ARTÍCULOS ORIGINALES
LABORATORIOS BETERÁ
Comportamiento de diferentes sistemas tampón en equipo
PhastSystem
Dra. Hilda Marilín García1, Dr. David Higginson2 , Lic. Odalys Martín3 y Dr. Félix Ganem2
RESUMEN
El sistema PhastSystem de electroforesis, a pesar de ser uno de los más modernos en el mercado, presenta la dificultad de su dependencia al uso de los geles (PhastGel) y tiras tampón de electrodo que el mercado internacional presenta a elevado precio. Se desarrolló un método de fabricación de geles de poliacrilamida heterogéneos vertidos en moldes de 50 x 43 x 0,45 mm (largo x ancho x alto). Se estudió el efecto de diferentes sistemas tampones sobre el poder resolutivo y el tiempo de corrida. Se empleó una mezcla de proteínas patrones con pesos moleculares en el rango de 13 a 66 kDa. Los datos obtenidos se procesan estadísticamente con STATISTIC 5.1 M, 1998. Se obtuvieron geles por el sistema de Laemmli modificado con tiempos de corrida y resolución entre bandas sin diferencias significativas con el sistema PhastGel. Estos resultados permiten concluir que los geles preparados con el sistema desarrollado sustituyen satisfactoriamente a los PhastGeles originales y que el sistema tampón modificado por los autores es de mejor resultado que el método sin modificar.
Palabras clave: PhastSystem, electroforesis, poliacrilamida.
La electroforesis es un método de separación de biomoléculas sobre un soporte sólido (generalmente en forma de gel) que tradicionalmente emplea una fuente de poder y una cubeta, después de manera independiente se realiza el revelado de este. Sin embargo, se ha logrado automatizar esta técnica de forma que en una unidad integrada (equipo PhastSystem) se realice mediante control computarizado la electroforesis y el revelado posterior. En aras de la disminución de los costos, existe una tendencia actual en los países del primer mundo al reacondicionamiento de los equipos y sistemas manteniendo los parámetros de calidad de los diseños originales (Block Scientific, INC1 y
Diagnostic Consumables, Inc.2); para países del
tercer mundo como lo es Cuba, esto reviste una importancia mucho mayor.
Para la utilización del equipo PhastSystem es necesario la importación, entre otros insumos de los geles denominados PhastGel y de las tiras de tampones de electrodos. Estos renglones son
los más costosos, por lo que se hace necesaria su obtención en el laboratorio. Tomando en cuenta lo anterior, los autores se propusieron como objetivo, desarrollar sistemas de geles de corridas así como de tampones de electrodos con propiedades similares a los del PhastSystem.
MÉTODOS
MOLDES DE LOS GELES PARA PHASTSYSTEM
Se emplea como soporte para el gel de poliacrilamida gel bond (Catálogo Sigma, 1998) o cualquier película plástica transparente degaseada de aproximadamente 0,2 mm de grosor. El molde confeccionado tiene capacidad para 2 geles de 50 mm de longitud, 43 mm de ancho y 0,45 mm de grosor. Zona de concentración: 6 % en T; 3 % en C y 13 mm de longitud. Zona de separación: 12,5 % en T; 2 % en C y 37 mm de longitud. Temperatura de polimerización: 5 ºC
1 Máster en Ciencias Bioquímicas. Investigador Agregado. 2 Doctor en Ciencias.
3 Licenciado en Ciencias Biológicas. Aspirante a Investigador. 4 Doctor en Ciencias.
SISTEMA DE LAEMMLI UK, 19703
Tampón de gel concentrador: Tris HCl
0,125 mol/L pH 6,8, SDS 0,1 %.
Tampón de gel separador: Tris HCl 0,375 mol/L
pH 8,8, SDS 0,1 %.
Tampón de electroforesis: Tris HCl 0,05 mol/L,
glicina 0,834 mol/L pH 8,3, SDS 0,1 %.
LAGLI
Se adiciona al sistema de Laemmli glicerol
hasta 10 % en el gel concentrador y 7,5 % en el gel separador.
LAGLIPH
Se cambia en el sistema de Laemmli el pH
del Tris HCl a 8,8 en el gel concentrador, manteniendo el glicerol en ambos geles a las concentraciones similares que LaGli.
LAGLIPHM
Se cambia en el sistema LaGlipH la
concentración del Tris HCl a 0,375 mol/L en el gel concentrador.
MÉTODO DE STARR CM, 19974
Tampón de gel separador: Tris acetato
0,0679 mol/L pH 7, glicerol 7,5 %.
Tampón de gel concentrador: Tris acetato
0,044 mol/L pH 7, glicerol 6,5 %, PEG 8000 5 %
Tampón de electroforesis: Tricina 0,2 mol/L,
tris 0,2 mol/L, SDS 0,55 % pH 8,1.
MÉTODO DE WEBER Y OSBORN 19695
Tampón de electroforesis: Fosfato de sodio
0,05 mol/L, SDS 0,15 % pH 7,0.
Tampón de gel: Fosfato de sodio 0,1 mol/L,
SDS 0,1 %, pH 7,0.
TRIS-ACETATO DECLARADO PARA PHASTGEL6
Tampón de gel separador y concentrador:
Tris acetato 0,114 mol/L pH 6,5.
Tampón de electroforesis: Tricina 0,2 mol/L,
Tris 0,2 mol/L, SDS 0,55 %, pH 8,1
TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS
Se utilizaron como proteínas patrones: albúmina bovina, ovoalbúmina, anhidrasa carbónica, quimotripsina, lactoalbúmina, ribonucleasa y
aldolasa. Para la desnaturalización se mantienen 5 min a 100 ºC en el tampón de muestra.
PROGRAMA DE CORRIDA
Precorrida: 250 V,10 mA, 3 W,15 ºC,1V.h Aplicación: 250 V, 1 mA, 3 W, 15 ºC, 1 V.h Corrida: Para las corridas se definió como
número de V.h óptimo, el necesario para que el bromofenol azul migre hasta el final del gel:
Laemmli UK: 250 V, 10 mA, 3 W, 15 ºC, 61 V.h Tris acetato: 250 V, 10 mA, 3 W, 15 ºC, 55 V.h Weber K y Osborn M: 250 V, 20 mA, 3 W, 15 ºC,
71 V.h
Starr C: 250 V, 10 mA, 3 W, 15 ºC, 102 V.h PhastGel: 250 V, 10 mA, 3 W, 15 ºC, 65 V.h Tinción: La tinción se realizó con coomassie
brillante R-250 según Phastsystem Development Technique7
MEDICIONES
Las diferentes mediciones se realizaron empleando un vernier o pie de rey y a partir del punto de aplicación de las muestras. Se determinaron la resolución y el Rf según las fórmulas siguientes:
2 (Distancia banda 2 – Distancia banda 1) Resolución banda 1 y 2: ––––––––––––––––––––––––– Ancho banda 2 + Ancho banda 1
Distancia de migración de la banda Rf: –––––––––––––––––––––––––––– Distancia de migración del bromofenol azul
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Se aplicó un análisis de varianza (ANOVA),
para determinar diferencias significativas entre las medias de los Rf obtenidos para cada marcador de peso molecular, la resolución entre bandas contiguas y el tiempo de corrida con los diferentes sistemas tampón. En el caso de existir diferencias significativas, se evaluaron por una prueba de rangos múltiples de DUNCAN. Se determinó la ecuación de regresión de las rectas obtenidas
mediante el ploteo de Rf en función del log PM, la calidad de ajuste de estas se definió por el cálculo de los coeficientes de determinación. Para comparación de las pendientes se empleó un análisis de covarianza. Se trabajó con un coeficiente de variación menor que 10 %, un nivel de significación de a = 0,l05 y el paquete estadístico STATISTIC versión 5.1 M de 1998.
Fig. 1. Tiempo de corrida de las electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) en los sistemas tampón estudiados.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Tiempo (min)
Sistemas tampón
Tris-Acetato
W eber y O sborn
Starr C M
Laemmli original
Laemmli+Gli (LaG li)
Laemmli+Gli+pH+FI(LaGlipHM )
Phastgel comercial
Laemmli+Gli+pH (LaGlipH)
RESULTADOS
Los resultados se presentan en la tabla y en las figuras 1 y 2.
Fig. 2. Comparación de los Rf de proteínas patrón en SDS-PAGE obtenidos por los diferentes sistemas tampón. Los números del 1 al 7 representan los pesos moleculares de 13,7; 14,2; 25; 29; 40; 43 y 66 kD respectivamente. La comparación de las medias de estos para cada punto reflejó la existencia de diferencias significativas. La prueba de DUNCAN demostró que los sistemas PhastGel y LaGlipHM pertenecen al mismo nivel de significación en los marcadores de peso molecular 13,7 y 14 kD.
Fig. 3. Resolución entre las bandas de proteínas patrón obtenidas por SDS-PAGE con los diferentes sistemas tampón. Los números del 1 al 6 representan la resolución entre los marcadores de pesos moleculares de 13,7-14,2, 14,2 - 25, 25 - 29, 29 - 40, 40 - 43 y 43 - 66 kD respectivamente. Al aplicar un ANOVA se observaron diferencias significativas entre estos.
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1 2 3 4 5 6 7 Pe so mol ec ula r Rf
T ris-Ac etato W e ber y Osborn Starr CM Pha stGe l com erci al
La emml i La Gl i LaG lipH LaG lipH M
0 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 Peso Molecular Resolució n Tris-Acetato Weber y Osborn Star CM PhastGel comercial Laemmli LaGli LaGlipH LaGlipHM
DISCUSIÓN
En el sistema de Weber y Osborn5 existen
diferencias significativas respecto al PhastGel en cuanto a la distancia media recorrida por las muestras (resultó la menor de todos los estudiados con solo 2,l05 cm) mientras que el tiempo de corrida medio es significativamente mayor (fig, 1), Es de destacar que en todas las repeticiones fue necesario detener la corrida, porque el gel comienza a deformarse, se detiene la migración de las muestras y la capacidad tampón no es suficiente para mantener el pH (se aprecia el cambio de color del bromofenol azul a amarillo, lo que indica un pH inferior a 3, y el valor original en el gel es de 7), por lo que se determinó que este sistema tampón no es apropiado para su empleo en PhastSystem. En el sistema de Starr CM4 el tiempo de corrida es
muy superior al del PhastGel (fig.1) y el gel presenta tendencia a la separación física entre el gel concentrador y separador. Estas desventajas lo hacen no apropiado para el PhastSystem. El sistema de Tris-acetato tiene el mayor tiempo de corrida con diferencias altamente significativas con el resto de los sistemas (fig. 1), sin embargo el gel muestra una buena adaptación al equipo PhastSystem, El sistema de Laemmli UK3 alcanza
menor tiempo de corrida que el resto de los sistemas estudiados excepto al del PhastGel (pero sin diferencias significativas con este) así como buena capacidad de adaptación al equipo PhastSystem. Por lo que los autores de este trabajo lo consideran apropiado para su uso.
En el sistema de electroforesis con tampón y gel heterogéneos, la diferencia de concentración entre los geles concentrador y separador crea un potencial osmótico entre los 2 geles, la difusión del agua en el gel lo hace inestable y es necesario emplearlos en el día de su preparación. Se ha reportado una serie de compuestos posibles a adicionar para inmovilizar el agua, sin afectar el proceso electroforético.4 El método de Laemmli
se modificó con la adición de compuestos que disminuye la difusión del agua y la ruptura de los geles durante su secado.8 La inclusión de SDS en
la muestra permite hacer los geles sin SDS ya que durante la electroforesis, al gel se le suministra SDS proveniente del tampón de corrida manteniendo así el nivel de saturación de las proteínas en el sistema.9 Por causa de esto en los minigeles para
PhastSystem diseñados en este trabajo se eliminó
el SDS. La inclusión del SDS modifica el sistema y no es necesario que los pH y la fuerza iónica de los geles concentrador y separador sean diferentes,10 por lo que se igualó el pH a 8,8 y la
fuerza iónica a 0,l375 mol/L en ambos geles, se consideró que la movilidad del complejo SDS-proteína es insensible al pH en este rango, Esta adaptación es además conveniente para evitar la difusión entre la zona de concentración y separación.
El tiempo de corrida obtenido en las SDS-PAGE con el sistema de Laemmli, ya sea original o modificado, no presenta diferencias significativas con el PhastGel (fig. 1), además la distancia migrada por las muestras en el gel se logra con el mismo valor de VH. Por lo que, considerando este parámetro, el método de Laemmli modificado Tabla 1. Parámetros de las rectas de regresión de los Rf como función del log PM de las proteínas patrón por los diferentes sistemas tampón
Sistema tampón Coeficiente de regresión Significación Coeficiente de determinación (r2) N
Tris-acetato - 0,195 A 0,19802 3 5 Weber y Osborn - 0,1646 C 0,19691 4 1 Starr CM - 0,1934 A 0,19378 4 0 PhastGel - 0,1822 B 0,19741 3 5 Laemmli - 0,1972 A 0,19965 5 3 LaGli - 0,1977 A 0,19714 3 4 LaGlipH - 0,1848 B 0,19812 3 5 LaGlipHM - 0,1859 B 0,19803 5 5
cumple los requisitos de rapidez necesarios para el trabajo con el equipo PhastSystem,
En PhastGel con los marcadores de peso molecular empleados se obtienen mayores valores de Rf (fig. 2), coincidiendo con el sistema de Starr CM y LaGlipHM a peso molecular menor que 14,2, pero sin diferencias significativas respecto a la resolución (fig. 3), lo que difiere de reportes sobre geles de poliacrilamida para SDS-PAGE en el sistema Tris-Acetato/Tris-Tricina11donde los
valores de Rf son similares a los obtenidos por el sistema de Laemmli.3 En el sistema de Weber y
Osborn se obtienen valores Rf significativamente menores que el PhastGel y LaGlipHM (fig. 2), y existe una menor resolución entre las bandas de 29-40 y 43-66 respecto al resto de los sistemas (fig. 3), aspectos que se pueden considerar como desventajas de este y que posiblemente están implícitos en el comportamiento de la electroforesis continua. Al probar el sistema descrito por Starr CM en el equipo PhastSystem en cuanto al comportamiento de los diferentes marcadores de peso molecular, se obtuvieron niveles de migración sin diferencias significativas con PhastGel en 13,7; 14,2; 25 y 43; mientras que presenta diferencias en el resto de los marcadores. Es de destacar que en la resolución entre 25-29 y 43-66 se obtiene un valor significativamente superior al obtenido por
PhastGel. En el sistema de Laemmli original y
modificado a pesar de que se obtuvieron diferencias significativas en varios Rf respecto al
PhastGel (fig. 2), al analizar la resolución no se
encontraron diferencias significativas entre ellos (fig. 3), lo que significa que la migración neta fue mayor, pero no la relación de la distancia entre las bandas y el ancho de estas,
En la tabla I se observa que el coeficiente de determinación obtenido con el sistema tampón de Starr CM al ser aplicado en el equipo
PhastSystem presenta un valor más pequeño
comparado con el resto de los sistemas tampón estudiados, a pesar de esto el ajuste de la recta de regresión no puede considerarse malo, pues más de 93 % del error total está explicado y por ende eliminado por la regresión; el resto de los coeficientes de determinación oscilan entre 0,l9691 y 0,l9965, lo que demuestra un buen ajuste. También puede apreciarse en el análisis de los coeficientes de regresión obtenidos en la SDS-PAGE con los
diferentes sistemas tampón, se destaca que el valor del PhastGel es similar a los obtenidos por el sistema LaGlipH y LaGlipHM. A un grupo de mayor pendiente pertenecen los sistemas Tris Acetato, Starr, Laemmli y LaGli. La menor pendiente se obtiene con el sistema continuo de Weber y Osborn (característico de los sistemas continuos).
Se concluye lo siguiente:
1. Se obtuvieron moldes para la polimerización simultanea de dos geles de poliacrilamida similares al PhastGel,
2. Se modificaron los tampones de preparación de geles del sistema discontinuo de Laemmli, y se obtuvieron parámetros de corrida (tiempo, voltaje, comportamiento del gel), y resolución de las bandas en los patrones electroforéticos sin diferencias significativas con el gel comercial del PhastSystem,
3. Se determinó que en geles del sistema de Laemmli con glicerol e igual pH y fuerza iónica en las zonas concentradoras y separadoras se obtenían resultados similares al PhastGel,
SUMMARY
The electrophoresis Phastsystem in spite of being, one of the most modern in the market, it depends upon the use of gels (phastgel) and electrode buffers stripes which are very expensive at the international market. A method was developed for producing heterogeneous polyacrylamide gels poured into 50x 43x0.45 mm casts (length, width, height). The effect of different buffer systems upon the resolution power and the running time was studied. A mixture of pattern proteins with molecular weights within the range of 13 to 66 kda was employed. The resulting data were statistically analyzed by Statistic 5.1 M. 1998. By means of the modified system of Laemmli, gels were attained, the running time and the resolution between the bands did not have significant differences with the phastgel System. It can be concluded that the gels prepared by this system satisfactorily replace the original Phastgels and the buffer system, modified by the authors give better results than the original methods.
Keywords: Phastsystem, electrophoresis, polyacrylamide.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1 . Bock Scientific, Inc, LabMedica Internacional 2000; 17: 2 4 .
2 . Diagnostic Consumables, Inc, LabMedica International 2000; 17: 24.
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8 . Notes K and Aspiratory M, inventors; Daiichi pure Chemicals Co, assignee, Methods for drying polyacrilamide gel after electrophoresis, US patent 5 635 046 June 3, 1997.
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in enzimology, Academic Press,1990; vol, 182.
1 0 . Bjellqvist B, Inventor; Pharmacia Biotech AB, assignee, ”Buffer system for electrophoresis and use thereof” U S
patent, 6 090 252, July 18, 2000.
1 1 . Nicholson S, Inventors; FMC Corporation assignee, “Poliacrilamide cross-linked with a polysaccharide resin as electrophoresis gel medium”, US patent 4 542 200, Sep 17, 1985.
Recibido: 10 de enero del 2001. Aprobado: 22 de febrero del 2001.
Dra. Hilda Marilín García Pérez,Laboratorio BETERÁ, Calle 102 e/ 31 y 31-B Marianao, Ciudad de La Habana, Email: beterá@infomed,sld,cu
