MICROSCOPIA
El pequeño tamaño de la mayor parte de las células hace que para su estudio sean necesarios los microscopios. Se conocen dos tipos básicos de microscopios: el microscopio óptico y el electrónico.
MICROSCOPIA ÓPTICA
Los microscopios ópticos constan básicamente de una lente ocular y de una serie de lentes objetivo, son los que proporcionan los aumentos utilizando los fotones de la luz visible para observar muestras. En muchos microscopios además se utilizan unas lentes especiales (lentes de inmersión) que requieren la colocación entre la muestra y la lente de un tipo de aceite, en lugar del aire.
Las dos características más importantes de un microscopio son la amplificación (cuánto se aumenta el tamaño original de la muestra) y el poder de resolución (capacidad para observar separados dos puntos muy cercanos en la muestra).
El poder de resolución de los microscopios no solo depende del tamaño y la calidad de las lentes objetivo, sino también de la longitud de onda de la luz incidente y del índice de refracción del medio - normalmente el aire- que se encuentra entre el objetivo y la preparación.
Cuanto mayor es el índice de refracción, más disminuye la velocidad de la luz y más aumenta la resolución; por esta razón, los objetivos de inmersión tienen un poder de resolución mayor, ya que el aire (índice de refracción: 1,0) es sustituido por una sustancia viscosa como el aceite (índice de refracción: 1’5). La resolución que ofrecen los objetivos normales alcanza un límite máximo de 300nm y llega hasta 200nm en los de inmersión.
La microscopia óptica se basa en el siguiente procedimiento: 1. Los rayos luminosos, que proceden de
la fuente de iluminación, cruzan el aire e inciden sobre la preparación, constituida por el vidrio porta objetos, la muestra, el medio engloban y el vidrio cubreobjetos.
2. A continuación, los rayos atraviesan el aire hasta llegar a la lente frontal del objetivo del microscopio.
3. El objetivo recoge los rayos luminosos, que han sufrido múltiples refracciones, y los proyecta hacia el ocular, aumentando la imagen del objeto recibida.
4. Los rayos alcanzan el ocular, que vuelve a incrementar la imagen del objeto.
Las muestras deben ser muy finas, de solo unas micras de grosos, para que los rayos pueden atravesarlas.
Las muestras vivas suelen ser incoloras y transparentes a la luz, por lo que resulta casi imposible observar detalles con un microscopio óptico convencional. Para subsanar el problema, se pueden teñir las muestras o bien emplear microscopios especiales, como los de contraste de fase o los de fondo oscuro, que permiten la observación sin necesidad de tinción.
Para observar células vivas se utilizan colorantes que no las maten: los denominados colorantes vitales, como el azul de metileno. Estas preparaciones no son duraderas, por lo cual se conocen como preparaciones temporales. Para obtener preparaciones permanentes es preciso recurrir a técnicas especiales de elaboración de preparaciones microscópicas. Estas técnicas son la fijación, la inclusión, el corte, la tinción y el montaje.
1. Fijación: Consiste en tratar la muestra biológica con líquidos fijadores o conservantes, que preservan la morfología de las células, su organización interna y su composición química, alterándolas lo mínimo posible despeñes de su muerte. Los fijadores más utilizados son el alcohol etílico al 70% y el glutaraldehído.
2. Inclusión: Si los tejidos son rígidos, como es el caso de las raíces, los tallos y las hojas bien desarrolladas, los cortes se pueden efectuar directamente; pero para estructuras blandas, yemas, pequeñas hojas y casi todos los tejidos animales, las muestras deben ser incluidas previamente en una sustancia que les proporcione consistencia para evitar su deformación durante el corte. Es lo que se denomina técnica de inclusión.
El medio de inclusión más utilizado en histología es la parafina, una sustancia que se vierte fundida, a unos 60ºC, sobre la muestra y se mantiene a esta temperatura un mínimo de 4 horas. La parafina fundida penetra en la muestra y solidifica cuando se enfría. Como la parafina es hidrófoba, antes de la inclusión se debe proceder a la deshidratación de la muestra. Para ello se pasa la muestra por una serie de disoluciones de alcohol, y, por último, a un líquido apolar como el xileno, que es un buen disolvente de la parafina.
3. Corte: Si las muestras biológicas son de un grueso tal que no resultan transparentes al paso de la luz, antes de la observación con el microscopio deben de ser cortadas en capas tan finas que
sí sean transparentes. Los aparatos utilizados para cortar las muestras, los microtomos, pueden efectuar cortes extremadamente finos, por lo general, entre 6 y 12 micrómetros de grosor.
4. Tinción: Después de cortar la muestra, los cortes se depositan y se fijan sobre un porta objetos mediante un ligero calentamiento y, después, se lleva a cabo la tinción. Según las estructuras que se quieran destacar, se utilizan unos colorantes u otros. Por ejemplo, si se pretende observar la cromatina del núcleo, constituida por el ADN, y por tanto, ácida, se puede emplear un colorante como la hematoxilina, que por su naturaleza básica se unirá con fuerza a la cromatina.
Los colorantes más conocidos son: el azul de metileno, el carmín, la eosina, la hematoxilina, la orceína, la safranina, el sudán y el verde de metilo.
5. Montaje: Tras la tinción, y antes de pasar a su observación debe realizarse el montaje definitivo de la muestra. Este consiste en cubrir la muestra teñida, situada sobre el porta objetos, con un medio de montaje viscoso y transparente, y colocar encima un vidrio cubreobjetos que proteja la muestra.
Los medios de montaje más utilizados son: entre los no hidrosolubles y que, por tanto, necesitan deshidratación previa, el bálsamo de Canadá, el DPX y el Eurapal; entre los hidrosolubles, la goma arábiga, la glicerina y la gelatina gliceinada.
Lo ideal es que los medios de montaje se consoliden, para formar una estructura compacta con el porta objetos. Así, se consiguen preparaciones microscópicas definitivas, es decir, que pueden ser observadas con el microscopio durante muchos años.
TIPOS DE MICROSCOPIOS ÓPTICOS
• Microscopio de campo claro: Es el más común. En este tipo de microscopio las muestras se observan directamente. Como las células vivas son muy transparentes, el contraste suele ser bastante bajo y se utilizan con frecuencia tinciones con colorantes para obtener una imagen más definida de algunos componentes celulares.
• Microscopio de contraste de fase: Se basa en las diferencias en la refracción de la luz de las distintas estructuras celulares.
• Microscopio de campo oscuro: Un disco opaco bloquea el haz de luz, de forma que solo la luz refractada por la muestra alcanza el objetivo y esta aparece iluminada sobre un fondo oscuro.
• Microscopio de interferencia diferencial de Nomarsky: Utiliza un prisma refringente que divide la luz en dos rayos polarizados que interfieren entre sí y proporcionan una imagen de la célula que parece tridimensional.
• Microscopio de fluorescencia: En este caso se emplea una lámpara especial y un filtro que permiten emitir luz a diferentes longitudes de onda y excitar ciertas moléculas (fluorocromos) capaces de emitir fluorescencia. Algunos pigmentos, como las clorofila presentan “autofluorescencia”, es decir pueden visualizarse directamente las células si son iluminadas con la longitud de onda adecuada.
MICROSCOPIA ELECTRÓNICA
A principios del sigo XX, la aparición del microscopio electrónico supuso un avance extraordinario en las técnicas de observación microscópica, ya que permitió aumentar el límite de resolución
hasta 0’3nm y la amplificación desde 1000 aumentos (microscopio óptico) hasta unos 250000 aumentos.
Este instrumento se basa en la utilización de un haz de electrones que atraviesa una seria de lentes electromagnéticas (en lugar de luz y lentes de cristal como en el microscopio óptico) en u sistema de vacío. Existen dos tipos de microscopios electrónicos: el de transmisión (MET) y el de barrido (MEB).
La preparación de las muestras para el microscopio electrónico también es muy distinta de la utilizada para el óptico.
• Debido al escaso poder de penetración de los electrones, la muestra debe estar formada por cortes extremadamente finos (150- 500 amstrongs). Esto se consigue mediante ultramicrotomos, cuya hoja es de vidrio o diamente.
• Se realiza una prefijación con glutarladehído y, a continuación, una fijación con sustancias como el tetróxido de osmio.
• La inclusión se lleva a cabo en una resina plástica.
• No hay tinción de la muestra, puesto que la imagen resulta de la difracción de los electrones en los MET es siempre en positivo y negativo (blanco y negro)
• Los cortes se colocan sobre una rejilla de 3mm de diámetro y se dejan con una sustancia permeable a los electrones, como el colodión.
• Por último, se realiza un contraste con soluciones de sales d metales pesados, para resaltar las diferentes estructuras. En el caso del MEB, la muestra se debe recubrir al final con una fina capa metálica, generalmente de oro, para posibilitar la reflexión de los electrones.
• La introducción de la rejilla se realiza a través de una compuerta que evita la entrada de aire.
TIPOS DE MICROSCOPIOS ELECTRÓNICOS
• MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN (MET): Las muestras, en cortes ultrafinos, se montan en rejillas de cobre que permiten el paso de los electrones. Se aumenta el contraste mediante la utilización de metales pesados, como el plomo, en lugar de colorantes.
• MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO (MEB): El paso de los electrones por un deflector provoca el barrido de la muestra, generándose electrones secundarios en función del relieve, y una imagen tridimensional. La muestra se cubre previamente con una capa de oro.
MITOCONDRIA MET MITOCONDRIA MEB
CRIOFACTURA
Es una técnica de microscopía electrónica especialmente utilizada para estudiar los componentes de la membrana.
Consiste en la congelación de la muestra, que posteriormente se fractura con una cuchilla por las superficies que ofrecen menor resistencia. A continuación, se sombre con un metal y se cubre con una fina capa de carbono para obtener una réplica, que s la que se observa al microscopio, ya que la muestra original se elimina por disolución. Con esta técnica se ponen de manifiesto detalles en el relieve de distintas superficies.
OTRAS TÉCNICAS DE ESTUDIO DE LAS CÉLULAS
FRACCIONAMIENTO CELULAREsta técnica consiste en la ruptura controlada de tejidos y células para separar diversos orgánulos o componentes intracelulares en distintas
“fracciones”. Para ello, se homogeneiza el tejido, ya sea por plasmólisis, aplastado, batido o mediante ultrasonidos, con el fin de romper las células y, posteriormente, el extracto celular se somete a una centrifugación diferencial (centrifugaciones sucesivas a distintas velocidades) que permite la separación de los distintos componentes celulares.
Las partículas de la muestra, de diferentes densidades, sedimentan a distintas velocidades que se miden en
unidades de Svedbeg (S). La centrifugación se lleva a cabo en una centrífuga o una ultracentrífuga (centrifugación a velocidades muy elevadas).
CULTIVOS CELULARES
La mayor parte de las células se pueden hacer crecer en placas de cultivo, lo que permite su observación, su análisis bioquímico y su respuesta ante determinados estímulos o ante la presencia o ausencia de algunas moléculas o de otras células.
Un cultivo celular es una técnica que permite que una células aisladas de un organismo pluricelular se mantengan vivas y se dividan en un medio preparado de forma artificial.
Los medios de cultivo deben incluir todos los nutrientes que necesitan las células, tales como glucosa, aminoácidos, sales minerales, vitaminas y factores de crecimiento específicos para cada tipo celular, muchos de los cuales están incluidos en algunos de los componentes más utilizados en estos medios, como es el suero. También tienen una gran importancia la concentración y el pH, así como la naturaleza del sustrato, que puede ser sólido o líquido.
El cultivo de la mayor parte de los tipos celulares está limitado por un determinado número de divisiones, tras las cuales las células mueren. Sin embargo, muchas de las células más utilizadas en los cultivos corresponden a las llamadas líneas celulares. Cada línea celular es un cultivo de células que pueden proliferar de forma indefinida si se las mantiene en un medio adecuado y disponen de espacio suficiente. Las dos clases más importantes de cultivos celulares son las siguientes:
-
Cultivos en masa: emplea un elevado número de células que se dividen hasta llegar a formar una capa continua de células sobre la placa en la que se realiza el cultivo.-
Cultivos clónicos: utilizan un pequeño n´mero de células que se disponen sobre una placa, de tal forma que quedan separadas unas de otras y cada una genera al dividirse un clon o línea de células genéticamente idénticas.DIFRACCIÓN DE RAYOS X
La difracción de rayos X es una técnica que se utiliza para estudiar detalles de la estructura molecular de los componentes celulares. Mediante un haz de rayos X se puede determinar la disposición de los átomos en una molécula en estado cristalino. Los rayos X son dispersados por los electrones de la muestra, de modo que los átomos grandes conchos electrones, como el C, el N, el O y el P, se detectan con más facilidad que los átomos pequeños, como el H. El patrón de difracción se recoge en una placa fotográfica. Una vez reina esta información, y tras un estudio detallado de los resultados, se pueden obtener modelos tridimensionales.
AUTORRADIOGRAFÍA
Los elementos que constituyen las moléculas orgánicas de las células no presenta isótopos radiactivos. La técnica de la autorradiografía consiste en incubar las células en presencia de determinados isótopos radiactivos que podrán ser incorporados a determinados moléculas. Estos radioisótopos son inestables y emiten radiaciones ionizasteis que se pueden registrar con aparatos, como en contador Geiger, o bien mediante su impresión sobre un emulsión fotográfica. Mediante las técnicas es posible seguir el “recorrido” de los radioisótopos por la célula o a través de los tejidos. Una de las primeras aplicaciones prácticas de este procedimiento fue el marche con 14C del CO2, y el estudio de su incorporación a las moléculas orgánicas en el proceso de
