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Efecto de la administración crónica de curcumina sobre el hipocampo y la corteza media prefrontal en ratones en etapa senil

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Academic year: 2020

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(1)BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA. INSTITUTO DE FISIOLOGÍA MAESTRÍA EN CIENCIAS FISIOLÓGICAS. INSTITUTO DE FISIOLOGÍA LABORATORIO DE NEUROPSIQUIATRÍA Tesis:. “EFECTO DE LA ADMINISTRACIÓN CRÓNICA DE CURCUMINA SOBRE EL HIPOCAMPO Y LA CORTEZA MEDIA PREFRONTAL EN RATONES EN ETAPA SENIL.”. Para obtener el grado de MAESTRO EN CIENCIAS FISIOLÓGICAS. Presenta: QFB. ALDO EFRAÍN GONZÁLEZ GRANILLO. Director de tesis: DR. GONZALO FLORES ALVAREZ. JUNIO 2017.

(2) Resumen La población de adultos mayores en México ha aumentado a una tasa creciente año con año, principalmente debido al aumento en la esperanza de vida de las personas. Sin embargo, aunque se han logrado grandes avances en el área de la geriatría, la calidad de vida de las personas mayores a 65 años sigue siendo muy inferior la ideal. El envejecimiento se caracteriza por una disminución progresiva de la capacidad fisiológica para responder correctamente ante estímulos externos, lo cual conduce a una mayor susceptibilidad y vulnerabilidad a las enfermedades. La disminución en las capacidades de aprendizaje y la memoria son muy comunes durante la senectud. Se ha descrito previamente el papel crucial que juega el estrés oxidativo y la neuroinflamación en el proceso de desgaste cerebral presente en el envejecimiento En los últimos años, se han incrementado el número de estudios que describen los efectos farmacológicos de diferentes compuestos derivados de productos naturales. Uno de ellos es la curcumina (CUR), a la que se le han atribuido diferentes propiedades terapéuticas entre las que destaca su capacidad antioxidante y antiinflamatoria. Por tanto, en este estudio se estudió el efecto de la administración crónica de CUR en ratones en etapa senil, sobre el aprendizaje y la memoria mediante la prueba del laberinto acuático de Morris y de reconocimiento de objeto novedoso. Concluido el periodo de pruebas, analizó la densidad dendrítica en hipocampo y corteza media prefrontal mediante la tinción de Golgi-Cox, así como la tinción de Nissl para el análisis de la densidad neuronal y el análisis de inmunofluorescencia para los marcadores de sinaptofisina, GFAP y metalotioneína 3. Se encontró que la administración crónica de curcumina mejora las capacidades de aprendizaje y de memoria de los ratones seniles. También se encontró que la CUR genera un incremento de la longitud de las dendritas y de la densidad de espinas de las neuronas piramidales de la corteza y del hipocampo, sin embargo, la densidad neuronal mostró modificaciones. Por otro lado, se observó un aumento en la expresión de sinaptofisina, así como una disminución de la expresión de Metalotioneína 3 y de GFAP en el hipocampo y la CmPF de ratones tratados con curcumina. En general, se puede afirmar que la administración crónica de CUR ayuda a mantener una buena funcionalidad de las regiones cerebrales involucradas con los procesos cognitivos, las cuales, en condiciones normales de envejecimiento, se encuentran alteradas. I|Página.

(3) Índice 1.. Introducción. ................................................................................................................ 1 1.1. Mecanismos degenerativos en el envejecimiento. ......................................................... 2. 1.2. Aprendizaje y memoria........................................................................................................ 3. 1.2.1. Memoria de corto plazo ............................................................................................... 3. 1.2.1. Memoria de largo plazo ............................................................................................... 4. 1.3. El hipocampo. ....................................................................................................................... 5. 1.4. La corteza media prefrontal. ............................................................................................... 6. 1.5. El envejecimiento cerebral. ................................................................................................. 8. 1.6. Curcumina. .......................................................................................................................... 10. 2.. Justificación. .............................................................................................................. 12. 3.. Hipótesis..................................................................................................................... 12. 4.. Objetivos. ................................................................................................................... 13 4.1 Objetivo general. ...................................................................................................................... 13 4.2 Objetivos particulares. ............................................................................................................ 13. 5.. Diagrama de trabajo................................................................................................... 14. 6.. Desarrollo experimental. ........................................................................................... 15. 7.. 6.1. Sujetos de experimentación. ............................................................................................ 15. 6.2. Administración de curcumina. .......................................................................................... 15. 6.3. Prueba del laberinto acuático de Morris. ........................................................................ 15. 6.4. Prueba de reconocimiento de objeto novedoso (NOR) ............................................... 17. 6.5. Técnica Golgi-Cox.............................................................................................................. 19. 6.6. Análisis morfológico. .......................................................................................................... 20. 6.7. Tipificación de espinas. ..................................................................................................... 21. 6.8. Cortes en criostato. ............................................................................................................ 22. 6.9. Análisis estereológico. ....................................................................................................... 23. 6.10. Inmunofluorescencia.......................................................................................................... 24. Resultados. ................................................................................................................ 26 7.1. Pruebas de aprendizaje y la memoria. ........................................................................... 26. 7.1.1. Prueba de laberinto acuático de Morris. ................................................................. 26. 7.1.2. Prueba de reconocimiento de objeto novedoso (NOR). ...................................... 27. 7.2. Análisis morfológico. .......................................................................................................... 29. 7.2.1. Morfología de la corteza media prefrontal. ............................................................. 29. 7.2.2. Morfología del hipocampo......................................................................................... 31. 7.3. Estereología. ....................................................................................................................... 37 II | P á g i n a.

(4) 7.4. 8.. 9.. Inmunofluorescencia.......................................................................................................... 38. 7.4.1. Expresión de sinaptofisina. ....................................................................................... 38. 7.4.2. Expresión de metalotioneína 3................................................................................. 40. 7.4.3. Expresión de GFAP. .................................................................................................. 41. Discusión de resultados. ........................................................................................... 43 8.1. Aprendizaje y memoria...................................................................................................... 43. 8.2. Morfología neuronal. .......................................................................................................... 45. 8.3. Densidad neuronal. ............................................................................................................ 47. 8.4. Reactividad a SYP, MT3 y GFAP. ................................................................................... 48. Conclusiones. ............................................................................................................ 51. 10. Bibliografía. ................................................................................................................ 52. III | P á g i n a.

(5) Abreviaturas. ASB. Albúmina sérica de bovino. CA. Cuerno de Amón. CmPF. Corteza media prefrontal. CUR. Curcumina. DAPI. 2,4-diamino-2-fenilindol. DMSO. Dimetilsulfóxido. EEM. Error estándar de la media. FITC. Fluoresceína 5-isotiocianato. GD. Giro dentado. GFAP. Proteína ácida glial fibrilar. INEGI. Instituto Nacional de Estadística y Geografía. MT. Metalotioneína. NOR. Prueba de reconocimiento de objeto novedoso. PBS. Buffer fosfato salino. SSI. Solución salina isotónica. SYP. Sinaptofisina. IV | P á g i n a.

(6) ÍNDICE DE FIGURAS. Figura 1. Comparación de la composición de la población por sexo y edad............................. 1 Figura 2. Regiones del hipocampo. .................................................................................................. 5 Figura 3. Esquema de los circuitos en el hipocampo. ................................................................... 6 Figura 4. Regiones del hipocampo. .................................................................................................. 7 Figura 5. Estructura química de la curcumina. ............................................................................. 10 Figura 6. Estudios del efecto de la curcumina en diferentes modelos de ratón...................... 11 Figura 7. Diagrama de trabajo. ....................................................................................................... 14 Figura 8. Laberinto acuático de Morris. ......................................................................................... 17 Figura 9. Reconocimiento de objeto novedoso. ........................................................................... 18 Figura 10. Análisis de Sholl. ............................................................................................................ 21 Figura 11. Clasificación de los diferentes tipos de espinas. ....................................................... 22 Figura 12. Inmunoreactividad a SYP. ............................................................................................ 39 Figura 13. Inmunoreactividad a MT3. ............................................................................................ 41 Figura 14. Inmunoreactividad a GFAP........................................................................................... 42. ÍNDICE DE GRÁFICAS. Gráfica 1. Tiempo de latencia en encontrar la plataforma de escape. ..................................... 26 Gráfica 2. Tiempo de latencia al cruce con la plataforma........................................................... 27 Gráfica 3. Reconocimiento de objeto novedoso........................................................................... 28 Gráfica 4 A-C. Análisis de la morfología de las neuronas de la CmPF capa III. ..................... 30 Gráfica 5 A-B. Densidad y tipificación de las espinas dendríticas de la CmPF capa III. ....... 31 Gráfica 6 A-C. Análisis de la morfología de las neuronas de la región CA1. .......................... 32 Gráfica 7 A-B. Densidad y tipificación de las espinas dendríticas de la región CA1. ............ 33 Gráfica 8 A-C. Análisis de la morfología de las neuronas de la región CA3. .......................... 34 Gráfica 9 A-B. Densidad y tipificación de las espinas dendríticas de la región CA3. ............ 35 Gráfica 10 A-C. Análisis de la morfología de las neuronas del GD. ......................................... 36 Gráfica 11 A-B. Densidad y tipificación de las espinas dendríticas de la región de GD. ...... 37 Gráfica 12 A-D. Análisis estereológico. ......................................................................................... 38 Gráfica 13 A-D. Expresión de SYP. ............................................................................................... 39 Gráfica 14 A-D. Expresión de MT3. ............................................................................................... 40 Gráfica 15 A-D. Expresión de GFAP. ............................................................................................ 42. V|Página.

(7) 1. Introducción. En los últimos años México ha experimentado una profunda transformación demográfica, la estructura por edades de la población ha cambiado, pasando de una población predominantemente de menores de 15 años a una de jóvenes. Según datos del Instituto Nacional de Estadística y Geografía (INEGI) (2014), paulatinamente se ha acumulado una mayor cantidad de personas de 60 y más años, debido a la mayor esperanza de vida. Según los resultados definitivos de la Encuesta Intercensal realizada por el INEGI (2015), los adultos mayores mexicanos, es decir, aquellos mayores a 65 años, pasaron de ser el 6.2% del total de la población en 2010, al 7.2% en 2015. Según el Consejo Nacional de Población, para 2050 habrá 150 millones 837,517 mexicanos y la esperanza de vida promedio será de 79.42 años; ésta, que actualmente es de 77.4 años para las mujeres y 71.7 para los hombres, aumentará a 81.6 y 77.3 años, respectivamente. El ritmo de crecimiento de la edad de la población tan elevado lleva a predecir una población más vieja para los próximos años, es por ello que la importancia de aumentar la calidad de vida de las personas mayores es un tema que ha aumentado su presencia en todas las ramas de la investigación científica en los últimos años.. Figura 1. Comparación de la composición de la población por sexo y edad. Grafica obtenida de los datos de los censos de población realizados en los años 2000 y 2010, y de la encuesta intercensal realizada en 2015 por el INEGI.. 1|Página.

(8) 1.1. Mecanismos degenerativos en el envejecimiento.. El envejecimiento es un proceso deletéreo, progresivo, intrínseco y universal que con el tiempo ocurre en todo ser vivo a consecuencia de la interacción de la genética del individuo y su medio ambiente (Gómez y cols., 2000). La esperanza de vida de los organismos está regulada por genes que controlan el metabolismo, los sistemas antioxidantes, la reparación del ADN, envejecimiento celular y muerte celular. Las funciones celulares se van deteriorando constantemente por pequeños errores en la replicación del ADN y daños a macromoléculas, que lleva a la acumulación de células senescentes y tejido dañado con la edad (Sikora y cols., 2010). Kirkwood en 1977 propone su “teoría del soma desechable”, en donde afirma que: •. El envejecimiento se debe a limitaciones que han surgido en el mantenimiento somático y la reparación, debido a que compite con ellas de forma prioritaria la reproducción.. •. El envejecimiento es resultado de la acumulación de daño en las células y tejidos durante la vida del organismo.. •. Contribuyen al envejecimiento múltiples mecanismos (puesto que son formas múltiples de mantenimiento somático), todas las cuales están sujetas al mismo proceso de optimización.. •. Los principales genes que determinan la longevidad y la tasa de senescencia son genes que especifican los niveles de funciones de mantenimiento (genes de reparación de ADN, enzimas antioxidantes, proteínas de estrés, etc.). •. La longevidad máxima no está controlada por ningún tipo de reloj, pero si es modulable, por ejemplo, modificando la exposición al daño o mejorando las funciones del mantenimiento corporal.. La universalidad del fenómeno de envejecimiento, que comprende el ciclo de crecimiento, la decadencia y la muerte, sugiere que las reacciones que la causan son básicamente las mismas en todos los seres vivos (Harman, 1956). A pesar de las grandes diferencias en la esperanza de vida de muchas especies (un ratón de 2 años, un perro de 12 años, un chimpancé de 32 años, o un hombre de 80 años), se presentan muchas deficiencias comunes, tales como la reducción en la elasticidad de los tejidos, deficiencias en las respuestas inmunológicas, una disminución de la fuerza. 2|Página.

(9) muscular, deterioro en las percepciones sensoriales y reflejos, así como la elevada incidencia de enfermedades asociadas a la edad como osteoporosis, artrosis, enfermedades cardiovasculares, cataratas y degeneración macular, enfermedades neurodegenerativas o daño cognitivo como disminución en la capacidad de aprendizaje y pérdida de memoria (Kappeler y Epelbaum, 2011).. 1.2. Aprendizaje y memoria.. David Sweatt define los términos aprendizaje y memoria en su libro “Mechanisms of Memory” (2010) de la siguiente manera: el aprendizaje es la adquisición de una respuesta alterada de comportamiento debido a un estímulo ambiental, es decir, cambios en los patrones de comportamiento de un sujeto en respuesta a una experiencia. Por otro lado, la memoria es el mecanismo de almacenamiento de un elemento aprendido, es decir, el proceso a través del cual la información aprendida es guardada. Existen, sin embargo, otros procesos que alteran el comportamiento y que no son considerados aprendizaje “real”, como por ejemplo la sensibilización y la habituación. El proceso de memoria puede categorizarse, dependiendo de la duración del recuerdo, en dos tipos: memoria de corto plazo o de largo plazo. Por lo general la duración de la memoria de un evento aprendido depende del número de veces que el sujeto experimenta un estímulo que cambia su comportamiento, es decir, la adquisición de la memoria es un fenómeno gradual.. 1.2.1 Memoria de corto plazo. Se le conoce como memoria de corto plazo a aquellos sistemas encargados de guardar información sensorial por algunos segundos hasta unos cuantos minutos después de su terminación (Sweatt, 2010). El sistema de memoria de corto plazo puede ser dividido a su vez en tres componentes:. 3|Página.

(10) •. La memoria sensorial es la encargada de la información percibida recientemente por los sentidos, por ejemplo, un olor, un sonido o ver la cara de alguien que acabas de conocer.. •. El almacenamiento a corto plazo se refiere a la retención de información cuando ésta ha alcanzado un nivel de conciencia.. •. La memoria de trabajo ayuda al almacenamiento de información por periodos cortos de tiempo mientras sea utilizada.. 1.2.1 Memoria de largo plazo. La memoria a corto plazo es un sistema para almacenar una cantidad limitada de información durante un corto periodo de tiempo, es una memoria inmediata para los estímulos que acaban de ser percibidos. Los cambios moleculares y estructurales que ocurren en las sinapsis son solamente transitorios. Sin embargo, cuando el estímulo que promueve estos cambios persiste por una cantidad mayor de tiempo, o se presenta de forma repetitiva, se pueden activar mecanismos de plasticidad neuronal, produciendo finalmente cambios estructurales en las sinapsis. Estos cambios van a producir que el evento al que están asociados, forme parte de la memoria de largo plazo del sujeto, la cual a diferencia de la de corto plazo, es más estable y duradera. A este proceso se le conoce como consolidación de la memoria (Morgado, 2005). Cualquier evento de memoria se puede comprender en tres componentes: aprendizaje, consolidación y recuperación de la memoria. A cada uno de estos procesos le corresponden distintos eventos moleculares y celulares. Actualmente, se considera que tanto el aprendizaje como a la memoria son parte de un sistema múltiple en el que se involucran un complejo número de subregiones interconectadas del sistema nervioso central, entre los principales involucrados se encuentran el hipocampo y la corteza media prefrontal (CmPF).. 4|Página.

(11) 1.3. El hipocampo.. El hipocampo (del latín hippocampus, caballo de mar, llamado así por la semejanza en su forma con este animal) es uno de los núcleos cerebrales más relacionados con la consolidación de la memoria en el sistema nervioso central. El hipocampo cuenta con 3 subdivisiones anatómicas, que bajo la nomenclatura Cornu Ammonis (Cuerno de Amón, deidad egipcia representada en forma de carnero), son llamadas CA1, CA2 y CA3. Las regiones CA1 y CA3 son las más grandes y fácilmente reconocibles (figura 2). Las neuronas principales de las regiones CA son llamadas piramidales, debido a la forma de su cuerpo celular. Estas áreas forman al hipocampo propiamente dicho, mientras que el hipocampo en conjunto con el giro dentado (GD) y el subiculum dan origen a la formación hipocampal (Andersen y cols., 2007).. Figura 2. Regiones del hipocampo. Se muestra en la figura una representación del hipocampo con cada una de las regiones de interés: en azul, la región CA1, en verde, la región CA3, en rojo, la región de GD. Tomado de Paxinos y Franklin, 2001.. Los circuitos en el hipocampo forman la llamada vía trisináptica excitatoria (figura 3), en donde los axones de las neuronas de la capa II de la corteza entorrinal proyectan hacía el GD a través de la vía perforante. El GD envía proyecciones a las células piramidales de CA3 a través de las fibras musgosas. Las neuronas piramidales de CA3 descargan la información a las neuronas piramidales de CA1 a través de los colaterales de Schaffer. A su vez, las neuronas piramidales de CA1 envían las proyecciones dentro de la capa de neuronas de la corteza entorrinal. CA3 también recibe proyecciones directas de la capa II de la corteza entorrinal a través de la vía 5|Página.

(12) perforante, mientras que CA1 recibe entradas directas de la capa III de la corteza entorrinal a través de la vía temporoammonica. Las células del GD también proyectan a las células musgosas del hilus e interneuronas hilares que envían proyecciones excitatorias e inhibitorias respectivamente, hacías las neuronas granulares (Olivares y cols., 2015).. Figura 3. Esquema de los circuitos en el hipocampo. La tradicional vía excitatoria trisináptica es descrita por las flechas de colores (flecha azul: vía perforante; flecha naranja: vía de fibras musgosas; flecha verde: colaterales de Schaffer; flecha roja; proyecciones de CA1 a corteza entorrinal (CE); VP, vía perforante; VT, vía temporoammonica. Tomado de Olivares y cols., 2015.. Los axones de las neuronas piramidales de CA1 son también la vía de salida de información del hipocampo propiamente dicho, proyectando predominantemente hacia las cortezas entorrinales ipsi- y contralaterales (Sweatt, 2010).. 1.4. La corteza media prefrontal.. La corteza prefrontal se refiere a las regiones de la corteza cerebral que son anteriores a la corteza premotora y la zona motora suplementaria. En base a sus conexiones neuroanatómicas, la corteza prefrontal puede dividirse en dos secciones: corteza media prefrontal (CmPF) y corteza lateral prefrontal. La CmPF incluye las porciones mediales de las áreas de Brodmann 9-12 y BA 25, y tiene conexiones recíprocas con regiones del cerebro que están implicadas en el procesamiento emocional (amígdala),. 6|Página.

(13) memoria (hipocampo) y regiones sensitivas de orden superior (corteza temporal). La corteza lateral prefrontal incluye las porciones laterales de las áreas de Brodmann 912, 44, 45 y 46, y tiene conexiones recíprocas con regiones del cerebro que están implicadas en el control motor (ganglios basales, corteza premotora, área motora suplementaria), y procesamiento sensorial de orden superior (cortezas temporal y parietal) (Grossmann, 2013). Figura 4. Regiones del hipocampo. Se muestra en la figura una representación de la corteza media prefrontal. Tomado de Paxinos y Franklin, 2001.. La corteza cerebral en general está dividida en seis capas (Swenson, 2006), las cuales están numeradas desde la parte superficial a profunda con números romanos: •. Capa I. Es la capa molecular, que contiene muy pocas neuronas y principalmente axones.. •. Capa II. Es la capa granular externa. •. Capa III. Es la capa piramidal externa.. •. Capa IV. Es la capa granular interna.. •. Capa V. Es la capa piramidal interna.. •. Capa VI. Es la capa multiforme (o fusiforme).. Existen reportes que afirman que la CmPF se encuentra involucrada en diferentes funciones como la coordinación de extremidades, atención a las tareas cognitivas exigentes, modulación de la excitación corporal, memoria espacial, movimiento autoiniciado, tareas de detección y secuenciación de estímulos y planificación 7|Página.

(14) (Siddiqui y cols., 2008). Existe evidencia experimental que afirma que la corteza prefrontal es el sitio anatómico donde se procesa la memoria de trabajo (GoldmanRakic, 1995). La. CmPF. está. constituida. predominantemente. por. neuronas. piramidales. glutamatérgicas (aproximadamente 80-90%) y una serie de poblaciones de interneuronas locales (aproximadamente 10-20%) (McKlveen y cols., 2015). Las neuronas piramidales se encuentran principalmente en las capas III y V y son especialmente importantes, porque están muy relacionadas con procesos cognitivos (Spruston, 2008). La corteza media prefrontal (CmPF) y el hipocampo se encuentran funcionalmente interconectados y se han descrito dos diferentes vías de conexión. La primera son proyecciones de las neuronas piramidales de la región CA1 y neuronas del subículo a las cortezas entorrinal y perirrinal, que a su vez proveen inervación eferente hacia la CmPF. La segunda es una vía más directa en la que las neuronas de CA1 proyectan directamente a CmPF. Por otro lado, la información de la CmPF llega al hipocampo a través de las cortezas entorrinal, perirrinal y parahipocampal (Braak y cols., 1996).. 1.5. El envejecimiento cerebral.. Durante el envejecimiento, muchos individuos experimentan un deterioro cognitivo que se presenta como déficits en la memoria y en las capacidades para el uso de la información adquirida. Estudios estereológicos cuantitativos en ratas, monos y humanos han demostrado una pérdida mínima de neuronas excitadoras o inhibidoras en algunas regiones neocorticales y del hipocampo durante el envejecimiento normal (Morrison y Baxter, 2014). Por otro lado, se han encontrado cambios estructurales y funcionales en las neuronas, como por ejemplo diferencias en la cantidad y tipos de espinas dendríticas, alteraciones en los receptores de neurotransmisores y cambios en las propiedades electrofisiológicas de las células. Estudios en animales sugieren que el deterioro cognitivo asociado a la edad es mediado principalmente por alteraciones sinápticas en circuitos neuronales (Hof y Morrison, 2004).. 8|Página.

(15) Las sinapsis son uniones intercelulares altamente especializadas que median la transmisión de señales neuronales. Una propiedad fundamental de las sinapsis es su capacidad para modificar la eficacia de la comunicación sináptica a través de cambios morfológicos asociados al citoesqueleto de actina, que es el componente estructural principal de las sinapsis (Dillon y Goda, 2005). Otra proteína importante en la comunicación neuronal es la sinaptofisina (SYP), que es uno de los componentes polipeptídicos más abundantes de las vesículas sinápticas. A pesar de que no es esencial para la neurotransmisión, se cree que modula la eficiencia del ciclo de la liberación vesicular. Reportes indican que su disminución en las neuronas produce deficiencias en el aprendizaje y la memoria (Schmitt y cols., 2009). Los astrocitos son células del sistema nervioso central que son considerados moduladores clave de la función neuronal y la homeostasis del microambiente neuronal. Se ha observado que con el envejecimiento existe un aumento en reactividad astrocítica, que se define como una hipertrofia celular (también conocida como gliosis) y es caracterizada por una elevada expresión de GFAP (Nichols, 1999). Los astrocitos reactivos cambian su expresión de factores de crecimiento y citoquinas, lo cual puede ser perjudicial para las neuronas (Bernal y Peterson, 2011). Las metalotioneínas (MTs) son pequeñas proteínas intracelulares de unión a metales pesados que intervienen en la detoxificación y protección contra el estrés oxidativo. En mamíferos, la familia de las MTs de se divide en cuatro subgrupos: MT1, MT2, MT3 y MT4. Las isoformas MT1 y MT2 se encuentran ampliamente expresadas en todos los tejidos y son inducidas por diversos estímulos, incluyendo exposición a metales, fármacos y mediadores inflamatorios. La MT3 es específica del cerebro y se expresa principalmente en las neuronas que contienen Zn +2 del hipocampo, la amígdala y la corteza cerebral (Sharma y Ebadi, 2014). En el cerebro de los mamíferos, la MT1 y la MT2 se expresan preferentemente en astrocitos activados y microglía. Por su parte, la MT3 se expresa predominantemente en neuronas y, en menor medida, en astrocitos (Scudiero y cols., 2017). Algunos de los núcleos cerebrales involucrados con el aprendizaje y la memoria, y que se ven afectados con el envejecimiento son la CmPF y el hipocampo, pues se ha observado que durante el proceso normal de envejecimiento se ven deterioradas habilidades para evocar información muy específica, el aprendizaje y la capacidad. 9|Página.

(16) recordar información relacionada con habilidades no específicas, funciones que están muy asociadas a estos núcleos (Winocur y Moscovitch, 1990).. 1.6. Curcumina.. Recientemente, se ha postulado que los tratamientos dirigidos a frenar el envejecimiento podrían ofrecer un beneficio mucho mayor que los destinados a alguna enfermedad específica. La teoría de la evolución de soma desechable sugiere que el envejecimiento es inevitable, sin embargo, es maleable y plástico. Por tanto, es posible extender la vida útil de un organismo mediante la intervención dietética, farmacéutica o alteración genética que modifique su metabolismo (Vijg y Campisi, 2008). En las últimas décadas se han logrado comprender los mecanismos moleculares de acción de muchos productos naturales y esto ha aumentado el interés en su uso terapéutico en muchas áreas de la salud (Goel y cols., 2008). La cúrcuma (rizoma de la planta Curcuma longa), que es empleada generalmente como un condimento en la gastronomía países orientales, ha sido tema de muchos estudios en los últimos años debido a que se le han atribuido diferentes propiedades medicinales, tomando como base la herbolaria tradicional indochina. Esto ha llevado al análisis de los componentes de los extractos de esta raíz y se ha encontrado que la curcumina (CUR) es el componente activo principal (Figura 5) (Tatsuzaki y cols., 2006).. Figura 5. Estructura química de la curcumina. (Tatsuzaki y cols., 2006).. Diversos trabajos han demostrado que la CUR ayuda en el tratamiento una gran diversidad de enfermedades, como el cáncer, infecciones microbianas (Mesa y cols., 2000), y enfermedades mentales como el Alzheimer y la demencia (Brondino y cols., 2014). Los principales mecanismos farmacológicos que se le atribuyen a la CUR son 10 | P á g i n a.

(17) sus propiedades antioxidantes tomando el papel de carroñero de muchos radicales libres de oxígeno, incluyendo al anión superóxido y el radical hidroxilo (Maheshwari y cols., 2006). La administración crónica de CUR (6 semanas) causa la restauración del glutatión reducido, las enzimas superóxido dismutasa, glutatión-S transferasa, y catalasa en un modelo de envejecimiento (Kumar y cols., 2011). Puede actuar también como un potente antiinflamatorio: disminuyendo la actividad de las enzimas ciclooxigenasa-2 (Zhang y cols., 1999), lipooxigenasa y óxido nítrico sintasa de tipo inducible (Chan y cols., 1998); y su capacidad antioxidante: aumentando la actividad de la enzima superóxido dismutasa y también inhibiendo la peroxidación lipídica disminuyendo los niveles de lipofuscina y malonildialdehido (Reddy y Lokesh, 1992; Juturu y cols., 2015) En la figura 6 se muestran algunos estudios de modelos animales en ratón de diferentes enfermedades, en los que se administra por vía intreperitoneal a diferentes dosis y por diferentes periodos de tiempo. En todos estos estudios, la CUR fue administrada usando dimetilsulfóxido (DMSO) como vehículo.. Autor, año. Tratamiento. Gururaj y cols., Angiogénesis. Dosis (i.p.) y duración de tratamiento 10 mM-100 µL/ratón por 10 días. 2002. tumoral. Rajeswari, 2008. Toxicidad del MPTP. 80 mg/kg por 7 días. Reddy, 2005. Malaria. 100 mg/kg por 5 días. Yu, 2011. Pancreatitis. 50 mg/kg por 6 días. Dujic, 2009. Antitumoral. 15 mg/kg por 29 días. Kumar y col.,2011 Senescencia. 15 y 30 mg/kg por 6 semanas. Figura 6. Estudios del efecto de la curcumina en diferentes modelos de ratón.. 11 | P á g i n a.

(18) 2. Justificación.. La población de adultos mayores en México ha aumentado a una tasa creciente año con año, principalmente debido al aumento en la esperanza de vida de las personas. El envejecimiento se caracteriza por una disminución progresiva de la capacidad fisiológica para responder correctamente ante estímulos externos, entre las principales afecciones presentes en la senectud se encuentra la disminución en las capacidades de aprendizaje y la memoria. La CUR es una molécula a la que se le han atribuido diferentes propiedades terapéuticas entre las que destacan sus capacidades antioxidantes y antiinflamatorias. En este estudio se analizará el efecto de la administración crónica de CUR en ratones en etapa senil, sobre el aprendizaje y la memoria, así como los efectos celulares que produce en regiones cerebrales relacionadas con procesos cognitivos.. 3. Hipótesis.. La administración crónica de curcumina en ratones seniles genera una disminución del deterioro cognitivo en regiones del hipocampo y la corteza media prefrontal producido por el proceso de envejecimiento.. 12 | P á g i n a.

(19) 4. Objetivos.. 4.1 Objetivo general.. Evaluar los cambios conductuales y celulares relacionados al hipocampo y la corteza media prefrontal que se producen por la administración crónica de curcumina en ratones seniles.. 4.2 Objetivos particulares.. Determinar el efecto producido por la administración crónica de curcumina en ratones seniles sobre: •. El aprendizaje y la memoria espacial mediante la prueba del laberinto acuático de Morris y la prueba de reconocimiento de objeto novedoso.. •. La longitud dendrítica, arborización y número de orden de la CmPF capa III, y las regiones CA1, CA3 y GD del hipocampo dorsal mediante el análisis de Sholl.. •. La densidad neuronal de la CmPF y las regiones CA1, CA3 y GD del hipocampo dorsal, mediante el análisis estereológico.. •. Medir y analizar la inmunoreactividad de los marcadores de respuesta inflamatoria (GFAP), de estrés oxidativo (Metalotioneína 3) y de liberación vesicular (sinaptofisina) en la CmPF e hipocampo.. 13 | P á g i n a.

(20) 5. Diagrama de trabajo. N= 24 ratones seniles (18 meses de edad) Cepa C57BL/6 Administración i.p. por 2 meses de:. -DMSO 18% (4 mL/kg) n=18. -CUR (20 mg/kg) n=18 Pruebas de aprendizaje y memoria. Laberinto acuático de Morris. Reconocimiento de objeto novedoso. Sacrificio de ratones. Perfusión con SSI. Tinción de Golgi-Cox n=6 por grupo. Análisis morfológico. Perfusión con PFA. Cortes en criostato n=6 por grupo. Tinción de Nissl y estudio estereológico. Inmunofluorescencia. Figura 7. Diagrama de trabajo.. 14 | P á g i n a.

(21) 6. Desarrollo experimental.. 6.1. Sujetos de experimentación.. Se obtuvieron 24 ratones macho de la sepa cepa C57BL/6 de 18 meses de edad, provenientes del bioterio “Claude Bernard” de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. Los ratones fueron albergados individualmente en condiciones de bioterio controladas, temperatura de 23 °C y humedad 40 % con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas (07:00-19:00), con acceso a agua y alimento ad libitum.. 6.2. Administración de curcumina.. Los ratones fueron asignados aleatoriamente a la administración de CUR (grupo experimental) y a la administración del vehículo, DMSO. Se formaron 2 grupos (n=12) a los que se les administró CUR en una dosis de 20 mg/kg disueltos en DMSO al 18% y su correspondiente grupo control administrado con vehículo. El DMSO es un disolvente que mejora la absorción de la CUR considerablemente (Perkins y cols., 2002). La administración se realizó por 5 días de la semana consecutivos, por un lapso 2 meses. Terminado el tratamiento, se evaluó la capacidad de aprendizaje y memoria mediante la prueba del laberinto acuático de Morris y la prueba de reconocimiento de objeto novedoso.. 6.3. Prueba del laberinto acuático de Morris.. El laberinto acuático de Morris es una técnica que nos permite evaluar la capacidad de aprendizaje y memoria de los animales. Es una prueba de nado forzado en donde los ratones deben encontrar una plataforma escondida en una piscina llena de agua. Según Morris (1984) el animal evaluado podría encontrar la plataforma nadando al azar o en rutas de búsqueda no sistemáticas a lo largo de la piscina; pero se ha observado que los animales normales aprenden muy rápidamente a nadar 15 | P á g i n a.

(22) directamente hacia la plataforma desde cualquier posición de partida en la circunferencia de la piscina. La direccionalidad precisa de su comportamiento de escape (y otras medidas de rendimiento) proporciona evidencia de que consiguen localizar la plataforma por el aprendizaje de la posición espacial con respecto a las señales visuales externas. Posteriormente se prueba la memoria mediante su capacidad de retención de la información al ser evaluados en el laberinto unos días después. El laberinto acuático consiste en una piscina circular con un diámetro de 40 cm y 50 cm de alto, dentro de la cual se encuentra una plataforma de 6 cm de diámetro y 50 cm de alto (figura 8). La piscina se llena de agua hasta una altura de 39 cm a una temperatura de 23 ± 2 °C. La piscina se divide en cuatro cuadrantes imaginarios (Norte, Sur, Este y Oeste), los cuales son tomados como puntos de partida y al mismo tiempo marcados con letras N, S, E y O respectivamente. La plataforma se mantiene siempre en una posición constante, a igual distancia del centro y el borde de la piscina. El agua se tiñe al 0.01% de blancos con dióxido de titanio. En cada ensayo, el ratón se coloca en el agua de frente a la pared de la piscina en una de las cuatro ubicaciones de partida. Los ensayos se registran en una cámara de video para ser analizados posteriormente. La prueba se desarrolló en dos fases (Lazcano y cols., 2014), una llamada fase de adquisición (o de aprendizaje) y otra llamada retención (o de memoria): -Fase de adquisición: Se realizaron 4 ensayos al día (uno por cada cuadrante) durante 5 días consecutivos, con un intervalo entre ensayos de aproximadamente 30 minutos. Esta fase consiste en introducir al animal en cada uno de los cuatro cuadrantes con el hocico apuntando hacia las paredes de la piscina para que busque la plataforma. Únicamente en el primer ensayo del primer día, si el animal no logra encontrar la plataforma después de 90 segundos, se guía manualmente hasta la localización de la plataforma, en la que permanece por 30 segundos más. Para los siguientes 3 ensayos de ese día y de los otros cuatro días restantes, la prueba termina cuando el animal encuentra la plataforma o cuando transcurrieron 90 segundos. Se considera que un animal ha encontrado la plataforma cuando permanece sobre ella 10 segundos.. 16 | P á g i n a.

(23) -Fase de retención: O también llamada memoria de largo plazo, se realiza sin la plataforma de escape dentro de la piscina. Se lleva a cabo 7 días después de haber terminado el último día de la fase de adquisición (día 12) y consiste de 4 ensayos en sólo un día de prueba. Los ensayos se realizan de la misma forma como se describieron anteriormente en la fase de adquisición sólo que sin la presencia de la plataforma.. Cuadrante Este. Cuadrante Sur. Cuadrante Norte. Cuadrante Oeste. Plataforma de escape Figura 8. Laberinto acuático de Morris. Se muestra la forma del laberinto de agua y el lugar donde se sitúa la plataforma sumergida (plataforma de escape). En el centro de las paredes de cada uno de los cuadrantes se colocan etiquetas con figuras que representa cada uno de los cuadrantes, siendo el triángulo el norte, el cuadrado el este, la cruz el sur y el circulo el oeste. En el centro del cuadrante oeste se coloca siempre la plataforma de escape.. 6.4. Prueba de reconocimiento de objeto novedoso (NOR). La prueba de NOR consiste en evaluar la capacidad que tienen los animales en recordar el objeto con el que han interactuado previamente y reconocer el objeto que es novedoso para ellos y pues no han tenido previo contacto con él. Esta prueba se lleva a cabo en una caja de actividad motora en campo abierto (figura 9) y se evalúa el tiempo que le dedica cada animal a dos objetos diferentes colocados en medio de la caja; esto se realiza en tres días diferentes de la siguiente manera (Carlini 2011):. 17 | P á g i n a.

(24) -Fase de habituación. El primer día consiste en colocar al animal en una caja de actividad motora y dejarlo explorarla durante 10 minutos. -Fase de aprendizaje. En el segundo día se coloca el animal en la caja de actividad motora junto con dos objetos idénticos colocados a distancias iguales con respecto a las paredes de la caja y entre ellos (objeto A y objeto A’) y se deja explorarla durante 6 minutos. -Fase de memoria a corto plazo. Dos horas después de la fase de aprendizaje, se coloca de nuevo al animal en la caja de actividad motora, dejando al objeto A y cambiando el objeto A’ por otro (objeto B), también permitiendo la libre exploración por 6 minutos. Ésta es la exposición al 1er objeto novedoso (el objeto B). -Fase de memoria a largo plazo En el tercer día (24 horas después de la exposición al 1er objeto novedoso) se coloca nuevamente al animal en la caja de actividad motora, dejando constante el objeto A y cambiando el objeto B por otro (objeto C), dejándolo explorar por 6 minutos. Ésta es la exposición al segundo objeto novedoso.. Figura 9. Reconocimiento de objeto novedoso. Se muestra la forma de la caja de actividad motora en campo abierto donde se realiza la prueba de NOR. Cada imagen representa cada uno de los ensayos que se realizan en la prueba como se describe anteriormente, siendo A el objeto constante, A’ el objeto idéntico, B el primer objeto novedoso y C el segundo objeto novedoso.. 18 | P á g i n a.

(25) Cada ensayo fue videograbado para su posterior análisis, en el cual se evalúa el tiempo que le dedica cada animal a cada objeto (tiempo de reconocimiento), además se evalúa el índice de discriminación de cada animal mediante la fórmula:. Í𝑛𝑑𝑖𝑐𝑒 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑠𝑐𝑟𝑖𝑚𝑖𝑛𝑎𝑐𝑖ó𝑛 =. 𝑡𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑜𝑏𝑗𝑒𝑡𝑜 𝑛𝑜𝑣𝑒𝑑𝑜𝑠𝑜 [𝑡𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑜𝑏𝑗𝑒𝑡𝑜 𝑛𝑜𝑣𝑒𝑑𝑜𝑠𝑜 + 𝑡𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑜𝑏𝑗𝑒𝑡𝑜 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒]. Después del periodo de pruebas de aprendizaje y memoria, cada ratón fue sedado usando pentobarbital sódico vía intraperitoneal para poder realizar una perfusión cardiaca por el ventrículo izquierdo del corazón para eliminar los eritrocitos de los vasos sanguíneos cerebrales con: •. SSI para el análisis de la densidad dendrítica mediante la tinción de Golgi-Cox.. •. Paraformaldehído. para. la. tinción. de. Nissl. y. las. técnicas. de. inmunofluorescencia.. 6.5. Técnica Golgi-Cox.. La tinción de Golgi-Cox es uno de los mejores métodos neurohistologicos para revelar la citoarquitectura del cerebro y la morfología de las neuronas de forma muy detallada. Se basa en el principio de impregnación metálica de las neuronas, lo que permite la visualización en su totalidad incluyendo soma, dendritas, y espinas. La técnica de perfusión para la tinción de Golgi-Cox (Gibb y Kolb, 1998) se llevó acabo con SSI. Los cerebros extraídos fueron almacenados de manera individual en frascos con solución de Golgi-Cox (K2Cr2O7 170 mM, HgCl2 200 mM, K2CrO4 200 mM) y almacenados en completa oscuridad durante 15 días. Posteriormente se realizó un recambio de solución de Golgi-Cox nueva en la que permanecieron otros 15 días. Transcurrido este periodo, los cerebros se colocaron en una solución de sacarosa al 30% durante 5 días. Por último, se procedió a cortar los cerebros utilizando un vibratomo manual motorizado, obteniendo rebanadas de 200 µm de tejido, las cuales fueron colocadas en laminillas previamente gelatinizadas. 19 | P á g i n a.

(26) Una vez obtenidos los cortes se procedió a revelarlos mediante la siguiente técnica: 1. Sumergir 30 min en hidróxido de amonio (en oscuridad). 2. 10 lavados con agua destilada (en oscuridad). 3. Sumergir 30 min en fijador rápido de Kodak, diluido en agua 1:3 (en oscuridad). 4. 10 lavados con agua destilada (en oscuridad). 5. Deshidratar el tejido sumergiéndolo en concentraciones crecientes de alcohol: a. - 10 min en alcohol al 75%. b. - 10 min en alcohol al 90%. c. - 30 min en alcohol absoluto. 6. Aclarar el tejido sumergiéndolo 15 min en xileno. 7. Montar con resina sintética.. 6.6. Análisis morfológico.. Con ayuda de un microscopio óptico marca Leica DM2000, a un aumento de 40x, se localizaron las regiones de interés mediante el atlas de referencias estereotáxicas del cerebro de ratón (Paxinos y Franklin, 2001) y se seleccionaron neuronas completamente teñidas y aisladas que permitieran apreciar completamente el árbol dendrítico (Gibb y Kolb., 1998). Con ayuda de una cámara lúcida acoplada al microscopio, se dibujaron las neuronas seleccionadas, 10 por cada región. Una vez trazados los segmentos dendríticos se procedió a su análisis mediante la técnica de Sholl, que consiste en diferenciar las dendritas según su orden dendrítico: las nacientes del soma se consideran de primer orden hasta su bifurcación, que serán consideradas de segundo orden, y las nacientes de la bifurcación de éstas últimas, serán de tercer orden y así sucesivamente. Después se coloca una plantilla transparente de círculos concéntricos, en donde el círculo central coincide con el soma, y se cuentan las intersecciones de cada orden dendrítico con cada uno de los círculos (figura 10). De este análisis se estimó la arborización total, el número de orden y la longitud dendrítica total (LDT).. 20 | P á g i n a.

(27) Figura 10. Análisis de Sholl. Los números en las dendritas de la derecha indican el orden dendrítico, que aumenta de valor cada vez que la dendrita se bifurca. Los anillos concéntricos de la izquierda forman la red para el análisis Sholl. El número de cruces de cada anillo de cada rama da una estimación de la longitud de la dendrita.. 6.7. Tipificación de espinas.. Las espinas dendríticas son proyecciones del citoesqueleto de las neuronas que son consideradas unidades integradoras, multifuncionales y complejas, que forman compartimentos neuronales especializados postsinápticos con receptores de neurotransmisores y canales iónicos, y cuya función altera las propiedades biofísicas de la neurona (Rasia-Filho y cols., 2012). El procedimiento utilizado para la tipificación de espinas fue el siguiente: Con ayuda de un aumento 2X modelo Leica acoplado al microscopio se identificó el tipo de espinas clasificadas en cinco categorías (figura 11) basadas en el tamaño de la cabeza y el cuello: •. Espinas de tipo hongo: Presentan una cabeza grande y cuello angosto. 21 | P á g i n a.

(28) •. Espinas de tipo delgadas: Con una cabeza más pequeña y un cuello angosto.. •. Espinas de tipo gruesas: Sin obvia constricción de la cabeza y la aproximación al eje dendrítico.. •. Espinas de tipo bifurcadas: Cuando tiene más de 2 cabezas una misma espina.. •. Espinas sin clasificación: Sin una morfología distintiva.. Figura 11. Clasificación de los diferentes tipos de espinas. Dependiendo de su forma, las espinas dendríticas pueden ser divididas dentro de 5 diferentes categorías. Tomado y modificado de Rasia-Filho y cols., 2012.. 6.8. Cortes en criostato.. Para llevar a cabo las técnicas de inmunofluorescencia y la estereología, se obtuvieron cortes de 20 µm y 50 µm de grosor respectivamente. Para esto, se llevó a cabo la perfusión intracardiaca para la extracción de cerebros libres de eritrocitos como se ha descrito previamente, incluyendo un lavado con paraformaldehído al 4% después de la solución salina 0.9%. Los tejidos se preservaron en paraformaldehído 4% por 15 días, posteriormente se realizó un proceso de crioprotección para evitar la formación de cristales en el tejido, colocando los cerebros en concentraciones crecientes de sacarosa, 10, 20 y 30%, 24 horas en cada solución. Por último, se colocaron en medio de montaje de Leica y se congelaron en el criostato (-20 a -21 ºC) para realizar los cortes. Las rebanadas obtenidas se recolectaron en portaobjetos previamente impregnados con silano.. 22 | P á g i n a.

(29) 6.9. Análisis estereológico.. El análisis estereológico de poblaciones neuronales se utiliza para estimar el número total de células en una región determinada con ayuda de la tinción de Nissl, la cual permite la visualización de todos los somas en secciones de tejido preparadas apropiadamente. Realizando un conteo representativo de células en las muestras teñidas, y asociándolo con el grosor del corte analizado y el número total de cortes realizados, se puede obtener un aproximado del número total de células en las áreas cerebrales de interés (Vázquez-Roque y cols., 2012). Para esto, a los cortes de 50 µm obtenidos en el criostato fueron tratados de la siguiente manera:. 1. Hidratar los tejidos en agua destilada por 30 segundos. 2. Sumergir en solución de violeta de cresilo por 8 minutos. 3. Deshidratar el tejido sumergiéndolo en concentraciones crecientes de alcohol: a. - 2 minutos en alcohol etílico al 95%. b. - 2 minutos en alcohol etílico absoluto. 4. Aclarar el tejido sumergiéndolo en xileno por 1 minuto. 5. Montar con resina sintética.. Una vez teñidos los tejidos, se realizó el análisis estereológico con ayuda de un disector óptico. Las células fueron muestreadas dentro del volumen de la CmPF y el Hp por seccionamiento óptico, a una distancia de 10 µm, usando un microscopio Olympus BH2 con una cámara digital de color unido a un sistema de análisis de imagen. asistido. por. computadora. DataCELL. (Stereo. Investigator. Sistem;. MicroBrightField, Williston, VT) para estereología. Para cada caso, se analizaron al menos. cuatro. secciones. aleatorias. dentro. de. un. área. determinada. de. aproximadamente 400 µm, y los resultados se promediaron y se expresaron como número total por milímetro cúbico (Vázquez-Roque y cols., 2012).. 23 | P á g i n a.

(30) 6.10 Inmunofluorescencia.. Para determinar la calidad de la comunicación neuronal y del estado inflamatorio del sistema nervioso central, se realizó la técnica de inmunofluorescencia para detectar la presencia de los marcadores neuronales, sinaptofisina y metalotioneína 3, y de astrogliosis, GFAP. Para esto, a los cortes de 20 µm obtenidos en el criostato fueron tratados de la siguiente manera:. 1. 3 lavados con PBS pH 7.4 por 10 minutos. 2. Bloqueo con ASB (Sigma) al 2 % en PBS durante 2 horas en una cámara húmeda a temperatura ambiente para evitar el marcaje inespecífico. 3. Permear los tejidos agregando detergente Tritón X-100 al 0.1 % en PBS durante 10 minutos. 4. 2 lavados con PBS pH 7.4 por 10 minutos 5. Incubar con el anticuerpo primario por 60 horas a 4°C. Los anticuerpos primarios se preparan siguiendo las diluciones indicadas en ASB al 1% en PBS:. -. anti-GFAP de cabra Abcam (Ab53554) (1:1000).. -. anti-Sinaptofisina-38 de ratón Abcam (Ab8049) (1:50).. -. anti-Metalotioneina-3 de cabra Santa Cruz biotechnology (SC164990) (1:50).. 6. 2 lavados con PBS pH 7.4 por 10 minutos. 7. Incubar con el anticuerpo secundario durante 2 horas a temperatura ambiente en cámara húmeda y protegidos de la luz. Los anticuerpos secundarios se preparan siguiendo las diluciones indicadas en ASB al 1% en PBS:. -. anti-Cabra conjugado con FITC (492-518 nm) (1:200).. -. anti-Ratón conjugado con Lisamina-Rodamina (540-570 nm) (1:200).. 8. 2 lavados con PBS pH 7.4 por 10 minutos. 24 | P á g i n a.

(31) 9. Montar con medio Vecta-Shield conjugado con DAPI (358-461 nm), un marcador fluorescente que se une a secuencias del DNA para poder distinguir los núcleos de las células. 10. Sellar las laminillas y se almacenarlas en oscuridad a 4ºC. El análisis de la inmunorreactividad de los anticuerpos en el Hp y la CmPF se realizó en un microscopio acoplado a una lámpara de mercurio y con los filtros: rojo, azul y verde (Leica, DM/LS). El registro de las imágenes observadas se captura por medio de una cámara digital (DFC – 300 FX) Leica, acoplada al microscopio y con los objetivos 20x y 40x. Las fotomicrografías obtenidas en formato JPEG, del software IM1000, se almacenaron y fueron posteriormente analizadas. El número de píxeles fue contado por cada ratón por medio de imágenes capturadas con una cámara digital Leica usando el software Image–J 64.. 25 | P á g i n a.

(32) 7. Resultados. 7.1. Pruebas de aprendizaje y la memoria.. 7.1.1 Prueba de laberinto acuático de Morris. En algunos de los sujetos se encontraron discapacidades físicas provocadas por la edad, debido a lo cual no todos los ratones se determinaron aptos para realizar la prueba. Los principales problemas encontrados fueron una marcada hipocinesia y la presencia de cataratas en uno o ambos ojos. Estas características afectan de manera significativa el desempeño de los animales durante la prueba, ya que la visión y la capacidad de nado son habilidades cruciales en este modelo. De esta manera, de los 24 animales que fueron administrados (12 vehículo y 12 CUR), 4 ratones del grupo vehículo y 1 del grupo CUR, fueron excluidos, resultando en una n de 8 vehículo contra 11 CUR. En la gráfica 1 se muestra en el eje y el tiempo (en segundos) que tomó a los animales alcanzar la plataforma de escape en el laberinto acuático de Morris (latencia de escape), durante los 5 días que duró la primera fase de la prueba (adquisición). V e h íc u lo C u r c u m in a. (s e g u n d o s ). L a te n c ia d e e s c a p e. 80. 60. 40. 20. 0 D ía 1. D ía 2. D ía 3. D ía 4. D ía 5. Gráfica 1. Tiempo de latencia en encontrar la plataforma de escape. Promedios ± EEM de los tiempos de latencia de cada grupo, por día. ANOVA de dos vías, post hoc Bonferroni, p<0.05; vehículo n= 8, CUR n=11.. 26 | P á g i n a.

(33) Se realizó una ANOVA de dos vías con un análisis post hoc de Bonferroni, se considerandose una p<0.05 como significativa. Aunque el grupo administrado con curcumina presentó una menor latencia durante todos los ensayos, los resultados del análisis de varianza, no mostraron una diferencia estadística al compararlo contra el. L a t e n c ia a l c r u c e. c o n la p la t a fo r m a (s e g ). grupo control (F=3.83; DFn=1, DFd=17, p=0.06).. 60. 40. * 20. 0 V e h íc u lo. C u r c u m in a. Gráfica 2. Tiempo de latencia al cruce con la plataforma. Promedios ± EEM de los tiempos de latencia de cada grupo en el día 12, t de Student, p<0.05; vehículo n= 8, CUR n=11.. 7.1.2 Prueba de reconocimiento de objeto novedoso (NOR).. Uno de los métodos utilizados para la evaluación de la capacidad de aprendizaje y memoria de los ratones fue mediante la prueba de NOR, la cual permite estudiar la memoria a corto y a largo plazo. En esta prueba se evalúa el tiempo de exploración que cada animal le dedica a diferentes objetos presentados ante él en un espacio abierto. Esta prueba nos permite evaluar la memoria no especial, utilizando la tendencia natural de los roedores a explorar objetos nuevos. Diferentes estudios demuestran que la capacidad de reconocimiento de objetos se ha relacionado estrechamente con el hipocampo como una de las estructuras implicadas en estas conductas (Cohen, 2015). En la gráfica 3 se muestran los resultados del índice de reconocimiento (IR) del objeto novedoso; el índice de reconocimiento se mide en una escala de 0 a 1, en donde un resultado entre 0 y 0.49 indica una preferencia por explorar el objeto conocido, 0.5 indica que no existe preferencia por alguno de los dos objetos, y un resultado entre 27 | P á g i n a.

(34) 0.51 y 1 indica que los ratones prefieren explorar el objeto novedoso (es decir, que recuerda al objeto familiar, por lo que pasa menos tiempo con éste). En el caso del grupo administrado con el vehículo, no se encontró diferencia estadística en ninguna de las tres fases debido a que los ratones de este grupo presentaron un índice mayor a 0.5 desde la fase 1 (de entrenamiento) y un índice similar en las siguientes dos fases. Sin embargo, el comportamiento que presentó el grupo tratado con CUR fue un comportamiento típico, es decir, en la fase 1 (entrenamiento) el índice de reconocimiento es de 0.51, lo que indica que exploraron ambos objetos sin distinción; en la fase 2 (2 horas después del entrenamiento) el índice de reconocimiento es de 0.78 y en la fase 3 (24 horas después) es de 0.68, lo que apunta hacia una mayor exploración del objeto novedoso, en comparación con el índice de la fase 1 (p=0.0009 y p=0.019, respectivamente).. *. Ín d ic e d e r e c o n o c im ie n to. 1 .0 0. *** 0 .7 5. 0 .5 0. 0 .2 5. 0 .0 0 F ase 1. F ase 2. V e h íc u l o. F ase 3. F ase 1. F ase 2. F ase 3. C u r c u m in a. Gráfica 3. Reconocimiento de objeto novedoso. Los valores indican el índice de reconocimiento a objetos a 0 hrs, 2 hrs y 24 hrs. Promedios ± EEM de los tiempos de latencia de cada grupo, por día La estadística se realizó mediante una prueba ANOVA de dos vías de medidas repetidas, post hoc Bonferroni tomando al tratamiento y el tiempo como variables independientes, con una n=3 animales/grupo; *p<0.05, ***p<0.001.. 28 | P á g i n a.

(35) 7.2. Análisis morfológico.. Una vez finalizadas las pruebas conductuales, se procedió al sacrificio y extracción de los cerebros para su análisis como se explica en la sección de metodología. Para el análisis morfológico de las neuronas, se realizó la tinción de Golgi-Cox y se dibujaron 10 neuronas por cada región del cerebro de cada uno de los 6 animales de cada grupo. Se dibujaron las regiones CA1, CA3, giro dentado y la capa III de la CmPF, es decir, 480 neuronas. Los parámetros evaluados mediante el análisis de Sholl fueron los siguientes: •. Arborización de las dendritas: nos permite visualizar la distribución de las dendritas desde que emergen del soma hasta la dendrita más alejada del cuerpo celular.. •. Longitud por orden dendrítico: en la que se puede observar la sumatoria en micrómetros de todos los segmentos de las dendritas por cada orden dendrítico.. •. Longitud dendrítica total: donde se representa la sumatoria de la longitud de los segmentos de todos los órdenes dendríticos.. Por otro lado, se estimó la densidad de espinas dendríticas al contar y promediar el número de espinas encontradas en 10 μm de la parte más distal de las dendritas y la tipificación de 100 espinas por neurona. Considerando las 600 neuronas analizadas por grupo, se obtuvo un total de 12000 espinas tipificadas por grupo de experimentación y por región cerebral.. 7.2.1 Morfología de la corteza media prefrontal. 6.2.1.1 Capa III En la gráfica del análisis de Sholl (gráfica 4-A) se puede observar la línea que describe la arborización del grupo CUR se encuentra por arriba de la línea del grupo vehículo. Esto significa que el grupo que tuvo tratamiento con CUR mostró tener neuronas más arborizadas que las que sólo recibieron vehículo (F=225.72; DFn=1; DFd=280; p<0.0001), especialmente a nivel de los órdenes 3 y 4 (F=28.67; DFn=1; DFd=70;. 29 | P á g i n a.

(36) p<0.0001), como se observa en la gráfica de longitud por número de orden (gráfica 4B). De igual manera, en la gráfica de longitud dendrítica total (gráfica 4-C) se muestra que las neuronas del grupo CUR son significativamente más largas que las del grupo vehículo (p=0.0003).. A) 18 #. #. 16. *. N ú m e ro d e s e g m e n to s. **. #. #. ***. #. **. 14. #. 12. #. 10 #. 8 6. ** V e h íc u lo. 4. C u rc u m in a. 2. 0. 0. 0 3. 0. 9. 8 2. 2. 0. 0 7. 2. 0 5. 6 2. 2. 4. 0. 0. 2. 2. 0. 3. 0. 2 2. 0. 1. 0 2. 2. 0. 0 9. 1. 0. 8. 7 1. 1. 0. 0 6. 1. 0. 5 1. 0. 4. 3 1. 1. 0. 0. 1. 2. 0. 1 1. 0. 0. 0. 1. 9. 8. 0. 0. 0 7. 6. 0. 5. 4. 0. 0. 0 3. 2. 1. 0. 0. D is t a n c ia a l s o m a (  m ). C). B) L o n g itu d d e n d rític a to ta l  S E M ( m ). 2500. 1000. L o n g itu d d e n d rític a  S E M ( m ). # 800. 600. # 400 V e h íc u lo C u rc u m in a. 200. ***. 2000. 1500. 1000. 500. 0. 0 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. V e h íc u lo. C u r c u m in a. Gráfica 4 A-C. Análisis de la morfología de las neuronas de la CmPF capa III. A) Arborización dendrítica. B) Longitud por número de orden. C) Longitud dendrítica total. Cada punto en las gráficas A) y B), así como las barras de la gráfica C), representan los promedios ± EEM para cada valor correspondiente. La estadística para las gráficas A) y B) se realizó mediante una prueba ANOVA de dos vías para datos pareados tomando al tratamiento y el tiempo como variables independientes post hoc Bonferroni. Para la gráfica C) se realizó una prueba t de Student. Se tomaron los valores de *p<0.05, **p<0.005, ***p<0.001, #p<0.0001 como significativos (n=60 neuronas por grupo).. 30 | P á g i n a.

(37) En el caso de las espinas dendríticas, (Gráfica 5-A), las neuronas piramidales de la capa III de la CmPF del grupo CUR presentan una densidad de espinas significativamente mayor a las del grupo vehículo (p=0.0005). Estas espinas son en su mayoría espinas del tipo delgadas en ambos grupos, sin embargo, el grupo CUR tiene un menor porcentaje de estas espinas en comparación con el grupo vehículo y, en consecuencia, una mayor proporción de espinas gruesas (gráfica 5-B).. A). B). *** 10. 5. P o rc e n ta je d e e s p in a s  S E M. P r o m e d io d e e s p in a s / 1 0 µ m ( ± S E M ). 80. #. 15. 60. ***. 40. V e h íc u lo 20. C u rc u m in a. 0. 0 V e h íc u lo. C u r c u m in a. Ho ngo. D e lg a d a. G rue s a. S in C la s if ic a r. B if u r c a d a. Gráfica 5 A-B. Densidad y tipificación de las espinas dendríticas de la CmPF capa III. A) Densidad de espinas dendríticas. B) Tipificación de espinas dendríticas. Cada barra de las gráficas A) y B) representan los promedios ± EEM para el promedio de la densidad de espinas dendríticas y el porcentaje de tipo de espinas respectivamente. La estadística para la gráfica A) se realizó una prueba t de Student y para B) se realizó mediante una prueba ANOVA de dos vías para datos pareados tomando al tratamiento y el tipo de espinas como variables independientes post hoc Bonferroni. Se tomaron los valores de ***p<0.001, #p<0.0001 como significativos (n=60 neuronas por grupo).. 7.2.2 Morfología del hipocampo.. 6.2.1.1 CA1. Las gráficas resultantes del análisis de la morfología de las neuronas piramidales de la región CA1 del hipocampo se muestran en la gráfica 6. En esta región no se encontraron cambios en la arborización dendrítica (gráfica 6-A) después de realizar el análisis de Sholl (F=0.73; DFn=1; DFd=280; p=0.39); tampoco en la longitud por número de orden (F=0.16; DFn=1; DFd=70; p=0.69) y la longitud dendrítica total (p=0.73), como se muestra en las gráficas 6 A) y B).. 31 | P á g i n a.

(38) A) 25. N ú m e ro d e s e g m e n to s. 20. 15. 10. V e h íc u lo C u rc u m in a. 5. 0. 0. 0. 9 2. 3. 0 2. 8. 0. 0. 7 2. 0. 6 2. 0 4. 5 2. 2. 3. 0. 0. 2. 2. 0. 2. 0. 1 2. 0. 0. 9 1. 2. 0. 0. 1. 8. 0. 7. 6 1. 1. 0. 0 5. 1. 0 1. 4. 0. 3 1. 0 1. 2. 0. 1 1. 0. 0. 0. 1. 9. 8. 0. 0 7. 6. 0. 0 5. 4. 0. 0. 0 3. 2. 1. 0. 0. D is ta n c ia a l s o m a ( m ). B). C) 2500 L o n g itu d d e n d rític a to ta l  S E M ( m ). L o n g itu d d e n d rític a  S E M ( m ). 750. 600. 450 V e h íc u lo C u rc u m in a 300. 150. 0. 2000. 1500. 1000. 500. 0 1. 2. 3. 4 O rd e n d e n d rític o. 5. 6. 7. V e h íc u lo. C u r c u m in a. Gráfica 6 A-C. Análisis de la morfología de las neuronas de la región CA1 del hipocampo. A) Arborización dendrítica. B) Longitud por número de orden. C) Longitud dendrítica total. Cada punto en las gráficas A) y B), así como las barras de la gráfica C), representan los promedios ± EEM para cada valor correspondiente. La estadística para las gráficas A) y B) se realizó mediante una prueba ANOVA de dos vías para datos pareados tomando al tratamiento y el tiempo como variables independientes post hoc Bonferroni. Para la gráfica C) se realizó una prueba t de Student (n=60 neuronas por grupo).. En cuanto a las espinas dendríticas de la región CA1 (Gráfica 7-A), las neuronas piramidales presentan una densidad de espinas significativamente mayor a las del grupo vehículo (p=0.0047). Igual que en las neuronas de la corteza, las espinas son clasificadas mayoritariamente como espinas delgadas en ambos grupos (gráfica 7-B), pero el grupo CUR tiene un menor porcentaje de este tipo de espinas en comparación al grupo vehículo (p=0.0017), y también un mayor porcentaje de espinas gruesas (p=0.00022). 32 | P á g i n a.

(39) B). A). 80. **. ** 10. 5. P o rc e n ta je d e e s p in a s  S E M. P ro m e d io d e e s p in a s /1 0 µ m ( ± S E M ). 15. 60. *** 40. V e h íc u lo C u rc u m in a. 20. 0. 0 V e h íc u lo. C u r c u m in a. Ho ngo. D e lg a d a. G rue s a. S in C la s if ic a r. B if u r c a d a. Gráfica 7 A-B. Densidad y tipificación de las espinas dendríticas de la región CA1 del hipocampo. A) Densidad de espinas dendríticas. B) Tipificación de espinas dendríticas. Cada barra de las gráficas A) y B) representan los promedios ± EEM para el promedio de la densidad de espinas dendríticas y el porcentaje de tipo de espinas respectivamente. La estadística para la gráfica A) se realizó una prueba t de Student y para B) se realizó mediante una prueba ANOVA de dos vías para datos pareados tomando al tratamiento y el tipo de espinas como variables independientes post hoc Bonferroni. Se tomaron los valores de **p<0.005, ***p<0.001, como significativos (n=60 neuronas por grupo).. 7.2.1.1 CA3. Los resultados del análisis de la morfología de las neuronas piramidales de la región CA3 del hipocampo se muestran en la gráfica 8. De manera similar a las neuronas de CA1, la arborización dendrítica del grupo CUR de la región CA3, es mayor en comparación a la del grupo vehículo (F=36.78; DFn=1; DFd=280; p<0.0001) (Gráfica 8-A). Este incremento en la arborización corresponde a una mayor longitud dendrítica en los órdenes 3 y 4 (F=9.29; DFn=1; DFd=80; p<0.003), tal y como se observa en la gráfica de longitud por número de orden (figura 8-B). A pesar del incremento en la arborización dendrítica del grupo CUR en los órdenes antes mencionados, no se encontró una diferencia estadística en la longitud dendrítica total (p=0.0822). (Gráfica 8-C).. 33 | P á g i n a.

(40) A) 14. N ú m e ro d e s e g m e n to s. 12. 10. * 8. 6. 4. V e h íc u lo C u rc u m in a. 2. 0. 0 0. 3. 0. 9 2. 0. 8. 7 2. 2. 0. 0 6. 2. 0. 5 2. 0. 4 2. 0. 3 2. 0. 2. 1 2. 2. 0. 0 0. 2. 0. 9 1. 0. 8 1. 1. 7. 0. 0. 6 1. 0. 5 1. 0. 4 1. 0. 3. 2 1. 1. 0 1. 1. 0. 0. 0. 0. 1. 9. 0. 0. 8. 7. 6. 0. 0 5. 0. 0. 4. 3. 0. 2. 1. 0. 0. D is ta n c ia a l s o m a ( m ). B). C) L o n g itu d d e n d rític a to ta l  S E M ( m ). L o n g itu d d e n d rític a  S E M ( m ). 1500. *. 450. * 300. V e h íc u lo C u rc u m in a. 150. 0 1. 2. 3. 4 O rd e n d e n d rític o. 5. 6. 7. 1200. 900. 600. 300. 0 V e h íc u lo. C u r c u m in a. Gráfica 8 A-C. Análisis de la morfología de las neuronas de la región CA3 del hipocampo. A) Arborización dendrítica. B) Longitud por número de orden. C) Longitud dendrítica total. Cada punto en las gráficas A) y B), así como las barras de la gráfica C), representan los promedios ± EEM para cada valor correspondiente. La estadística para las gráficas A) y B) se realizó mediante una prueba ANOVA de dos vías tomando al tratamiento y el tiempo como variables independientes post hoc Bonferroni. Para la gráfica C) se realizó una prueba t de Student Se tomaron los valores de *p<0.05, como significativos (n=60 neuronas por grupo).. Como puede observarse en la gráfica de densidad de espinas dendríticas (Gráfica 9A), las neuronas piramidales de la región CA3 de las neuronas del grupo CUR presentan una densidad de espinas significativamente mayor a las del grupo vehículo (p<0.0001).. 34 | P á g i n a.

Figure

Figura 1. Comparación de la composición de la población por sexo y edad.
Figura 2. Regiones del hipocampo.
Figura 3. Esquema de los circuitos en el hipocampo.
Figura 4. Regiones del hipocampo.
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Referencias

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