de la respuesta al tratamiento del cáncer de colon

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PROGRAMA DE DOCTORADO EN BIOMEDICINA

TESIS DOCTORAL

Desarrollo de nuevas nanoplataformas funcionalizadas asociadas a 5-fluorouracilo como estrategia para la mejora

de la respuesta al tratamiento del cáncer de colon

Memoria presentada por Dña. Beatriz García Pinel para optar al grado de Doctora por la Universidad de Granada Granada, 24 de Octubre de 2021

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Editor: Universidad de Granada. Tesis Doctorales Autor: Beatriz García Pinel

ISBN: 978-84-1117-194-6

URI: http://hdl.handle.net/10481/72071

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Melguizo Alonso y José Carlos Prados Salazar]

Garantizamos, al firmar esta tesis doctoral, que el trabajo ha sido realizado por el doctorando bajo la dirección de los directores de la tesis y hasta donde nuestro conocimiento alcanza, en la realización del trabajo, se han respetado los derechos de otros autores a ser citados, cuando se han utilizado sus resultados o publicaciones.

/

Guarantee, by signing this doctoral thesis, that the work has been done by the doctoral candidate under the direction of the thesis supervisor/s and, as far as our knowledge reaches, in the performance of the work, the rights of other authors to be cited (when their results or publications have been used) have been respected.

Lugar y fecha / Place and date:

Granada, 24 de Octubre de 2021 Director/es de la Tesis / Thesis

supervisor/s; Doctorando / Doctoral candidate:

Firma / Signed Firma / Signed

Consolación Melguizo Alonso Beatriz García Pinel

Firma / Signed José Carlos Prados Salazar

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desarrollo de esta Tesis Doctoral han dado lugar a la publicación de tres artículos cuyos indicios de calidad son:

 Jabalera, Y.; Garcia-Pinel, B.; Ortiz, R.; Iglesias, G.; Cabeza, L.; Prados, J.;

Jimenez-Lopez, C.; Melguizo, C. Oxaliplatin–Biomimetic Magnetic Nanoparticle Assemblies for Colon Cancer-Targeted Chemotherapy: An In Vitro Study. Pharmaceutics 2019, 11, 395.

doi:10.3390/pharmaceutics11080395 Indicios de Calidad:

Datos del Journal Citation Reports o Impact Factor: 4.421 (2019)

o Categorías (incluyendo el Nº de revistas y posición):

PHARMACOLOGY & PHARMACY – SCIE; 270 revistas, posición 44.

o Cuartil: Q1

o Número de citas recibidas: 12

 Garcia-Pinel, B.; Jabalera, Y.; Ortiz, R.; Cabeza, L.; Jimenez-Lopez, C.;

Melguizo, C.; Prados, J. Biomimetic Magnetoliposomes as Oxaliplatin Nanocarriers: In Vitro Study for Potential Application in Colon Cancer. Pharmaceutics 2020, 12, 589.

doi:10.3390/pharmaceutics12060589 Indicios de Calidad:

PHARMACOLOGY & PHARMACY – SCIE; 275 revistas, posición 28.

o Cuartil: Q1

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Francisco Sarabia, José Prados, Juan M. López-Romero & Consolación Melguizo (2020) Magnetically active pNIPAM nanosystems as temperature- sensitive biocompatible structures for controlled drug delivery. Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology, 48:1, 1022-1035, DOI:10.1080/21691401.2020.1773488.

Indicios de Calidad:

BIOTECHNOLOGY & APPLIED MICROBIOLOGY – SCIE; – 159 revistas, posición 25

o Cuartil: Q1

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AGRADECIMIENTOS

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(9)

Índice

(10)

(11)

Resumen ... 23

Summary ... 29

Capítulo 1. Introducción ... 35

1.1. El cáncer: generalidades ... 37

1.1.1. Carcinogénesis y características de las células tumorales ... 39

1.2. Cáncer colorrectal ... 41

1.2.1. Incidencia, mortalidad y supervivencia ... 41

1.2.2. Etiología y factores de riesgo ... 42

1.2.3. Clasificación del cáncer colorrectal ... 44

1.2.4. Clínica y Diagnóstico del cáncer colorrectal ... 51

1.2.5. Tratamiento del cáncer colorrectal ... 54

1.3. Nanomedicina aplicada al cáncer ... 72

1.3.1. Ventajas de las nanoformulaciones en el tratamiento del cáncer ... 72

1.3.2. Características de las nanoformulaciones ... 73

1.3.3. Tipos de nanoformulaciones ... 79

1.4. Referencias ... 96

Capítulo 2.Objetivos ... 103

Capítulo 3. Magnetically active pNIPAM nanosystems as temperature- sensitive biocompatible structures for controlled drug delivery ... 107

3.1. Introduction ... 109

3.2. Materials y methods ... 113

3.2.1. Materials ... 113

3.2.2. Characterization ... 113

3.2.3. Preparation of pNIPAM nanoparticles (pNIPAM@) ... 113

3.2.4. Preparation of pNIPAM-co-3BA@, pNIPAM-co-AA@ and pNIPAM-co-AL@ co-polymeric nanoparticles ... 115

(12)

3.2.6. Functionalization of magnetic nanoparticles with 3-butenoic

acid (@Fe3O4-3BA) or acrylic acid (@Fe3O4-AA) ... 116

3.2.7. Preparation of hybrid pNIPAM magnetic systems: pNIPAM@Fe3O4-3BA, pNIPAM@Fe3O4-AA and pNIPAMco- AL@Fe3O4-AA ... 116

3.2.8. Incorporation of FITC fluorescent marker to pNIPAM-co- AL@Fe3O4-AA nanoparticles ... 117

3.2.9. Drug encapsulation into pNIPAM systems: 5-fluorouracil and oxaliplatin ... 117

3.2.10. In vitro drug release ... 118

3.2.11. Proliferation assay ... 119

3.2.12. Hemocompatibility assays ... 119

3.2.13. Application of magnetic fields in vitro ... 119

3.3. Results y discussion ... 120

3.3.1 pNIPAM@ systems... 120

3.3.2. Magnetic pNIPAM systems ... 122

3.3.3. Encapsulation of 5-fluorouracil and oxaliplatin ... 130

3.3.4. In vitro 5-fluorouracil and oxaliplatin release ... 130

3.3.5. Cytotoxicity and biocompatibility of blank nanoparticles ... 131

3.3.6. Proliferation studies of the drugs-loaded pNIPAM@ nanosystems ... 134

3.3.7. Cell migration under a magnetic field in vitro ... 135

3.4. Conclusions ... 136

3.5. Supplementary material ... 137

3.6. Referencias... 138

Capítulo 4. Oxaliplatin–Biomimetic Magnetic Nanoparticle Assemblies for Colon Cancer-Targeted Chemotherapy: An In Vitro Study ... 141

(13)

4.2.1. Expression and purification of MamC and synthesis of BMNPs

... 147

4.2.2. Nanoparticles characterization ... 148

4.2.3. Oxa-BMNPs nanoassemblies ... 148

4.2.4. Cell Culturing ... 151

4.2.5. In vitro proliferation assays ... 151

4.2.6. Blood cells compatibility of MamC mediated magnetite nanoparticles ... 152

4.2.7. Internalization and functionality tests of BMNPs ... 154

4.2.8. Statistical Analysis ... 155

4.3. Results... 155

4.3.1. BMNPs and Oxa-BMNPs nanoassemblies ... 155

4.3.2. In vitro proliferation assays ... 158

4.3.3. BMNPs internalization ... 161

4.3.4. Cell Migration under a magnetic field in vitro ... 162

4.3.5. BMNPs biocompatibility in blood cells. ... 163

4.4. Discussion ... 165

4.5. Conclusions ... 170

4.7. References ... 172

Capítulo 5. Biomimetic Magnetoliposomes as Oxaliplatin Nanocarriers: In Vitro Study for Potential Application in Colon Cancer ... 177

5.2. Material and Methods ... 182

5.2.1. Preparation of Oxa-BMNP Nanoassemblies ... 182

5.2.2. Preparation of BMLs and Oxa-BMLs ... 183

5.2.3. Characterization of Magnetoliposomes... 185

(14)

... 186

5.2.6. In Vitro Proliferation Assays ... 187

5.2.7. Cell Uptake and Intracellular Location of BMLs and IMLs ... 188

5.2.8. Statistical Analysis ... 189

5.3. Results ... 189

5.3.1. Characterization of the Nanoformulations ... 189

5.3.2. BMLs and IMLs Biocompatibility in Blood Cells. ... 191

5.3.3. In Vitro Proliferation Assays ... 194

5.3.4. Cell Migration under a Magnetic Field In Vitro ... 198

5.3.5. BMLs Internalization in Colon Cell Lines ... 199

5.4. Discussion... 201

5.5. Conclusions ... 205

5.7. References ... 208

Capítulo 6.Conclusiones Generales ... 213

Capítulo 7. General Conclusions ... 217

ANEXO ... 221

(15)

Abreviaturas

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(17)

17 3_________________________

3BA: 3-butenoic acid.

5__________________________

5,10-CH2-THF: 5,10- Metilentetrahidrofolato.

5-dFUR: 5’-deoxy-5-fluorouridine.

5-FU: 5-Fluorouracilo.

A_________________________

AA: Acrylic acid.

ACT: Adoptive cell transfer, transferencia de células adoptivas.

ADN: Ácido desoxirribonucleico.

Aes: Adverse effects.

AJCC: American Joint Committee on Cancer.

AL: Allylamide.

ALT: Aminotransferasa sérica.

APC: Gen Adenomatous polyposis coli.

ARN: Ácido ribonucleico.

ATCC: American Type Culture Collection.

AuNPs: NPs de oro.

B__________________________

BIS: N,N’-methylenebisacrylamide BMLs: Biomimetic magnetosomes.

BMNPs: Biomimetic magnetic nanoparticles.

BRAF: Gen que codifica la proteína B-Raf

C_________________________

CAPOX: Régimen quimioterapico basado en Capecitabina+OXA.

CIMP: CpG Island Methylator

Phenotype; Fenotipo metilador de islas CpG.

CCK-8: Cell Counting Kit-8.

CCM: Cáncer colorrectal metastásico.

CMC: Critical micellar concentration;

concentración micelar crítica.

CP: Corona proteica.

CRC ó CCR: Colorectal cancer;

cáncer colorrectal.

CTAB: Hexadecyl trimethyl ammonium bromide.

CTLA-4: Cytotoxic T-lymphocyte- associated antigen 4, antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos.

CTC: Computed tomographic colonography, colonografía por tomografía computarizada.

D_________________________

DDS: Drug delivery systems; sistemas de administración de fármacos.

DLS: Dynamic light scattering.

DMEM: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium.

DMSO: Dimetilsulfóxido.

DR: Release efficiency.

DRG: Dorsal root ganglia; ganglios de las raíces dorsales.

DSPE-PEG: 1,2-distearoyl-sn- glycerol-3-phosphoethanolamine-N [methoxy (poly-ethyleneglycol)-2000].

dTMP: Desoxitimidina monofosfato ó 5'timidilato.

dTTP: Desoxitimidina 5'-trifosfato.

dUMP: Desoxiuridilato.

E__________________________

EE%: Encapsulation efficiency.

EELS: Electron energy loss spectroscopy.

(18)

EGFR: Epidermal growth factor receptor; receptor del factor de crecimiento epidérmico.

EMA: European Medicines Agency;

Agencia Europea de Medicamentos.

EPCAM: Gen que codifica la proteína EPCAM (epithelial cell adhesion molecule).

EPR: Enhanced permeability and retention effect; Efecto de

permeabilidad y retención mejorada.

F__________________________

FBAL: α-fluoro-β-alanina.

FBS: Fetal bovine serum.

FDA: Food and Drug Administration;

Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos.

FdUMP: Fluorodeoxiuridina monofosfato.

FdUTP: Fluorodeoxiuridina trifosfato.

FIT: Fecal immunochemical test, prueba inmunoquímica fecal.

FITC: Fluorescein isothiocyanate isomer I.

FLOX: Floxuridine.

FOLFIRI: Régimen quimioterapico basado en 5-FU/LV + IRI.

FOLFOX: Régimen quimioterapico basado en 5-FU/LV + OXA.

FPLC: Fast Protein Liquid Chromatography.

FUDR: Fluorodeoxiuridina.

FUDR: Floxuridina, fluorodeoxiuridina.

FUOX: Régimen quimioterapico basado en 5-FU+OXA.

FUTP: Fluorouridina trifosfato.

G_________________________

gFOBT: Guaiac-based fecal occult blood test; prueba de sangre oculta en heces a base de guayacol.

H_________________________

HEPES: 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid.

HER2: Human Epidermal Growth Factor Receptor 2, Receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano.

HIF-1α: Hypoxia-inducible factor 1 alpha; factor 1 alpha inducible por hipoxia.

HIFU: High-intensity focused ultrasound; ultrasonidos de alta intensidad.

HNPCC: Hereditary nonpolyposis colorectal cancer; cáncer colorrectal hereditario no asociado a poliposis o síndrome de Lynch.

HNR: Hiperplasia nodular regenerativa

HR: Hemolysis ratio.

I__________________________

I.V.: Intravenoso.

IC50: Inhibitory concentration 50%;

concentración inhibitoria al 50%.

ICIs: Immune checkpoint inhibitors, inhibidores de puntos de control inmunológico.

IMAC: Immobilized metal affinity chromatography.

IMLs: Inorganic magnetoliposomes IMS: Inestabilidad microsatelital.

IMS-A: Inestabilidad microsatelital alta.

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19 IONPs: Iron oxide NPs; NPs de

óxidos de hierro.

IPTG: Isopropyl-1-thio-β-D- galactopyranoside.

IRI: Irinotecan.

K_________________________

KLF: LF affinity constant.

KRAS: Gen que codifica la proteína K-RAS.

L_________________________

LCST: Lower critical solution temperature.

LIFU: Low-intensity focused ultrasound; ultrasonidos de baja intensidad.

LV: Leucovorin; leucovorine.

M_________________________

MDR: Multidrug resistence;

resistencia a múltiples fármacos.

MF: Multifarmacológicos.

MFS: Mononuclear phagocytic system; sistema fagocítico mononuclear.

MLH1: Gen MutL Homolog 1.

MNPs: Magnetic NPs; NPs magnéticas.

MP: Micela polimérica.

MSH2: Gen que codifica la proteína MSH2.

MSH6: Gen que codifica la proteína MSH6.

MUTYH: Gen MutY DNA Glycosylase.

N_________________________

NLC: Nanostructured lipid carriers;

transportadores lipídicos nanoestructurados.

NRAS: Gen que codifica la proteína N-RAS.

NSCLC: Non-small cell lung cancer.

NTRK: Neurotrophic tropomyosin or tyrosine receptor kinase, receptor de la tropomiosina neurotrófica o tirosina quinasa.

O_________________________

OXA: Oxalato-(trans-l-1,2- ciclohexanodiamina)-platino(II).

P__________________________

PAF: Poliposis adenomatosa familiar.

PBS: Phosphate buffered saline.

PD-1: Programmed cell death protein 1; proteína de muerte celular

programada 1.

PEG: Polietilenglicol.

pI: Punto isoeléctrico.

PMS2: Gen que codifica la proteína PMS2.

pNIPAM: poly(N-

Isopropylacrylamide); poli(N- Isopropilacrilamida).

p(NIPAM-co-DMA: poly(N,N- (dimethylamino)ethyl methacrylate.

PQs: Quantum dots; puntos cuánticos.

PTX: Paclitaxel.

PZ: Potencial zeta.

Q_________________________

QMF: Quimioterapia multi- farmacológica.

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R_________________________

r: Cooperativity coefficient.

RES: Reticuloendothelial system;

sistema reticuloendotelial.

ROS: Reactive oxygen species;

especies reactivas de oxígeno.

S__________________________

SCNA: Somatic copy number alterations; alteraciones del número de copias somáticas.

SD: Standards deviation.

SDS-PAGE: Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis;

electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico.

SLN: Solid lipid NPs; Nps lipídicas sólidas.

SPSS: Statistical Package for the Social Sciences.

SQUID: Superconducting quantum interference device.

SRB: Sulforhodamine B.

SSPs: Sessile serrated polyps; pólipos serrados sésiles.

STK11: Gen que codifica la proteína serine/threonine kinase 11.

T__________________________

TB: Blocking temperature.

TCO: Transportadores de cationes orgánicos.

TEM: Transmission Electron Microscopy.

TF/TYMP: Enzima timidilato fosforilasa.

TGF-β: Transforming growth factor β;

factor de crecimiento transformador β.

TMAOH: Tetramethylammonium hydroxide.

TME: Tumor microenviroment;

microambiente tumoral.

TNM: Tumor, ganglio linfático y metástasis.

TQ: Enzima timidina quinasa.

TS/TYMS: Timidilato sintasa.

TSAs: Traditional serrated adenomas;

adenomas serrados tradicionales.

U_________________________

UV: Ultraviolet; ultravioleta.

V_________________________

V50: 2,2’-azobis(2-methylpropion- amidene

VEGF: Vascular Endothelial Growth Factor; factor de crecimiento

endotelial vascular.

VEGFR: Vascular Endothelial Growth Factor Receptor; receptor del factor de crecimiento endotelial vascular.

VPT: Volume phase transition.

W_________________________

WBC: White blood cells.

X_________________________

XRD: X-ray-diffraction.

(21)

21

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Resumen

El cáncer colorrectal (CCR) es el tercer cáncer más frecuente en el mundo y el segundo cáncer más mortal, con aproximadamente 2 millones de nuevos casos y 100.000 fallecimientos en el año 2020. Su presentación es

“asintomática” o con signos clínicos inespecíficos que pueden ser confundidos con otras patologías lo que provoca en muchas ocasiones, a pesar de los cribados realizados para su detección, un diagnóstico tardío. Su tratamiento, en fases tempranas de la enfermedad, se basa en la resección quirúrgica y/o la quimioterapia que incluye la administración del 5- fluorouracilo (5-FU), normalmente coadministrado con leucovorina (LV), el oxaliplatino (OXA) y el irinotecan (IRI), tanto de forma monoterapéutica como en combinación. No obstante, en estadios avanzados de la enfermedad se hace necesario la aplicación de quimioterapia junto a terapia adyuvante o neoadyuvante utilizando anticuerpos monoclonales del tipo de Cetuximab o Bevacizumab. A pesar de la reciente mejora en la supervivencia del CCR gracias a un diagnóstico más precoz a través de los sistemas de cribado y al desarrollo de nuevas terapias como Aflibercept, Ramucirumab, Regorafenib, Panitumumab, Pembrolizumab, entre otros, los numerosos efectos secundarios asociados a los fármacos quimioterápicos, la inespecificidad de los tratamientos y la aparición de quimioresistencia a los mismos, son las principales causas del fracaso en el tratamiento del CCR. Además, la imposibilidad de realizar resección quirúrgica sin límites comprometidos en muchos casos y las bajas tasas de supervivencia a 5 años en estadios avanzados (14.7%) hacen necesario el desarrollo de nuevas herramientas que mejoren la terapia de esta patología.

En este contexto, las nanopartículas (NPs), unos sistemas de pequeño tamaño (1-200nm), con facilidad y versatilidad de síntesis y capaces de encapsular y vehiculizar fármacos, agentes de contraste o genes para el

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tratamiento del cáncer, se presentan como una gran oportunidad para la mejora del pronóstico de esta enfermedad. Estos sistemas han demostrado ser biocompatibles y biodegradables, mejorar la solubilidad de los agentes que vehiculizan y protegerlos de la degradación aumentando su tiempo de circulación en el organismo y, por tanto, el número de moléculas alcanzan el tumor. Además, gracias a su capacidad de funcionalización, las NPs pueden evitar la entrada de su carga en células no tumorales, aumentando la concentración de los fármacos específicamente en el sitio tumoral, pudiendo controlar su liberación y evitando mecanismos de resistencia de los fármacos.

Aquellos nanosistemas que permiten la inclusión de núcleos magnéticos, no solo se benefician de las ventajas generales de las NPs, sino que las mejoran ya que facilitan su direccionamiento mediante un campo magnético, se concentran en el sitio tumoral y permiten la aplicación de hipertermia magnética al ser expuestos a un campo magnético alterno.

En la presente tesis doctoral se han evaluado diferentes nanosistemas para la vehiculización de los agentes 5-FU y el OXA. Las nanoformulaciones utilizadas fueron sintetizadas por el Departamento de Química Orgánica de la Universidad de Málaga bajo la supervisión del Dr. Juan M. López Romero y el Departamento de Microbiología de Universidad de Granada bajo la dirección de la Dra Concepción Jiménez López.

En primer lugar, se estudiaron nanosistemas basados en nanogeles de poli(N-isopropilacrilamida) (pNIPAM). Para mejorar el nivel de encapsulación de fármaco además de la dispersión de las mismas y la adicción de núcleos magnéticos de magnetita (Fe3O4), los nanogeles de pNIPAM se combinaron con otros polímeros como el ácido 3-butenoico (3BA), el ácido acrílico (AA) y la alilamina (AL) a diferentes ratios. Para incorporar núcleos magnéticos correctamente, estos se funcionalizaron con 3BA (@Fe3O4-3BA) y AA (@Fe3O4-AA) y se usaron como semillas para la polimerización de pNIPAM y la combinación de pNIPAM y AL (pNIPAM-co-AL). Del amplio

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abanico de combinaciones posibles, se seleccionaron las siguientes síntesis para ser estudiadas en cultivos celulares: pNIPAM@ (NPs sin núcleo magnético), pNIPAM@Fe3O4-3BA y pNIPAM-co-AL@Fe3O4-AA.

Adicionalmente, se incorporó el colorante fluorescente FITC al sistema pNIPAM-co-AL@Fe3O4-AA (pNIPAM-co-AL-FITC@Fe3O4-AA) para evaluar su capacidad como sistema de visualización y seguimiento. La biocompatibilidad de estas nanoformulaciones sin fármaco fue evaluada tanto en la línea tumoral de CCR T84 como en células sanguíneas humanas obtenidas de donantes sanos. Por un lado, se observó que ninguna de las nanoformulaciones estudiadas causaron toxicidad en la línea T84 ni en las células sanguíneas blancas humanas (WBC) a ninguna de las dosis y tiempos de exposición ensayados. Además, no produjeron la hemolisis de los eritrocitos humanos a excepción de pNIPAM-co-AL@Fe3O4-AA que indujo un ratio de hemolisis del ~6% a dosis elevadas (150 µg/ml). No obstante, ninguna de las nanoformulaciones originó aglutinación ni cambios de la morfología de los eritrocitos. En cuanto a sus propiedades de migración magnética, pNIPAM-co-AL@Fe3O4-AA mostró capacidad de migrar ante un campo magnético externo a dosis bajas (10 µg/ml). Finalmente, las NPs se cargaron con 5-FU (pNIPAM@+5-FU, pNIPAM@Fe3O4-3BA+5-FU, pNIPAM-co-AL@Fe3O4-AA+5-FU y pNIPAM-co-AL-FITC@Fe3O4- AA+5-FU) y OXA (pNIPAM@+OXA y pNIPAM@Fe3O4-3BA+OXA) y se estudió su efecto citotóxico en la línea celular T84. De las NPs estudiadas, pNIPAM@Fe3O4-3BA+5-FU fue la que mostró un mayor efecto citotóxico, similar al producido por el 5-FU en monoterapia.

En segundo lugar, se estudiaron nanoplataformas basadas en núcleos magnéticos biomiméticos. En concreto, estos núcleos magnéticos de Fe3O4

de ~34 nm de diámetro se sintetizaron inorgánicamente mediante la intervención de la proteína asociada a la membrana del magnetosoma (MAPs), MamC, dando lugar a nanopartículas magnéticas biomiméticas

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(BMNPs). Los cristales de Fe3O4 resultantes no solo fueron estructuralmente diferentes a aquellos sintetizados de forma inorgánica sin MamC, sino que además mantuvieron dicha proteína unida de forma covalente a su superficie, aportando por tanto numerosos grupos para la funcionalización de las BMNPs. Para evaluar su biocompatibilidad, se estudió el efecto de las BMNPs en una amplia batería de líneas celulares de colon, células sanguíneas humanas (eritrocitos y WBC) y en la línea murina de macrófagos RAW 264.7. Las BMNPs mostraron una gran biocompatibilidad en líneas celulares tumorales, no obstante, en la línea de colon no tumoral CCD18, se pudo observar toxicidad a partir de 0.5 µg/ml de Fe debido a la sensibilidad de estas líneas a dosis altas de hierro. En cuanto a su hemocompatibilidad, las BMNPs no produjeron un nivel de hemolisis relevante (< 2%) en eritrocitos incluso a dosis muy elevadas de Fe (de 500 µg/ml). Sin embargo, se pudo observar grados crecientes de aglutinación de los mismos al aumentar la dosis. Por otro lado, en WBC y en la línea RAW 264.7, las nanoplataformas causaron una toxicidad dependiente de la dosis a tiempos de exposición cortos (1h), aunque dicha toxicidad se vio revertida transcurridas 12h en el caso de los WBC. El daño severo observado en la línea RAW 264.7, como se ha observado en otros estudios con NPs magnéticas (MNPs), se debe a la generación de altos niveles de estrés oxidativo. La evaluación de la capacidad de internalización de las BMNPs en las líneas celulares T84 y RAW 264.7 mediante Prussian Blue y microscopia electrónica de transmisión (TEM), determinó una internalización creciente dependiente de la dosis. Mediante TEM se determinó que las BMNPs fueron capaces de internalizarse en tan solo 15 min en la línea T84, probablemente mediante endocitosis mediada por clatrina. El estudio de la capacidad de las BMNPs de migrar en respuesta a un campo magnético externo (imán) de cara a un posible direccionamiento magnético in vivo, mostró una migración dependiente de la dosis. Así, se pudo observar que utilizando 100 µg/ml de Fe, prácticamente todas las células migraron hacia el imán. Esta migración no se observó en ausencia del imán.

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Finalmente, las nanoplataformas se cargaron con OXA (Oxa-BMNPs) y se estudió su efecto antiproliferativo en las líneas celulares de colon, pudiendo observarse, en todos los casos, una reducción de la IC50 con respeto a la del OXA administrado de forma libre.

A pesar de su efectividad como sistemas de transporte de fármacos, las BMNPs mostraron algunos aspectos que comprometen su biocompatibilidad, por lo que se procedió a la adición de una cubierta y a la funcionalización de la misma. Las BMNPs y las Oxa-BMNPs se envolvieron por liposomas unilaminares de fosfatidilcolina de 100 nm o de 200nm (BMLs y Oxa-BMLs) y se funcionalizaron con polietilenglicol (PEG) en su superficie (BMLs-PEG y Oxa-BMLs-PEG) para mejorar su estabilidad y dispersión. Aunque las Oxa-BMLs y las Oxa-BMLs-PEG, tanto de 100nm como de 200nm, no mostraron una disminución de la IC50 del OXA libre tan marcada como las Oxa-BMNPs, ambas nanoformulaciones produjeron un efecto similar o mejor que el fármaco libre en todas las líneas estudiadas. No obstante, su biocompatibilidad se vio notablemente mejorada. En este caso, la toxicidad de las nanoformulaciones sin fármaco (BMLs y BMLs-PEG) en la línea CCD18 se vio enormemente reducida, observándose solo una ligera toxicidad a dosis elevadas. Además, tanto en la línea RAW 264.7 en como WBC su administración solo causó una toxicidad moderada a dosis elevadas, que en el caso de los WBC se vio revertida de nuevo, observándose en torno al 100%

de viabilidad transcurridas 12h. En cuanto a su efecto sobre los eritrocitos, las BMLs mostraron un ratio de hemolisis superior al 3% mientras que en las nanoformulaciones pegiladas fue de < 2%, en consonancia con lo observado con las BMNPs y considerándose por tanto biocompatibles. Adicionalmente, no se observó aglutinación de los eritrocitos tras la administración de BMLs y BMLs-PEG. En cuanto a su capacidad de internalización y migración magnética, la adicción de una cubierta y su funcionalización con PEG no

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afectó a sus propiedades, que en todo caso mejoraron la internalización y migración en las BMLs-PEG, especialmente en las NPs de 100nm.

En conclusión, los resultados del presente trabajo de investigación demuestran que las NPs sintetizadas basadas en pNIPAM (pNIPAM@, pNIPAM@Fe3O4-3BA, pNIPAM-co-AL@Fe3O4-AA y pNIPAM-co-AL- FITC@Fe3O4-AA) y BMNPs (BMLs y BMLs-PEG) fueron nanoformulaciones altamente compatibles en líneas celulares (incluidas las tumorales) y en células humanas sanguíneas, lo que avala su capacidad para ser usadas como transportadores de agentes terapéuticos. Además, las nanoplataformas BMNPs, BMLs y BMLs-PEG presentan una gran capacidad de internalización celular en las líneas celulares tumorales T84, SW480 y MC38 con capacidad de provocar migración magnética de dichas células.

Asimismo, estas nanoplataformas (Oxa-BMNPs, Oxa-BMLs y Oxa-BMLs- PEG) fueron capaces de mejorar el efecto antitumoral del OXA libre. Estos resultados avalan la posibilidad de utilizar dichos nanoconjugados como potenciales herramientas terapéuticas para la mejora del tratamiento del cáncer en general y del CCR en particular.

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Summary

Colorectal cancer (CRC) is the third most common cancer in the world and the second deadliest cancer, with approximately 2 million new cases and 100,000 deaths in 2020. Its presentation is "asymptomatic" or with nonspecific clinical signs that can be confused with other pathologies, which in many cases causes a late diagnosis, despite the screening performed for its detection. Its treatment, in the early stages of the disease, is based on surgical resection and/or chemotherapy that includes the administration of 5- fluorouracil (5-FU), usually co-administered with leucovorin (LV), oxaliplatin (OXA) and irinotecan (IRI), both monotherapeutically and in combination. However, in advanced stages of the disease it is necessary to apply chemotherapy together with adjuvant or neoadjuvant therapy using monoclonal antibodies such as Cetuximab or Bevacizumab. Despite the recent improvement in CRC survival thanks to earlier diagnosis through screening systems and the development of new therapies such as Aflibercept, Ramucirumab, Regorafenib, Panitumumab, Pembrolizumab, among others, the numerous side effects associated with chemotherapy drugs, the non- specificity of the treatments and the appearance of chemoresistance are the main causes of failure in the treatment of CRC. Furthermore, the impossibility of performing surgical resection without compromised limits in many cases and the low 5-year survival rates in advanced stages (14.7%) make it necessary to develop new tools that improve the therapy of this pathology.

In this context, nanoparticles (NPs), small systems (1-200nm) with ease and versatility of synthesis, and capable of encapsulating and conveying drugs, contrast agents or genes for the treatment of cancer, are presented as a great opportunity to improve the prognosis of this disease. These systems have been shown to be biocompatible and biodegradable, improve the

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solubility of the agents they carry and protect them from degradation by increasing their circulation time in the body and, therefore, the number of molecules reaching the tumor. In addition, thanks to their functionalization capacity, NPs can prevent the entry of their cargo into non-tumor cells, increasing the concentration of drugs specifically at the tumor site, being able to control their release and avoiding drug resistance mechanisms. Those nanosystems that allow the inclusion of magnetic cores, not only benefit from the general advantages of NPs, but also improve them since they facilitate their targeting by means of a magnetic field, they are concentrated in the tumor site and allow the application of magnetic hyperthermia by being exposed to an alternating magnetic field.

In the present doctoral thesis, different nanosystems have been evaluated for the delivery of 5-FU and OXA agents. The nanoformulations used were synthesized by the Department of Organic Chemistry of the University of Malaga under the supervision of Dr. Juan M. López Romero and the Department of Microbiology of the University of Granada under the direction of Dr. Concepción Jiménez López.

First, nanosystems based on poly (N-isopropylacrylamide) (pNIPAM) nanogels were studied. To improve the level of drug encapsulation in addition to their dispersion and the addition of magnetite (Fe3O4) magnetic cores, pNIPAM nanogels were combined with other polymers such as 3-butenoic acid (3BA), acrylic acid (AA) and allylamine (AL) at different ratios. To incorporate magnetic cores correctly, these were functionalized with 3BA (@

Fe3O4-3BA) and AA (@ Fe3O4-AA) and were used as seeds for the polymerization of pNIPAM and the combination of pNIPAM and AL (pNIPAM-co-AL). From the wide range of possible combinations, the following syntheses were selected to be studied in cell cultures: pNIPAM@

(NPs without magnetic cores), pNIPAM@Fe3O4-3BA and pNIPAM-co- AL@Fe3O4-AA. Additionally, the fluorescent FITC dye was incorporated

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into the pNIPAM-co-AL@Fe3O4-AA system (pNIPAM-co-AL- FITC@Fe3O4-AA) to evaluate its capacity as a visualization and monitoring system. The biocompatibility of these drug-free nanoformulations was evaluated both in the CRC T84 tumor line and in human blood cells obtained from healthy donors. On one hand, it was observed that none of the nanoformulations studied caused toxicity in the T84 cell line or in human white blood cells (WBC) at any of the doses and exposure times tested.

Furthermore, they did not produce the hemolysis of human erythrocytes except for pNIPAM-co-AL@Fe3O4-AA which induced a hemolysis rate of ~ 6% at high doses (150 µg/ml). However, none of the nanoformulations caused agglutination or changes in erythrocyte morphology. Regarding its magnetic migration properties, pNIPAM-co-AL@Fe3O4-AA showed the ability to migrate under an external magnetic field at low doses (10 µg/ml). Finally, the NPs were loaded with 5-FU (pNIPAM@+5-FU, pNIPAM@Fe3O4-3BA+5- FU, pNIPAM-co-AL@Fe3O4-AA+5-FU and pNIPAM-co-AL- FITC@Fe3O4-AA+5-FU) and OXA (pNIPAM@+OXA and pNIPAM@Fe3O4-3BA+OXA) and their cytotoxic effect was studied in the T84 cell line. Of the NPs studied, pNIPAM@Fe3O4-3BA+5-FU was the one that showed a greater cytotoxic effect, similar to that produced by 5-FU in monotherapy.

Second, nanoplatforms based on biomimetic magnetic cores were studied. Specifically, these ~ 34 nm diameter Fe3O4 magnetic cores were inorganically synthesized through the intervention of the magnetosome membrane-associated protein (MAPs), MamC, giving rise to biomimetic magnetic nanoparticles (BMNPs). The resulting Fe3O4 crystals were not only structurally different from those synthesized inorganically without MamC, but also kept said protein covalently attached to its surface, thus providing numerous groups for the functionalization of BMNPs. To evaluate their biocompatibility, the effect of BMNPs was studied in a wide battery of colon

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cell lines, human blood cells (erythrocytes and WBC) and in the murine macrophage line RAW 264.7. The BMNPs showed great biocompatibility in tumor cell lines, however, in the non-tumor colon line CCD18, toxicity could be observed from 0.5 µg/ml of Fe due to the sensitivity of these lines to high doses of iron. Regarding their hemocompatibility, BMNPs did not produce a relevant hemolysis level (<2%) in erythrocytes even at very high doses of Fe (500 µg/ml). Nevertheless, increasing degrees of agglutination could be observed with increasing dose. On the other hand, in WBC and in the RAW 264.7 cell line, nanoplatforms caused a dose-dependent toxicity at short exposure times (1h), although said toxicity was reversed after 12h in the case of WBC. The severe damage observed in the RAW 264.7 cell line, as has been observed in other studies with magnetic NPs (MNPs), is due to the generation of high levels of oxidative stress. Evaluation of the internalization capacity of BMNPs in T84 and RAW 264.7 cell lines by Prussian Blue and transmission electron microscopy (TEM) determined increasing dose- dependent internalization. Using TEM, it was determined that BMNPs were able to internalize in just 15 min in the T84 line, probably by clathrin- mediated endocytosis. The study of the ability of BMNPs to migrate in response to an external magnetic field (magnet) with perspectives on a possible magnetic targeting in vivo, showed a dose-dependent migration.

Thus, it was observed that using 100 µg/ml of Fe, practically all the cells migrated towards the magnet. This migration was not observed in the absence of the magnet. Finally, the nanoplatforms were loaded with OXA (Oxa- BMNPs) and their antiproliferative effect was studied in colon cell lines, being able to observe, in all cases, a reduction of the IC50 with respect to the OXA administered freely.

Despite their effectiveness as drug transport systems, BMNPs showed some aspects that compromise their biocompatibility, which is why a coating was added and its functionalization was carried out. BMNPs and Oxa-

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BMNPs were enveloped by 100 nm or 200nm phosphatidylcholine unilamellar liposomes (BMLs and Oxa-BMLs) and functionalized with polyethylene glycol (PEG) on their surface (BMLs-PEG and Oxa-BMLs- PEG) to improve its stability and dispersion. Although Oxa-BMLs and Oxa- BMLs-PEG, both 100nm and 200nm, did not show a decrease in the IC50 of free OXA as marked as Oxa-BMNPs, both nanoformulations produced a similar or better effect than the free drug in all the cell lines studied. However, its biocompatibility was significantly improved. In this case, the toxicity of the drug-free nanoformulations (BMLs and BMLs-PEG) in the CCD18 cell line was greatly reduced, with only slight toxicity being observed at high doses. In addition, both in the RAW 264.7 line and WBC, its administration only caused moderate toxicity at high doses, which in the case of WBC was reverted again, with around 100% viability being observed after 12h.

Regarding their effect on erythrocytes, the BMLs showed a hemolysis ratio greater than 3% while in the pegylated nanoformulations it was < 2%, in line with what was observed with the BMNPs and therefore considered biocompatible. Additionally, no agglutination of erythrocytes was observed after administration of BMLs and BMLs-PEG. Concerning its capacity for internalization and magnetic migration, the addition of a coat and its functionalization with PEG did not affect its properties, which in any case improved internalization and migration in BMLs-PEG, especially in 100nm NPs.

In conclusion, the results of the present research work demonstrate that the synthesized NPs based on pNIPAM (pNIPAM@, pNIPAM@Fe3O4-3BA, pNIPAM-co-AL@Fe3O4-AA and pNIPAM-co-AL-FITC@Fe3O4-AA) and BMNPs (BMLs and BMLs-PEG) were highly compatible nanoformulations in cell lines (including tumor cells) and in human blood cells, which supports their ability to be used as transporters for therapeutic agents. Furthermore, the nanoplatforms BMNPs, BMLs and BMLs-PEG have a great capacity for

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cellular internalization in tumor cell lines T84, SW480 and MC38 with the capacity to cause magnetic migration of said cells. In addition, these nanoplatforms (Oxa-BMNPs, Oxa-BMLs and Oxa-BMLs-PEG) were able to improve the antitumor effect of free OXA. These results support the possibility of using said nanoconjugates as potential therapeutic tools to improve the treatment of cancer in general and of CRC in particular.

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Capítulo 1

Introducción

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Capítulo 1: Introducción

1.1. El cáncer: generalidades

Se estima que en el año 2020 se produjeron 19.3 millones de nuevos casos de cáncer y casi 10 millones de muertes por esta enfermedad en todo el mundo. Sin embargo, debido a la pandemia por la COVID-19, la incidencia y mortalidad por cáncer probablemente hayan sido mucho mayores. Se estima que a nivel mundial, el número de nuevos casos alcanzará los 30,2 millones en 2040 [1]. El cáncer de mama ocupa el primer puesto como el cáncer más diagnosticado (11.7%) seguido de cerca por el de pulmón (11.4%), el colorrectal (10%), el de próstata (7.3%) y el de estómago (5.6%). En España y según datos del año 2021, el número de cánceres diagnosticados alcanzará los 276.239 casos (REDECAN 2021) (Tabla 1.1) [2].

Tabla 1.1. Cáncer en España en 2021. Estimación del número de nuevos casos según la red REDECAN [2].

Hombres Mujeres Ambos sexos

45 a 64 años 46,802 29.5% 45,030 38.4% 91,832 33.2%

> 65 años 106,263 66.9% 62,675 53.4% 168,938 61.2%

Todas las edades 158,867 100% 117,372 100% 276,239 100%

En cuanto a la mortalidad, el cáncer sigue constituyendo una de las principales causas de mortalidad del mundo, con aproximadamente 9,9 millones de muertes en 2020 (International Agency for Research on Cancer - IARC). Al igual que con la incidencia, se espera un incremento de la mortalidad en los próximos años, estimándose la mortalidad en más de 16 millones en 2040. El cáncer de pulmón continua siendo la principal causa de muerte por cáncer (18%) seguido por el colorrectal (CCR) (9.4%). Tras estos se sitúan los cánceres de páncreas, mama y próstata (Tabla 1.2) [3,4]. En España, durante el año 2020, el cáncer constituyó la tercera causa de muerte (21%) a diferencia de años anteriores, debido a la pandemia de la COVID-19

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que ha causado una disminución en la eficacia de los programas de cribado.

Hasta la fecha, el cáncer constituye la principal causa de muerte en hombres (26%) en nuestro país, siendo el cáncer de pulmón el causante de la mayoría de fallecimientos [4]. Se estima que habrá un incremento de mortalidad que alcanzará los 160.000 fallecimientos en 2040. En varones, se estima que el cáncer de pulmón será el responsable de una cuarta parte de las muertes por cáncer (17.346 fallecimiento; 25,6%), seguido por el CCR (9.640; 14,2%).

En mujeres, los tipos de cáncer responsables de una mayor mortalidad serán los cánceres colorrectales (6.830; 15,1%), y los de mama (6.606; 14,6%).

Tabla 1.2. Tumores en España, 2020. Fallecimientos en el periodo de enero a mayo teniendo en cuanta ambos sexos [2].

Fallecimientos

Total tumores 47,222

Cáncer de pulmón 9,147

Cáncer de colon 4,579

Cáncer de páncreas 3,058

Cáncer de mama 2,832

Cáncer de próstata 2.550

Entre las causas generales de aumento de la incidencia de cáncer se encuentra el envejecimiento de la población, la contaminación, la obesidad, el aumento en la exposición a factores de riesgo (tabaco, alcohol, etc) y también los programas, cada vez más eficaces, de detección precoz [5].

Algunos de estos factores de riesgo como el tabaquismo ha aumentado su prevalencia [6].

Por último, la supervivencia ha mejorado debido a la prevención (diagnóstico precoz) y las nuevas terapias. Así, la supervivencia neta en España a los 5 años (2008-2013) fue de 55,3% en los hombres y de 61,7% en

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las mujeres. Esta supervivencia es similar a la de los países de nuestro entorno y aumentará en los próximos años.

1.1.1. Carcinogénesis y características de las células tumorales

El cáncer engloba un amplio grupo de enfermedades que comparten un mismo origen. De forma natural, las células que componen nuestro organismo se dividen, crecen y llegado el fin de su vida útil, mueren por un proceso de muerte programada denominado apoptosis. Sin embargo, en ciertas ocasiones, determinadas células escapan a este proceso a pesar de los numerosos mecanismos de control, continúan dividiéndose y generan un cáncer [7,8]. Por tanto, una célula tumoral será aquella capaz de escapar de su muerte programada y proliferar sin control. Esta transición se produce debido a una mutación genética que puede deberse a numerosos factores como el estilo de vida del individuo (hábitos alimenticios, sedentarismo, tabaquismo, etc.), la exposición a agentes carcinogénicos o la herencia genética. No obstante, no todas las mutaciones ocurridas en una célula acaban generando una célula tumoral. Son aquellas que se producen en los genes reparadores de ADN, los proto-oncogenes o los genes supresores de tumores los que tienden a generar un cambio genético tumoral [8]. Los primeros se encargan de reparar los daños en el ADN celular evitando un funcionamiento anormal de la célula, por lo que una mutación en estos genes no solo evitaría la reparación de las mutaciones existentes sino que favorecería la generación de mutaciones adicionales. Los proto-oncogenes, se encargan del crecimiento y la división celular normal, y los genes supresores de tumores, que controlan dicho crecimiento, se encuentran estrechamente relacionados. Una mutación en cualquiera de ellos generaría un crecimiento descontrolado al fomentar o no limitar un crecimiento y división más activos.

Las células tumorales que proliferan y se dividen de forma acelerada van adquiriendo y acumulando nuevas mutaciones que confieren heterogeneidad

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a la masa tumoral que afecta a las células y tejidos circundantes en su propio beneficio, generando nuevos vasos sanguíneos que les aporten un suministro de oxígeno y nutrientes o modulando la respuesta de las células del sistema inmune. Este conjunto heterogéneo formado por las células cancerosas, el sistema inmune, las células epiteliales y las sustancias secretadas por todas ellas se denomina microambiente tumoral (TME) [8,9]. Las zonas hipóxicas del TME generan estrés sobre las células tumorales favoreciendo la sobreexpresión de diversos factores como el factor de inducible por hipoxia 1 alpha (HIF-1α) que modulan procesos como el de angiogénesis, la alteración del metabolismo o la progresión metastásica [9]. En relación a esta última, acontece cuando células del tumor original o primario adquieren la capacidad de romper las interacciones célula-célula y célula-matriz extracelular, atravesar la membrana basal circundante, viajar a través del torrente sanguíneo o el sistema linfático e invadir un nuevo tejido generando tumores secundarios o metástasis [7].

Con objeto de mejorar la comprensión de la compleja biología del cáncer, Hanahan y Weinberg [10], establecieron diez señas de identidad del cáncer que resumen las propiedades de las células tumorales y su TME:

 Inestabilidad y mutación genómica.

 Resistencia a la muerte celular.

 Desregulación del metabolismo celular.

 Evasión de los supresores de crecimiento.

 Mantenimiento de la señalización proliferativa.

 Adquisición de inmortalidad replicativa.

 Evasión de la destrucción por el sistema inmune.

 Inflamación promotora de tumores.

 Inducción de angiogénesis.

 Activación de la invasión y metástasis.

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41

1.2. Cáncer colorrectal

1.2.1. Incidencia, mortalidad y supervivencia

El CCR es el tercer cáncer más frecuente en el mundo y el segundo más mortal, siendo responsable de 1.9 millones de nuevos casos y 935.000 muertes en todo el mundo en 2020. En nuestro país constituye el segundo cáncer más mortal (16.470 muertes) superado únicamente por el cáncer de pulmón. Se estima que en 2021, el CCR se convierta en el cáncer más frecuentemente diagnosticado en España (43.581 nuevos casos) [3,4].

Figura 1.1. Porcentaje de casos y supervivencia relativa a 5 años por etapa en el momento del diagnóstico de cáncer colorrectal [11].

La supervivencia a los 5 años del CCR es del 64.7%, la cual se ve ligeramente disminuida al 58.1% a los 10 años. Aun así, la mayoría de los casos de cáncer colorrectal están constituidos por tumores localizados (37%) o regionales (36%) en los cuales la supervivencia a los 5 años es del 90.6%

y 72.2%, respectivamente (Figura 1.1). En los casos con tumores metastásicos esta supervivencia se reduce a un 14.7% [11]. En España, la

37% 36%

22%

5%

90.6%

72.2%

14.7%

39%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Localizado Regional Distante Desconocido

Porcentaje

Etapa

Porcentaje de casos por etapa y supervivencia 5 años

Casos (%)

Supervivencia a 5 años

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supervivencia del cáncer CCR se encuentra en torno al 63%, siendo ligeramente superior en mujeres que en hombres [4].

1.2.2. Etiología y factores de riesgo

El CCR se origina, en la mayoría de los casos, a partir de un crecimiento del recubrimiento interno del colon o el recto denominado pólipo. La presencia de un pólipo o pólipos no indica que estos se conviertan inequívocamente en procesos tumorales, no obstante, con el tiempo y dependiendo del tipo de pólipo, este puede acabar volviéndose canceroso. La presencia de algunos tipos de pólipos como son los adenomatosos o adenomas, se considera una condición pre-cancerosa por su tendencia de derivar en cáncer. Los pólipos serrados sésiles (ASS) y los serrados tradicionales (AST) son considerados como adenomas debido a su alta predisposición a generar cáncer. Otros pólipos como los hiperplásicos o los inflamatorios son mucho más comunes y no constituyen en sí una condición pre-cancerosa, pero factores como un tamaño superior a 1cm, la presencia de más de 3 pólipos y la aparición de displasia (condición pre-cancerosa) tras una resección pueden aumentar enormemente el riesgo de padecer cáncer colorrectal y se debe aumentar la frecuencia de las revisiones [12].

La mayoría de los CCR son esporádicos, un 5% se deben a mutaciones genéticas hereditarias y aproximadamente un 20% poseen un componente familiar. El envejecimiento es el factor más importante en la gran mayoría de los cánceres y también en el CCR. La mayoría se diagnostican en pacientes mayores de 50 años. La edad media para el cáncer de colon es de 68 años en varones y 72 en mujeres. En el caso del cáncer de recto la edad se modifica ligeramente, siendo detectado a los 63 años en ambos sexos [11,13,14].

Otros factores relevantes son el consumo moderado a excesivo de alcohol y el tabaquismo y la obesidad unidad a dietas ricas en carnes rojas y

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43

procesadas. A pesar de que algunos factores de riesgo están asociados al estilo de vida, existen algunos factores como la etnia o la herencia genética familiar que no pueden ser cambiados [15]. Por ello, la presencia de antecedentes familiares de CCR en parientes de primer grado o afecciones hereditarias como la poliposis adenomatosa familiar (PAF) o el síndrome de Lynch (HNPCC) están estrechamente ligados con un alto riesgo de generar CCR. El PAF se origina debido a una mutación heredada en el gen supresor de tumores APC, como consecuencia, las células afectadas se dividen sin control llegando a general cientos de pólipos en el colon del paciente y eventualmente, alguno o varios de ellos generan cáncer. El HNPCC, por otro lado, se debe a la mutación de un gen reparador del ADN, como pueden ser MLH1, MSH2, MSH6, PMS2 o EPCAM, que al no poder reparar los errores producidos en el ADN permite que a lo largo del tiempo alguno de ellos afecte a genes implicados en el crecimiento celular. El síndrome de Peutz-Jeghers (gen supresor de tumores STK11) y la poliposis asociada a MUTYH (gen reparador del ADN) son otros ejemplos de enfermedades causadas por la herencia de mutaciones genéticas que favorecen el desarrollo de CCR [14,16]. A pesar de que las mutaciones hereditarias son uno de los principales factores de riesgo, las mutaciones ocurridas en el propio individuo o las causadas por enfermedades preexistentes como la colitis ulcerosa y la colitis de Crohn también son de especial relevancia [13].

Por último, la microbiota y sus desequilibrios han cobrado gran relevancia en los últimos años no solo como etiología del CCR sino como elemento que puede ser decisivo en la respuesta del paciente a la terapia [17].

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1.2.3. Clasificación del cáncer colorrectal

El 95% de los CCR se clasifica histológicamente como adenocarcinomas. Existen otros variantes como los adenocarcinomas mucinosos, de células en anillo de sello, carcinoma escamoso, medular, adenoescamoso, neuroendocrino, indiferenciado y otros (melanomas, sarcomas, carcinoides, linfomas) [13,18]. En la Figura 1.2. se muestran cortes histológicos de algunas de las variedades de CCR.

Figura 1.2. Variantes histológicas del adenocarcinoma del CCR. A) Adenocarcinoma mucinoso, B) Adenocarcinoma de anillo de sello y C) Carcinoma medular. Imágenes realizadas por Fleming y cols. [19].

Por otra parte, también ha existido un intento de realizar una clasificación basada en vías y eventos moleculares. De esta forma, la más aceptada es la propuesta por un consorcio internacional (Tabla 1.3)[20].

Sin embargo, para su tratamiento se utiliza la estadificación TNM elaborada por el American Joint Committee on Cancer (AJCC) que se basa en la descripción de la extensión del tumor primario (T), su diseminación a ganglios linfáticos (N) y la presencia de metástasis (M) [13,18,21,22].

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45

Tabla 1.3. Clasificación molecular de CCR. Adaptada de Guinney J, 2015 [20].

CSM1 IMS Inmune

CMS2 Canónico

CMS3 Metabólico

CMS4 Mesenquimal

14% 37% 13% 23%

IMS, CIMP ↑,

hipermutación SCNA ↑

IMS mezclado, SCNA↓,

CIMP↓

SCNA ↑

BRAF mutado KRAS mutado

Infiltración inmune

Activación de WNT y MYC

Desregulación metabólica

Angiogénesis, infiltración

estromal y activación TGF-

β Activación

inmunológica

Sin activación inmunológica

Sin activación

inmunológica Inmunosupresión

↓ Supervivencia después de la

recaída

↓ Supervivencia sin recaídas y en

general Lado drcho. Lado izqdo. Lado drcho. Ambos lados

En 2017 se publicó un nuevo manual de estadificación del cáncer de la AJCC (8ª versión) que introdujo nuevos cambios en los estadios del CCR con respecto a la versión anterior. Los principales cambios fueron el cambio de la descripción de M1b de “metástasis en 2 o más sitios u órganos, o el peritoneo”

a “metástasis en 2 o más sitios u órganos sin metástasis peritoneal”

permitiendo introducir una nueva categoría, la M1c, definida como

“presencia de metástasis en la superficie peritoneal, sola o con metástasis en otros sitios u órganos”. La progresión tumoral asociada a cada estadio se representa en la Figura 1.3. Además se establecen las mutaciones de KRAS, NRAS y BRAF como factores pronósticos predictores de riesgo y eficacia de gran importancia junto con la inestabilidad microsatelital [23].

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Figura 1.3. Estadificación del cáncer de colon. Adaptación de las ilustraciones de Terese Winslow. ©(2021) Terese Winslow LLC, U.S. Govt. tiene ciertos derechos.

[24]

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47

La clasificación TNM para el CCR se detalla en la Tabla 1.4.

Tabla 1.4. Sistema de clasificación TNM para el cáncer colorrectal según la AJCC.

Estadio TNM Descripción

0 Tis, N0, M0

Tis

Carcinoma in situ, carcinoma intramucoso (compromiso de la lámina propia sin diseminación a la capa muscular de la mucosa).

N0 Sin metástasis en ganglios linfáticos regionales.

M0 Sin indicios de metástasis a distancia.

I T1, T2,

N0, M0

T1 Tumor con invasión de la submucosa (pero no dentro de la capa muscular propia).

T2 Tumor con invasión de la capa muscular propia.

IIA T3, N0, M0

T3 Tumor con invasión de los tejidos pericolorrectales a través de la capa muscular propia.

IIB T4a, N0, M0

T4a Tumor con invasión del peritoneo visceral (perforación macroscópica).

IIC T4b, N0, M0

T4b Tumor con invasión directa o adherencia a órganos o estructuras adyacentes.

N Cualquier N. Misma descripción que para IVA.

M1c Presencia de metástasis en la superficie peritoneal, sola o con metástasis en otros sitios u órganos.

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Tabla 1.4. Sistema de clasificación TNM para el cáncer colorrectal según la AJCC. Continuación.

Estadio TNM Descripción

IIIA

T1, N2a, M0

N2a Compromiso de 4 a 6 ganglios linfáticos regionales.

T1-2, N1/N1c,

M0

N1

Compromiso de 1 a 3 ganglios linfáticos regionales o X cantidad de depósitos tumorales y todos los ganglios linfáticos libres de compromiso.

N1c

Sin compromiso de ganglios linfáticos regionales.

Existen depósitos tumorales en la subserosa, el mesenterio, los tejidos pericólicos no peritonealizados o en los tejidos perirrectales o mesorrectales.

IIIB

T1-T2, N2b, M0

N2b Compromiso de 7 o más ganglios linfáticos regionales.

T2-T3, N2a, M0

T3 Tumor con invasión de los tejidos pericolorrectales a través de la capa muscular propia.

N2a Compromiso de 4 a 6 ganglios linfáticos regionales.