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EFEITO NEUROTÓXICO DO EXTRATO CONTENDO ANATOXINA A(S) EM NAUPHOETA CINEREA: COMPARAÇÃO COM O ORGANOFOSFORADO TRICLORFON

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Academic year: 2020

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(1)EFEITO NEUROTÓXICO DO EXTRATO CONTENDO ANATOXINA-A(S) EM NAUPHOETA CINEREA: COMPARAÇÃO COM O ORGANOFOSFORADO TRICLORFON. Maria Eduarda Rosa 1 Ernani Pinto 2 Kelly Fernandes 3 Douglas S dos Santos 4 Cháriston André Dal Belo 5 Velci Queiróz de Souza 6. Resumo: INTRODUÇÃO: A anatoxina-a(s) é uma potencial cianotoxina de risco biológico, na qual o mecanismo baseia-se na inibição da enzima acetilcolinesterase (AChE). Existe uma carência de estudos que demonstrem a relação entre a atividade biológica da anatoxina-a(s) e de organofosforados químicos sobre o sistema nervoso de insetos e outros animais. Este estudo teve como objetivo investigar o mecanismo de interação entre o extrato contendo anatoxina-a(s) (ECATAS) sobre o sistema nervoso de Nauphoeta cinerea, comparando com o organofosforado Triclorfon (TN). METODOLOGIA: O extrato contendo Anatoxinaa(s) utilizado foi cordialmente cedido pelo Dr. Ernani Pinto, da Universidade de São Paulo. Como modelo experimental, foram utilizadas baratas adultas da espécie Nauphoeta cinerea. As preparações do nervo-músculo coxal-adutor metatorácico foram montadas como descrito por Martinelli et al. (2014). Os ensaios de locomoção foram realizados como descrito por Adedara et al. (2015). A avaliação do comportamento de grooming foi realizada de acordo com Sturmer et al. (2014). Os resultados foram expressos como a média ± erro padrão da média (EPM). A análise estatística foi realizada através da análise de variância One Way ANOVA, seguida pelo teste de Dunnett, e as diferenças foram consideradas estatisticamente significantes quando p Palavras-chave: anatoxina-a(s); triclorfon; neurotoxicidade; contaminação; insetos. Modalidade de Participação: Iniciação Científica. EFEITO NEUROTÓXICO DO EXTRATO CONTENDO ANATOXINA-A(S) EM NAUPHOETA CINEREA: COMPARAÇÃO COM O ORGANOFOSFORADO TRICLORFON 1 Aluno de graduação. rosaedumaria@gmail.com. Autor principal 2 Professor. ernani@usp.br. Co-autor 3 Pós-gradução. kelly.af@usp.br. Co-autor 4 Pós-graduação. dougllasbio@yahoo.com.br. Co-autor 5 Docente. charistonbelo@unipampa.edu.br. Orientador 6 Professor. velciq@ufsm.br. Co-orientador. Anais do 10º SALÃO INTERNACIONAL DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO - SIEPE.

(2) EFEITO NEUROTÓXICO DO EXTRATO CONTENDO ANATOXINA-A(S) EM Nauphoeta cinerea: COMPARAÇÃO COM O ORGANOFOSFORADO TRICLORFON 1 INTRODUÇÃO As cianobactérias são microrganismos fotossintéticos primitivos presentes em ambientes aquáticos e desempenham um importante papel na oxigenação da atmosfera terrestre (DISMUKES et al., 2001). Estes microrganismos têm despertado enorme interesse devido ao aumento de sua ocorrência, sua ampla distribuição e ao número de notificações de toxicidade através da disseminação de seus metabólitos secundários nocivos, especialmente em ambientes aquáticos (CHORUS e BARTRAM, 1999). Além das microcistinas hepatotóxicas e das saxitoxinas neurotóxicas, as cianobactérias também produzem anatoxinas (RASTOGI et al., 2015). Estes últimos compostos são subdivididos em dois grupos principais: anatoxinas-a e anatoxinas-a(s) (CARMICHAEL et al., 1990). A anatoxina-a(s) é uma cianotoxina neurotóxica, sendo considerada o único organofosforado de ocorrência natural, produzida como metabólito secundário de cianobactérias dos gêneros Anabaena, Aphanizomenon e Lyngbya (MAHMOOD e CARMICHAEL, 1987). Esta cianotoxina compartilha com outros compostos organofosforados como por exemplo o Triclorfon, a mesma atividade inibitória sobre a enzima acetilcolinesterase (AChE) (STÜRMER et al., 2014). Como a AChE é responsável pela hidrólise da acetilcolina (ACh), sua inibição leva ao acúmulo desse neurotransmissor nas terminações nervosas, incluindo as junções neuromusculares. Essa exacerbação colinérgica, afeta o sistema nervoso autônomo parassimpático, até atingir os sistemas nervoso simpático e nervoso central (ECOBICHON, 2001). No entanto, existe uma carência de estudos que demonstrem a relação entre a atividade biológica da anatoxina-a(s) e de organofosforados químicos sobre o sistema nervoso de insetos e outros animais (RODRÍGUEZ et al., 2012). Este estudo teve como objetivo investigar o mecanismo de interação entre o extrato de Anabaena spiroides contendo anatoxina-a(s) (ECATAS) sobre o sistema nervoso central e periférico de Nauphoeta cinerea, comparando com o organofosforado Triclorfon (TN) em ensaios in vivo e in vitro. 2 METODOLOGIA O extrato contendo Anatoxina-a(s) utilizado foi cordialmente cedido pelo Dr. Ernani Pinto, da Universidade de São Paulo - USP, São Paulo, Brasil. Como modelo experimental, foram utilizadas baratas adultas da espécie Nauphoeta cinerea de ambos sexos, mantidas em insetário com temperatura (25-27°C) e luminosidade controladas, com água e alimento ad libitum. Todos os ensaios envolvendo animais foram previamente aceitos pela Comissão de Ética no Uso de Animais da UNIPAMPA-CEUA, sob número de protocolo 043/2015, com vigência até 01/2019. As preparações do nervo-músculo coxal-adutor metatorácico foram montadas como descrito por Martinelli et al. (2014). Os ensaios de locomoção foram realizados como descrito por Adedara et al. (2015), adaptado por Leal et al., (2018). A avaliação do comportamento de grooming foi realizada de acordo com Sturmer et al. (2014). Os resultados foram expressos como a média ± erro padrão da média (EPM). A análise estatística foi realizada através da análise de variância One Way ANOVA, seguida pelo teste de Dunnett, utilizando o software GraphPad Prism 6.0 (Software Inc., San Diego, CA), e as diferenças foram consideradas estatisticamente significantes quando p< 0.05. 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO Anais do 10º SALÃO INTERNACIONAL DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO - SIEPE Universidade Federal do Pampa œ Santana do Livramento, 6 a 8 de novembro de 2018.

(3) R e s p o s t a c o n tr á til (% ). A atividade do ECATAS (5, 25 e 50 µg / g animal) nas preparações do nervo-músculo coxal-adutor metatorácico de N. cinerea foi avaliada pela medida das respostas contráteis (Figura 1). A administração de solução salina de insetos isoladamente não interferiu nas respostas neuromusculares durante os 90 minutos de registro (n = 6). A administração de diferentes concentrações do ECATAS induziu um bloqueio não-dependente da dose nos 90 minutos de registro. Quando ECATAS (5 µg / g animal) foi testado, observou-se aproximadamente 100% de bloqueio da resposta contrátil em 80 minutos (n = 6, p <0,05). A dose de (25 J J animal) do ECATAS também induziu uma inibição significativa da resposta contrátil que foi máxima (43.35 ± 1%), após 70 minutos. Com a dose mais elevada (50 J / g animal), houve um efeito facilitador transitório (10.6 ± 0.2%), nos primeiros 10 minutos de registro, seguido por um bloqueio neuromuscular irreversível e progressivo (45.64 ± 0.05%). O efeito da administração de TN (0,3 µg / g animal) pode ser comparado ao do ECATAS (25µg / g animal), sugerindo assim o potencial efeito neurotóxico que o extrato contendo anatoxina-a(s) possui sobre o sistema nervoso periférico de N. cinerea. 120. C o n tr o le s a lin a. 100. E C A T A S 5 µ g /g a n im a l. T N 0 .3 µ g /g a n im a l. *. 80. *** ***. 60 ***. 40. ***. *** ***. E C A T A S 2 5 µ g /g a n im a l. **. **. *** ***. ***. *** ***. *** ***. *** *** ***. ***. ***. ***. ***. 60. 70. 80. 90. *** ***. 20. ***. 0 0. 10. 20. E C A T A S 5 0 µ g /g a n im a l. *** *** ***. 30. 40. 50. 100. T e m p o (m in .). FIGURA 1. Comparação do bloqueio neuromuscular induzido por ECATAS e TN em preparação in vivo de baratas da espécie N. cinerea, *p<0.05, ****p<0.0001, (n=6). Os inseticidas são reconhecidos por exercerem três efeitos principais sobre o sistema nervoso de insetos, dos quais (1) neuroexcitação que resulta em hiperatividade, (2) movimentos espontâneos e descoordenados, seguido de paralisia e (3) bloqueio neuromuscular (RATTAN, 2010). Sendo assim, é possível inferir que o bloqueio neuromuscular por ECATAS comparado ao mesmo efeito do bloqueio por TN está relacionado com a interação de interneurônios colinérgicos e GABAérgicos, uma vez que existe uma intrínseca relação entre interneurônios colinérgicos com outros interneurônios que utilizam monoaminas (como por exemplo: octopamina, glutamato e gaba) (CARRAZONI et al., 2016). A administração do ECATAS H J J animal) em N. cinerea induziu uma série de alterações significativas nos padrões locomotores normais em baratas (Figura 2). Assim, os valores de controle para distância percorrida, episódios imóveis e tempo parado foram 481,6cm, 461n e 45,9%, respectivamente. Neste experimento foi possível observar que a máxima diminuição na distância percorrida foi obtida com a administração de TN (0,3 µg / g animal), enquanto que a administração do ECATAS inibiu este parâmetro de forma inversamente proporcional (5> 25> 50 µg / g animal) (n = 30, p <0,05). No entanto, o aumento máximo de episódios imóveis foi obtido com as doses de (5 e 25 µg / g animal) do ECATAS, que pode ser comparado ao mesmo efeito induzido por TN (0,3 µg / g animal). Enquanto que o ECATAS (50 µg / g animal) não alterou este parâmetro. Também foi possível observar que o aumento máximo do tempo parado foi obtido com as doses de (5 e 25 µg / g animal) do ECATAS cujo efeito possui a mesma extensão da administração de TN (0,3 µg / g Anais do 10º SALÃO INTERNACIONAL DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO - SIEPE Universidade Federal do Pampa œ Santana do Livramento, 6 a 8 de novembro de 2018.

(4) 600 500 400 300. ***. ***. ****. 200 100 0. C o n tr o le. T r ic lo r f o n. ECATAS. ECATAS. ECATAS. s a lin a. 0 ,3 µ g /g. 5 µ g /g. 2 5 µ g /g. 5 0 µ g /g. a n im a l. a n im a l. a n im a l. a n im a l. E p is ó d io s d e im o b ilid a d e (n ). D is t â n c ia p e r c o r r id a ( c m ). animal), enquanto que a concentração de (50 µg / g animal) do ECATAS não alterou o tempo de parada (n = 30, p <0,05, respectivamente para TN e ECATAS 5 e 25 / g animal).. 1000. ****. 800. ****. ****. 600 400 200 0. C o n tr o le. T r ic lo r f o n. ECATAS. ECATAS. ECATAS. s a lin a. 0 ,3 µ g /g. 5 µ g /g. 2 5 µ g /g. 5 0 µ g /g. a n im a l. a n im a l. a n im a l. a n im a l. T e m p o d e p a r a d a (% ). 100 80. ****. ****. ***. C o n tr o le. T r ic lo r f o n. ECATAS. ECATAS. ECATAS. s a lin a. 0 ,3 µ g /g. 5 µ g /g. 2 5 µ g /g. 5 0 µ g /g. a n im a l. a n im a l. a n im a l. a n im a l. 60 40 20 0. FIGURA 2. Comparação do efeito entre ECATAS e TN sobre o comportamento exploratório de Nauphoeta cinerea. (A) distância total percorrida, (B) número de episódios de imobilidade e (C) tempo de parada em porcentagem, ****p<0.0001, (n=30). A medida da atividade de grooming (atividade de limpeza de N. cinerea) foi feita por meio da observação comportamental dos animais em um Open Field, durante um período de 30 minutos (Figura 3). Os tratamentos (5, 25 e 50 µg /g animal) do ECATAS induziram alterações significativas no comportamento dos insetos, em comparação ao controle. Com a menor concentração do ECATAS (5 J / g animal) observou-se um aumento significativo do tempo de grooming de perna (252 ± 10s) e antena (46 ± 8s). A concentração intermediária (25 µg / g animal) induziu o maior aumento no tempo de grooming de pernas e antenas em comparação com as outras doses, respectivamente (312 ± 12s e 62 ± 6s). Enquanto que não se observou alterações no comportamento com a administração da maior concentração do ECATAS (50 J / g animal). O efeito do TN foi testado em comparação com o efeito neurotóxico provocado por ECATAS. Assim, quando o 71 J J animal) foi injetado, o tempo gasto na limpeza das pernas aumentou (261,77s) bem como o tempo gasto na limpeza das antenas (131s) (n = 30; p <0,05). Os resultados com ECATAS mostraram um efeito significativo na atividade de limpeza de pernas e antenas, sugerindo um forte envolvimento da modulação octopaminérgica e dopaminérgica, assim como, o efeito do TN.. Anais do 10º SALÃO INTERNACIONAL DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO - SIEPE Universidade Federal do Pampa œ Santana do Livramento, 6 a 8 de novembro de 2018.

(5) P e rn a. T e m p o d e g r o o m in g ( s ). 450. A n te n a. 400. ****. 350. ****. 300. ****. ****. 250 200. ****. 150 100. 0. ****. *. 50 C o n tr o le. T r ic lo r f o n. ECATAS. ECATAS. ECATAS. s a lin a. 0 ,3 µ g /g. 5 µ g /g. 2 5 µ g /g. 5 0 µ g /g. a n im a l. a n im a l. a n im a l. a n im a l. FIGURA 3. Comparação na modulação do tempo de grooming pela administração do ECATAS e TN, *p<0.05, ****p<0.0001, (n=30). 4 CONSIDERAÇÕES FINAIS O presente estudo demonstrou que um composto organofosforado de origem natural como a anatoxina-a(s) induz alterações relevantes no sistema nervoso de insetos como de N. cinerea, podendo ser comparado a um potente organofosforado químico como o Triclorfon. Os resultados validam a Nauphoeta cinerea como modelo alternativo para a detecção da presença da contaminação de anatoxina-a(s) e de outros organofosforados sintéticos. Além disso, a anatoxina-a(s) demonstrou seu potencial biotecnológico para futuros estudos com a finalidade de desenvolver inseticidas naturais e medicamentos para doenças neurodegenerativas. 5 REFERÊNCIAS ADEDARA, A. I., ROSEMBERG B. D., SOUZA O. D., KAMDEM P. J., FAROMBI O. E., ASCHNER M., et al., Biochemical and behavioral déficits in the lobster cockroach Nauphoeta cinerea model of methylmercury exposure. Toxicol. Res., v.4, p. 442-451, 2015. CARMICHAEL, W.W., MAHMOOD, N.A., HYDE, E.G., 1990. Natural toxins from cyanobacteria, in: Sherwood, H., Strichartz, G. (Eds.), Marine Toxins- Origin, Structure and Molecular Pharmacology. American Chemical Society, pp. 87±106. CARRAZONI T., HEBERLE A. M., PERIN A. P. A., ZANATTA P. A., RODRIGUES V. P., et al., Central and peripheral neurotoxicity induced by the Jack Bean Urease (JBU) in Nauphoeta cinerea cockroaches. Toxicology v. 368, p.162±171, 2016. CHORUS, I., BARTRAM, J. Toxic Cyanobacteria in Water: A guide to their public health consequences, monitoring and management, First edit. ed. E & FN Spon, an imprint of Routledge 11 New Fetter Lane, London EC4P 4EE, London, 1999. DISMUKES, G.C., KLIMOV, V. V., BARANOV, S. V., KOZLOV, Y.N., DASGUPTA, J., TYRYSHKIN, A., 2001. The origin of atmospheric oxygen on Earth: The innovation of oxygenic photosynthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. 98, 2170±2175. Anais do 10º SALÃO INTERNACIONAL DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO - SIEPE Universidade Federal do Pampa œ Santana do Livramento, 6 a 8 de novembro de 2018.

(6) ECOBICHON, D.J., 2001. Toxic Effects of Pesticides, in: Klaassen, C.D. (Ed.), Casarett and 'ROO¶V 7R[LFRORJ\: The Basic Science of Poisons. McGraw-Hill, New York, pp. 769±84. MAHMOOD, N.A., CARMICHAEL, W.W., 1987. Anatoxin-a(s), an anticholinesterase from the cyanobacterium Anabaena flos-aquae, NRC-525-17. Toxicon 25, 1221±1227. MARTINELLI, A.H.S., et al. Structure-function studies on jaburetox, a recombinant insecticidal peptide derived from jack bean (Canavalia ensiformis) urease. Bioch. Biophys. Acta 1840, 935±944, 2014. RASTOGI, R.P., MADAMWAR, D., INCHAROENSAKDI, A., 2015. Bloom dynamics of cyanobacteria and their toxins: Environmental health impacts and mitigation strategies. Front. Microbiol. 6, 1±22. RATTAN, R.S. Mechanism of action of insecticidal secondary metabolites of plant origin. Crop Prot. 29, 913±920, 2010. RODRÍGUEZ, V., MORI, B., DÖRR, F.A., DAL BELO, C.A., PINTO, E., 2012. Effects of a cyanobacterial extract containing anatoxin-a (s) on the cardiac rhythm of Leurolestes circunvagans. Brazilian J. Pharmacogn. 22, 775±781. STÜRMER, G.D., et al. Modulation of dopaminergic neurotransmission induced by sublethal Doses of the organophosphate trichlorfon in cockroaches. Ecotoxicol. Environ. Saf. 109, 56±62, 2014.. Anais do 10º SALÃO INTERNACIONAL DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO - SIEPE Universidade Federal do Pampa œ Santana do Livramento, 6 a 8 de novembro de 2018.

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FIGURA 1. Comparação do bloqueio neuromuscular induzido por ECATAS e TN em  preparação in vivo de baratas da espécie N
FIGURA 2. Comparação do efeito entre ECATAS e TN sobre o comportamento  exploratório de Nauphoeta cinerea
FIGURA 3. Comparação na modulação do tempo de grooming pela administração do  ECATAS e TN, *p&lt;0.05, ****p&lt;0.0001, (n=30)

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