodegradación. Sin embargo no se puede asegurar totalmente que esta
degradación se haya presentado exclusivamente debido a los hongos, puesto que se
observaron algunas bacterias sobre las fibras de la muestra las cuales también podrían
haber estado generando algún tipo de interacción con el A. niger y por lo tanto
contribuyendo a este proceso.
Imagen 6. Micrografías SEM de la manguera antes y después de 1 mes de biodegradación. (a) antes de la incubación sin UV; (b) antes de la inoculación con UV; (c) Blanco (LDPE en el medio sin el hongo sin UV); (d) Blanco (LDPE en el medio sin el hongo con UV); (e) y (g) después de la inoculación sin UV; (f) y (h) después de la inoculación con UV.
Por otra parte en la imagen 7 se observan los resultados de la microscopia SEM
realizada dos meses después de la inoculación con el hongo; en esta se presentaron
signos claros de degradación, también se vió claramente la formación de biopelículas
sobre la superficie del material en (a) y (b). Además al realizar un acercamiento al
material (c) se pudieron observar algunas hifas sobre una fibra del plástico que al
más claramente las biopelículas formadas por el crecimiento de las hifas, sin embargo
también se vieron algunas bacterias sobre la muestra de manguera, las cuales podrían
haber tenido algún tipo de simbiosis con A. niger y de esta manera haber participando
en el proceso de degradación. Por otra parte se observó como en los blancos no se
presentó degradación y su apariencia era muy similar al que se tenia en las condiciones
iniciales donde (e) no había sido expuesto a ningún tratamiento, mientras en (f) se
observaron algunas grietas pero estas eran muy similares a las causadas en el momento
de exponer este material a los rayos UV más no a un efecto generado por algún tipo de
microorganismos.
Imagen 7. Micrografías SEM de la manguera dos meses después de la biodegradación. (a) y (c) después de la inoculación sin UV; (b) y (d) después de la inoculación con UV ; (e) Blanco (LDPE en el medio sin el hongo sin UV); (f) Blanco (LDPE en el medio sin el hongo con UV).
4. 3 Análisis SEM de las muestras de bolsa plástica
En la imagen 6 se observan fotografías de SEM de la bolsa plástica: antes y un mes
después de la biodegradación y de los blancos; tanto de las muestras que fueron o no
expuestas a la radiación UV. Los resultados mostraron que se presentó deterioro en el
material, ya que la superficie de las imágenes (e) y (g) se encontraron más rugosa e
irregulares que la (a); esto mismo se observó entre las imágenes (d) y (f) respecto a la
(b) que era la inicial. Por otro lado para las imágenes correspondientes a los blancos se
vió como en (c) no hay afectación aparente del material, mientras que en (d) se observó
un leve deterioro. También se puede decir que la exposición de este material a los rayos
UV generó un pequeño desgaste en el material.
Imagen 8. Micrografías SEM de la bolsa plástica antes y después de 1 mes de biodegradación (a) antes de la inoculación sin UV; (b) antes de la inoculación con UV; (c) Blanco (LDPE en el medio sin el hongo sin UV); (d) Blanco (LDPE en el medio sin el hongo con UV); (e) y (g) después de la inoculación sin UV; (f) y (h) después de la inoculación con UV.
5. DISCUSIÓN
Bajo condiciones de laboratorio se observó como A. niger tiene la capacidad para
degradar polietileno de baja densidad. Sin embargo los resultados macroscópicos y
microscópicos mostraron como la degradación fue mayor en las muestras de manguera
polietileno generando biopelículas sobre la superficie, además se presentó una perdida
de dureza en estas muestras, signos que se han encontrado previamente en otros
estudios como indicadores de biodegradación (Zahra et al., 2010; Mathur, G., et al.
2011; Nowak, B., et al. 2011).
Los resultados obtenidos de la observación SEM para la manguera ratificaron que A.
niger tiene una tasa de degradación alta, pues en las observaciones a 4000X un mes
después de la inoculación del hongo ya se podían observar claramente biopelículas tanto
para las muestras vírgenes como para las previamente irradiadas. Y en las observaciones
a 10.000X se vieron más claramente las biopelículas formadas por las hifas sobre
algunas fibras de la manguera que estaban siendo degradadas, sin embargo también
habían algunas bacterias sobre la superficie de la muestra, las cuales podrían tener
algún tipo de simbiosis con A. niger y de esta manera estar participando en el proceso
de degradación. Al comparar estas observaciones con las realizadas a los dos meses de
la inoculación, fue evidente el aumento en el crecimiento y colonización del hongo
sobre la superficie, ya que se necesitó de un aumento mucho menor para encontrar
signos claros de biodegradación. Los resultados de la manguera a 500X y 1000X para
la muestra virgen y la irradiada respectivamente, mostraron claramente las biopelículas
y en la muestra virgen se evidenció un desgarramiento en las fibras de la manguera. En
las observaciones a 4000X se vio la colonización de las fibras de la muestra y al igual
que en la observación realizada un mes antes se siguen encontrando el mismo tipo de
bacterias.
Respecto a estudios previos en los que se midió la biodegradación de otras especies de
hongos con microscopia SEM, aunque se encontró formación de biopelículas no se
obtuvieron resultados tan claros en tan corto tiempo ya que a 5000X después de 100
cambios sobre la superficie del material (Zahra et al., 2010; Chatterjee, S. et al., 2013).
Por otra parte en un estudio realizado con A. niger sobre polietileno de alta densidad
oxidado anteriormente, después de un mes se observaron resultados muy similares a los
del presente estudio. En este también se formaron biopelículas y se evidenció la
penetración de las hifas sobre la superficie del material a un aumento de 5000 y
10.000X, aunque este estudio no se realizó sobre LDPE se muestra la capacidad de este
hongo de atacar el polietileno en general (Mathur, G., et al. 2011).
Además de los signos encontrados microscópicamente se encontraron signos
macroscópicos, donde a los dos meses en el montaje del laboratorio se evidenciaban
hilos desprendiéndose de los pedazos de plástico, también se presentó perdida de dureza
del material desde el primer mes de exposición a este microorganismo. Si se comparan
estos resultados con los obtenidos en un estudio previo realizado igualmente con A.
niger pero sobre polietileno de alta densidad se encuentra que los resultados son
consistentes ya que en los dos casos se observaron signos de degradación después de un
mes (como perdida de dureza y formación de biopelículas), sin embargo en el otro
estudio además se realizaron pruebas para determinar la reducción gravimétrica del
material en el que se encontró una reducción de 0.81% en el peso del LDPE puro
después de 90 días (Mathur et al., 2011).
Es importante resaltar que las muestras de manguera que no fueron expuestas a rayos
UV presentaron cambios en cuanto a su dureza y en la superficie, además de ser
colonizadas por el microorganismo en un grado similar a las que fueron expuestas a
esta radiación (las cuales presentaron algunos cambios microscópicos tales como
nuevas grietas antes de ser inoculadas con el hongo). Sin embargo la exposición a estos
rayos se realizó por un tiempo muy corto comparada con la mayoría de los estudios
generar un buen número de grupos funcionales y debilitar en un mayor grado el
polímero, por lo que se podría decir que A. niger es efectivo degradando la matriz del
polímero sin necesidad de realizarle tratamientos previos (Yamada-Onodera, K. et al.,
2001; Zahra et al., 2010; Kumar, S. et al., 2013).
6. CONCLUSIONES
Con los resultados obtenidos en el presente estudio se comprobó la capacidad
degradante del hongo A. niger sobre LDPE en condiciones controladas de laboratorio.
Sin embargo se encontró una preferencia de este microorganismo por las muestras de
manguera sobre las de bolsa plástica, ya que en las primeras se observó como estos
hongos se adhieren a la superficie del polietileno formando biopelículas de hifas que
penetran la superficie y utilizan este polímero como fuente de carbono, así como
perdida de dureza del material y cambios macroscópicos. Sin embargo en los resultados
de la microscopia SEM para estas muestras se observaron algunas bacterias por lo que
no puede descartarse la posibilidad de que estas tengan algún tipo de simbiosis con este
hongo y estén participando también en el proceso de biodegradación. Mientras que en
las muestras de bolsa plástica no se presentaron estas biopelículas y aunque se presenta
un desgaste y rugosidad en la superficie, no es tan claro como en la manguera. Para
futuros estudios y un mayor entendimiento respecto al tema es recomendable conocer la
composición exacta de los tipos de plásticos utilizados para poder entender la
preferencia de compuestos que tiene A. niger u otro tipo de microorganismos. Más
estudios deben ser realizados para entender las posibles simbiosis que A .niger pueda
estar presentando con algunas bacterias en el proceso de biodegradación, además de
estudios sobre el metabolismo de este microorganismo y las enzimas que están
degradación del polietileno las muestras que no fueron expuestas a ningún tipo de
tratamiento respondieron muy bien al proceso de biodegradación.
7. AGRADECIMIENTOS
Este estudio se realizó como requisito parcial para obtener el grado en ingeniería
ambiental de la Universidad de los Andes. Agradezco al profesor Manuel Rodríguez
Susa por su asesoría, así como a Juliana Martínez encargada del laboratorio de
ingeniería ambiental por toda su colaboración, a Dery corredor encargada de operar el
microscopio electrónico con el que se analizaron las muestras y al LAMFU por
otorgarme la muestra de Aspergillus niger.
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