CAPÍTULO 3:
EL COMPUESTO
3.1 INTRODUCCIÓN
Una vez desarrollado un biomaterial elastomérico poroso para regeneración cardiaca o de tejidos elásticos, surge la necesidad de un nuevo biomaterial para fracturas de hueso que supongan una pérdida masiva de tejido óseo, ocasionadas por problemas osteoporóticos o por problemas derivados de tumores. La respuesta normal a una fractura de hueso es una secuencia espontánea de los siguientes eventos; inflamación inicial, seguido de la formación de un callo blando; formación del callo duro y, por último, la remodelación del hueso [1]. Cuando este proceso natural no ocurre, hay que realizar una intervención quirúrgica. En la actualidad dichas operaciones incluyen el uso de fijaciones rígidas e internas con las que se usan platos o rodillos intermedulares, injertos de hueso y otros sintéticos [2, 3]. Sin embargo, esto no resulta en la reparación completa del hueso y en su remodelación, debido, entre otras cosas, a que estos materiales utilizados no son reabsorbibles por el propio cuerpo, sino que permanecen en el sistema, pudiendo, por tanto, sufrir fatiga y fractura a lo largo del tiempo [4, 5].Tratando de solventar estos problemas, los investigadores en ingeniería de tejidos han desarrollado diferentes materiales sintéticos. Estos compuestos están formadas por una gran variedad de materiales biocompatibles (polímeros naturales y sintéticos, cerámicos, y composites) [3, 6] diseñados para la proliferación celular, mediante la incorporación de factores de crecimiento que ayuden a tal efecto, para soportar cargas físicas y siendo biodegradables, lo que ayuda a que el tejido dañado pueda ser sustituido lentamente por uno completamente nuevo [7, 8].
En ingeniería tisular se han desarrollado diversos biomateriales que promueven la proliferación celular, soportan cargas fisiológicas y son fáciles de manipular y sintetizar [7, 8]. Entre estos materiales existen diversos tipos de polímeros biocompatibles, que a menudo, son además biodegradables [9‐12]. Algunos materiales presentan baja viscosidad en condiciones de síntesis, pero son capaces de polimerizar y formar geles en condiciones fisiológicas, lo que permite que sean inyectables y evitan así la necesidad de cirugía [13, 14]. La bibliografía científica es prolífica en ejemplos y combinaciones. A modo de muestra, Byeongmoon et al. [15] describen la síntesis de un biopolímero en bloque que es biodegradable porque contiene ácidos orgánicos, tales como el ácido láctico y el ácido glicólico y, biopolímeros como el
polietilenglicol capaces de gelificar en condiciones fisiológicas sin producir irritación del tejido y que, además, son biodegradables y reabsorbibles por el organismo. Sin embargo, los materiales de este tipo no pueden soportar cargas fisiológicas pues carecen de dureza, por lo que resultan ineficaces mecánicamente cuando se utilizan en estructuras de carga como huesos en animales o ramas en vegetales. Además, algunos polímeros experimentan deformaciones cuando son expuestos a altas temperaturas o a estrés por un período de tiempo prolongado, sufriendo un deterioro tan rápido que a veces no permite la completa reparación de la estructura antes de la degradación del polímero. Para solucionar este problema se han ingeniado una serie de materiales compuestos utilizando biocerámicas, para simular el comportamiento del hueso natural [16]. En ocasiones, algunos implantes médicos de elementos estructurales del cuerpo, como por ejemplo los huesos, están fabricados con un material compuesto polímero/cerámica [17].
La empresa Abbott cardiovascular Systems Inc. desarrolló un composite1 implantable
compuesto de partículas biocerámicas dentro de una matriz de L‐Lactide y glicolide, lo cual facilita la resistencia y reduce el desgaste del implante. A diferencia de los polímeros inyectables, estos implantes se forman normalmente fuera del cuerpo y se colocan mediante cirugía. Lamentablemente, tales implantes presentan problemas de adaptación a las superficies de destino, que son normalmente irregulares, presentan grietas o una morfología no estándar. En cierto tipo de lesiones, es posible una estrategia de tratamiento donde el implante constituye una plataforma para la reconstrucción del tejido. Se conocen en el estado de la técnica diversas solicitudes de patentes que describen la preparación de plataformas con características muy diversas. Un problema crítico para el correcto funcionamiento de estas plataformas es que se ajusten correctamente a las diversas irregularidades de la estructura a tratar. Sin embargo, una vez moldeados, estos compuestos tampoco pueden volver a remodelarse para ajustarse con precisión a la superficie a reparar. En el año 2007 Guillermo Ameer desarrolló una material compuesto2 formado por una biocerámica (Hidroxiapatita) y
un biopolímero biodegradable (Poly (diol‐co‐citrate)), desarrollados para ingeniería de tejidos y fijación de dispositivos ortopédicos. La composición del material compuesto descrito
en ella le otorga una rigidez apropiada para cargas fisiológicas pero que impide la correcta adaptación a la superficie a reparar.
Muchas son las aplicaciones que cubren estos materiales, como ya se ha visto en la introducción, pero un campo en el que se están realizando muchos esfuerzos es en la columna vertebral, concretamente en la regeneración de vertebras fracturadas y discos intervertebrales [18‐21]. Dentro del campo de la regeneración ósea en vertebras una de necesidad no cubierta por este tipo de biomateriales es la vertebroplastia, una intervención cuyo objetivo es fijar vértebras rotas que producen dolor a un paciente [22]. En la actualidad, en esta intervención, un radiólogo se encarga de inyectar el medicamento, un biomaterial compuesto por un cemento óseo, en la vértebra dañada con un doble objetivo: fijar la vértebra y anular el dolor, aprovechando que la temperatura del implante elimina las terminaciones nerviosas responsables de transmitir señales de dolor en esa zona [23‐25]. La necesidad en este mercado radica en que los cementos óseos que se utilizan tienen una elevada dureza que a corto‐medio plazo provoca roturas en las vértebras colindantes a la vértebra fijada, ya que el hueso de estas vértebras suele se un hueso osteoporótico con una densidad ósea baja cuyas propiedades de resistencia mecánica son mucho menores que un hueso sano. Así las vértebras colindantes no aguantan la dureza producida por el cemento óseo [22]. (Figura 1).
Entre los cementos utilizados, el estándar es el polimetilmetacrilato (PMMA) [22, 26‐28], que lleva casi 60 años de trayectoria en la cirugía ortopédica. Los cementos óseos se han usado por mimetismo en muchas aplicaciones ortopédicas, pero existen aplicaciones específicas en las que los cementos usados ahora tienen deficiencias tecnológicas Tabla 3.1.
Todos los competidores en la aplicación de cementos en fractura vertebral compresiva basan sus productos en formulaciones de PMMA o en fosfatos cálcicos. El entorno competitivo es complejo ya que todos los productos basados en PMMA tienen más de 25 años de antigüedad como tratamientos para aliviar la fractura vertebral compresiva.
Tabla 3.1: Cementos óseos utilizados en la actualidad con sus propiedades.
PRODUCTO Fractura
postoperación
Dureza Eliminación dolor Regeneración
PMMA [26] Alta Alta Alta Ninguna
Fosfato calcio [29] Alta Alta Alta Alta
Cortoss[30] Media Alta Alta Ninguna
Figura 1: La vertebroplastia. a) las vertebras, ya sea por una enferemedad osteoporóticao una debilidad ósea, sufren una rotura, lo que provoca que los nervios se pinzen, originando en el paciente un gran dolor. b) para solucionar esto se realiza una inyección en la zona dorsal, del biomaterial (c), ayudados por sistemas de resonancia y TAC (d).
Aproximadamente un 30‐50% de las mujeres y un 20‐30% de los hombres desarrollan fractura vertebral compresiva y la mitad de todos ellos sufren múltiples fracturas a lo largo de la vida [31]. Se producen alrededor de 1,5 millones de fracturas vertebrales compresivas en el mundo de las cuales una tercera parte causan dolor agudo [32]. De estas fracturas con dolor, 250.000 son intervenidas mediante vertebroplastia.
Los pacientes intervenidos se pueden dividir en dos grupos principales, que se diferencian por la causa de la fractura: • Pacientes que tienen rotura vertebral por una pérdida de densidad en el hueso debida a un cuadro de osteoporosis. Este grupo de pacientes acostumbran a tener una edad superior a los 50 años y hay más incidencia en las mujeres. • Pacientes que tienen rotura vertebral por una pérdida de densidad ósea provocada por un cáncer en el tejido óseo. También se pueden clasificar los pacientes en función de la edad: • menores de 50 años. • mayores de 50 años. Ambas clasificaciones de los pacientes se tienen en cuenta a la hora de escoger el tratamiento a utilizar. Los pacientes menores de 50 años que sufren fractura vertebral compresiva, son tratados con cementos óseos con mayor capacidad de osteointegración (cementos de calcio), aunque el tratamiento sea mucho más caro. El origen de la fractura también influye a la hora de escoger el tipo de tratamiento. • En el caso de pacientes que tienen cáncer, el único objetivo del tratamiento es mitigar el dolor que provoca la fractura vertebral compresiva. • En cambio, los pacientes que tienen osteoporosis, pueden buscar también ser tratados con medicamentos que frenen o incluso mejoren la degeneración del tejido óseo, además del objetivo principal del tratamiento, que es eliminar el dolor en la vértebra colapsada.
Dentro de todos estos materiales utilizados en vertebroplastia, existe una necesidad no cubierta que es la adaptabilidad, la biodegradación y la regeneración, en donde surgen nuevas oportunidades para el desarrollo de biomateriales con capacidad osteoinductora que sea capaz de aguantar los requerimientos mecánicos de las vértebras dañadas [21].
En el presente capítulo se ha desarrollado un material compuesto por una biocerámica y un polímero en bloque, formado por bloques rígidos alternados con bloques flexibles, como por ejemplo, los polímeros de polietilenglicol, que permiten la remodelación tras el endurecimiento de la plataforma. De esta manera, se puede crear una plataforma con una morfología inicial que podrá ser remodelada mediante fuerzas mecánicas a la hora de implantarla para su perfecta adaptación a la superficie a reparar. Este material puede aplicarse además en campos diferentes de la biomedicina, por ejemplo, en ingeniería tisular de plantas, como plataforma para injertos o como inductor de enraizamiento.
3.2 OBJETIVOS
El objetivo de este capítulo, centrado en la composición de un biomateriales, es el desarrollo de un material biodegradable con capacidad regeneradora. Este compuesto deberá cumplir con los requerimientos mecánicos de las zonas donde será implantado. Además, también será un material que servirá como sistema de liberación controlada de fármacos que ayude en la regeneración de la zona dañada
Plan de trabajo
Para conseguir estos objetivos se propone el desarrollo de un material formado por dos componentes, una biocerámica y un material polimérico que consta de dos bloques, una parte dura y otra parte blanda. La parte dura es la que asume la componente cristalina y la que da dureza al material gracias al efecto de las fuerzas de atracción por puentes de hidrógeno. Por otro lado, la componente blanda es la que asume la parte elástica. Aprovechando los métodos desarrollados en el capítulo anterior para el desarrollo de polímeros mediante síntesis por microondas, este polímero de bloque se realizará según este método de síntesis.
3.3 MATERIALES Y MÉTODOS
3.3.1 Síntesis del composite
El composite se desarrolló utilizando la tecnología de las microondas, anteriormente analizada. La síntesis tiene lugar en dos etapas. En una primera etapa se sintetizó el segmento duro (denominado prepolímero) que consta de los monómeros 1,8‐octanediol y ácido glutárico. Se añadió un exceso de ácido glutárico, en una proporción 1:1,2 para que las cadenas tengan como terminación el ácido y así puedan reaccionar con el polietilenglicol que se añadirá en la segunda etapa. Todos los reactivos se añadieron en un matraz esférico de 250 ml. La reacción se realizó en un microondas CEM discovery monomodal con una potencia de 100W a una temperatura de 120°C con dos tandas de 30 minutos cada una, aplicando aire comprimido para aumentar el efecto de las microondas. Además, al sistema se le conectó un refrigerador a la salida para eliminar el agua evaporada en la reacción (Figura 3.2).
Una vez concluida esta primera etapa se añadió Polietilienglicol (PEG) de peso molecular 1500 (sigma aldrich) o 2000 en relación 1:1 en peso (Figura 3.3) y se hizo reaccionar en las mismas condiciones que la etapa anterior. Figura 3.3 Esquema de reacción del polímero en bloque utilizando como monómeros 1,8 octanodiol y ácido glutárico para formar el segmento duro y añadiéndole una cadena flexible compuesta por el polietilenglicol. Una vez que se tiene el polímero terminado, se añade la Hidroxiapatita en la relación en peso deseada (1:1,1:0,75,1:0,5,1:0,25). Cuando se añadió la hidroxiapatita se calienta a unos 60ºC hasta que este fluido para poder mezclarlo con facilidad.
3.3.2 Determinación del peso molecular por MALDI TOF MS.
La determinación del peso molecular y su distribución es un punto de interés en el análisis de polímeros, porque algunas de la propiedades importantes como la elasticidad, la dureza y la procesabilidad, están correlacionadas con la estructura química y con el peso molecular. El método que se usa con más frecuencia es el de HPSEC (High Performance Size Exclusion Chromatography), que mide el peso molecular y su distribución. Sin embargo, es un método que muestra imperfecciones sobre todo cuando se habla de polímeros poco conocidos y de los que no se tiene un calibre. Para ello, se desarrolló el MALDI TOF, en 1988 por Hillenkamp y Karas, para el análisis de grandes biomoléculas tales como péptidos y proteínas [34‐36], pero hoy en día también es una técnica muy utilizada para la caracterización de polímeros [37‐40]. Esto permite determinar del peso molecular absoluto y la distribución de polímeros sintéticos con una estrecha polidispersividad. Las biomoléculas y los polímeros se pueden analizar gracias a que tienden a hacerse frágiles y fragmentarse cuando son ionizadas por métodos convencionales.MALDI‐TOF es una técnica de ionización suave utilizada en espectrometría de masas. Se denomina MALDI por sus siglas en inglés, Matrix‐Assisted Laser Desorption/Ionization
(desorción/ionización láser asistida por matriz), y TOF por el detector de iones que se acopla al MALDI y, cuyo nombre procede también de sus siglas en inglés, Time‐Of‐Flight [41, 42]. La macromolécula se implanta en primer lugar en una matriz sólida que a menudo, consta de un material orgánico, como ácido trans‐3‐indoleacrílico, y sales inorgánicas como cloruro de sodio o trifluoruroacetato de plata. Esta matriz se utiliza para proteger a la biomolécula de ser destruida y para facilitar la vaporización y la ionización. La muestra es entonces irradiada con un láser pulsado, como un láser de nitrógeno. La energía del láser expulsa iones de la matriz, electrónicamente excitados, cationes y macromoléculas neutrales, que crean una densa nube de gas por encima de la superficie de la muestra. La macromolécula es ionizada por las colisiones y complejación con pequeños cationes (Figura 3.4).
Figura 3.4 Funcionamiento del MALDI‐TOF. A) la muestras situada en una matriz, es ionizada mediante un laser creando iones de la matriz y del compuesto a analizar B) posteriormente se mide con un analizador el tiempo de vuelo de estos iones caracterizando del material
En el análisis de los polímeros sintéticos por MALDI‐TOF, una elección muy importante es elegir la matriz apropiada para obtener un buen espectro másico. Nielen resumió una serie de matrices para polímeros sintéticos teniendo una gran variedad de estructuras moleculares y polaridades diferentes. Por ejemplo, 2,5‐ dihydroxybenzoic acid (DHB) y dithranol son las recomendadas como matrices para PEG y poliestireno respectivamente (Figura 3.5) [43].
Matrices Polímeros Hidrofilicos Ácido 2,5‐ Dihidroxibenzoico (DHB) PoliPropilen Glicol ácido α‐Ciano‐ Hidroxicinámico Polivinil acetato Ácido Ferulico Politratmetilene glicol Ácido Indoleacrilico polimetilmetacrilato Ditranol Poli estireno Ácido Trans‐Retinocio Poli Butadieno Difenilbutadieno Poli Dimetilsiloxano Hidrofobico Figura 3.5 Matrices utilizadas para el análisis del MALDI‐TOF
Después de la selección de la matriz apropiada, es importante la preparación de la cocristalización homogénea de la matriz y de la muestra [43]. El método del goteo seco es uno de los más usados. En este método, las dos soluciones se mezclan por volumen, después 1‐2 microlitros de la mezcla se aplica en el “target plate” y se seca a temperatura ambiente. Para la cocristalización homogénea y minimizar la secreción a través de la matriz y la muestras durante la evaporación del disolvente, es preferible usar el mismo disolvente para las dos soluciones. El composite matriz/muestra se distribuye en un ratio molar aproximado de 100 a 1000 [43] (Figura 3.6)
Figura 3.6 Método de la gota seca para la preparación de muestras en el Maldi Tof. a) Se disuelve la muestra y la matriz en dos disolventes, a ser posible el mismo, para evitar tiempos de evaporación diferentes y así obtener una muestra más homogénea. b) se mezclan y se depositan en una superficie. c) se deja evaporar el disolvente consiguiendo una muestra homogénea entre la matriz y el compuesto que se va a analizar.
Todos los polímeros fueron analizados usando un MALDI‐TOF Microflex. Bruker Daltonics Spectrometer en el departamento de bioingeniería del IQS (instituto Químico de Sarria). Las muestras se prepararon usando el método del goteo seco. Se disolvieron 5 mg de prepolímero en 500 μl de acetona y 4 μl de esta disolución se mezclaron con 80 μl de la solución matriz, que fue preparada mediante la disolución de 5 mg de DHB en 500 μl de acetona. Un μl de la solución matriz/muestra se aplicó sobre plato correspondiente (MSP 96 ground steel) y se dejó secar a temperatura ambiente. La calibración se realizó aplicando 1 μl del standard péptido calibrador (cuya masa está entre 1000 y 3500 Da, Bruker Daltonics) y después dejándolo secar al aire, aplicando 1 μl de la solución matriz. El método usado en el programa Flex control y los settings correspondientes del espectrómetro se muestran en la Tabla 3.2.
Tabla 3.2: Datos utilizados en el espectrómetro.
Nombre Fuente Ion 1 Fuente Ion 2 Lens Reflector Intensidad del laser
RP_PepMix 19 16 9,6 19,2 80%
3.3.3 Análisis Dinamo Mecánico y reometría.
El Análisis Dinamo Mecánico conocido por sus siglas en inglés como DMA, es un análisis utilizado en estudios de procesos de relajación y en reología para estudiar y caracterizar el comportamiento de materiales viscoelásticos, como polímeros, y sus respuestas ante impulsos, estrés, deformación en tiempo y frecuencia [44].
Este estudio es importante para la comprensión de la mecánica de los materiales poliméricos utilizados como hules, fibras textiles, empaques, plásticos, espumas y diferentes compuestos. El DMA utiliza el principio de estímulo‐respuesta. Para ello se aplica una fuerza oscilante a la muestra y se mide desplazamiento resultante, se determina la rigidez de la muestra y se calcula el módulo de la muestra. Por medio de la medición del lapso entre el desplazamiento y la fuerza aplicada, es posible determinar las propiedades de deformación del material.
Los materiales viscoelásticos como los polímeros existen típicamente "en dos estados", es decir, muestran propiedades vítreas con un módulo considerablemente alto a bajas temperaturas y, un estado ahulado, con un módulo relativamente bajo a temperaturas altas. Por medio de un barrido de temperaturas durante un estudio de DMA, se obtiene este cambio de estado entre vítreo y ahulado, es decir, se obtiene la transición vítrea dinámica y transición α. La temperatura de transición vítrea, o Tg, es obtenida, por medio de estudios de DSC. La transición vítrea dinámica, análoga a la transición vítrea térmica (Tg), provee de datos más útiles para el estudio de los polímeros y puede ser utilizada para investigar la frecuencia (y con las transformaciones matemáticas adecuadas, también el tiempo) en dependencia de la transición.
Otro de los análisis realizados se llevó a cabo mediante un reómetro. Los principios básicos de un reómetro oscilatorio inducen una deformación sinusoidal en la muestra y miden el
resultado de la respuesta a este estrés. En un experimento típico, la muestra se sitúa entre dos platos, y mientras uno permanece en estado estacionario, un motor rota en el otro plato [45]. El comportamiento viscoelástico se analizó mediante el módulo de almacenamiento (G’) y módulo de pérdida(G’’). La tan δ entre la deformación y la resistencia, determina un índice de la proporción de componente elástica que tiene el sistema.
tan δ = G’/G’’
En un experimento típico de reología, se mide G’ y G’’, cuando G’’>G’ el sistema puede ser caracterizado como viscoso mientras que si es al revés el sistema exhibe un comportamiento elástico.
Los experimentos reológicos de todos los polímeros fueron realizados en el reómetro AR 550 (TA instruments). Los experimentos de flujo en estado estacionario fueron realizados empleando un gap de 100 μm. El esfuerzo cortante, que fue tomado como una función de la velocidad de corte, se incrementó de 500 a 2000 Pa. Los ciclos de frecuencia (1 a 25 hz) se tomaron a 35°C usando un plato de acero de 20 mm. Los experimentos de frecuencia de barrido se llevaron a cabo utilizando un gap de 100 micras. El estrés oscilatorio se mantuvo constante a 500 Pa. Se tomó el módulo de almacenamiento (G’) y el módulo de pérdida (G’’) como función de la frecuencia.
La curva de temperatura tuvo lugar en un rango de entre 45°C y ‐5°C con un ratio de enfriamiento de 5°C con una constante de estrés oscilatorio de 500 Pa, elegidos de la región viscoelástica lineal de la muestra a 1 Hz. Los experimentos de curvas de temperatura se hicieron usando un plato de acero (20 mm de diámetro) con un gap de 20 μm. G’ y G’’ se reportaron en función de la temperatura.
3.3.4 Adhesión
En las pruebas de adhesión, la idea principal es ver como el material tiene propiedades de adhesión y, en caso afirmativo, ver que influencia tiene la biocerámica sobre ello.
Para ello se utilizó un ElectroPuls E1000 All‐Electric Test Instrument (Instron). El material se aplicó sobre unos platos de alumino mini pin Stub de 6 mm de diámetro (Ted Pella, Inc).
Figura 3.7 Forma y dimensiones de los platos utilizados para la prueba de adhesión (Mini pin Stub)
Los materiales que se utilizaron tenían una cantidad de biocerámica de 0, 15 y 35%, con respecto al polímero matriz. Para realizar el test de propiedades mecánicas en el estudio de adhesión, se fijó una cantidad en un pin situado en los grips de tensión del equipo electrodinámico. Otro pin se situó a una distancia de 2 mm del primer pin y se utilizó como cero esta distancia a lo largo de todo el experimento. Se aplicó un gradiente de carga en el adhesivo hasta que el material se rasgó. Este proceso se repitió 10 veces para cada muestra. Se determinó la carga máxima, el módulo, carga a tracción y el límite elástico. Para el test de adhesión con tejidos, se tomaron unos pequeños trozos de la región media del intestino de ratones, que se guardaron en PBS y se usaron en el experimento dentro de las 3‐4 horas siguientes a la cosecha. Se pegaron secciones de 5 mm de diámetro del intestino al pin metálico y se aplicó una cantidad de material sobre cada uno de los tejidos. Posteriomemente, un segundo pin, también con tejido sobre él, se situó a una distancia dada sobre el primer pin, como se explica en el método anteriormente mencionado. Se aplicó un gradiente de carga hasta que el material se rasgó. El proceso se repitió 5 veces para cada muestra. El número de repeticiones es más bajo que el método anterior debido a que los resultados del experimento tienen una menor variabilidad, lo que indica que este método es muy apropiado para la medición de las propiedades adhesivas.
3.3.5 Pruebas in Vivo.
Las pruebas in vivo del composite se realizaron en el Karolinska Institute, de la mano del Dr. Ion Tcacencu del grupo del Dr. Mikael Wenden del Centre for Oral Biology (COB). Se operaron 3 ratas macho Sprague‐Dawley con las pasta termoplástica sin carga. Las ratas fueron anestesiadas usando un inhalador de isoflurano (4% induction, 2‐3% maintenance). Se afeitó la cabeza de las ratas y se lavaron con una solución de iodo. Se separaron la piel y las capas subcutáneas incluido el músculo temporal para exponer el hueso calvario. Se creó un defecto circular de 8 mm transóseo en el lado izquierdo de la región parietal usando untaladro trépano y con un enfriamiento con medio salino. El defecto se cubrió con un disco estéril del composite ( ~40 mg, ~8 mm de diámetro). El disco se mantuvo en una solución salina al 0.9% antes de la implantación.
Tras la operación la incisión fue cerradas con una sutura simple de dos capas. Las ratas fueron sacrificadas por inhalación de CO2 12 semanas tras la operación. Para el análisis histológico se
recolecto el hueso calvario.
3.4 RESULTADOS
En el presente capítulo se ha desarrollado un material compuesto cuya reología es característicamente tixotrópica, por lo que tras endurecerse es capaz de recuperar cierta viscosidad en función de las fuerzas mecánicas y fuerzas calóricas que se apliquen. Los elementos constituyentes del material compuesto, consisten principalmente en un polímero de bloque y una biocerámica y, opcionalmente, otros componentes minoritarios. La composición del polímero en bloque es de particular importancia para la adaptabilidad de la pasta termoplástica, ya que es la alternancia de bloques rígidos con bloques flexibles lo que permite la reología tixotrópica. Así, inicialmente, los bloques flexibles establecen asociaciones por medio de fuerzas débiles con la biocerámica, gracias a los grupos éster de la cadena polimérica y a la estructura de la biocerámica. En la pasta en reposo, al enfriarse suficientemente, se desacopla esta asociación quedando la pasta cohesionada principalmente por asociaciones internas en el bloque rígido y, además, con la interacción con la biocerámica. Al aplicar fuerzas mecánicas y una pequeña cantidad de calor sobre la pasta rígida, cuya dureza proviene de la biocerámica, el bloque flexible vuelve a establecer las fuerzas débiles, gracias a la presencia de grupos hidroxilo libres en el bloque flexible, lo que lleva a un aumento de la viscosidad, teniendo como consecuencia la reología tixotrópica descrita (Figura 3.8).
El polímero es un poliéster con tres monómeros diferentes, ácido glutárico, 1,8 octanodiol y polietilenglicol (PEG). La biocerámica utilizada fue hidroxiapatita, debido a su liberación de calcio en el sistema. El poliméro principal tiene una estructura [A‐B]n‐C donde A es el ácido glutárico, B es el 1,8 octanediol y C el PEG (figura 3.8).
Figura 3.8 Estructura interna del composite, a) monómeros utilizados en la síntesis, donde se ve la configuración de cada uno de ellos. b) estructura del pre‐polímero formado por el ácido glutárico y el 1,8‐octanodiol. Este segmento no posee la componente flexible por lo que la estructura es quebradiza y rígida, como la mayoría de los polilácticos y policaprolactonas c) Estructura completa del composite donde se aprecia el segmento duro formado por los pliegues y un segmento blando o flexible formado por el PEG. Entre medias del sistema se aprecian unas esferas de Hidroxiapatita que evita el deslizamiento de las cadenas, lo que le confiere mayor dureza.
Se podrían incluir en la pasta termoplástica elementos variados en porcentajes, tales que sin afectar significativamente a la reología del material, le otorguen propiedades específicas para su aplicación en diferentes usos prácticos.
Como se ha comentado anteriormente, las propiedades del composite fueron testeadas por reología. El composite muestra un comportamiento reológico muy interesante con una alta tixotropía. En ausencia de velocidad de flujo la pasta es dura, con una textura y dureza que se aproxima a la del hueso natural [46]. Sin embargo, cuando se le aplicó un esfuerzo cortante el composite actúa como un material blando que puede ser fácilmente procesado y manipulado. La pasta termoplástica se ha caracterizado por NMR, HPSEC y MALDI‐TOF. Estos resultados demuestran que el polímero es un poliéster con bajo peso molecular y con una baja
polidispersividad. El peso molecular depende del tiempo de reacción y del monómero utilizado en la reacción.
En el espectro obtenido de la resonancia magnética nuclear (figura 3.9) se muestran los principales grupos característicos: el enlace éster del ácido glutárico, con el 1,8 octanodiol (pico 4.07‐4,04), que demuestra que el primer bloque, que será el segmento duro, se ha sintetizado correctamente; el grupo éter (pico 3,59), perteneciente al PEG y el grupo éster, unido al polietilenglicol (pico 4,19), como seña de la formación del segmento blando con el segmento duro (Figura 3.9).
Si comparamos con el espectro obtenido con el prepolímero, se puede ver como ya en este existe la formación de un grupo poliéster, que sería el bloque duro, mediante el enlace entre el ácido glutárico y el 1,8 octanodiol. Mientras que en el del polímero completo, se muestra el enlace con el polietilenglicol.
Figura 3.9 Espectro de RMN del prepolímero (a) y del polímero final (b)
En el análisis por HPSEC (High Pressure Size Exclusion Chromatography) se analizó la evolución de los pesos moleculares, teniendo en cuenta los diferentes tiempos de reacción (Tabla 3.3 ) Además, la comparación entre el prepolímero y el polímero completo con el Polietilenglicol (Figura 3.10)
Figura 3.10 Resultados del GPC realizado a los polímeros de la primera sección y al polímero final en comparación con los patrones que se utilizaron (poliestireno monodisperso de PM 6000 y PEG 2000.
Tabla 3.3: Resultados de los pesos moleculares Mn y Mw y la polidispersidad de los prepolímeros (ácido glutárico más 1,8 octanodiol) y los poliméros finales (prepolímero más polietilenglicol) Mn Mw Polidispersidad T3 3644 8397 2,304 T4 3716 7624 2,051 T5 3796 7422 1,955 T6 3875 7462 1,926 T7 4032 7510 1,863 T8 3841 7353 1,914 T8T1 2938 6666 2,269 T8T2 3396 6660 1,961 T8T5 3142 6849 2,180 T8T8 3700 7111 1,922
En la Tabla 3.3 se resumen los principales pesos moleculares obtenidos mediante HPSEC (High Pressure Size Exclusion Chromatography) en los diferentes tiempos de reacción, tanto para la primera etapa como para la segunda etapa de reacción. La polidisperidad indica el grado de variación o amplitud de una campana gausiana que representa los pesos moleculares de un polímero. Se representa por la división del peso molecular promedio en masa, con respecto al peso molecular promedio en número: 𝑃𝐷𝐼 = 𝑀!/𝑀! 𝑀! = Σ𝑀! · 𝑁! Σ𝑁! · 𝑀! = Σ𝑀!!· 𝑁 ! Σ𝑀!𝑁! = Σ𝑀!!𝑁 ! Σ𝑀!!𝑁 !, 𝑀! = Σ𝑀!!!!𝑁 ! Σ𝑀! 𝑁! ! !
Los polímeros, a diferencia de los compuestos de bajo peso molecular, no tienen un peso molecular único, sino que poseen una distribución de pesos moleculares. Este hecho complica el estudio de la física de los polímeros, que tiene que ser estadística. Por ello, se utiliza el peso molecular promedio. Sin embargo, el promedio de pesos moleculares puede representar o incluir pesos muy distintos.
Cabe destacar que los resultados obtenidos para los prepolímeros poseen, según este análisis, un mayor peso molecular que los polímeros completos y, dentro de cada una de las etapas a mayor tiempo de reacción, mayor peso molecular, excepto en los últimos, sugiriendo que llegados a un punto, las cadenas poliméricas en lugar de crecer se comienzan a destruir por efecto de las microondas.
Para realizar un análisis de la evolución de los pesos moleculares, se llevó a cabo a un análisis mediante MALDI‐TOF, con que se puede obtener un estudio de los pesos moleculares mucho más preciso. El análisis de los polímeros se realizó a diferentes relaciones entre el ácido glutárico y el octanodiol (Tabla 3.4). Tabla 3.4: Relación molar entre el ácido glutárico y el 1,8 octanodiol en cada uno de los prepolímeros utilizados en los análisis con respecto al PEG. Polímero Relación molar del ácido glutárico y el 1,8‐Octanodiol con el PEG 1 1,2 2 1,4 3 1,4 (Peg 1500) 4 1,1 5 1,0 En los espectros de masa del MALDI‐TOF obtenidos de los compuestos, se puede ver un pico principal de intensidad en todos ellos, en la repetición de unidades másicas del ácido glutárico y del 1,8 octanodiol menos dos moléculas de agua (m/z)= 242.35) (Figura 3.11).
La Figura 3.12 muestran la presencia de una gran cantidad de picos, lo cual puede ser atribuido al PEG. Los picos principales de intensidad se observan en la repetición de la unidad másica del intervalo C2H4O (m/z = 44). El espectro másico del MALDI‐TOF de los polímeros 1,
2, 4 y 5 tienen una distribución molecular con el centro alrededor del m/z = 2000, correspondiente con el valor del PEG usado (Mw=2000). El espectro del MALDI‐TOF del polímero 3 tiene una distribución del peso molecular con el centro alrededor de los 15000, correspondiente al PEG utilizado (Figura 3.12, Figura 3.13). Figura 3.11 Segmento Duro, ácido glutárico con el 1,8‐Octanodiol.
Figura 3.13 espectro másico de los polímeros 4 y 5
Con estos resultados se puede ver que tenemos un polímero de cadena corta de un peso molecular de entre 3000 y 4000, cuya masa principal reside entorno al PEG. Esta composición
permite al material una ordenación de las cadenas, como se ha visto anteriormente en la Figura 3.8 , cuando se aplica un esfuerzo superior a las fuerzas débiles ejercidas en sus bloque duro.
Una vez caracterizado químicamente el material, se realizó al análisis mecánico del mismo. Para ello, se realizaron diferentes experimentos de reometría, intentando caracterizar el comportamiento del composite. El primer análisis que se realizó fue un estudio de la reología de une pasta compuesta por el polímero y la biocerámica en relación 1:0.75. La curva que muestra el material es de un polímero tixotrópico, ya que, a medida que se le aplica un esfuerzo la velocidad de flujo aumenta. Además, ante un esfuerzo constante, la velocidad de flujo también asciende. Cuando se disminuye este esfuerzo, el material vuelve a su estado original, confirmando de esta forma que el material del que disponemos tiene una estructura apropiada para el fin que se busca (Figura 3.14) Figura 3.14 Gráfico de Shear Stress Vs Shear Rate del Composite 1:0.75 El composite está formado, como se ha comentado con anterioridad, por dos componentes, un polímero biodegradable y un material biocerámico. La relación de cada uno de ellos influye en la regulación de las propiedades mecánicas del material. Así, al aumentar la cantidad de hidroxiapatita en relación con el polímero, la resistencia al esfuerzo cortante aumenta a medida que aumentamos la cantidad de biocerámica, de tal forma que cuando la pasta está
compuesta por una relación polímero‐biocerámica de 1:0.25 el esfuerzo que hay que aplicar para que comience a fluir es de aproximadamente 0,6 MPa. Mientras que cuando la relación aumenta a 1:1 la resistencia será de 1,6 MPa (Figura 3.15). Todos los gráficos han sido obtenidos a 37°C, lo cual nos da idea de las características del material una vez ha sido implantado.
Figura 3.15 Comparación entre tres composites diferentes, en función de la cantidad de hidroxiapatita que posee cada uno.
Conforme a los resultados obtenidos de reometría, se puede ver en la Figura 3.16 como el biomaterial es perfectamente adaptable a las diferentes superficies que se pudieran encontrar al ser implantado. 0 500 1000 1500 2000 2500 3000
0,00E+00 1,00E+00 2,00E+00 3,00E+00 4,00E+00 5,00E+00
Shear stress [Pa] Shear rate [1/s]
Comparativa Pastas
Pasta 125 Pasta 1:1 Polímero
Figura 3.16: Adaptación del composite a diferentes zonas
La caracterización mecánica del composite se realizó en función de la relación entre el ácido glutárico y el 1,8 octanodiol. En primer lugar, se realizó un análisis de velocidad de flujo vs esfuerzo aplicado, que mostró el comportamiento del material (Figura 3.17 y Figura 3.18). La reducción de la viscosidad es una consecuencia del peso molecular del polímero, debido a que se desenmaraña y se orienta durante el proceso de flujo. En el caso del polímero 3, el límite de fluencia que muestra es mucho más bajo que es del resto de polímeros, lo cual es debido a que se utilizó PEG 1500 durante la síntesis en lugar del PEG 2000. A medida que aumenta el ratio molar entre el ácido glutárico y el 1,8‐octanodiol, el esfuerzo de cizalla al cual comienza a fluir (límite de fluencia) también aumenta Tabla 3.5.
Figura 3.18 Gráficos de Esfuerzo vs Velocidad de flujo para diferentes polímeros
Tabla 3.5: Resultados para los diferentes polímeros de los esfuerzos cortantes.
Alrededor de una cierta temperatura todos los sistemas poliméricos sufren un cambio de un estado sólido a un estado fluido (Figura 3.19, Figura 3.20) (componente viscosa vs componente elástica). La temperatura alrededor de la cual este cambio ocurre se resume en la Tabla 3.6 Tabla 3.6: Resultados de la temperatura de cambio de componente viscosa a componente elástica para los diferents polímeros. Polímero Temperatura (°C) 1 40 2 35 3 30 4 25 5 30 Polímero Esfuerzo Cortante (Pa) 1 1500 2 1300 3 600 4 1200 5 800
Figura 3.20 Resultados de G’ y G’’ Vs Temperatura de los polímeros 4 y 5.
En los valores de los polímeros 1, 2, 3, 4 y 5, cuando la relación molar entre el ácido glutárico y el 1,8‐octanodiol se incrementa, la temperatura a la cual el cambio ocurre también se incrementa (Polímero 1, 2 muestran un valor más alto que los polímeros 4 y 5). Esto puede ser debido al efecto de la relación molar existente entre los monómeros, ya que, al haber más cantidad de ácido glutárico, será más fácil que las cadenas se unan y así tener cadenas poliméricas más largas. La longitud de la cadena en este caso es directamente proporcional a
Figura 3.21 G’ y G’’ Vs Frecuencia para los polímeros 1,2 y 3. La componente elástica G’ domina sobre G’’, excepto en el polímero 3 donde se utilizó un PEG de peso molecular 1500, donde G’’ domina sobre G’.
Figura 3.22 G’ y G’’ Vs Frecuencia para los polímeros 4 y 5
En la Figura 3.21 y en la Figura 3.22 G’ domina sobre G’’: El polímero no puede relajar tan rápidamente y tiene una alta elasticidad. El comportamiento es típico de polímeros elásticos. Solo en la caso del polímero 3, con PEG 1500, G’’ domina sobre G’, lo que indica una mayor componente viscosa para este composite, por efecto del menor peso molecular o de las cadenas más cortas.
El material ha sido caracterizado mecánicamente y se ha visto su comportamiento en función de las diferentes variables que se introduzcan en el sistema. Existen varias aplicaciones para este composite, una de las cuales podría ser la de bioadhesivo. Para ello, se analizará su comportamiento en la unión intestinal.
Los resultado para la carga máxima se muestran en la figura 3.23. El polímero por sí solo tienen una carga máxima de 1,55±0.31 N, el polímero con una carga de 15% de biocerámica, tiene una carga máxima de 0,89±0.17 N y, el polímero con un 35% de componente cerámico, tiene una carga máxima de 2,22±1.21 N. Figura 3.23 Comportamiento de los composites en función de la cantidad de carga que tienen al ser adheridos a los spines. Los resultados no muestran una tendencia en función de la cantidad de cerámica utilizada, lo cual implica que el método utilizado podría no ser el óptimo para el objetivo del mismo. También, los resultados obtenidos presentan mucha variabilidad.
Para determinar si el pin metálico está afectando a los resultados, se realizó un segundo experimento en el que se utilizó un trozo de intestino de rata que se pegó sobre los pines. Sobre estos tejidos se añadieron 3 tipos diferentes de composite con cantidades diferentes de biocerámica. Los resultados se muestran en la Figura 3.24.
El intento muestra para los tres diferentes materiales que, cuando aplicamos el material sobre el tejido, es similar a los resultados cuando se aplica directamente sobre el spin. Sin embargo,
cuando aplicamos el material sobre el tejido, la adhesión desciende un 80%. También, el hecho de que los resultados son más bajos en valor, estrecha la ventana de resultados, haciendo que no sean estadísticamente diferentes, cuando se considera la desviación standard. Sin embargo, este tipo de resultados, junto con una alta desviación estándar, es típica de este tipo de experimentos, debido entre otras cosas a la diferencia entre los diferentes trozos de intestino animal.
Figura 3.24: Comportamiento de los tres polímeros en función del porcentaje de carga que tienen. El experimento se realizo adheriendo el composite a muestras de intestino.
Por último, y tras ver la aplicación in vitro del material, tanto como adhesivo como composite, estructural inyectable, se llevaron a cabo pruebas in vivo para validar la tecnología y la biocompatibilidad del composite, realizando de esta forma testeos de biodegradación in vivo mediante biodegradación enzimática. Las pruebas in vivo se realizaron en el Karolinska Institute de la mano del Dr. Ion.Tcaneau del grupo del Dr. Mikael Wendel del Centre for Oral Biology (COB). Se realizaron unos implantes en unos defectos calvarios originados en ratas. La importancia del estudio radica en ver la toxicidad del material al ser implantado in vivo y su correspondiente biodegradación. El material se dejó durante 12 semanas viendo la evolución que iba sufriendo el animal. Transcurrido el tiempo, se realizaron los cortes histológicos y se realizaron las tinciones con hematoxilin‐eosina. Lo que se pudo ver fue que el material había sido eliminado en su totalidad, siendo reabsorbido por el animal, sin mostrar ningún tipo de reacción negativa (Figura 3.25)
Figura 3.25 Imagen de la tinción con Hematoxilin‐Eosina del defecto calvario con el composite, transcurridos las 12 semanas
3.5 DISCUSIÓN.
Tras realizar todas las pruebas de caracterización del composite se puede ver que la reología tixotrópica es la principal característica del mismo. Esta característica confiere la ventaja de permitir una perfecta adaptación a la superficie a tratar. Los elementos que confieren esta ventaja le dan al material el aspecto y la consistencia de una pasta moldeable por acción de fuerzas mecánicas y calóricas. Otra ventaja característica del composite es su biocompatibilidad, demostrada mediante los implantes in vivo, donde no se observó ninguna complicación toxicológica y una perfecta integración en el animal. La pasta termoplástica es biocompatible porque es bien tolerada por el organismo al cual se incorpora. Esta ventaja viene dada por la naturaleza de sus componentes: el polímero en bloque está compuesto por dos tipos de biopolímeros, rígido y flexible, ambos degradables, reabsorbibles y asimilables por los organismos vivos. Así mismo, la biocerámica es también reabsorbible, asimilable y biodegradable.
El biopolímero que constituye el bloque rígido es un heteropolímero compuesto por ácido glutárico y 1,8‐octanodiol, aunque se pueden utilizar otro ácidos o dioles como por ejemplo caprolactona, ácido láctico, ácido glicólico, ácido fumárico y sus mezclas (Figura 3.26). También es posible añadir grupos amino, para enlazar con el glutárico, lo cual daría una mayor dureza gracias a los enlaces amídicos producidos a través de los puentes de hidrógeno formados (Figura 3.27)
Figura 3.26 Esquema de la composición de los segmentos duros y blandos en el composite.
El bloque flexible está formado por polímeros de óxido de etileno, concretamente polietilenglicol (PEG). Aunque la pasta termoplástica puede albergar cualquier biopolímero con un número suficiente de radicales hidroxilo libres de manera que éstos sean capaces de formar puentes de hidrógeno con la cerámica. En ingeniería tisular este composite sería de mucha utilidad al añadir constituyentes minoritarios para conseguir efectos terapéuticos o cosméticos apropiados para cada caso. Entre ellos, se pueden encontrar compuestos citotóxicos; factores de crecimiento o diferenciación celular; compuestos antivirales, antibióticos y antifúngicos; partículas portadoras de ácidos nucleicos destinados a modificar la expresión celular de elementos genéticos intrínsecos o extrínsecos al tejido, elementos nutritivos y acondicionadores, como aceites cosméticos, y combinaciones de todos ellos. Por ejemplo, el composite puede ser cargado con diferentes compuestos, como puede ser el ácido hialurónico, el cual resulta altamente compatible con el tejido nervioso, epitelial y conectivo y es un promotor de la proliferación y la migración celular [47, 48]. El composite resultante tendría efectos citotóxicos para el tratamiento de lesiones producidas por un crecimiento celular desproporcionado, como por ejemplo tumores.
El composite está dominado por el efecto de las fuerzas de atracción que se producen en el segmento duro, que, al aplicar un esfuerzo cortante, van desapareciendo y perdiendo la componente elástica del polímero. Al añadir otros monómeros en la segmento duro, como
pueden ser los grupos amino, que forma enlaces amídicos, se varían las propiedades mecánicas del material gracias a la aparición de nuevas fuerzas de atracción con mayor intensidad (Figura 3.27). Figura 3.27 Efecto de las fuerzas de atracción que se producen en el segmento duro del composite. Se puede ver que el cambio de un monómero permite el endurecimiento gracias a las fuerzas de atracción mayores que provocan por ejemplo los grupos amino.
La biocerámica se encuentra particulada y está distribuída de manera homogénea en la ultraestructura de la pasta. Cuanto más uniforme sea la distribución de las partículas de biocerámica, más uniforme serán las propiedades del material y más predecible su comportamiento en cada aplicación práctica. Dentro de la gran cantidad de biocerámicas se escogió la hidroxiapatita (HA) como componente particulado del composite. La HA es el componente mineral del hueso natural y es ampliamente utilizado en la regeneración ósea. Otra biocerámica que también puede ser utilizada es el bioglass [49]. El bioglass es una cerámica no cristalina altamente biocompatible.
Viendo las amplias características del material y, por tanto, sus variadas aplicaciones el composite fue patentado en la Oficina Española de patentes y Marcas y también se ha presentado la solicitud PCT, que a la hora de realizar este escrito está concedida y en fases regionales de Europa, EEUU, Canada y Japón. El composite recibió el nombre comercial de Biotack simulando un blue‐tack biodegradable.
El Biotack tiene propiedades adhesivas, aunque no parezca que depende en gran medida de la cantidad de biocerámica que contiene a bajas concentraciones. Sin embargo, parece que con una alta cantidad de componente cerámico (35%) la adhesión del material mejora
notablemente. Por lo que se estima que, a mayores concentraciones de éste, las capacidades adhesivas mejoraraá notablemente.
El resultado del material utilizado sobre tejido tiene valores entre 0.227 y 0.317N. Los valores típicos de carga máxima al fallo de adhesivos para propuestos médicos son de entre 0.2 N para la fibrina y de 0.7 N para el cianoacrilato. Mientras que la fibrina es un adhesivo altamente biocompatible, sus propiedades de adhesión son extremadamente pobres. Por contrapartida, el cianoacrilato, tiene tal fuerza de adhesión, que daña los tejidos donde es aplicado. En la Tabla 3.7 se resumen los principales adhesivos utilizados en medicina. Todos ellos para ser perfectamente adaptables a las zonas donde se implantarán han de estar en estado líquido antes de la implantación y posteriormente, por diferentes métodos, ha de realizarse el curado y así solidificar para obtener la acción sellante. En la tabla Tabla 3.7 también se pueden ver los principales métodos de curado de cada uno de los productos. El gran problema que reside en todos ellos es que son materiales que requieren una manipulación para poder ser utilizados, lo que complica la forma de uso. Por ello, la necesidad de buscar un adhesivo intermedio que además sea fácil de utilizar como biosellante tiene una alta importancia. El biotack tiene una fuerza de adhesión en el rango anteriormente escrito, lo cual lo convierte en un material apropiado para fines médicos. El material que posee una cantidad de 15% de cerámica, está muy cerca del “fibrin glue”, por lo que su adhesión no es especialmente fuerte. Sin embargo, el polímero con una cantidad de cerámica del 35% tiene mejores propiedades, mostrando una mayor fuerza de adhesión que los otros dos materiales. Tabla 3.7: Resultados de la temperatura de cambio de componente viscosa a componente elástica para los diferents polímeros.
El biotack se puede utilizar como adhesivo gracias a que se inyecta en estado fluido por estar a una temperatura de 45°C, y de esta forma se acopla o adapta a todas las imperfecciones del hueso (Figura 3.28). A la temperatura del cuerpo, 37°C, después de la inyección, se endurece el material volviendo a su estado original, y obeniendo las propiedades necesarias para actuar como adhesivo.
Por otro lado, la composición de la cadena polimérica hace que se produzcan interacciones entre el componente del hueso y los grupos hidroxilo de la cadena principal, al igual que se produce en materiales adhesivos utilizados en medicina como el poliacrilato (Figura 3.29). Figura 3.28 Esquema de colocación del composite y de su funcionamiento en la adhesión de dos huesos fracturados. Figura 3.29 Interacciones que se producen entre el poliacrilato y las partículas de cálcio en el uso como adhesivo médico
Por lo tanto, el material tiene unas buenas propiedades para ser usado como bioadhesivo, según la fuerza de adhesión que se muestra en los test mecánicos. En todos los análisis realizados con anterioridad, al aumentar la cantidad de cerámica presente en el polímero se CH2 CH CH2 CH CH2 CH CH2 CH C OH O C OH O C OH O CH2 CH CH2 CH CH3 C OH O C OH O C OH O CH CH2 CH CH2 CH CH2 CH C C C C HO O HO O HO O HO O Zn Ca Ca Ca
que podrá ser utilizado en todos los rango que sean necesarios y para cada uno de los tejidos, añadiendo, además, las capacidad regeneradora del propio material incluyendo en el mismo diferentes factores de crecimiento que puedan ser de interese en función el tejido a reparar.
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