Influencias de los iones salinos sobre el fraccionamiento cromatográfico de la bilirrubina

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(1)Influencias de los iones salinos sobre el fraccionamiento cromatográfico de la bilirrubina Josep Carreras Barnés. ADVERTIMENT. La consulta d’aquesta tesi queda condicionada a l’acceptació de les següents condicions d'ús: La difusió d’aquesta tesi per mitjà del servei TDX (www.tdx.cat) i a través del Dipòsit Digital de la UB (diposit.ub.edu) ha estat autoritzada pels titulars dels drets de propietat intel·lectual únicament per a usos privats emmarcats en activitats d’investigació i docència. No s’autoritza la seva reproducció amb finalitats de lucre ni la seva difusió i posada a disposició des d’un lloc aliè al servei TDX ni al Dipòsit Digital de la UB. No s’autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX o al Dipòsit Digital de la UB (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant al resum de presentació de la tesi com als seus continguts. En la utilització o cita de parts de la tesi és obligat indicar el nom de la persona autora.. ADVERTENCIA. La consulta de esta tesis queda condicionada a la aceptación de las siguientes condiciones de uso: La difusión de esta tesis por medio del servicio TDR (www.tdx.cat) y a través del Repositorio Digital de la UB (diposit.ub.edu) ha sido autorizada por los titulares de los derechos de propiedad intelectual únicamente para usos privados enmarcados en actividades de investigación y docencia. No se autoriza su reproducción con finalidades de lucro ni su difusión y puesta a disposición desde un sitio ajeno al servicio TDR o al Repositorio Digital de la UB. No se autoriza la presentación de su contenido en una ventana o marco ajeno a TDR o al Repositorio Digital de la UB (framing). Esta reserva de derechos afecta tanto al resumen de presentación de la tesis como a sus contenidos. En la utilización o cita de partes de la tesis es obligado indicar el nombre de la persona autora.. WARNING. On having consulted this thesis you’re accepting the following use conditions: Spreading this thesis by the TDX (www.tdx.cat) service and by the UB Digital Repository (diposit.ub.edu) has been authorized by the titular of the intellectual property rights only for private uses placed in investigation and teaching activities. Reproduction with lucrative aims is not authorized nor its spreading and availability from a site foreign to the TDX service or to the UB Digital Repository. Introducing its content in a window or frame foreign to the TDX service or to the UB Digital Repository is not authorized (framing). Those rights affect to the presentation summary of the thesis as well as to its contents. In the using or citation of parts of the thesis it’s obliged to indicate the name of the author..

(2) ��L. \\)\t.c�.. �',;.. '1 �b. Oc. (..". \�) ) ",. ,�ATEDRA DE FISIOLOGIA DE LA FACULTAD DE MEDICINA. 'VIVo n � 'S",<Ó UNIVERSIDAD DE BARCELONA. INFLUENCIAS DE LOS IONES SALINOS SOBRE EL FRACCIONAMIENTO CROMATOGRAFICO DE LA BILIRRUBINA. Volumen 1. Tesis. presentada. para aspirar al. José. Carreras. grado. de Doctor. Medicina por. Rarnés. : "')Iiij�jijmilr 0700391009. en. Barcelona, 1969..

(3) ,. SANTIAGO VIDAL. SIVILLA,. Catedrático de FISIOLOGIA. de la Facultad de Medicina de la Universidad de Barcelona. 'CERTIFICO. Que el presente trabajo de Don [o sé Carreras Barrié cuyo título. ". es. s. el fraccionamiento ha sido realizado. cromatográfico. en. la Cátedra de. de la bilirrubina" ,. Fisiología. de la. Facultad de Medicina de Barcelona y bajo mi orienta. .... cíón y direcci6n. y para que así conste y a los efectos oportunos extiendo el pre sente .ce r-tifi.cado , en Barcelona, mayo de mil novecientos sesen .... ta y. nueve.. ,. Influencias de los iones salinos sobre. ....

(4) A mis. padres. A mi maestro, el Prof. Dr. A todos en. aquellos. la Cátedra de. que. reunen. Fisiología.. S. Vidal Sivilla su s. esfuerzos.

(5) INDICE. 1. .... DE. REVISION. MATERIAS. BIBLIOGRAFICA. Formas de bilirrubina. o. o. II. ... o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. la reacci6n diazoica. según. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. de los pigmentos. Fraccionamiento cromatográfico 15iliare s. o. ... o. 01. o. o. o. 1. o. o. o. o. o. o. o. 14. o. o. EN SAYOS DE SEPARACION SOBRE CAP A FINA DE. POLlAMIDA. o. o. o. o. o. o. o. o. Anittecedentes. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. 41. o. o. o. 41. o. Variabilidad del fraccionamiento de los pigmentos biliares del. la técnica de axtr-acc íón.. según. suero. Métodos. o. o. o. Resultados Dí.scu.s ión. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. 44. o. o. 45. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. 47. 50. Influencia de las proteinas sobre el comportamiento. cromatográfico. de la btl.í r-rubína. Métodos. o. o. o. o. Resultados Dí scustón. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. gráfico. de la bilirrubina. Métodos. o. o. o. o. Resultados. o. Conc lu síón Influencia del. gráfico. pH. o. o. o. o. o. o. o. o. o. sobre el. o. o. o. o. Resultados. o. Conclusi6n. o. o. o. o. o. o. o,. Resultados Dí.scus íón. o. o,. o. o. o. o. o. o. o. o,. •. o. o. ,. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. ,. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. ,. o. o. o. ,. o. o. o. o. o. o. o. o'. o. ,. o. o. o. o. ,. o. o. o. o. o. ,. o. o. o. o. o. •. 58. o. o. o. o. o. o. 60. o. o. o. o. o. o. o. o. 60. o. o. 62. o. o. o. o. 66. o. o. o. o. o. o. o. o. ". o. o. 68 68 70. o. o. o. o. o. o. o. o. o. ,. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o,'. o. o. o. o,. 73. ... o. ,. o. o. sobre el frac. orgánicos. o. o. .... o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. ero. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. 52 52 54. cromato .... o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. ... ,. •. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. de los pigmentos biliares. o. ,. o. o. o. o'. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. cromatográfico. Métodos. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. Influencia de los disolventes cionamiento. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. comportamiento. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. comportamiento o. o. o. o. o. o. o. o. de la bilirrubina. Métodos. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. o. Influencia de las sales sobre el mato. o. .. •. o. o. ,. o,. o. o. o. ,. o. o. ,. o. ,. o. o. o. o. ,. ,. o. •. o. o. o. o,. o. o. o. o. o. o,. o. o. o. o. o. o. o. 74 74 75. 78.

(6) S. 1. .... e. u. g. d. n. a. t. par. e. COMPROBACION DE LAS CONDICIONES EXPERIMEN![ALES OPTIMAS. 80. El.ec c íón del sistema. eluyente. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 80. ... Elección de los tiempos de saturaci6n de las cámaras y de secado de las. II. ... ANALISIS. placas. ;. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ... DE LAS INFL UENCrAS IONICAS SOBRE EL COM. .... POR T AMIENTO CROMATOGRAFICO DE LA BILIRRUBINA. 89. Métodos. 89. Resultados. 94. '. Resumen comparativo de los resultados IlI. .... 109. INVESTIGACION DE LAS FRACCIONES DE BILIRRUBINA OBTENIDAS BAJO LA INFLUENCIA DE LAS SALES. para aislar las fracciones.. Ensayos. Desarrollos bidimensionales Desarrollos consecutivos. IV. .... .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. direcci6n.. la misma. en. .. .. .. .. ... .. ... .. .. ... .. .. ... Métodos :<�. �.'. ... 117. 122. INFLUENCIAS DE LAS SALES SOBRE LA CROMATOGRAFIA DE LA BILIRRUBINA EN OTROS SOPORTES 124. .... .... 115. 121. :::. Investigaciones sobre capa fina de c el.trlo sac Investigaciones sobre capafína de silicagel <Ihvestigaciones sobre capa fina de silicagel siliconado. Investigaciones sobre capa fina de óxido de aluminio VI. 114. 121. Resultados. .... 114. REVERSIBILIDAD DE LOS EFECTOS DE LAS SALES SO", BRE LAS DISOLUCIONES DE BILIRRUBINA. V. 87. 124 128. 129 131. EXPERIMENTOS DE DIALISIS CON SUEROS NORMALES E ICTERICOS. 133. .. 133. Métodos. 135. Re sultado s Dí. scu sí.ón. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. RESUMEN Y CONCLUSIONES. BIBLIOGRAFIA. .. .. .. ... .. ... .. ... .... .. .. .. .. .. .. .. .. .. ... 141. ,. .... ... .. .. ... .... .... ..... ... .... 137. .. ..... ... 145.

(7) -1-. p. t. r. m. .. 1. .... e. r. a. a. p. t. r. e. REVISION BIBLIOGRAFICA =========================. La distinci6n de diferentes formas de bilirrubina. se. ha basado durante mucho tiempo. en. o. compuestos. aIguna s particula. ridades de la diazÜl1'eacci6n que sirve para detectar la presencia. ... del i!. pigmento. y para determinarlo. cua��ativamente. los últimos lustros han sido introducidas. cromatográfico r-rubína , pero rizarlas y. que han se. permitido. por colorimetría.. algunas técntca s. En. de análisis. separar distintas fracciones de bili. sigue recurriendo. la diazorreacci6n para caracte. a. ... .... distinguirlas.. FORMAS DE BILIRRUBINA SEGUN LA REACCION DlAZOICA. En ma. Ehrlich descrubi6 que la bilirrubina for. el ácido sulfanfl íco diazotado. con. según. 1833,. el. pH. del. azocompuesto de color variable. un. la presen y propuso esta reacci6n para detectar. medio". cía de, pigmentos biliares En. en. la orina. ... .... (12Q�.. 1913, Hijmans. Van den. Bergh. y. Snapper. írrtr-o». dujeron. la reacci6n diazoica para la determinaci6n cuantitativa de la bíl.í.­. rrubina. en. el. obtener. un. medio. agente. suero J. usando etanol. homogérieo. acoplante (212).. de sc r-ubte r-on ,. ,. en. con. el fin. de eliminar las proteinas y. el que fueran solubles la bilirrubina. Unos años más tar-de , Van den. accidentalmente,. que el alcohol. desarrollo del color cuando la reacci6n. se. no. es. realiza. Bergh. yel. y MttUer. necesario para el. en. 1& bilis. y_. en. ciertos.

(8) -:¿,. ictéricos,. sueros. recta", te,. caracterizada por ocurrir. antes. sidad,. y describieron dos. de los 30. cohol , tarda. en. en. ausencia de. y alcanzando. segundos,. y la "reacci6n. tipos de reacci6n: la "reacci6n di. indirecta",. aparecer de 2. a. en. la intensidad máxima muy lentamente. en. los. sueros. de pacientes. cí.ón "indirecta" ictericia. los. en. hemoHtica; también. desaparece. en. ausencia de al. en. los. descrubieron que. dicha diferencia y todos los. sueros. toda. con. sueros. en. su. se. y la. hepatitis. a nuevas. "reacci6n indirecta" la. inmediata,. (523),. presencia de alcohol comportan. intensidad. igualmente,. (209. y. mediahora,. lentamente, en. algunos. una. es. forzada;. muy. alcohol,. hora. alcanzando casos. o. su. una. más tiempo,. en. según. ,. 1920).. no. son. y. 507). introdujeron. destaca With. (Varela. se. varias. positivamente Fuentes y. sj ín. inicia se. después. intensifica. horas,. aunque. hasta 24 con una. se. acuosas. añada al­. Recarte, 494),. desdJVan. realizadas,. den. Bergh. la reacci6n diazoica para la determinaci6n de los. pigmentos biliares del suero,. han sido muy. ... sin. típica, pueden dar,. los casos, y en. sue ro. las soluciones coloidales. reaccionan. otra sustancia. como. Las únicas disoluciones. Las investigaciones y Müller. obstante,. realidad todos los. máxima intensidad. (Katznal son. de bilirrubina pura, que. cualquier. No. ligera coloraci6n que. reacci6n verdaderamente negativa. ooholo. 211).. subtipos de "reacci6n directa!',. tres. consideran de reacci6n indirecta. necesidad de añadir de. distinguieron. se. la retardada y la bifásica.. se. con. subdivisiones de la reacci6n diazoica: además de La;. la diferenciaci6n. cluso los que. -. reac .... de enfermos. Investigaciones posteriores (210, 129, 277 condujeron. ... Observaron la reacci6n "directa". normales y. dando la reacci6n inmediatamente y. ínmedí.atamen. incluso más tiempo y alcanza. o. ictericia obstructiva y. con. sueros. color,. .... la máxima inten­. rápidamente. la que el. 4 minutos. al.coholj. -. numerosas. y uariadas.. han estudiado las características de la propia r-eacción. investigando. Se su.

(9) -::>-. mecanismo y. su. cinética. (2, 68, 136,264, 137, 138, 139, 291, 2�5,. 3'1g. 346, 347, 493, 494, centraci6n. 519), y las. del pí.gmento. del. o. influencias sobre esta última de del medio y de la temperatura. pH. 77,94,105,108,191,206,.122,367). accíón aceleradora disolventes. otros. terol y otros. inhibidora de sales y. o. or'gárrico s. de. Hpí.do s. También. se. ha. l� con ... (76,. investigado la. electrolitos,. los ácidos y sales biliares. del coles­. '". de proteinas y de otros diversos compuestos. ,. -. alcoholes y. or­. gánicos (1, 66, 74, 76, 77, 95, 137,223, 249, 250, 277, 296, 308, 311, 312, 313, 314, 319, 381, 528). Como resultado de estas investigaciones han descrito diversos "aceleradores" ces. de acelerar la reacci6n diazoica y de convertir. reacci6n "indirecta" de ciertos. bilirrubina; tes. entre. ellos. se. sueros. butírico y. biles. (acetato sódí.co. y las sales tamina y. puede. biliares,. ser. ciertos. ácidos. En. atribuído. a. algunos. casos. como. mo-ieculares. modificaciones del. más fácilmente. mecanismo de acci6n permanece sin. trado ces. y. algunos compuestos (ácido. de actuar. 417). y. también. se. ha. una. en. forma. s6dico), cafeína,. pl-l. solubles; explicar.. scór-bí.co ,. ,. o. a. a. los ácidos urea, o. ace. la formaci6n de en otros. Además,. ci.s tefna y. se. .... acoplan­. acciones físicas fa. pero. ... .... com­. casos,el han. glutation). ericon capa. .... .... contraria, inhibiendo la reacci6n diazoica (6�O. cmprobado. considerable. la diazorreacci6n. a. sales de ácidos dé. el efecto acelerador. cilitadoras de la solubilidad de la bilirrubina. puestos. "directa" la. orgánicos (acético. cítrico), algunas. y diversas sustancias. antipirina.. .... alcoholes y otros disolven­. henzoato sódí.co , salicilato. ,. en. capa. y de las disoluciones puras de. encuentran los. orgánicos (acetona, piridina),. glacial, acetoacético,. te. ,0 "agentes acoplantes",. se. que ciertos. iones,. aniones y. cationes, ejercen. influencia, generalmente aceleradora,. (1, 76, 77, 313).. sobre.

(10) -Ll-. Por otra parte,. investigaciones. rosas. comunes. y. zoi�os. para determinar las. "reacci6n''indirecta'',. resultantes de. otras aminas. copulaci6n. su. aromáticas.. Se ha. diversas circunstancias. en. así. nume. .... pr'opí.edad.e s físico químicas, ... de los dos tipos de. diferenciales,. directa" y el de. han realizado también. se. pigmentos, el de "reacci6n de los compuestos dia. como. .... el ácido sulfanfiico diazotado y. con. investigado. espectro <le. su. absorci6n,. (32, 33, 62, 63, 64, 82, 83, 86, 106, 142,. 143,204,207, 264, 291,331,350, 351, 353, 355, 359, 360, 361, 362, 519) ¡su solubilidad cos. y. en. y. su. e. stado de dí sol.ucí.ón. los diversos medios. orgáni. .... bio16gicos (14, 15, 16,1-8, 20, 24, 25, 72,. 76, 77, 195, 233, 321: 336, 347, 348, 349:); disolventes. los disolventes. en. su. extracci6n. con. diversos. (72, 119, 176, 195, 315, 317, 318, 319, 419, 460,490, 491,. 493, 495, 497, 498, 499, 514);. su. comportamiento frente. la diálisis. a. (34,35,7E, 76,77, 105, 107, 118, 152, 153, 209, 230, 296, 242, 343� 389, 432, 512, 517); y. su. sensibilidad al. su. adsorci6n al. oxígeno,. a. la luz y. Finalmente, das to. a. descubrir los factores. de la reacci6n diazoica.. pecto. son. muy. variadas,. precipitado proteico (762 99, 189), a. otras. investigaciones. responsables Las. pero. hip6tesis. pueden. radiacione�12, 52, 417).. las. del caracter directo que. reunirse. tales: a) la naturaleza de la reacci6n diazoica la. pr-cpña bilirrubina,. mente. con. otras. sustancias que actuarían. o. sino. como. con. medio; b). el. principal. la concentraci6n de dos estado físico. único,. ... factor. pero asociado. a. en unos. séricos;. los dos. a. dirigi. ... este res. ... grupos fundamen. o. la. con(.entraJ::i� o. ... ... de. inhibidores. y las características. de la reacci6n diazoica. es. tipos de reacci6n obedecen. distintos del pigmento;. distintas sustancias;. .... indirec. o. está asociada directa. no. presencia. responsable. bilirrubina; c). químicos. la. han emitido. se. agentes aceleradores. modificarían el estado de los coloides. del. han sido. d). existe. un. a. pigmento. e) la bilirrubina directa. y.

(11) -5-. la bilirrubina índtr-ecra sonancia y tos. spond.ena. ccsre. formas mesoméricas por. f) las dos formas de reacción. debidas. son. a. re ... dos pigmen. distintos.. Como ya. ha citado. se. vestigaciones han puesto de manifiesto. anteriormente, diversas. que los iones tienen cierta. cia sobre el desarrollo de la reacción diazoica. (1, 76, 77, 313),. moque otras sustancias normalmente presentes. en. como. sales y ác ído s. 316, 379);. no. Aunque. cí.ón directa de los. sueros. capaz de. explicar,. por. influe,g, lo mis. .... bio16gicos,. en. ya. puede. indirecto de. o. alterar la. reac ... la velocidad y la intensidad fi. .... admite que la concentraci6n de bilirru si. .... lípidos (1, 29, 75, 83,. del caracter directo. ictéricos, se. los medios. in. admite que otras sustancias distintas. simple dilución. la. (184, 269, 340), tampoco sea. se. sead�espons�bles. la diazorreacci6n.. bina. colesterol y otros. biliares,. pero actualmente. de la bilirrubina. nal. .... sola, el. caracter. .... de la reacción dia. ... zoica.. Determinados hechos. experimentales. apoyan la hi. defendida por [í.r sa y col. (232, 233) de que formas físicas dis I&.. tintas de bilirrubina son las responsables de las diferencias. póte s í.s. ,. .... .... o�s/)erva�as. .. en. la velocidad de la reacción. eN-. �1iX. dM �toa �J6\ l.hdlk)\.lkWtMJ� ()ke<ke.. que los agrega '(.. ... diazoica·)&-w-�:-w.,@lentras. ... dos moleculares de caracter coloidal dan reacción indirecta. de. agregaci6n. de gran no. tas. de las moléculas de bilirrubina. importancia para. confirma ni niega la formas. químicas. del. la cinética de. existencia,. en. l�. en. la que. se. disoluci6n. El estado. puede. ser. reacci6n diazoica, pero ello. los medios. biológicos,. de distin. ... pigmento.. La unión de la bilirrubina en. l. 1 cww.. han fundamentado varias. hip6tesis. de la reacción dí.azotca , ha sido demostrada. e. con. para. las proteinas séricas .. explicar. investigada. la dualidad. por métodos.

(12) -6-. solubilidad. diversos: se.s. estabilidad frente. ,. ffl.tr-ac íón , y el. y estabilidad del a. la oxídactón ,. electroforesis y. alcohol,. y las. proteinas. las disoluciones de nas. y frente. tectora. séricas,. ya. bilirrubina,. los cambios de. a. cromatografía. hip6tesis. en. en. de. presencia. entre la. ictérico y el. proteina. Según. indirecta. era. ci6n directa. unos. y para. ninguno de. a. los pigmentos. su. los dos. en. la accí.ón pro­. (bilis,. permeables. a. los. (21, 33, 355, 519). es. de la bili. ... ... y modificaciones del. los primeros estu. con. (75, 1052 209, 389). ... fueron contradicto. otros autores era. I. en. �. el. pigmento de. ... dializable,. .... reac .... afirmaban. cambio,. si bien la. adtctói. sód.íco) convertían. Investigaciones posteriores (34, 35, 76, estos. últimos. permiten el" paso de. pigmentos séricos,. tanto. resultados, las. indirecta;. fá.cflrnente. través de dichas membranas.. ,. tampoco. de reacci6n directa. por el contear-ío , los pigmentos. de reacci6n. al demostrar. pr-otetna s. .. a. típico. eSfectro. alcohol 2 cafefna benzoato. confirmaron no. (12, 13, 14,. result6 confirmada por los estudios. tipos de bilirrubina. que las membranas que. ... mientras la bilirrubina sérica de reacci6n. través;. dializables.. 77,107,230,517). pr-otet. pigmento�342).. autores,. de ciertas sustancias. son. explicar. retenida por las membranas dialíticas. pasaba. .... al añadirle compuestos capaces de romper la. dios de diálisis y ultrafiltraci6n. que. ausencia de. en. Los resultados obtenidos. ria.s.. .... gelfiltraci6n.. o. que demostraron cambios del. suero. y ultra. .... por la distinta estabilidad de. pH (76,77),. presencia de proteinas. espectro del. acuo. fraccionada por las sales. de las proteinas sobre la oxidabilidad del pigmento. pectrosc6picos,. unión. disoÚlciones. las. de uniones entre los pigmentos bilia. sugerida. 15, 16, 17, 18, 21, 24, 25, 26),. rrubina. en. espectroscopia, diálisis. ultracentrifugaci6n, precipitaci6n. La res. pigmento. la.. til'". de(la. '1. como. de. orina pasan.

(13) t-. -. Estas últimas investigaciones y otras ulteriores. (152, 153, 342, 343, 512), pusieron pigmentos biliares de la presencia. s. de las memhranas dialíticas. ausencia de. o. de diálisis y de la. quido mo. tr-avé. str-ó. ,. la. proteinas, de. concentraciones,de' pH,. las. tre. a. de manifiesto que el paso de los. de. cafe ina ,. da,. bilirrubina una. glucuronato, salicilato, urea. nas, el. p'Ie jo. pigmentos,. complejo. (466).. clusione s. da. a. la. ca. se. propuso la. unidos. indirecto,. la existencia del. .... que aún. las protei. a. que el. lábil,. .... com. .... con .... complejo pigmento. del hemo , y. con. unos. años más tar-da. (380) supusieron. a. a. la. gl.obína. la albúmina.. y result6 insostenible cuando. globina. es. similar. de reacci6n directa. en. los. diazoica,. proteinas distintas.. de que la bilirrubina. hip6tesis. y Polonovski y col.. (354, 508). sue r-os. sulfonami. la acci6n disociante de las sales bi­. a. de reacci6n in�ecta está unida. ci6n de. so .... sueros. comprob6. se. intent6 explicar la dualidad de la reacci6n. de reacci6n directa está unido da. ,. .... (432).. globina. 134, 135). los. Los experimentos "in vivo" confirmaron todas estas. tiendo la uni6n de la bilirrubina. berg (117). Se de. dializable y ultrafiltrable. de la bilirrubina directa I'!esulta más. Comprobada proteinas. en. Finalmente,. el dirl'!cto y el. de la forma indirecta frente. liares. el Ir. y otras sustancias capaces de romper la uni6n de la. parte de la bilirrubina s�rica.. estando ambos. a. benz oato , taur-ocolato. las p r-o te.ina s convierten. con. en. en .... proporci6n influyen. su. bre la diálisis de los pigmentos sé nico s y que la adici6n. í.cté r-í.co s. relativa. disolvente de este último.. que la adici6n de alcohol y. también,. proporci6n. de la presencia de electrolitos. capacidad. mucho. depende. sueros. se. ,. ,. En. y. y. La. hip6tesis. ... que. no. fue discuti. .... concentr!!; en. cuando. existe. .... pigmento. demostr6 que la. especialmente. mostr6, -80r investigaciones electroforéticas,. uni. que la bilirrubina séri. mientras��l. .... col.(133,. de reacci6n indirrecta y. (60, 374, 378). admi. 1934, Du!:_s. permanecía. Fiessinger. .... los. se. complejo. de. .... al. ....

(14) -. guno entre la. glo bina. y el. pigmento.. Diversos autores demostraron que te. todo el pigmento de los. (60, 378). nico. con. y. Najjar. y Childs. cipitar. insignificantes. (332, 333). con. la. traron que con. no. los dos tipos de. las. con. obstante. investigadores. la albúmina.. 1,. III y IV. con. (el pigmento. fracci6n. muy rica. que sólo. baja. puede. las fracciones. contener. pl.e adición de etanol,. se. compr-obó. 1951,. casos. pre. ... la bilirru. ,,_. (252). demos. indirecto, preci. plasma. .... principalmente con. se. una. .... .... el método. con. 1, IlI); también. las. con. la frac. aí sl.ó. .... una. pero de concentraci6n. precipitando que. la. con. cantidades mínimas de bilirrubina. Fmalmente ,. 96 % según los. y el. especialmente. bilirrubina,. en. 90, 305:1 3062 505).. del 37 al. directo. a. y. la misma técnica. El fraccionamiento del. con. tan. globulinas. pigmento, el directo. ción 1V y el indirecto. globulina 'C{2. En. .... experimentos posteriores,. ,. de Cohn demostró que la bilirrubina pr-ec íprta.. fracciones. con. globulinas.. ... sulfato amó. -. afirmaron que el sulfato amóní.co hade. albúmina;. realizados por otros. prácticamen. la mayor parte. (118)) las. con. la bilirrubina indirecta junto. a. bina directa. pitan. ictéricos precipita. sueros. ácido tricloroacético. albúmina y cantidades. 8-. (21�. las proteinas por sim. buena parte del. permanece todavía. en. .... pigmento,. disoluci6n. (126,. 127, 128). Las traron. das. a. también que. investigaciones por ultracentrifugación demos. tanto la. bilirrubina directa. como. laindirecta van uni. la albúmina y que la adición de ciertas sustancias. permite. la dí. sodacíón parcial de los compuestos de La. teinas frente. a. investigaci6n. ovo albúmina. y las. globulinas. sorción de la bilirrubina. en. gamma.. y. (sales biliares). otra(354,432).. del efecto protector de las pro. la oxidación por radiaciones. cho efecto sólo lo ejerce la albúmina. una. sérica,. R<5ntgen demostr6. que di. El estudio del expectro de ab puso. en. .... evidencia. .... ... careciendo del mismo la. presencia de proteinas. .... ...

(15) -g-. que sól.o resulta. modificado. adici6n de globina. por adí.cíón de. globulinas. o. y. no. por. (33,60,3522377,512).. En cuanto nicas. suero albúmina. la. a. todas las téc. electroforesis,. empleadas (electroforesis libre,. electroforesis. en. gel de. .... al". Q.n. mídón ,. papel·. en. de. acetato. ... celulosa,. han confirmado los resultados obtenidos. niendo de manifiesto que la bilirrubina con. la. ricos:. una. A valores de. to. sueros. junto. el p H , to. globulínicas (. pH intermedios. la albúmina. produce. en. emigrar. parece. según. todos los casos; entre. mos. a. 6,. con. el. só lo. una. no. obstante,. su. uni.ón A. entre. el pigmen. indirecta,. del. con. la. se. como. pH más bajos, y. 8J. si. pH pr6xi. desplaza. proteina. su. con. movilidad. parte del. coincidir.. desplaza. a. velocidad mayor que la albúmina avanzando. pigmento. se. delante de ésta. (34, 35, 61, 62, 63, 64, 87, 99, 104, 152, 153, 183,. 252, 305,306, 354, 512,. 517,. 518).. Finalmente por la bilirrubina resulta. fectamente de míriac ícne. s. una. ella,. los. a. a. .... con. electroir'ética vuelve. pH superior. .... pigme�. sigueavanzando junto. valores de. a. autores).. el disminuir. desplazamiento. A. de. alguna. ninguna diferencia. sul.ta.s'a más lábil.. lentamente;. dos tipos de pigmento rompen. con. los diversos. parte del pigmento indirecto. el resto más. emigrando. r-e. la bilirrubina directa. mientras. albúmina,. la albúmina. ... fuertemente icté. sueros. indirecta, desplazándose. e. disociaci6n. una. de. observa. se. métodos, 'po. desplaza siempre junto. se. casos. polivinilo). los otros. de reacción directa y el pigmento de reacci6n. la urríón de éste. la. no. con. 42,�;8-1. <i1�. de raacci6n directa. con. se. algunos. en. pequeña parte del pigmento. las fracciones. los. y sól.o. albúmina,. y Cloruro de. otros. séricas.. separada junto. compuestos que. Además,. la. cromatografía con. la. de. albúmina,. son causa. de. gel-filtraci6n,. aislándose per. error. gel filtraci6n permite ... en las deter separar el. ... ....

(16) -10-. pigmento libre del pigmento unido. utilizada, junto. con. para investigar la. las técnicas. proporci6n. proteina(198, 238, 432). investigaciones,. les de. albúmina,. spéctr-ofotométr-ícs.s. e. molar. los. en. En relaci6n. con. complejos. mediante puentes de. débilmente. bilirrubina�rmás. pued-e. diálisis,. y de. bilirrubina. -. los resultados de estas. con. hidr6geno, meJácHas. otras. Como conclusi6n de las se. por lo que ha sido. deduce que cada mol de albúmina está fuertemen. se. unido, probablemente. te. la. a. con. dos. .... mo­. del pigmento.. investigaciones citadas,. afirmar que la uni6n de los pigmentos biliares. con. las pro. -. \otO. teinas séricas permite. reacci6n diazoica. te. y si bien. ,. explicar. la existencia de dos modalidades de. El supuesto. complejo globina. algunos experimentos. tidades de pigmento unidas. a. han. .... bilirrubina. no. permitido aislar pequeñas. exi s. can .... proteinas distintas de la albúmina, las. investigaciones electroforchicas más. recientes parecen indicar que la. albúmina. que. Sin del. es. la única. embargo, suero. rior. a. g-,�ere. proteina sérica. se une. con. la bilirrubina.. Watson ha encontrado recientemente que la. del hombre adulto para fijar bilirrubina. la calculada. a. partir de. que además de esta. cias capaces de unirse. su. contenido. proteina el. con. .... existen. en. en. bastante supe lo que. albúmina,. el. Para. pigmento.. es. capacidad. suero otras. Watson,. la. electroforéticos. cia entre estos dos datos y los resultados. .... su .... sustan­. discrepan es. .... s610 apa. ,_,. .. rente,. suponiendo. bilirrubina. que más de. una. fracci6n. glo buHnica. electroforéticamente junto. podría emigrar. Durante mucho yiempo. lirrubinemia por el contenido del pigmento en. 1962,DWatson. tigadores,. dcmo st'ró. que cantidades. los hematíes 2 por uní.ón. ,. con. la. en. con. la albúmina.. suero. o en. plasma,. de la membrana.. pero. otros inves. de bilirrubina están. superficie. la. a. ha determinado la bí-.. confirmaci6n ulterior por. apreciables. con. se. asociada. fijadas. en. La unión. ....

(17) -.u-. parece. pigmento mente te. físico químico, puesto. la membrana. a. se. produce. de. una. uní.ón de la bilirrubina. de la membrana.. desempeñar,. como. El fenómeno señala Wí.th ,. y desarrollo de la ictericia. que la. incorporaci6n. instantáneamente,. casi. reversible y basta el estroma para trata. se. pído s de. de tipo. ser. libre, apolar,. con. influible por ciertas. ,. importante papel. un. fácil. .... conseguirla; probablemen­. La uriíón , que. (523);. es. del. se. da ya. .... drogas, p� la. en. los lf. apar-ící.ón. con. niveles. normales de bí.Ií.r-r-ubí.na , aumenta bruscamente cuando la bilirrubine mí.a excede de 33. mg/100. de la bilirrubina. con. ml ,. respecto En. ca. a. 1953,. decir,. meras. (314).. ptr-ról.íco. ,. De. Mendioroz. tetrapirr6lica. intermedia. entre. la combinaci6n. reactivas,. se. con. po. pigmento. Paul.íng. s icí.ón. en. expl.í.có. y el indirecto. te,. por. ser. estarían la más. .. del&.. ��Ón la dualidad diazoi ... la molécula de bí. son. ... dos formas mes6. una estructura en. electr6nica. no. reactiva,. (f6rmula de Fischer),. que. perd�o. con. ... resonancia no. permite. y dos estructuras. los átomos de carbono de los núcleos centra. equilibrio,. en. la urrizid.ad. Mendioroz considera que la molécu. ,. les los ekec tr'one s necesarios para combinarse tres formas. en. a. molar. los fen6menos de resonancia del núcleo. el diazonio. que tienen. superior. es. produce. de la bilirrubina posee una. proporci6n. cl�l«-\o. acue rco con. descritos por. cuando la. la albúmina. por fen6menos de resonancia que. lirrubina y supuso que el. la. es. .... el. diazonio;. .... las. "in. reactiva sería dominan­. capaz de retener más tiempo los electrones. estable,. libres La molécula de sonancia. cial. en. disoluci6n acuosa, daría. (reacci6n indirecta). tíva s. ,. frente al. lirrubina. se. predominio. combinase. directa) sex:ía. debido al. con. de las. bilirrubina, una. escaso. no. su. estado de. re­. reacci6n diazoica lenta y Pél,l'. porcentaje de. reactivas.. el daizorreactivo. necesario que. en. seinterrumpiera. en. estructuras. re�c. Para que toda la bi. forma. ... rápida (reacciÓn. la resonancia y. se. detuviera.

(18) -!2-. el el'Ctr6n libre. el. las estructuras. en. nitr6geno pirrólico pierde. el. raactivas,. sucede cuando. como. hidr6geno. tkQ 1Y\a!¡o. Esta. hip6tesis explicaría. bre la reacción dí azotca-jm medio. tuarían separando el. interrumpiría de la. hidr6geno. la resonancia y. bilirrubina;. en. cambio,. alcalino,. del. so-. los hidr6xilos libres. nitr6geno pirrólico. aparecerían en. la acci.ón del p H. con. ac .... lo que. se. las estructuras reactivas. medio ác ido , los. hidrogeniones. li-. 'ri bres. interrumpían. rición de la. también la resonancia, pero determinarían la apa-. estructura. no. reactiva de la bilirrubina.. hipótesis. La. también la aétc íón de los agentes dos. e Il o s. tr6nica,. en. se. su. La. tes y. su. reb.c..;:.-ión. a. ca. con. ,. deducir que la. negativa. la. de los núcleos. los disolventes y. cíón indirecta. en. apar-ící.ón. de las formas. captactón. de los protones. ... ... reél,S. se. hidr6geno.. la forma de bilirrubina. no. ni. ... reactiva y. condiciona una, afinidad el.ectr-o státt-,. explicaría. pigmento,. así las diferencias de solubilidad el de reacci6n directa y el de. reac ... (83). La. otros autores. to­. pirr6. parte, la distinta pofar-ídad de los. las formas reactivas. los dos tipos del. entre. hidr6geno a. poseyendo. alta >d:ensidad elec. con. través de la formaci6n de puentes de. tr6genos pí.r-ról íco s en. lugar. ya que. cuantitativa entre la concentraci6n de estos agen­. Por otra. positiva. oxígeno. eán capaces de separar el. acción, permite. realizaría. aceleradores,. molécula átomo s de. licos de la bilirrubina y darían tivas.. de las formas mesoméricas exp lí.caea,. (83),. hipótesis. de Mendioroz ha sido. y actualmente parece. aceptable. dos. formas mes6meras de la bilirrubina para la diazorreacci6n directa. e. el mecanismo de tr-. ,.�\. indirecta y también. ras. ,. difer��ias. -,. bilidad entre las dos formas del pigmento.. .� m. .,!. \f .. o-. por. la existencia de. explicar ,U,1oL. .. recogida. c;>,?í·;. 1....1 �,,;.¡. ,,��.. _. ¡. de solu-.

(19) -13-. las variaciones observadas de la bilirrubina al variar el. �ste. sobr-e. numerosos. pH del medio, así. como. la solubilidad la influencia de. las características de la reacción di.a.zotca , llevaron. investigadores (117 � 150, 195, 389). tesis de que la bilirrubina indirecta sería. mientras que la bilirrubina directa sería ro. en. a.. defender la. a. hí.pó-,. ácido (a. bilirrubínico). un. sal. una. (bilirrubinato);. pe­. diversos hechos experimentales demostraron ulteriormente la fal­. sedad de esta. suposici6n (83) Otros. ... autores. (150) defendieron. formas de bilirrubina serían dos tautómear-o s como una. cetona. de que, por. taut6metro los datos. y otro que reaccionaría. cada. definici6n,. no. una. y. a. esta. Rivoirre recta. podría. dose la. ser un. hip6tesis. se. tivos,. a. la. explicar. un. que. que reaccionaría. unalcohol.. en un. El hecho. medio,. se. un. a. opone. concepci6n {83) que la bilirrubina indi. de la bilirrubina. de la forma indirecta. en. el. ... directa, realizán. hígado.. ... A esta. opone el valor del peso molecular calculado por Fischer. para la bilirrubina indirecta. ponder. como. (/,388) sugiri6. tetrapoHmero. despolimeraci6n. uno. de las dos formas de reacci6n de. pueda manifestarse más. experimentales. :. que las dos. polímero. hip6tesis. que evidentemente. puede. corres. .... Si bien los resultados anteriores parecen nega. .... de. un. compuesto. no. tetrapirr6lico (83).. de la existencia de dos compuestos distintos. la dualidad. do mayor inter�s. (525). en. en. la díazorreaciión de la bilirrubina ha. matográfico aplicados. a. la. separaci6n. adquiri. A ello han contribuído. es-. por los método s de análisis. cro. los últimos lustros.. pecialmente los datos proporcionados. para. de los pigmentos biliares..

(20) FRACCIONAMLENTO CROMATOGRAFICO DE LOS PIGMENTOS BILIARES. Rl. cromatográficas del,. investigaci6n. 1935 utdiz6. en. que. la. a. primer investigador. la. nica fue mentos. en. sobtl ivi.ol.ena. (448).. biliares y las. (1941). biliares. en. orinas normales y. para separar bilirrubina y bihverdina.. (273. 523).. y. empleada. cromatografía. por primera. ra. separar los. La. cromatografía. vez. en. por Ledc re e-,. cblumna de. y. en. cro .... de éste­. última téc­. para separar los. pig­. (1942) para. ais­. (1943) para separar los. en. y por Tixier. ciertos. inverte�rados. quien. en. la utiliz6 pa. 1942,. la secreci6n de las. protoporfirina. .... "Aplysies".. de sfl.íc e fue introducida. gel. por Kench y col. para separar la. esta. se­. columna de carbonato cálcico fue. en. pigmentos biliares. 1939 la. separaci6n. pato16gicas,. (1945). La. yen. la orina, por With. porfirinas de. lar la bilirrubina urinaria, por Stich y Stark. pigmentos. (447),. Posteriormente,. por Schwartz y Watson. empleada. las técnicas. columna de talco para. columna de 6xido de aluminio para la. en. de los pigmentos biliares. res. me. aplic6. pigmentos biliares fue Sie­. cromatografía. parar la mesobilirrubina de la. matografía. de los. que. en. '1950. y la biliverdina. (273. 523). La. 'primera roz. vez. y col.. en. la. quienes. cromatografía. investigaci6n en. sobre. 1951 estudiaron el comportamiento. de la naturaleza de los. del pigmento y. como. comprobaron. líquidos empleados. eluyentes (317).. Tixier, Kelh. cromatografía. y. que el mismo. disolventes en. 1952,. descendente. bre. para separar la bilirrubina de las urobilinas. papel. cromatográ­. col,. col.,. 1953, emplearon. la. como. y Stich y. en. por. de los pigmentos biliares por Mendio­. fico de disoluciones puras de bilirrubina y. depende. papel fue empleada. so­. (247, 461)..

(21) -15-. La. directa. e. indirecta de la bilirrubina fue. Polonessky. por. separaci6n cromatográfica. y. Bourrillon,. 1952. en. conseguida primeramente. (378, 379).. Aislaron y pu­. rificaron los pigmentos biliares de la bilis y de la do la. cromatografía. cendente sobre. soluble. en. de estos. ,. en. cromatografía. en. en. el agua y. con. siempre sales biliares; el otro, el cloroformo y. era. producida. (ácido bilirrubinico),. directa venía dada por el. complejo. in­. reacci6n diazoi­. con. En vista. Pol.ono'v sky y Bourrillon formularon la. reacci6n indirecta. forma acida. des­. reacci6n dia­. estaba con.stttufde por bilirrubina ácida.. resultados,. sis de que la. soluble. contener. el agua y soluble. indirecta,. br-e. ellos,. directa, result6. zoica. columna de alúmina y la. orina, emplean­. y obtuvieron de los extractos de bilis dos. papcl.,. Unos de. pigmentos.. ca. en. de las formas. hip6te. .... por la bilirrubina li. mientras que la reacci6n. estable bilirrubina-sales. biliares,. que denominaron "colerubina".. Inve stigacione s po steriore s, de Lins Gries y col. lizadas. con. (189, 190), extractos de. cromatografía. en. y Monasterio y Giovenetti. de orina y de. bilis,. (324, 325),. separar los dos. col.umnavsobr-e papel, comprobaron. tipos de bilirrubina presentes. en. rea­. ictéricos y. sueros. en. los resultados. obtenidos por Polono-v skí y Bourrillon y confirmaron que .. (280),. era. posible. los medios bio16. -. gicos. En ca. de. nado,. cromatografía. Cole y Lathe. de fase inversa. descrita por Howard y Martín. pigmentos biliares extractos a. 1953,. séricos,. en. extractos de. obtenidos. satur'actón , proporcionaron. con. en. en. (91) aplicaron. columna de. (218),. sueros. a. la. la técni­ silico­. kieselguhr. investigaci6n. de los. ictéricos y de bilis.. Los. adtcí.ón de etanol y sulfato am6nico todos los casos,. a. pesar de que la.

(22) -u-. saturaci6n. no. rápidamente, en. algunos. 110. en. total,. era. y otra. dos. apolar,. fracciones,. casos, la fracci6n. otras. dos. fracciones,. polar. pigmento polar, fácilmente soluble mientras que el. directa, ble. en. los disolventes. orgánicos,. demostr6. un. el agua, dio la diazorreacci6n. proteico. los dos pigmentos eluídos contenía datos c. experimentales permiti6. íón diazoica. pigmento. con. no. en. con. tripsina perrntyíó. estos. que éste. ros. de ictericia hemoHtica en. pigmento polar.. cromato. Ninguno. lo que junto. proteínas!. primeros experimentos suero. se. .... de. con otros. reac-. corresponde. a. como. el pigmento de. lo que. índt-.. parecía. Mientras. bilirrubina libre.. predomin6. tipos de pig­. observ6 que la. se. comporta. separado cromatográficamente,. car. ta,. del. análisis. su. extraer. confirmar que la naturaleza de la. bilirrubina comercial añadida al. reacci6n indirecta. el agua y solu­. sino de la existencia de dos. proteinas,. Además,. mentos.. en. de la rotura por el alcohol de la urríón del. depende. las. ... manifest6 re.acci6n diazoica indirec­. predominio. gran. ,. El. eluyeron conjuntanmnte.. se. todavía considerables cantidades de pigmento, y. gráfico. s. durante el desarro. ,. pigmento apolar, insoluble. La hidr6lisis del residuo. ta.. en. que avanzó más. lentamente; adcmá. subd.ivi.dí.ó. se. luego. que. más. desplaz6. se. que. polar,. una. en. los. sue-,. el pigmento de reacci6n indirec­. los de ictericia obstructiva fue más abundante el pigmento de. reacci6n. directa;. en. los. sueros. de pacientes. con. hepatitis. las pr'opo r--. -. ciones de los dos. bilis obtenidos ron. varios. pigmentos fueron más iguales.. con. etanol. o. con. mezclas de etanol y. algunos En. a.Igiiria s. tanol.,. se. investigaciones ulteriores, Cole. la finalidad de separar. veces,. se. bilis;. separa­ y. de reacci6n diazoica negativa.. 93) wnsayaron eluyentes más polares con. me. pigmentos, siendo más abundante el de reacci6n directa. existiendo además. cial. De los extractos de. que el. empleado. completamente. en. y col.. (92,. la técnica. las dos fracciones. dividía el pigmento de reacci6n directa, y. con.s. i�. en. que,. í.guí.e. -.

(23) ron. así aislar de los. diferenciadas:. te. cíón diazoica y. sueros. una. ictéricos. que denominaron. pigmento Il (el más polar). de reacci6n. polares,. tos. puro, pero sometidos. directa,. su. pigmento 1 (el. pudieron. no. espectrosc6pico. polar). menos. aislados. ser. reac­. los dos pigmen. labilidad,. gran. con. un. mostraron. mento. de reacci6n. apolar. al de la bilirrubina. comercial;. puestos obtenidos de los. partir de. indirecta,. extractos. tres. el cual. fue,. espec-. por otra parte,. el espectro de absorci6n de los. pigmentos fue igual. de bilis y de orina. se. todos los. en. .... estado. en. de absorci6n semejante entre sí y diferente del ofrecido por el. tro. A. Por. análisis. a. perfectamen-. reacci6n diazoica indirecta y dos. con. �_'ldirecta,. fracciones. tres. p"!;.g. similar. azoc orrr -----. casos.. aislaron, además,. otros. pigmentos de reacci6n diazoica positiva. El método propuesto por Cole y col. fue. do por va. Billing,. de los. tres. comparaci6n. en. 1954. (41, 42, 43), f?ara. pigmentos. de los. muestras. en. el método de. Malloy. y. sueros. ictéricos de 1 rnl j la. logrados,. pigmentos 1. determinada. y Il.. según. sibilidad del método. los se­. Evelyn (3(}2, 303) demostr6 coincidencia. coincidi6 cuantitativamente. to",. en. determinación colorimétrica realizada. la''bilirrubina directa" determinada colorimetricamente total de. ninguna de. En cambio con. estas. de. y la cantidad. dos fracciones. la llamada bilirrubina directa "1 minu. la técnica de Ducci y Watson. aportado. por. ... la determinaci6n cuantitati­. resultados así obtenidos y los. mismos sueros, mediante la. gún. de. adapta. La. (116).. Billing s610 permitía. una. .... sen­. separaci6n. -. satisfactoria a. 5. mg. en. los. sueros. ictéricos. con. �_. bilirrubinemia superior. %.. Billing también intentó tos. resultantes de la reacción drazotca ,. fase inversa. en. columna de. kieselguhr. separar los. aplicada. siliconado. cromatografía. la a. az ocompue. �u��os. �. ro;;. �. :'i_;� .. ,;. de. de ictericia. ,ií. ':1;-. st­. . .• (>. -.

(24) -A_K-. I obstructiva tratados. azopigmento. A y el. el reactivo. con. azopigmento B.. zotada, proporcion6 únicamente. diazoico,. el azopigmento. al. po II. opi.gmanto sm el. ambos. az. y. La bilirrubina. tipo 1 dio lugar únicamente. proporcion6. con s. libre,. al. pigmento polar. A y el B. Lathe. Billing",. identificar la naturaleza. de obtener los. d.ade s,. su. contenido. alcalina y de la B.. f",glucuronidasa sobre. fue identificado. pigmento II. ter) de mento. como un. como un. un. éster. derivado. la bilirrubina.. 1 fuera. de los. gl.ucur-órudo. estas. la. posibilidad. II. y bilirrubina libre.. Checoslovaquia. bién el caracter. y col.. pemtnitieron. ictéricos.. pigmentos 1. y de. propia:. el. .... B. azopigmento. del azppigmento A y el. sugiri6. con stítufdo. como. de tipo és. probable. que el. de la bilirrubina y por. pero. una. con. se. .... pig. .... excluy6. mezcla de pigmento. independencia. Inglaterra, investigaciones. Schmíd, en. .... y II y de. sus. dí.glucur-óriino (probablemente se. Des. .... y la acctón de la hidr6lisis. monoglucur6nido. en. desa-. el pigmento II y el azopigmen. Simultáneamente,. en. de los. glucur6nido. ele Slue estuviera. trabajos de Billing. (48),. sueros. investigaciones,. Además,. de r'íbado. ... (41).. B, investigaron comparativamente. Como resultado de. ti. de los dos pigmentos de reacci6n di. química. ácido. en. y col.. Billing. prep.arados aislados. los azocompuestos A y. to. y. separados cromatográficamente. recta. pués. (45). ... polar. Finalmente, investigaciones posteriores rrrolladas por. dia. ser. el pigmento. A;. y el. azopigmento B,. iguíó. aislar el. de. de los. Talafant,. los Estados Unidos demostraron. tam. ... cIt�OIca... glucur6nido. de los pigmentos biliares de reacci6n dlÍ.,.. recta.. Tal.afant , ras. investigaciones sobre. 466, 467, 468), lleg6. a. en. 1954,. como. la naturaleza de los. resultado de. sus. prime. .... pigmentos biliares (465,. la conc.lu s íón de que los. pigmentos 1. y II sepa. ....

(25) -J9-. rados por Cole y Lathe , ter y. al monoés. correspondían respectivamente. al diéster de bilirrubina. Pero. ácido desoxic6lico.. con. de investigar la hidr6li. 1956, después. en. .... ... í. s. alcalina. s. yenzimática,. por. y diversas esterasas,. � gl.ucur-onída sa» l. de los pigmentos séricos de reacci6n directa y la de. un. pigmento directo aislado de la bí.Ií s. composici6n química. (469, 470, 471}:,472, 473),. Talafant rectific6 la concl.u.stón anterior y admí.tí.ó que los pigmentos de reacci6n directa rrído una. lle. .. son. de bilirrubina. c.onjugados. Para aislar el pigmento directo de la. con. bilis,. ácido. Talafant. técnica de adsorciones y eluciones sucesivas, descrita en. 1959.. glucur6. ... aplic6 con. deta. .... (H5). Schmíd ,. 428, 429, 430) aplic6. la. 1956. en. ceematogr-af'ía. y. 1957. (424, 425, 426, 427,. ascendente sobre pape l para. separar los compuestos dí.azo íco s de la bilirrubina comercial y de los. pigmentos directo. orinaje investig6. e. indirecto presentes. la compo sí.c íón. Inicialmente supuso que el ácido. hidroxílicos c\ y. demostró?01í. es. decir,. cul.a de bilirrubina.. dos. en. (202). Esta. que también. cr-omatogr-af'La. sobre. método de Cole y Lathe ,. con. conclusi6nes similares. sus. fía car. intentos de aislar los en. conc lu. pero. a. los grupos. posteriormente. de la bilirrubina. glucur6nido. unido. a. acil. .... los grupos .... stón fue confirmada posteriormente ]XJI'. investigaron los azocompuestos Otros. Pagliardi. y Gatdano. pigmentos de. sueros. y. después. ,. llegaron. a. .... el m'. la. de fracasar. en. ictéricos por cromatogra. alúmina, optaron en. separa. investigadores adoptaron. pequeñas modificaciones,. cromatografía. son. de las cadenas laterales de la molé. papel.. columna de almidón y de. la técnica de. está unido. bilirrubina,. poseen el ácido. bilis yen la. de los azopigmentos eluidos.. glucur-ónído. propi6nico. suero�nla. el. glucur6nidos. derivados. carboxílicos del ácido. Heikel y col. química. de la molécula de. que los. glucur6nidos, �. q',. en. en. 1956 (349). por. apli­. fase inversa propuesta por Cole y. -. .....

(26) -,20-. Lathe pero añadtcndoác ído asc6rbico al sistema. Ia. aparici6n. ck. �¿UVOVWV\M�O � �(f) � de sueros ictéricos, coincidieron en. algún caso. se. el comportameinto. ron. obtuvo. para evitar. �S\)liaJo5. oxtdac ión de la bilirrubina y la. si bien. eluyente. con. cuarto. un. cromatográfico. de biliverdina.. La.s�r. les de los autores. ingleses,. pigmento; también investiga­. de la bilirrubina comercial y el. espectro de absorci6n de los pigmentos diluídos. Bonomo y. bién. algunas modifiaaciones. reducir las de. pérdidas. bilitr-e�oina. Colombo,. de pigmento. en. la extracci6n y. Billing, basándose. con. ... Zoccoli y col.. anterioridad. a. los. fraccionada de la. bilirrubin,r,l�ue. la "bilirrubina indirecta". rrubina directa. precipitable. digesti6n trípsica. del. soluble. (161) aplicaron. de sueros ictéricos. en. (157, 158, 159, 160, y. la. un. ". (BDP),. en. alcohol y en. soluble. precipitado proteico En. cloroformo, la''bi. agua y al.cohol j y la''bili. en. sobre. directas,. sin. ..... agua y extraíble s610. resultante de la extrae. 1956, Gambigliani. cromatografía. muestras. método de determinaci6n fra. papel. ... ... Zoccoli y De. al fraccionamiento. desproteinizar. y de. ex. ... etan6licos de los mismos, comparando los resultados de los aná. cromatográficos. con. los obtenidos de los mismos. directo de. sueros. con. la mezcla. los. suer-os. cos. de reacci6n directa.. eluyente. ictéricos,. metanol. .... sin. desproteinizar,. etanol, proporcion6. de reacción indirecta y. tres. Mientras las. sueros. fracciones. sobre. papel. dos fracciones. en. proteinas de. por el mé. ... ... El análisis cromato. todo de extracci6n fraccionada propuesto por ellos.. gráfico. evitar la formaci6n. a. trabajos de Cole, Lathe. (BDA), soluble. ci6n al.cohól.i.ca de los pigmentos.. lisis. a. diferenciaba tres tipos de pigmento:. (B. 1.),. lirrubina directa al.cohól íca.". tractos. tendentes. ,. ... las características de solubilidad de las distin-. en. formas de bilirrubina habían propuesto. Blasiis. tam. por oxidaci6n de la bilirrubina.. 162, 163, 164, 165). con. 1959 (59) aportaron. la técnica de Cole y Lathe. a. Gambligliani. tas. en. los. sueros. suero. y. en. ictéri­. normal,. ero. ... ...

(27) -.2J-. matografiadas según única de forma. la. pigmentos,. sieran otra. dos. en. o. tres. éstos,. si. como. desplazaron. se. las proteinas de los. alargada,. plazaron separándose de los. IQ._:i"sma técnica,. sueros. fracciones; su. por. urríón. parte, los. etan6licos de. extractos. suero. ictéricos. coincidentes. con. éstas las características de movilidad. a. fracci6n. en una. las. de�. se. las. con. proteinas, Impu-,. cromatográfica.. proporcionaron. Por sola. una. fr-a.cctón al emplear <Jllfo eluyente etanol y dos fracciones al emplear el. eluyente. corresponderían. agua, que. la bilirrubina directa a.Icohól.íca. ríón. eluyentes,. una. (BDA);. fracci6n. rrubina directa pr-ec íñttabl.e. única,. Q.M. con. ulteriores de. por los autores. etan61icos de los mismos sueros,. ciones,. una. otra que lo. que. como. de comparar. química. comportaba. se. hada. su. (BI). solubilidad,. con. glucur6nido nido. con. tracto. 1" y. su. ingleses,. aparecían. su. Después. .... o. de fase los. en. ex ... en. los. ex. ... .... s610 dos de las frac­ o. absorci6n,. libre y. su. pigme.,E-t. compo s. í.­. correspondientes, identific��''bilirru­. (BDA). con. el. monoglucur6nido. "pigmento U".. El extracto de. su. "bí.­. de bilirrubi. ... el di. ... precipitable" (BDP). etanol y sulfato amórríco contendría los tres con. Zo. ... de obtener los tres. espectro de. "bilirrubina directa. de bilirrubina. obtenido solo. con. suero. obte­. pigmentos, el. ex­. etanol y sin sulfato amórríco , cotendría la bili­. rrubinaindirecta y la bilirrubina directa al.cohól.íca r-e's'lduo proteico de la extracci6n atanól.íca ,. la bí.Lí-,. la "bilirrubina libre" de Cole y Lathe y. lirrubina directa al.cohól íca". o''pigmento. con. cromatografía. la bilirrubina indirecta. como. el pigmento 1.. y los azoderivados. bina indirecta". na. a. llGambigliani. la técnica de. tractos. cíón. correspondería. -. adtc íón de etanol y sulfato am6nico apare. pigmentos descritos. tres. dí.ge s. etan6licos, proporcion6 que. a. y. \'ffCt. (166), realizadas'vaplicando. séricos obtenidos. cían los. tos y. el pigmento extraído por. descrita por Cole y Lathe , demostraron que mientras. inversa, tractos. (BI). (BDP).. Investigaciones ccoli y col. la bilirrubina indirecta. del residuo de los extractos. trípsica. todos los. a. ,. pigmento 1. y. permanecería fijad'\. la. en. el. bi.l.í-,.

(28) rrubina directa. precipitable (pigmento Il). En. 285), de. 1961,. Lombardo y Finoshiaro. sometiendo los residuos proteicos de las extracciones etan6licas. ictéricos,. saeros. vieron. a una. segunda extracci6n. fracci6n de bilirrubina. una. (288),. trataron. res iduo. de aislar esta fracci6n. proteico digerido. con. con. ácido acético obtu­. que llamaron "bilirrubina alcohol. precipitable acético-extraíble" (BDAc).. del. (282, 283, 284,. Posteriormente, partir de. a. tripsina. y por. ... 1964 /. en. extractos etan6licos del. cromatografía. sobre pa-. ��v2.. pel. con. �.. En el. segundo les. con. disoluci6n. la del. tres manchas de. en. corresponderían se. a. la fracci6n. trataría de. pig�mftto. un. ,. en. los. diglucur6nido. actualmente de be considerarse En en. los. 1962,. f6umicos y al cohól.ícos de los. proporcionaron na. c. libre por. su. íón diazoica.. r-íor-, contenían. un. problema todavía (69) investig6. distinto,. que fue identificado. alcoh6licos, que por. con. al de la. bilirrubina,. Broderson consideró. fue considerado. posible. discusi6n no. y y.. resuelto.. los pigmentos. extractos cloro. su. su. con. la bilirrubi. comportamiento. aspecto de absorci6n. como. en. además del pigmento. el ácido sulfanílico dí.azotado , similares pero. tamiento. ... ... Los extractos clorof6rmicos. espectro de absorci6n y por. otro. cua ... forma distinta. constante. normales, obteniendo. pigmento único,. de las. pigmento 1, aislado por Cole. Brodersen. mismos.. Los extractos. en. el. en. .. como un. sueros. única,. por Lombardo supo. combinado. ictéricos ha sido objeto de. sueros. fracci6n. variable/dos. BDAs:,postulada. Il de Cole y Lathe. biliares existentes. como. intensidad. La naturaleza del. Lathe. acétic(3\(como eluyentes k.l. de ácido. acuosa. primer caso, el pigmento avanzó. separ6. se. niendo que a. o. agua. un. derivado. que este derivado. mono. no. la. ante. ... rea_s ... y compor. .... ülQMtiUClS. monoconjugado.. conjugado. fuera �n. ....

(29) tico al. pigmento 1 de Cole, Lathe. Billing,. y. -:. pero. bilidad de que ambos fuer-an mezclas de diversos. bilirrubina,. itel. el. sulfato,. glucur6nido. dersen y col. demostraron que. los. en. ñas. cantidades de bilirrubina. te. la hidr6liais ácida y alcalina y. a. al del. conjugado. quizás. sueros. conjugada con. sugiri6. la. posi. monoconjugados otros.. En. 1963,. ... de B�­. normales existían peque. ... títufda , estable fren. .... mono sus. espectro de absorci6n similar. de bilirrubina alcalí estable obtenido de la bilis humana.. también. y Noir -,. Royer ron. y. _. los pigmentos biliares del. suero. en. 1962 (395), investiga. normal, preparando. extractos. con. etanol y sulfato s6dico y analizándolos por. cromatografía. mientras la bilirrubina libre y. diglucur6nido (pigmento Il). taban. derivado. su. el derivado. regularmente presentes. solo fue hallado ocasionalmente y. Cole, ya habían considerado la. rivado libre y. monoglucur6nido su. 1. .:. en. de la. en. favor de. su. 1963 (518) consiguieron. pr-ocedente-. proporci6n. de. molar. sis de disoluciones. 1/1;.. apoyan la. hí.póte sí s. por. del. con. que considera al. pigmento,. no. habían. menos. un. de. ... de bilirrubina. como. más pro. .... podido aportar. Fueron Weber y. col.,. los. separar bilirrubina y pigmento Il ,. humano normal.. pigmento 1. -por. hidr6li­ y por. Estos resultados. como una. mezcla equi­. Gr-�ori (I�G)J e�tudiando comparativamente los. en1963,. suero. ictérico por. la técnica de Coler y Lathe. terísticas de la fracci 6n. uncomplejo. fuera. pigmento Il.. pigmentos polares separados del. según. sino. no. (340). cromatografía reiterada.del pigmento. suero. También. fase inversa. pigmento 1. pigmento Il procedente de la bilis. molecular de bilirrubina libre y. dos. el. y Nosslin. también obtuvieron el pigmento 1. acuosas. incubaci6n del pigmento Il. que. existencia.. ictériftos-. sueros. Billing fQ_¡_7, 48, 93). pues si bien admitían. del. e�. monoglucur6nido (pigmento 1). bilirrubina, ,. papel;. cantidades mínimas.. de. posibilidad. monoconjugado. pruebas decisivas en. Lathe y. conjugado d.í.gl.ueur-óntdo. bhble el caracter. que. en. sobre. ... polar,. el. ,. cromatografía. hall6 que ciertas. pigmento 1,. no. en. carac. correspondían. ...

(30) -z�-. a. supuesta. su. monoglucur6nida. estructura. pí.gnranto 1 estaría constituído por. conjugado diglucur6nido. pigmento 1. dificada, ron una. do la. a. posterior análisis. Y obtuvo. como. su. muy. pequeña.. y. a. que. excluir la. sugiri6. dos. libre,. y la fracci6n. sus. tres. ninguna de ellas. era. existencia del. posibilidad. tas y perros sometidos. cromatografía. nido de. c. someti6 el. que. se. pigmento Il. mo­. comporta ,. ... varian­. 1.7 según los casos, El dio únicamente cantidades. polar (bilirrubina. no. II. pr-opor-ción. en. cromatográfico. de los azode­. apolar. totalmente pura.. y las do s .po. Gregory. ... no. de bilirrubina. monoglucur6nido. de que existieran varios. indirec­. de. polimeros. conjugados.. investigaron el pigmento 1. y. a. el. su. técnica algo. con una. fracciones (la. En el mismo año. papel,. como. tratamiento,. partir de las. posible. además la. bilirrubina y. do la. hip6tesis,. subfracciones,. Por otra parte, el análisis. lares) demostr6 a. mismo. esta. recromatografiada, proporcion6 pi.gmanto. rivados obtenidos. lleg6. en. molar entre ambas de 0.4. mínimas de bilirrubina al. comprobar. cromatográfico,. separaci6n. pigmento ll, sometido al. ta),. mezcla de bilirrubina libre y. una. la bilirrubina libre y la otra. proporci6n. ser. Para. indicaban más bien que el. e. llegaron. a. bilirmbina,. a. en. el suero,. en. el. Schoenfield y Bollman (43Li). hígado. diversas condiciones. de columna la. 1963,. conc lu. que s610. en. y. la bilis de. ra­. experimentales, ernpl.e an. fase inversa y la. cromatografía. stón de que el pigmento 1 son. en. es. un. capaces de conjugar los. sobre. monoglucur6. tejidos. extra. .... .... hepáticos.. Otro. vestigaciones. es. el de la. lirrubina, además. de los. problema. posible. que ha sido. objeto. existencia de otros. glucur6nidos.. de. in. .... de la bi. .... numerosas. conjugados.

(31) -'¿5-. Billing, la bilis humana. en. recta,. dos,. s610. no. posible. que el. •. pigmento l'. fi.cabl e. el ester. con. varia entre el. forma de. en. la bilirrubina.. A. ya habían hallado. ... misma sustancia. como una. (41? ). pigmento alcalí estable polar. proporci6n. cuya. mentos.. un. Cole y Lathe. 5. glucur ónído. investigar. hallado. ó1u"I,-í¿_h: ,. en. como. sulfatos,. la bilis y. no. es. identi-. I. corresponda. esta'. % del total de los pig­. tambíén. sino. estable,. •. .... puede formar diversos comjuga-.. glucur6nidos. al calf. y el 40. y de reacci6n di. posibilidad. .. se. de. sulfoconjugado. a un. dirigieron. los. tr-a­. bajos de diversos investigadores. En. 1958,. Watson. bina de reacci6n dí.azoí.ca indirecta al da. un. (509). tratada. ser. sobre. Rf distinto del de los. papel,. el. azo. derivado. no. ,. no. obtuvo sulfato. se. parecía probable. r-rubína. con. 228). sulfúr-íco. conjugaciones.. muestras traer y. embargo,. mostro. y por otra parte,. cromatográficamente. Isselbacher y. bilirrubina,. Después. en. un. la. de la. concluy6. McCarthy,. conjugados'. sin. de bilis que trataron. a. ratas, gatos. con. separar luego los diazocompuestos. de sulfato. y. radioactivo,. junto. con. con. los". re. sobre. sulkante s. papel. y. loa azocompue stos. p� vía. obtuvier-on. hombres,. ,. para. ex .... La ínve s tíga». .. autorradiografía. demostr6 que los metabolitos radioactivos sulfatados mayor parte,. ilI.959. ácido. con. ácido sulfanfl.ícodtazotado. cromatografía. en. precisar número de enlaces. de :inyectar, sulfato. intraperitoneal,. cíón de los mismos por. su. En el análisis. separaron de la bilis derivados de bilirrubina. e. .... ácido sulfúr-ico. con. por todo ello Watson. y .supu ste ron la existencia de. subcutánea. r-ru. sulfato.. g'rupo s hidroxílicos de la o. inorgánico;. que la btl. la existencia de derivados naturales de bi.Ii,­. Sin. (227�'. í. ,. correspondiente. azopigmentos naturales,. hidr6lisis de los azocompuestos separados. que. íó. derivado sulfatado de reacci6n diazoica directa.. cromatográfico. bi.Ii s. de scubr. se. enctientran,. conjugado s. de la. bilis;. en. de.

(32) este dato. dedujeron. micamente pura,. nido. da del la. un. azopigmento polar. de sulfato. mismo. con. Mc. tratan. de. Carthy. En otros. tasas.. inorgánico radioactivo;. arilsulfatasa. la. experimentos,. ligadura quirúrugica. con. tener. azocompuestos polares. nfíiber6,. por la elevada. explicar. ratas. sin. glucur�. con. el trata. embargo,. ;. de las sulfa. de sulfato radioactivo. biliares, permiti6. sulfato radio activo. la orina y. en. .... a. hecho que Isselbacher. de los conductos. ... a. ob. ... en. suero.. los. azopigmentos de la bilirs humana,. tes. orgánicos. los mismos. 6.4 %). o. en. p. por ... un. resistentes una. a. la. por tratamiento. la existencia de. íón del enzima y. a.cc. fr-accí.ón álcali. grupo car-boxfl.íco libre que. de los. a.zopí.gmnnto s biliares.. con". glucuronidasa. ... Carthy, también. cromatografía yd'emostraron. glucuronidasa,. Hallaron además. los. .... La hidr6lisis áci. especificidad. inyecci6n. Isselbacher y Mc. tos. quí. es. azopigmento. azopigmento sulfoconjugado.. miento del. ..¡.... del. no. a.zocompue'áto conjugado, eluído del cromatograma, dio lugar. seperaci6n. el. del. comprende, además. sino que. (pigmento B}. fr�1i6n. que la. o con. azocompuestos aislados. .... bí.l, que de los. no. álcali, comprobaron. glucuronato. cromatografía. conjugactón. ,. cabe la. dos de bilirrubina por carboxílicos.. jugado. de. posibilidad. con. metanol. otra. o. con. que. 13.. 7.!5. .. total.. 6 % de. papel pueden. los cácul.osde. li. .... Iss�. y'álcali-lá. representa de. un. ... 9 allO. conocidos de. conjugados. sean. glicerina incorporados a. % del. .... del tratamiento. un. sobre. glucur6nic. por pigmen. 15.0:'6.2. fr-acctón , polar. de que estos con. de ácido. otros mecanismos. Como dato adicional. bflí.r-rubina. al. Según. ni sulfato y que. Considerando. azopigmentos.. fracci6n (23.7. carente. correspondía. Carthy quedaría todavía. posee. una. estables, constituída. berar ácido sulftírico por hidrolisis ácida. bacher y Mc. disolven­. con. por tncubací.ón de. Finalmente, después. por. separaron. a. deriva sus. .... gru. favor de la existencia del. ... con ... sulfúrico aportaron el hecho de haber obteni. ...

(33) do. un. compuesto de. este.. yC:��nsumo. tipo mediante sínteis enzimática. de ATP. Por otra. de Watson tratada van. (509). con. (,«le. sulfúrico, experimenta la. simple introducci6n. cambios. de �. Schoenfield y. perimentos. en. la misma fr-acción. en. y. blecieron si el. glucur6nido. un. nunca. bilirrubina,. monoconjugados ron. o. con. pudo. ser. también realizaron. con. ex ... icterícia. quetales derivados que los. monoglucur6nidos;. y el sulfato. como. de ratas. cromatográfica. la de los. se. se. diconjugados.. intrahepático,. pero. esta. no. ... mo­. eran. obtenidos, deduje. conjugados sulfatados dependía. si bien la. .... conjugados. encontraban enla misma. De los resultados. ... ob�. presen. tampoco si los derivados sulfatados. además que la formaci6n de los. mecanismo. molécula que. su. Frel. suero. Encontraron. diglucur6nidos. lécula de. en. radical sulfato.. un. co], (435),. la bilis yen el. hepatocelular.. taban siempre. que la bilirrubina. sulfato y confirmaron la existencia de derivados sulfa. con. tados de bilirrubina tructiva y. crítica al trabajo anterior. como. Isselbacher$j McCarthy demostraron. ácido. más allá. parte,. conjugaci6n extrahepática. ... de. no. excluída del todo. También. en. 1962, Gregory. rando los resultados obtenidos por métodos. y Watson. (187), compa y por mé. cromatográficos. .... .... -. todo.s de. partici�. los pigmentos. averiguar. polares. si est. lirrubina,. a. en un. con. disolventes. 1 y II existe. fracci6n. una. orgánicos,. demostraron que. fracci6n álcali estable.. correspondía. sulfatados de bí. conjugados. trabajo posterior (188) investigaron. los. endovenosa,. tos. podían. ser. sulfato. radioactivo,. totalmente. separados. .... azopigmentos. obtenidos de la bilis de perros y de pacientes, que habían. vía. Para. .... a. en. recibido,. y demostraron que los. por. azopigmIlue�. del sulfato radioactivo por cromato 1""""".",. grafía bidimensional. en. papel. o. por métodos. extractivo.�'( ¡ � ?-. Como tampo �. f\ .. uí.. -. ,/:.(,./,"'-1 � ·H:rr;..�' )IJal��'t>-;I ::1. ... t. v. ti. .... ....

(34) -J8-. co. pudieron apreciar -una relaci6n. molecular entre el sulfato y la frac. cíón ácali estable de la bilirrubina. y Watson conclu. Gregory. directa,. .... yeron que la bilirrubina de reacci6n directa álcali estable. e. a. un. identificable. compuesto hidrosoluble de bilirrubina,. sulfoconjugado.. como. La. tados y los obtenidos por Isselbacher y por diferencias. fato. las técnicas. en. radioactivo, tiempos. con un. tiendo. anterior "in. trabajo. su. en. marcados).. bre la bilirrubina. es. un. cromatográfico. la. 1963, Vega s (500),. cromatografía. azoderivado del sulfato de. natural,. se. de bilirrubina. ser. invetigando. muy inderior tractos. en. a. Weber y Schalm. extractos de. bilis,. cala.. es. muy. conj�éd.¡álcali. que s610. En todos los. .... estable. sea. identifi.sa. hay pruebas indi 'no. ha. experimentos reali. ... la cantidad de sulfato aislada fue. de bilirrubina álcali. que la sulfo. .... podido. la que cabría esperar por el contenido de los mismos. escasa. el. (515), investigaronb. sulfatado y que éste-. conjugado. cantidad de sulfato de bfl í.r-r-ubína presente tables. el método de. de que esta fracci6n. bilirrubina; subrayaron. conjugados. El. papel.. azopigmento obtenido del conjugado. aislado de ninguna fuente natural.. zados. y. (pigmento B).. 1965,. de la existencia del. rectas. comportamiento. fracci6n álcali-estable de la bilirrubina. puedieron aportar pruebas directas sulfato de. .... so­. bilirrubinar.rof.ed!Z,")fesrJ�ueros. contenido de sulfato de bilirrubina de la fracci6n. como. ... de. pudieron. de intercambio i6nico sobre. separaron totalmente del. En. inve stig6 el. bilirrubina, preparado según. y el azoderivado de la. ble. ... pigmento marcado. y Watson. �. Watson,. diglucur6nido. ... explicados. Por otra parte insis. vitrol!, Gregory. de los azoderivados de. bilis, empleando. no. ser. resul. sulfonato de esta última.. En. y. entre estos. el derivado resultante de la acci6n del ácido sulfúrico. mostrar que. co .... administraci6n del sul. vi.a de. de cole cctón ,o diluci6n del no. .... glucur6nido. no. MacCarthy podían. empleadas (. e pool" de pigmentos. gran. discrepancia. podía. no. .... rresponder. ... .... estable; concluyeron. entre los. conjugaci6n. s610. conjugados. ocurre. ex",. que la. álcali e�. enJpequeña. .... es ....

(35) -2'1-. También minaron la fracci6n. de. sueros. en. 1965,. Colombo y Bonomo (98) deter. álcali-estable de los pigmentos. ictéricos mediante la técnica de. 1 y Il ,. cromatograM. separados. en. fase inversa. descrita por Cole y Lathe , y obsenraron que los dos pigmentos. presentan ble. prácticamente. (17 %).. mica del. Además,. la misma. Colombo y Bonomo estudiaron la compo stc íón. aJla. azopigmento purificado correspondiente. proporci6n. mejante. a. de ácido. glucur6nido. la encontrada ela el. En. mostraron que. su. con. respectoa. y. 1967,. .... fracci6n álcali-es. sulfato;. en. aCla.bilirrubina. Noier y Col�. comportamiento. en. (338, 339). la técnica de. sintético, según. semejante al del pigmento ll.. cromatografúa. ... cambio, fue. se. prepa. Watson,. .... .... y de. de fase inversa. .... era. Mientras la hidrGlisis del pigmento sin­. tético proporcion6 dos moles de sulfato por cada mol de de. quí. pigmento ll.. 1966,. sulfato de bilirrubina. raron. polares. de bilirrubina álcali-esta­. proporci6n. table del pigmento Il , y demostraron la carencia de la. .... la. bilirrubina,. correspondiente azoderivado dio cantidades equimoleculares de. su. ambos. productos,. lirnubina. sobre. lo que indica el caracter. Por otra parte, Noier y col. papel,. los azopigme1ntos. i,. di.conjugado. investigaron,. correspondientes. a. de los y cuyo. az. ocompuaato s A y. B, un. desplazamierto coincidi6. tercer con. imhtaron quew la cantidad de. malmente. en. la bilis. es. además. azocompuesto(que denominaron. Además,. sulfoconjugado. C. correspondiente. los resultados obtenidos. de bilirrubina presente. nor .... pequeña, "pe ro puede aumentar, hasta llegar al. 20 % del total de la bilirrubina venosa. cromatografía. obtuvieron,. el del azocompuesto. al aulf'ato de bilirrubina sintético.. en. .... la fracci6n directa. álcali estable separada de bilis humana y de r-ates, y .... del sulfato de bi. biliar,. cuando. se. Inyecta por. vía endo­. sulfato de bilirrubina sintético. Además de los. puestos de bilirrubina han sido ciones aisladas de los medios. sulfoconjugados, oíros posibles. postulados,. para. com-. explicar las diferentes frac-. bio16gicos por cromatografía..

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