MMeemmoorriiaa ddee PPrrááccttiiccaass

(1)

M M e e m m o o r r i i a a d d e e P P r r á á c c t t i i c c a a s s

1 1 º º c c u u r r s s o o G G r r a a d d o o d d e e B B i i o o l l o o g g í í a a

U U S S C C

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Curso 2009-2010

Coordinadores: Óscar J. Cordero, Ana Viñas, Jaime Gómez-Márquez

Autores: Emilia Rebolledo, Rosa Ana Sueiro, Francisco de la Torre, María Teresa Herrera, Javier Sampedro, Fátima Adrio, Francisco Salgado,

Jesús Aboal, Carmen Leirós, Carmen

Bermejo

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1. MANEJO DE REACTIVOS, APARATOS

BÁSICOS, PREPARACIÓN DE SOLUCIONES, Y BIENESTAR ANIMAL……... 1

2. TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN Y MEDIOS DE CULTIVO Y CONSERVACIÓN DE

MICROORGANISMOS... 19

3. TÉCNICAS DE CROMATOGRAFÍA Y

ESPECTROFOTOMETRÍA... 37

4. TÉCNICAS HISTOLÓGICAS Y

MICROSCOPIA ... 45

5. TÉCNICAS DE CENTRIFUGACIÓN Y

ELECTROFORESIS .………... 53

6. MEDIO FÍSICO Y TÉCNICAS DE

CARTOGRAFÍA ... 65

7. MÉTODO CIENTÍFICO Y TÉCNICAS DE

MUESTREO... 69

8. CONTENIDOS DE BIBLIOTECA ... 113

Í Í N N D D I I C C E E D D E E C C O O N N T T E E N N I I D D O O S S

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(5)

APARATOS BÁSICOS, PREPARACIÓN DE

SOLUCIONES, Y

BIENESTAR ANIMAL

(código calendario de prácticas: FA)

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INSTRUMENTOS BÁSICOS DE MEDIDA

BALANZAS DE LABORATORIO Y PIPETAS

1. Objetivo

1.1 Consideraciones prácticas y manejo de una balanza de precisión de calibración externa.

1.2 Consideraciones prácticas y manejo de pipetas. Pipetas automáticas, fijas y variables.

Pipetas repetitivas

2. Introducción

La fisiología y otras ramas de la biología son ciencias cuantitativas que requieren de un sistema de medición estandarizado (SI: sistema internacional de unidades) e instrumentos de medición precisa.

2.1 Balanzas de laboratorio

Uno de los instrumentos de medida más usados en el laboratorio es la balanza, utilizada para medir cantidades pequeñas de masa.

La masa, propiedad característica de los cuerpos, es la cantidad de materia de una sustancia o material. Concepto diferente al de peso: fuerza de la atracción gravitatoria que la Tierra ejerce sobre la materia.

La balanza compara la masa desconocida de una sustancia con la masa de un patrón o patrones de referencia (internos o externos), sometidas ambas a la misma aceleración debida a la gravedad. Al proceso de comparar masas se denomina pesada.

El rasgo que define a las balanzas de laboratorio es el de la precisión junto al de alta resolución.

Una vez calibradas, tienen también un alto grado de exactitud.

(8)

Exactitud: grado de concordancia entre el valor real y el valor medido.

Precisión: capacidad de dar el mismo resultado en mediciones diferentes realizadas en las mismas condiciones. Grado de concordancia o repetitividad de un resultado.

Una balanza será precisa cuando diferentes medidas de una misma magnitud sean muy parecidas. Una medida común de la variabilidad es la desviación estándar de las mediciones.

Resolución: incremento de peso más pequeño que permite diferenciar una medida de otra

Legibilidad: división más pequeña en la pantalla de la balanza

2.1.1 Tipos de balanzas

Las balanzas de laboratorio varían en su capacidad máxima de carga y en su legibilidad, y se clasifican como

1. Microbalanzas: capacidad de 0,5-3 g; legibilidad de 0,001 mg

2. Balanzas semimicro: capacidad 30-150 g, según la casa comercial, y legibilidad de 0,01 mg 3. Balanzas analíticas: 60 -250 g y legibilidad de 0,1 mg

4. Balanzas de precisión: capacidad de carga de 80 - 600 g; legibilidad 0,001g- 0,1 g

Microbalanza Balanza analítica Balanzas de precisión

Algunas balanzas, del tipo 2-4, tienen capacidad y legibilidad dual: pueden aumentar su capacidad disminuyendo su legibilidad o disminuir su capacidad y aumentar su legibilidad.

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2.1.2 Consideraciones prácticas en medidas de masa

1. Localización de la balanza

a) En una sala con una entrada, el mínimo número de ventanas. Evitar la luz directa del sol y corrientes de aire. Evitar choques y vibraciones.

Si las balanzas están ubicadas en lugares con alto grado de vibración, se recomienda colocarlas sobre mesas antivibraciones (fabricadas en granito masivo, la amortiguación por aire evita todo tipo de oscilaciones y vibraciones de una forma efectiva).

b) Mantener la temperatura de la sala constante. Humedad entre 45 - 60%.

c) Realizar las medidas lejos de fuentes de calor y de aparatos que utilicen ventiladores.

2. Cuidados básicos

a) Comprobar que la cámara de medida y el plato estén limpios b) Verificar siempre la nivelación de la balanza

c) Conectar y esperar tiempo de calentamiento. Si se deja en el modo “stand by” se evita posteriores esperas

d) Usar siempre un pesasustancias o frasco de la menor medida posible, limpios y secos e) No usar frascos de plástico cuando la humedad esté por debajo del 30 - 40%

f) La temperatura del frasco y su contenido deben de estar a la misma temperatura del ambiente de la cámara de medida. Las diferencias de temperatura causan corrientes de aire

g) Evitar el contacto directo de los dedos al poner o sacar los pesasustancias o frascos de la cámara de medida

h) Poner el pesasustancias o frasco en el centro del plato de medida

i) Verificar si el mostrador indica cero al empezar la operación. Tarar la balanza si fuese necesario j) Calibrar la balanza regularmente si los patrones de referencia son externos. Las balanzas analíticas de precisión que utilizan patrones internos pueden calibrarse automáticamente

Ejercicio 1. Nivelación, calibración y precisión de una balanza Denver Maxx Preparación de 100 mL de NaCl 1 M

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2.2 Pipetas

En el laboratorio, la medición precisa del volumen es tan importante como la medición precisa de la masa. La medición fiable del volumen se realiza con una pipeta, una bureta o un matraz aforado.

Las pipetas permiten la transferencia de volúmenes medidos exactamente de un recipiente a otro.

2.2.1 Tipos de pipetas de uso común en el laboratorio

1. Aforadas: transfieren un sólo volumen fijo, las hay desde 0.5 a 200 mL 2. Graduadas: transferencia de 0.1 a 50 mL

Ambas se llenan hasta la marca de calibración. La superficie alta de un líquido contenido en un tubo estrecho presenta una marcada curvatura o menisco. Es una práctica común usar la parte inferior del menisco de los líquidos acuosos como el punto de referencia en la calibración y empleo de las pipetas.

El llenado de las pipetas nunca se debe de hacer aspirando con la boca. Existen accesorios auxiliares para macropipeteado que facilitan la operación de carga y descarga.

Aspiradores de seguridad Dentalab

Pipeta graduada Pipeta aforada

Aspirador Macro de Brand

La transferencia se realiza apoyando la pipeta en el borde del recipiente recibidor y nunca se sopla el líquido residual.

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Ejercicio 2. Manejo de aspiradores de seguridad de pipetas de la casa Dentalab.

1. Aspiración: Gire la rueda hacia arriba y aspire, sin producir burbujas, hasta situarse un poco por encima de la marca de calibración. Desplace lentamente la rueda en sentido contrario para el ajuste de la pipeta. Preste atención al menisco.

2. Vaciado: Presionar la palanca una vez que la pipeta esté dentro del tubo o recipiente recibidor.

3. Pipetas automáticas: micropipetas y macropipetas

a) Micropipetas: transferencia de volúmenes de microlitros de líquido

- monocanal de volumen fijo: único volumen de transferencia, existen distintas pipetas que cubren el intervalo entre 1 μL y 1000 μL

- monocanal de volumen variable: elección del volumen de transferencia mediante desplazamiento de un micrómetro de ajuste localizado en la parte delantera o superior del dispositivo. Poseen un indicador del volumen seleccionado

Con un número reducido de aparatos se cubre el intervalo entre 0,1 μL y 1000 μL

- multicanal: igual que la anterior pero dispensando 4, 8 ó 12 veces simultáneamente el mismo volumen. Intervalo entre 0,5-300 μL

Micrómetro

Indicador de volumen

Monocanal fija y variable Multicanal y variable

b) Macropipetas: transferencia de volúmenes de mililitros de líquido - monocanal de volumen variable: hasta 2, hasta 5 o hasta 10 mL

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El uso adecuado de las pipetas automáticas está asociado a la elección de la punta de pipeta correspondiente.

N: 0,1 – 20 μL

A: 0,5 – 20 μL B: 2 – 200 μL C: 5 – 300 μL D: 50 – 1000 μL E: 0,5 – 5 mL

* Las más comunes son la B y la D, puntas amarillas y azules respectivamente

Ejercicio 3. Manejo de carga y descarga de pipetas automáticas.

1. Elija una pipeta de volumen variable de las disponibles en el laboratorio

2. Seleccione el volumen deseado girando con cuidado el micrómetro. Nunca supere la capacidad máxima de la pipeta

3. Inserte la punta desechable adecuada a la pipeta elegida

4. Oprima el botón pulsador situado en la parte superior de la pipeta hasta un primer tope. Esta operación desplaza un volumen de aire conocido en la punta desechable

5. Inserte la punta desechable dentro del líquido, agua destilada en nuestro caso, y libere la presión sobre el botón pulsador. Este hecho aspira el líquido por la punta

6. Coloque la punta sobre la pared del recipiente recibidor y oprima el botón pulsador hasta el primer tope. Después de un segundo, oprima el botón hasta un segundo tope para vaciar completamente la punta.

7. Expulsar la punta desechable

8. Practique hasta conseguir el dominio de la pipeta 9. Cuando esté seguro pase al ejercicio siguiente

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Ejercicio 4. Comprobación del pipeteo por medida gravimétrica (balanza Denver Maxx).

1. Utilice una pipeta de 1 mL fija o variable

2. Utilizar como líquido de transferencia agua destilada

3. Situar un vaso de precipitados de 25 mL sobre la balanza y ajustarla a cero 4. Pipetear en el vaso un mililitro

5. Anote su masa

6. Vuelva a tarar la balanza y añada 1 mL más 7. Anote su masa

8. Repita la operación hasta completar 5 muestras

9. Cambie la pipeta con un compañero e inicie el proceso desde el punto 3- 8

El uso de pipetas automáticas exige una comprobación regular de la exactitud y precisión de las mismas

Exactitud: indicada por E = diferencia entre el valor medio y el valor nominal referida al valor nominal en %

El control de la exactitud se realiza mediante control gravimétrico y aplicando un factor de corrección Z

Z = 1,0032 μL/mg si el control se realiza a una temperatura de 21,5 ºC a una presión atmosférica de 1013 mbar y con agua destilada

Precisión: indicada por el coeficiente de variación y definido éste como la desviación estandard en %, referida al valor medio.

Ejercicio 5. Simulación del control de la exactitud de la pipeta automática de 1 mL, utilizando los datos obtenidos en el ejercicio 4

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4. Pipetas automáticas repetitivas

En el laboratorio se dispone también de pipetas automáticas repetitivas para la dosificación en serie o para situaciones que requieren transferencia repetida de un volumen particular

Permite dosificar repetitivamente un volumen determinado con una sola carga

El número de repeticiones depende del volumen seleccionado en el mando deslizante de ajuste y del combitip corespondiente (ver tabla 1)

Mando selector de volumen Palanca de

dosificación

Palanca de bloqueo y de llenado combinados

Tabla 1

Ejercicio 6: Manejo de una pipeta repetitiva

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INSTRUMENTO BÁSICO DE MEDIDA

PEACHÍMETRO O PHMETRO

1. Objetivo

1.1 Consideraciones prácticas, calibración y manejo de un pHmetro

El pHmetro, portátil o de sobremesa, es un instrumento utilizado en los laboratorios químicos y biológicos para medir el pH de las disoluciones. El pH determina muchas de la características notables de la estructura y actividad de las biomacromoléculas y, por tanto, el comportamiento de células y organismos.

El pHmetro se utiliza también para determinar el pH de aguas, suelos, bebidas y alimentos. Los instrumentos portátiles facilitan la medida en campo.

Al pHmetro, que mide la diferencia de potencial existente entre dos electrodos, se conecta un electrodo combinado de pH: un electrodo de vidrio (indicador) y un electrodo de referencia montados ambos en un solo cuerpo. Se constituye así el sistema necesario para la medida de pH, que debe ser siempre precedida de una calibración del equipo con disoluciones tampón de pH conocido.

Si el pHmetro ha de ser informado de la temperatura de la muestra se conecta también un sensor de temperatura, a no ser que el electrodo disponga del mismo. La medida del pH se ve afectada por la temperatura.

Electrodo combinado de pH

En el dibujo se muestran los componentes y ubicación de las partes esenciales de un electrodo combinado de pH, con el electrodo indicador en el centro y el de referencia en el exterior.

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Tipos de elementos de referencia

Conector

Cable

Cabezal

De penetración Para emulsiones

Orificio de relleno

De superficie

Tipos de electrodos Para micromuestras

Electrolito interno: HCl 0,1M saturado con AgCl

Membrana de vidrio: sensible a H3O⁺

Elemento de referencia: cristales de AgCl encapsulados y con barrera a iones Ag⁺

Electrolito de referencia: (KCl 3M) puente salino entre el electrodo y el exterior. Impide que los componentes de la disolución objeto de medida se mezclen con los del electrodo de referencia.

Diafragma: punto de unión entre electrolito y muestra. De cerámica porosa, que permite un pequeño flujo de electrolito hacia el exterior estableciendose el circuito eléctrico para medición

Electrodo con sensor de temperatura

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3. Consideraciones prácticas

1. Si el electrodo de pH es rellenable, verificar el nivel de electrolito de referencia. Éste debe llegar cerca del orificio de llenado, asegurando un buen flujo de electrolito a través del diafragma.

2. Verificar la ausencia de burbujas de aire en la zona de la membrana, si se observa alguna sacudir el electrodo cuidadosamente

3. Limpiar el electrodo con agua destilada. No secar con un paño, utilizar un papel sin pelusa, aplicándolo suavemente para evitar cargas electrostáticas, y retirar el exceso de agua

4. Si las mediciones se realizan a temperatura ambiente sumergir el electrodo hasta cubrir como mínimo el diafragma

5. Si las mediciones se realizan a temperatura distinta de la ambiente sumergir el electrodo hasta cubrir el sensor de temperatura y el elemento de referencia.

4. Calibración

1. Se recomienda una calibración diaria antes de proceder a las mediciones. Si se realizan muchas es aconsejable repetir la calibración cada 2 ó 3 horas, para compensar la posible deriva del electrodo (potencial de asimetría) o una pérdida de sensibilidad del mismo (pendiente)

2. Con el pHmetro conectado, y el electrodo sumergido en disolución tampón de pH conocido (7.02 generalmente), esperar el tiempo indicado en las instrucciones del aparato antes de proceder a la calibración

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3. Calibrar siempre con disoluciones tampón frescas. Estas se alteran con el paso del tiempo, con el calor, la luz y, especialmente, con la contaminación

4. No devolver al frasco del tampón la disolución utilizada. Utilizar frascos pequeños para la calibración

5. Entre medidas, lavar con agua destilada y utilizar un papel sin pelusa para retirar el exceso de agua

6. Es recomendable para la calibración, así como para las mediciones, utilizar agitación. Un imán y un agitador magnético proporcionan rapidez y repetibilidad en las lecturas.

Tipos de calibración

1. En un punto, cuando se miden valores de pH cercanos al valor del tampón utilizado

2. En dos puntos, la habitual. Se recomienda como primer tampón el de pH 7 y como segundo tampón puede utilizarse el de pH 4 ó 9 dependiendo de si se trabaja en la zona ácida o alcalina.

Se corrige el potencial de asimetría y la pérdida de sensibilidad del electrodo

3. En tres puntos: si se mide en toda la escala de pH. Primer punto el tampón de pH 7, segundo y tercer punto dos de los valores restantes (2, 4.01, 9.21, 10.9 a 25ºC). Se compensa el potencial de asimetría y sensibilidad tanto en la zona ácida como en la alcalina

Ejercicio 1. Calibración en dos puntos de los equipos, marca CRISON, disponibles en el laboratorio, y siguiendo el manual de instrucciones del equipo correspondiente.

DISOLUCIONES Y CONCENTRACIONES

DISOLUCIONES STOCK, DISOLUCIONES DE TRABAJO, DISOLUCIONES TAMPÓN

1. Objetivo

1.1 Consideraciones prácticas y preparación de disoluciones usadas en la experimentación

1.2 Preparación de una disolución tampón y medida del pH

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La experimentación biológica utiliza técnicas de laboratorio que pueden ser de observación, analíticas y /o bioensayo. El bioensayo puede realizarse in vivo, utilizando organismos intactos, o in vitro, utilizando órganos, tejidos o suspensiones de células aisladas.

El bioensayo es una técnica muy utilizada en Fisiología Animal. Los estudios requieren habitualmente el uso de disoluciones cuya concentración iónica y osmolaridad mantengan la integridad y funcionalidad celular, y en los in vitro, además, que la disolución esté tamponada. Es decir, que contenga un sistema tampón o buffer para amortiguar las variaciones de pH que pudieran producirse a lo largo de un trabajo experimental, al igual que hace el plasma.

3. Disoluciones y concentraciones

En el laboratorio la concentración de las disoluciones se expresa de dos formas: concentración molar o concentración porcentual.

Concentración molar, es el nº de moles de una especie contenida en un litro (1L) de disolución.

Unidad de concentración molar = molaridad (M), dimensiones mol.L^-1 o mmoles.mL^-1 de disolución.

1 mmol = 10^-3mol

Concentración porcentual (partes por cien): tres formas de expresarla

a) tanto por ciento en peso (p/p): peso del soluto . peso de la disolución ^-1. 100

b) tanto por ciento en volumen (v/v): volumen del soluto . volumen de disolución^-1. 100 c) tanto por ciento en peso/volumen: peso del soluto (g) . volumen de la disolución (mL)^-1.100

Ejercicio 1. - Preparar 100 mL de NaCl 154 mM

- Preparar una disolución de NaCl 0.9% (p/v)

¿Qué observación destacaría?...

4. Disoluciones madre y disoluciones de trabajo

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En el laboratorio, es habitual preparar las disoluciones de trabajo a partir de disoluciones concentradas, a las que se les llama disoluciones madre o disoluciones stock.

Las disoluciones stock, además de proporcionar rapidez, disminuyen los posibles errores que se producirían durante continuas pesadas de los componentes de las disoluciones de trabajo.

Para preparar disoluciones diluidas a partir de las concentradas se utiliza la siguiente ecuación, la cual se basa en que el nº de moles de soluto de la disolución diluida es igual al de moles en el reactivo concentrado.

V

concentrada . Moles/L concentrada = Vdiluida . Moles/Ldiluida, , es decir

V

1

.C

1

= V

2

.C

2

Volumen en litros y concentración molar en moles/L O volumen en mL y concentración molar en mmoles/mL

Ejercicio 2. Tomando como disolución stock la de NaCl 1 M, calcular el volumen que habría que tomar para preparar 10 mL de NaCl 150 mM

5. Disoluciones tampón

Sistemas tampón o buffers son aquellas disoluciones cuya  H⁺ apenas varía al añadir ácidos o bases fuertes. Suelen ser mezclas binarias de un ácido débil y una sal del mismo ácido con base fuerte, o bien una base débil y la sal de esa base con un ácido fuerte.

La eficacia amortiguadora del sistema depende de la proporción relativa de las formas disociada y sin disociar, siendo máxima cuando el cociente sal /ácido es próximo a la unidad. Esta proporción está relacionada con el pH por la ecuación de Henderson-Hasselbach.

pH = pK + log  sal / ácido

El Tris-HCl es un tampón para medios biológicos de uso habitual en el laboratorio. Está compuesto de la base Tris-aminometano (Tris), y su sal cloruro de Tris. Sin embargo, no se suele comprar la sal, sino sólo la base, que se disuelve y se lleva al pH requerido añadiendo HCl. La cantidad de HCl no se suele medir con precisión, sino que es la necesaria para llevar la solución al pH deseado.

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Ejercicio 3. Preparar 100 mL de Tris-HCl 0.1M a pH = 8, midiendo en el pHmetro a temperatura ambiente

6. Disolución isotónica

Una disolución en la que se pueden introducir las células sin que se vea alterado su volumen celular se denomina isotónica. Son disoluciones isotónicas (moleculares, electrolíticas o mixtas) las que tienen la misma osmolaridad que el plasma.

Osmolaridad /L = M . 

M = concentración molar del soluto

 = nº de partículas en que se disocia el soluto cuando está en disolución

Osmolaridad/L de una disolución constituida por un conjunto de solutos = suma de osmolaridades parciales

Osmolaridad

El movimiento pasivo de agua a través de una membrana semipermeable, y a favor de su gradiente de concentración, se denomina ósmosis. El grado de presión necesario para interrumpir completamente la ósmosis recibe el nombre de presión osmótica.

La presión osmótica es proporcional al número de partículas disueltas / unidad de volumen líquido. La concentración de las disoluciones osmóticas en base al nº de partículas, se expresa en osmoles. Un osmol es la cantidad de soluto no disociado cuya presión osmótica corresponde a un mol.

Cuando los no electrolitos se disuelven en un litro de agua, las moléculas individuales entran en solución separadamente, y cada una constituye una partícula disuelta. Como un mol de soluto tiene el mismo número de moléculas (nº de Avogadro), una disolución de glucosa 0.1M tiene el mismo nº de partículas que una disolución de urea 0.1M. Y ambas la misma presión osmótica = 0.1 osmoles.

Cuando los electrolitos se disuelven en un litro de agua, las moléculas individuales se disocian en dos o más iones, cada uno de los cuales constituye una partícula disuelta. Así 0.1 mol de ClNa, que se disocia en Cl^- y Na⁺, da lugar a dos partículas y, por lo tanto, ejerce una presión osmótica = 0.2 osmoles.

Una disolución que contiene 1 osmol de soluto disuelto por litro de agua se dice que tiene una osmolaridad de 1 osmol/L.

Ejercicio 4. Si la osmolaridad plasmática es de 0.3 Osmoles/L, ¿una disolución de NaCl 0.15M es isotónica? ¿Y una de Na2PO4 1M?

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ESTERILIZACIÓN Y

MEDIOS DE CULTIVO Y CONSERVACIÓN DE

MICROORGANISMOS

(código calendario de prácticas:

MICRO)

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PRÁCTICA 1. Preparación de medios de cultivo y soluciones. Esterilización

Esterilización

La esterilización es la eliminación de todos los organismos presentes en un material, incluidas las esporas y otros agentes infecciosos. La metodología utilizada depende de la naturaleza del material que se va a esterilizar. Los principales métodos para destruir o eliminar microorganismos son los siguientes:

1. Calor húmedo. Esterilización por vapor

Es el método más común, eficaz y cómodo de esterilización. El vapor de agua a elevadas temperaturas mata los microorganismos porque degrada los ácidos nucleicos y desnaturaliza las proteínas. El tiempo y la temperatura necesarios para la esterilización de los medios de cultivo y del material dependen de los microorganismos que se pretenden destruir, de la composición química de los medios, de la cantidad de material y del volumen de medio que se esteriliza.

La esterilización por vapor se realiza en un autoclave, aparato similar a una olla a presión en la que el aire presente inicialmente en la cámara se expulsa quedando completamente llena de vapor de agua. La presión de vapor interna asciende hasta que se alcanzan 121º C de temperatura y 1,1 Kg/cm² de presión.

En estas condiciones todas las formas vegetativas y endosporas se destruyen en 10-12 minutos, aunque el tiempo estándar de esterilización es de 15 minutos. Por lo general, el autoclave se emplea para esterilizar medios de cultivo y soluciones acuosas no termolábiles, material de vidrio, plástico y metal.

2. Calor seco

Es menos efectivo que el calor húmedo, necesitándose temperaturas más altas y tiempos más largos que con el calor húmedo para matar a los microorganismos. La muerte celular se produce debido a la oxidación de los componentes celulares y la desnaturalización de proteínas. Este tipo de esterilización se realiza en hornos especiales de esterilización y requiere un tiempo de exposición largo del material (por ejemplo, 2 horas a 160º C o 1 hora a 180º C). Se utiliza principalmente para la esterilización de material de vidrio (placas de Petri no desechables, pipetas, etc.) y metal, y en algunos casos para esterilizar productos en polvo, aceites y materiales similares.

Una alternativa de esterilización con calor seco es la incineración, que se utiliza para la destrucción de material hospitalario contaminado, animales de experimentación, etc. En el laboratorio, la incineración se emplea para la esterilización de las asas de siembra metálicas antes y después de ponerlas en contacto con los cultivos.

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3. Filtración

Es el método alternativo a la esterilización por calor cuando se esterilizan líquidos termosensibles o gases. La filtración no destruye los microorganismos, sino que los elimina mecánicamente, combinando un proceso de retención y absorción. La técnica consiste en hacer pasar el líquido o gas a través de un material poroso, el filtro, con tamaño de poro demasiado pequeño para que pasen los microorganismos, pero suficientemente grandes para permitir el paso del líquido. Estos filtros retienen las bacterias, pero dejan pasar los virus.

Los filtros que se utilizan normalmente en la “esterilización” de líquidos son el filtro de membrana de acetato de celulosa o nitrato de celulosa con un tamaño de poro de 0,45 y 0,22 μm. Éstos últimos son los que garantizan la eliminación de las bacterias, ya que las bacterias más pequeñas conocidas miden alrededor de 0,3 μm. Para facilitar el paso de las soluciones a través de los filtros de membrana se aplica presión o se hace vacío, teniendo presente que los recipientes de recogida de la solución filtrada deben estar estériles. Hay un tipo de filtro, denominado filtros de alta eficacia de retención de partículas de aire (HEPA, high-efficiency particulate air) que se utilizan en las cabinas de flujo laminar y de seguridad biológica porque permiten eliminar el 99,9 % de las partículas mayores de 0,3 μm presentes en el aire.

4. Radiaciones

4.1. Radiaciones no ionizantes. Luz UV. La radiación ultravioleta no produce ionización al incidir sobre una molécula, pero sí excitación de sus electrones, haciendo que reaccione de forma anómala. La acción bactericida más efectiva de la luz UV se produce a 260 nm, que es el máximo de absorción del DNA. La capacidad de penetración de la luz UV es muy baja, no pudiendo atravesar el vidrio o líquidos, por lo que sólo se utiliza para la esterilización de superficies (las cámaras de flujo laminar) o la esterilización de aire en quirófanos o salas asépticas. En algunos casos específicos también puede usarse para la esterilización de agua.

4.2. Radiaciones ionizantes. Rayos gamma y rayos X. Debido a su elevada energía, causan la ionización de las moléculas y la aparición de radicales libres altamente reactivos que destruyen componentes celulares como el DNA y las proteínas. Las radiaciones ionizantes, además de tener un mayor poder microbicida que la radiación ultravioleta, presentan un mayor poder de penetración, pudiendo esterilizar el interior de material empaquetado. Aunque son altamente efectivas contra formas vegetativas y endosporas, no siempre lo son contra virus. Debido a la peligrosidad del equipo de radiación, este tipo de esterilización se limita a las aplicaciones industriales a gran escala, empleándose para esterilizar material plástico, material farmacéutico (antibióticos, hormonas), etc.

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5. Esterilización con agentes químicos

La mayor parte de los agentes químicos antimicrobianos se utilizan en la desinfección y no destruyen las esporas, por lo tanto no son esterilizantes Sin embargo, en condiciones apropiadas, compuestos como el óxido de etileno o el glutaraldehido eliminan formas vegetativas y esporas, por lo que deben clasificarse dentro de los agentes esterilizantes. Estos compuestos se emplean en la esterilización de instrumentos y material de plástico.

Medios de cultivo y soluciones

Los medios de cultivo son las soluciones nutritivas que se usan en el laboratorio para el crecimiento y mantenimiento de los microorganismos. También se pueden emplear para demostrar una característica fisiológica o bioquímica del microorganismo (utilización de una fuente de carbono, producción de ácido, producción de gas, etc). Antes de su empleo, tanto los medios de cultivo como las soluciones y todo el material utilizado para la manipulación de los microorganismos deben estar estériles para evitar la entrada de microorganismos contaminantes.

Tipos de medios de cultivo

En función de su composición química se pueden dividir en:

 Medios definidos: se conocen la composición química exacta del medio. Permite conocer los compuestos que metaboliza el microorganismo estudiado.

 Medios complejos o no definidos: contienen algunos componentes cuya composición química se desconoce. En su preparación se suelen emplear peptonas (hidrolizados parciales de proteínas de la leche, carne, soja, levaduras), extractos de carne, de levadura u otras sustancias muy nutritivas pero no definidas químicamente. Resultan muy útiles y son los más utilizados porque un único medio puede satisfacer las necesidades nutricionales de diversos microorganismos.

Tanto si se trata de medios definidos como complejos, hablamos de medios de cultivo líquidos o caldos y medios sólidos. Para pasar un medio líquido a medio sólido tan solo es necesario añadir un agente gelificante que permita al medio líquido solidificar: la adición de agar al 1,5 % al medio líquido es el procedimiento comúnmente empleado.

Existen una serie de medios de cultivo cuya composición ayuda a establecer o poner de manifiesto determinadas propiedades de los microorganismos que pueden servir para su aislamiento y/o clasificación. En este caso hablamos de:

 Medios generales: permiten el crecimiento de la mayoría de los microorganismos aerobios y anaerobios facultativos (ej: Triptona Soja agar, Agar Nutritivo, etc).

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 Medio de enriquecimiento: favorecen el crecimiento de un tipo de microorganismo en concreto pero sin inhibir el crecimiento del resto de la flora acompañante. Se utilizan para favorecer el crecimiento de microorganismos exigentes.

 Medios selectivos: Incorporan en su composición compuestos químicos que inhiben el crecimiento de determinados grupos de microorganismos mientras permite el crecimiento de otros, facilitando así su aislamiento. Se utilizan para aislar grupos específicos de bacterias.

 Medios diferenciales: permiten distinguir tipos diferentes de microorganismos que se encuentran generalmente relacionadas bien morfológica o bioquímicamente. Incorporan compuestos químicos que tras la inoculación e incubación producen un cambio característico en el aspecto del crecimiento bacteriano y/o el medio que los rodea, lo que permite su diferenciación (ej. Agar Citrato de Simons).

En numerosos casos, un mismo medio puede ser a la vez selectivo y diferencial (ej. Agar Eosina-Azul de Metileno Levine, Agar Xilosa Lisina Desoxicolato, etc.), o de enriquecimiento y diferencial (ej. Agar Sangre).

Es importante tener en cuenta que distintos microorganismos pueden tener requerimientos nutricionales muy diferentes. Por tanto, para el cultivo correcto de un microorganismo determinado es necesario conocer sus exigencias nutritivas y suministrarlas en los medios de cultivo con los nutrientes esenciales en la forma y proporción adecuados.

Por otro lado, las soluciones salinas no son medios de cultivo, puesto que no permiten el crecimiento de los microorganismos. Su función consiste en mantener los microorganismos en suspensión sin que se vea afectada su viabilidad, debido a que son soluciones isotónicas.

Objetivo

Conocer las técnicas de preparación de diferentes medios de cultivo y soluciones empleadas en el crecimiento, aislamiento e identificación de diversos microorganismos.

Material y Procedimientos

Numerosas casas comerciales suministran a los laboratorios los medios de cultivo deshidratados, que se reconstituyen con la adición de agua destilada. Para su preparación, se siguen las indicaciones realizadas por las propias casas comerciales sobre el medio de cultivo.

Los medios líquidos se hidratan con agua destilada, se distribuyen en los recipientes adecuados (tubos de ensayo, matraces, botellas, etc) y se tapan con un tapón metálico, de PVC o de algodón hidrófugo.

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La mayoría de ellos se deben esterilizar y, una vez esterilizados, se mantienen a temperatura ambiente para que enfríen. Cuando la temperatura del medio de cultivo es igual a la temperatura ambiental, ya se pueden utilizar.

Los medios sólidos, una vez hidratados, se hierven para que el agar pueda formar un gel homogéneo con el medio cuando se enfríe. La mayoría de los medios se esterilizan en autoclave. Si se van a preparar tubos con medio sólido, el medio se distribuye en los tubos antes de esterilizarlo. Si la finalidad es la preparación de placas, el medio se deja enfriar en un baño o a temperatura ambiente una vez estéril. Cuando la temperatura del medio alcanza aproximadamente los 50º C se reparte asépticamente en placas de Petri estériles a razón de 15-20 mL de medio por placa. El medio se debe dejar solidificar antes de su empleo.

Algunos medios de cultivo contienen componentes altamente selectivos y no es necesario esterilizarlos.

Por lo general, los medios de cultivo que no se utilizan se mantienen a 4 º C hasta su empleo.

Para la preparación de las soluciones salinas, se disuelven las sales en el agua destilada, se distribuyen en los recipientes adecuados y se esteriliza en el autoclave.

A continuación se indican los medios de cultivo y soluciones que se van a preparar así como el material necesario y el procedimiento a seguir en su preparación. Para esta práctica, los alumnos formarán 4 grupos.

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GRUPO I Material

- Rotulador.

- Pipetas de vidrio de 5-10 mL de capacidad.

- Dispensador para pipetas de vidrio.

- Matraces o botellas de vidrio de 500 mL de capacidad.

- Placas de Petri de 90 mm de diámetro vacías y estériles.

- Tubos de tapón de rosca de 5-10 mL de capacidad.

1. Triptona Soja Agar (TSA)

- Medio de cultivo para verter en placa.

- Cantidad a preparar: 250 mL.

- Repartir en 10-12 placas de Petri.

- Componentes/L:

- Triptona Soja Caldo (TSB) Cantidad fabricante (30 g/L)

- Agar 15 g

- Agua destilada 1.000 mL

Procedimiento: Disolver la Triptona Soja Agar en el agua destilada calentando hasta ebullición.

Esterilizar a 121°C/15 min. Verter en placas a razón de unos 20 mL por placa.

2. Agar Citrato de Simons (Agar Citrato)

- Medio de cultivo para preparar en tubos inclinados.

- Repartir en 10 tubos (5 mL/tubo).

- Componentes/L:

- Agar Citrato de Simons Cantidad fabricante (24,2 g/L)

Procedimiento: Disolver el Agar Citrato de Simons en el agua destilada calentando hasta ebullición. Repartir en tubos y esterilizar a 121°C/15 min. Dejar solidificar en forma inclinada.

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GRUPO II Material

- Rotulador.

1. Triptona Soja Agar (TSA)

- Medio de cultivo para verter en placa.

- Componentes/L:

- Triptona Soja caldo (TSB) Cantidad fabricante (30 g/L)

- Agar 15 g

Procedimiento: Disolver la Triptona Soja Agar en el agua destilada calentando hasta ebullición.

2. Agar semisólido

- Medio de cultivo para repartir en tubos.

- Componentes/L:

- Agar Nutritivo Cantidad fabricante (8 g/L)

- Agar 7,5 g

Procedimiento: Disolver los componentes en agua destilada calentando hasta ebullición. Repartir en tubos y esterilizar a 121°C/15 min. Dejar solidificar los tubos en vertical.

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GRUPO III Material

- Rotulador.

1. Medio Xilosa-Lisina-Desoxicolato (XLD) - Medio de cultivo para verter en placa.

- Componentes/L:

- Medio XLD Cantidad fabricante (55 g/L)

Procedimiento: Disolver el medio XLD en el agua destilada calentando hasta ebullición. NO ESTERILIZAR. Verter en placas a razón de unos 20 mL por placa.

2. Triptona Soja Caldo (TSB)

- Medio de cultivo para repartir en tubos.

- Cantidad a preparar: 50 ml.

- Componentes/L:

- Triptona Soja Caldo (TSB) Cantidad fabricante (30 g/L)

Procedimiento: Disolver el TSB en el agua destilada. Repartir en tubos. Esterilizar a 121°C/15 min.

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GRUPO IV Material

- Rotulador.

- Pipetas de vidrio de 10 mL de capacidad.

- Tubos de tapón de rosca de 10 mL de capacidad.

1. Agar Eosina-Azul de Metileno Levine (Agar EMB Levine) - Medio de cultivo para verter en placa.

- Componentes/L:

- EMB Levine Cantidad fabricante (37,4 g/L)

Procedimiento: Disolver el medio EMB Levine en el agua destilada calentando hasta ebullición.

2. Solución Salina

- Solución para repartir en tubos.

- Componentes/L:

- NaCl 8,5 g

Procedimiento: Disolver el NaCl en el agua destilada. Repartir en tubos y esterilizar a 121°C/15 min.

Cuestiones

A.- Indica los medios de cultivo asignados a tu grupo de trabajo y los cálculos realizados para la preparación de la cantidad especificada.

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PRÁCTICA 2. Cultivo de microorganismos en el laboratorio. Recuento de microorganismos viables

Primera parte. Cultivo de microorganismos en el laboratorio

Una vez preparado un medio de cultivo, se puede inocular (es decir, añadir los microorganismos) y a continuación incubar en las condiciones que favorezcan el crecimiento microbiano. Para la adecuada manipulación de los microorganismos es esencial el uso de la técnica aséptica. Esta técnica consiste en una serie de procedimientos que evitan la entrada de organismos no deseados o contaminantes durante la manipulación de los cultivos y de los medios de cultivo estériles (ver como ejemplo Figura 1). El problema más común en el laboratorio de microbiología es la contaminación a través del aire. Así pues, cuando las placas o tubos se abren deben manejarse de modo que los contaminantes del aire no penetren.

Figura 1. Transferencia aséptica. Procedimiento se toma de muestra a partir de un medio líquido. Imagen tomada de Madigan et al., 2004. Brock, Biología de los Microorganismos.

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En numerosas ocasiones, la finalidad del cultivo es obtener y mantener un único tipo de microorganismo para poder estudiarlo en detalle. Cuando el cultivo contiene un único tipo de microorganismo se denomina cultivo axénico o puro. Si, por el contrario, el cultivo contiene varios tipos de microorganismos se denomina cultivo mixto. La pureza de los cultivos bacterianos se puede verificar mediante la observación de las características de las colonias sobre una placa sembrada porque las distintas especies forman a menudo colonias con una forma y aspecto característico.

Objetivos

 Conocer diferentes métodos de siembra empleados para el aislamiento, identificación y mantenimiento de los microorganismos. Aprender a diferenciar entre cultivos puros y cultivos mixtos.

 Conocer y comprender las ventajas que supone la utilización de distintos tipos de medio de cultivo para el aislamiento e identificación de los microorganismos.

En esta práctica se emplearán diferentes métodos de siembra para el cultivo de microorganismos:

1. Siembra en placa

1.1. Siembra en placa en estrías o por agotamiento

Es un método cualitativo de aislamiento de microorganismos procedentes de una muestra o de un cultivo de laboratorio. Consiste en arrastrar con el asa de siembra un número cada vez más pequeño de células sobre la superficie de un medio de cultivo sólido en placa de Petri. Las células aisladas se multiplicarán formando colonias independientes. Una colonia es una formación o agrupación macroscópicamente visible de microorganismos en un medio sólido. Es importante indicar que cada colonia es un cultivo puro (población de células que procede de una única célula).

Material y medios de cultivo - Rotulador

- Asa de siembra curva o de bucle - 2 placas de medio TSA

- 1 Placas de medio XLD - 1 placas de Agar EMB Levine

Muestra

- Cultivos líquidos: Nº 1 y Nº 2

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Procedimiento:

Se emplearán 2 cultivos líquidos:

- Cultivo Nº 1: se debe sembrar para aislamiento en estría en una placa de TSA y en una placa de Agar EMB Levine

- Cultivo Nº 2: se debe sembrar en una placa de TSA y en una placa de XLD.

Para realizar la siembra se seguirán los siguientes pasos:

1. Rotular la base de las placas para poder identificarlas.

2. Esterilizar el asa de siembra en el mechero Bunsen y dejarla enfriar.

3. Tomar una alícuota del cultivo líquido con el asa de siembra y hacer estrías paralelas, pero no superpuestas, en un extremo de la placa de Petri sobre una parte del medio de cultivo sólido.

4. Esterilizar el asa de siembra y dejarla enfriar.

5. Realizar una nueva serie de estrías perpendiculares a las anteriores, de forma que se arrastren parte de los microorganismos sembrados en la serie anterior.

6. Esterilizar el asa de siembra y repetir el proceso indicado en el punto 4 una vez más. Esta tercera serie de estrías no debe superponerse a la primera.

7. Esterilizar el asa de siembra antes de depositarla en la mesa de trabajo.

8. Incubar las placas sembradas en estufa a 37º C durante 24 horas.

Cuestiones

B.- Observa y anota si en las placas de TSA, Agar EMB Levine y XLD sembradas para aislamiento en estría a partir de los cultivos líquidos suministrados se obtienen cultivos puros o mixtos.

C.- Considerando que el medio TSA es un medio general y los medios Agar EMB Levine y XLD son medios selectivos y diferenciales ¿la obtención de cultivos puros o mixtos en estos medios de cultivo a partir de los cultivos líquidos sembrados es coherente con lo que cabría esperar y por qué?

1.2. Siembra en placa por inclusión o en profundidad

Se trata de un método cuantitativo empleado para el recuento y aislamiento de microorganismos, por lo que se explicará en el apartado correspondiente a recuento de microorganismos.

2. Siembra en tubo con medio sólido 2.1. Siembra en tubo en estría

Método utilizado para el mantenimiento de cultivos puros, así como para la determinación de algunas características fisiológicas y bioquímicas de un cultivo puro de microorganismos.

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Consiste en arrastrar la suspensión microbiana procedente de un cultivo puro sobre la superficie inclinada del medio de cultivo, haciendo una estría en zig-zag desde la base a la parte alta.

- Asa de siembra curva o de bucle

- 1 tubo de Agar Citrato de Simons (tubo con agar inclinado) - 1 tubo de TSA (tubo con agar inclinado)

Muestra

1 cultivo puro en medio sólido

Procedimiento

El cultivo puro presente en la placa de TSA suministrada, se debe sembrar en estría en los 2 tubos con agar inclinado, tanto en el que contiene el medio TSA como el que contiene Agar Citrato.

Para ello, se seguirán los siguientes pasos:

1. Rotular los tubos para poder identificarlos.

2. Esterilizar el asa de siembra de bucle y dejarla enfriar.

3. Cargar el asa de siembra estéril con la porción del cultivo que se va a transferir.

4. Abrir el tubo que contiene el medio de cultivo estéril.

5. Flamear la boca del tubo e introducir el asa de siembra cargada con el inóculo bacteriano dentro del tubo y realizar estrías en zig-zag sobre la superficie inclinada del medio de cultivo, desde la base a la parte alta del tubo.

6. Flamear la boca del tubo y taparlo.

7. Esterilizar el asa de siembra.

8. Incubar en estufa a 37º C durante 24 horas.

Cuestiones

D.- Observa y anota si en los dos medios de cultivo sólidos en tubo sembrados en estría hay crecimiento continuo o se distinguen colonias aisladas. ¿Se observa cambio de coloración en alguno de ellos?

2.2. Siembra en tubo en picadura

Método utilizado para la determinación de algunas características fisiológicas y bioquímicas de un cultivo puro de microorganismos. En este caso se emplean asas de siembra de picadura. Se basa

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en introducir un inóculo bacteriano procedente de un cultivo puro en un medio sólido o semisólido.

- Asa de siembra de picadura - 1 tubo de agar semisólido

Muestra

1 cultivo puro en medio sólido

Procedimiento

El cultivo puro presente en la placa de TSA suministrada, se debe sembrar en picadura en el tubo con agar semisólido. Para ello, se seguirán los siguientes pasos:

1. Rotular los tubos para poder identificarlos.

2. Esterilizar el asa de picadura y dejarla enfriar.

3. Cargar la punta del asa con el cultivo puro que se va a transferir.

4. Abrir el tubo que contiene el medio de cultivo estéril y flamear la boca del tubo.

5. Introducir todo el filamento del asa de picadura dentro del medio de cultivo, en dirección perpendicular a la base del tubo pero sin llegar a tocar el fondo.

6. Flamear la boca del tubo y taparlo.

7. Esterilizar el asa de picadura.

8. Incubar en estufa a 37º C durante 24 horas.

En el medio de cultivo semisólido en tubo se debe observar crecimiento en la zona de inoculación, zona por la que ha pasado el filamento del asa de picadura con el cultivo bacteriano.

Cuestiones

E.- ¿En el medio de cultivo semisólido en tubo sembrado en picadura se observa desplazamiento en el crecimiento con respecto a la línea de siembra? ¿Qué indica el resultado obtenido?

Segunda parte. Recuento de microorganismos viables. Método de siembra en placa por inclusión o en profundidad

En ocasiones, es necesario realizar recuentos de microorganismos en una muestra (por ejemplo, en muestras de agua, alimentos suelo, orina, sangre, etc.) para estimar el número de células viables presentes. Una célula viable se define como aquella que es capaz de dividirse y dar lugar a una descendencia. El método habitual para realizar una determinación de células viables se basa en contar el

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número de células de la muestra que es capaz de formar colonias sobre un medio de cultivo adecuado.

Por esta razón, el recuento de células viables también se llama recuento en placa o recuento de colonias.

En este procedimiento se supone que cada célula viable puede formar una colonia.

Hay dos métodos para realizar un recuento en placa de microorganismos viables: el método de siembra por extensión, en el que un determinado volumen de la muestra diluida se extiende sobre la superficie de una placa con medio sólido y el método de siembra por inclusión o en profundidad, en el que se pipetea un volumen conocido (normalmente 1 mL) del cultivo en una placa Petri estéril sobre la que se añade el medio con agar fundido (Figura 2).

Figura 2. Metodos de siembra para realizar un recuento de células viables en placa: siembra por extensión y siembra por inclusión o vertido en placa. Imagen tomada de Madigan et al., 2004.

Brock, Biología de los Microorganismos.

Antes de proceder a la siembra de la muestra hay una serie de consideraciones importantes. Por un lado, el recuento se puede realizar tanto en muestras líquidas como en sólidas, pero en este último caso será necesario preparar una suspensión o dilución inicial con la muestra empleando una solución isotónica estéril. Adicionalmente, el número de colonias presentes en las placas no debe ser demasiado grande, pues algunas colonias se podrían fusionar y las estimaciones obtenidas serían erróneas. También es importante no obtener un número de colonias demasiado bajo, para que el cálculo sea más preciso y no se arrastren errores asociados con la preparación de excesivas diluciones. En general, se considera que el número de colonias por placa apropiado para el recuento oscila entre 30 y 300. Para conseguirlo, casi siempre se diluye la muestra (Figura 3). Teniendo en cuenta que raramente se sabe de antemano el número de células viables, se suelen hacer varias diluciones decimales sucesivas de la muestra. Tanto la preparación de la suspensión inicial (muestras sólidas), como de las diluciones decimales sucesivas, forman parte de la preparación de la muestra para el análisis.

En esta práctica se empleará una muestra líquida que contiene una concentración desconocida de microorganismos. Por ello, antes de proceder a su siembra, se deben preparar una serie de diluciones

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decimales sucesivas y posteriormente se sembrarán en placa. Se va a emplear un medio de cultivo general para la siembra, por lo tanto se realizará un recuento de la totalidad de los microorganismos viables presentes en la muestra líquida de partida.

Figura 3. Procedimiento para la determinación de células viables usando diluciones seriadas de la muestra y el método de siembra por inclusión o vertido en placa. Imagen tomada de Madigan et al., 2004. Brock, Biología de los Microorganismos.

Objetivo

Realizar el recuento de microorganismos viables presentes en una muestra problema.

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Material, soluciones, medios de cultivo y muestra a emplear 1. Preparación de diluciones decimales sucesivas

Material y soluciones - Rotulador

- Pipeta automática con capacidad para 1 mL - Puntas de pipeta estériles con capacidad para 1 mL - 3 tubos con 9 mL de solución salina estéril

Muestra

- Cultivo bacteriano líquido

2. Siembra en placa por inclusión o en profundidad Material y medios de cultivo

- Rotulador

- Pipeta automática con capacidad para 1 mL - Puntas de pipeta estériles

- 4 placas de Petri vacías y estériles

- 1 botella con 100 mL de TSA licuado y mantenido en un baño a 45º C

Muestras

- Las diluciones 1/100 y 1/1000 obtenidas a partir de la muestra de partida.

Procedimiento

1. Preparación de diluciones decimales sucesivas

A partir de la muestra líquida suministrada, se prepararán tres diluciones de la muestra: diluciones 1/10, 1/100 y 1/1000. Para ello, se seguirán los siguientes pasos:

1. Rotular los tubos con las distintas diluciones que se van a realizar

2. Preparación de dilución 1/10: usando una punta de pipeta estéril, se toma 1 mL de la muestra y se transfiere a un tubo con 9 mL de solución salina estéril. A continuación, se agita el tubo por rotación (nunca por inversión) para una homogenización completa del inóculo incorporado con el diluyente.

3. Para hacer diluciones sucesivas (diluciones 1/100 y 1/1000), se usa una nueva punta de pipeta estéril en cada paso de la dilución, se toma 1 mL de la dilución precedente y se lleva a un tubo con 9 mL de solución salina estéril, recordando que se debe agitar siempre el tubo una vez incorporado el inóculo.

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2. Siembra en placa por inclusión o en profundidad

1. Coger las dos placas de Petri vacías y rotularlas en la base para poder identificarlas. Indicar también la dilución que se va a sembrar.

2. Tomar una alícuota de 1 ml de la dilución 1/100, utilizar para ello una punta de pipeta estéril.

3. Depositar la alícuota sobre el fondo de las placas de Petri.

4. Verter sobre las placas inoculadas unos 20 ml de TSA fundido y mantenido a 45°C.

5. Agitar las placas suavemente mediante movimientos circulares y de traslación.

6. Dejar solidificar, invertir las placas e incubar en estufa a 37° C durante 24 horas.

7. Proceder de la misma forma para la dilución 1/1000 empleando una nueva punta de pipeta estéril.

Cuenta las dos placas de la dilución que contengan entre 30 y 300 unidades formadoras de colonias (UFC) y calcula la media aritmética. El resultado obtenido se multiplicará por el inverso de la dilución y se referirá como UFC/mL de muestra.

Cuestiones

F.- Indica los cálculos realizados para obtener el recuento de microorganismos viables presentes en la muestra suministrada, especificando el recuento obtenido en placa y la dilución empleada. Anota también el resultado final.

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3. TÉCNICAS DE

CROMATOGRAFÍA Y

ESPECTROFOTOMETRÍA

(código calendario de prácticas: FV)

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TÉCNICAS ESPECTROFOTOMÉTRICAS Objetivos:

a) Conocer y comprender las variaciones de color de una sustancia dependiendo del pH.

b) Conocer y comprender las variaciones de color de una sustancia dependiendo de la concentración.

La espectrofotometría es el método de análisis óptico más usado en las investigaciones químicas y biológicas.

La mayoría de los problemas analíticos reales comienzan con una compleja mezcla a partir de la cual es necesario aislar, identificar y cuantificar uno o más componentes de la misma. Se pueden plantear las siguientes cuestiones: una, de carácter cualitativo (¿de qué componente se trata?), y otra de carácter cuantitativo (¿cuánto hay de ese componente?). Para ello, se puede utilizar el método instrumental de análisis, como es la espectrofotometría para medir la absorción de radiación ultravioleta y visible que interactúa con la materia (átomos y moléculas), la misma es considerada una técnica cualitativa y cuantitativa basándose en la medición del color o de la longitud de onda de una radiación e intensidad de la misma.

Fundamento de la espectrofotometría

Todas las sustancias pueden absorber energía radiante, incluso el vidrio que parece ser transparente absorbe radiación de longitudes de ondas que no pertenecen al espectro visible y el agua que absorbe fuertemente en la región del infrarrojo. La absorción de las radiaciones ultravioletas, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las moléculas y es característica para cada sustancia química.

Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energía es absorbida y la energía radiante no puede producir ningún efecto sin ser absorbida. El color de las sustancias se debe a que éstas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo las longitudes de onda no absorbidas pueden ser visualizadas.

Se denomina espectro electromagnético a la distribución energética del conjunto de ondas electromagnéticas

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La espectrofotometría ultravioleta-visible usa haces de radiación del espectro electromagnético, en el rango UV de 80 a 400 nm, principalmente el comprendido entre 200 y 400 nm y en el de la luz visible de 400 a 800 nm, por lo que es de gran utilidad para caracterizar los materiales en la región ultravioleta y visible del espectro. Al campo de luz UV comprendido entre 200 y 400 nm se le conoce también, como rango de UV cercano, la espectrofotometría visible solamente usa el rango del campo electromagnético de la luz visible, de 400 a 800 nm.

El espectrofotómetro es un instrumento que permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia.

Las técnicas espectrofotométricas permiten determinar la identidad y la concentración de componentes disueltos en una muestra incógnita. El espectro de absorción de un material muestra la fracción de la radiación electromagnética incidente que un material absorbe dentro de un rango de

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longitudes de onda, aportando información sobre la molécula, puesto que está relacionado con su estructura molecular.

Practica 1. Efecto del pH sobre el espectro de absorción

Los cambios en las condiciones ambientales de una molécula pueden provocar cambios en su estructura molecular. Así, un cambio en el pH puede provocar alteraciones en su espectro de absorción.

El compuesto que se usará en la práctica será el naranja de metilo, que es un colorante que se utiliza como indicador de pH.

Se realizará el espectro de absorción entre 350 y 650 nm de distintas soluciones de naranja de metilo a la misma concentración pero con distintos pHs en el medio.

Naranja de metilo

Procedimiento

En primer lugar se preparan las siguientes soluciones de trabajo, a partir de las cuales prepararemos las soluciones a analizar:

1) Solución de naranja de metilo. Para ello se pesa en la balanza de precisión 1 mg de naranja de metilo empleando para ello una espátula y un tubo de centrífuga. Posteriormente se disuelve en 5 mL de H2O.

2) Solución de ácido cítrico 0.1 M. Se determinará la cantidad a pesar para preparar 30 mL de solución.

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3) Solución de ortofosfato bisódico 0.2 M. Se determinará la cantidad a pesar para preparar 15 mL de solución. Esta sal tarda más en disolverse que el ácido cítrico, es recomendable comenzar por ella y ayudarse de agitación mecánica.

Una vez preparadas las tres soluciones madre, se procederá a mezclar las soluciones 2 y 3 siguiendo la tabla siguiente, para preparar las soluciones tampón:

pH aproximado Sol. Na2HPO4 (mL) Sol. Ácido cítrico (mL)

3.0 1.0 4.0 3.4 1.3 3.7 3.8 1.8 3.2 4.2 2.1 2.9 4.6 2.3 2.7 En este punto tendremos 5 tubos de ensayo que formarán un gradiente de pH. A continuación se añaden con una micropipeta 0.1 mL de la solución stock de naranja de metilo a cada una de las soluciones tampón y se agitan las soluciones. Una vez comprobado que se genera un gradiente de color, se realizan los espectros de absorción entre 350 y 650 nm de las distintas muestras.

Cuestiones:

1. Comentar los resultados. Describir la gráfica obtenida, observando las variaciones en los espectros de absorción y comentando como aumenta o disminuye la absorbancia en función de la longitud de onda y el pH del medio.

2. Se observa un punto isosbéstico cuando en una solución coinciden dos especies absorbentes en equilibrio. Observa la gráfica. ¿Puedes localizar algún punto isosbéstico? Existe algún punto en el que la absorbancia no dependa del pH del medio?

3. En cada uno de los tubos el pH es distinto. ¿Por qué varía el espectro de absorción del naranja de metilo al variar el pH?

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Practica 2. Efecto de la concentración sobre el espectro de absorción.

Introducción:

La ley de Beer-Bougher-Lambert predice que para una molécula en disolución, un cambio en su concentración provocará un cambio proporcional en la absorbancia.

El aumento en la concentración de los compuestos aumenta las interacciones entre sus moléculas, cambiando su espectro de absorción. Aunque en la mayor parte de los casos este efecto puede despreciarse, no ocurre así en el caso del azul de metileno.

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Las condiciones en las que se encuentra una molécula pueden determinar cambios estructurales que afecten a sus propiedades. En esta práctica observaremos como un aumento en la concentración de una sustancia puede desencadenar un cambio estructural que cambie notablemente sus propiedades de absorción de luz.

Procedimiento

Se preparan 10 mL de una solución stock de azul de metileno 1 mM (1x10^-3 M) en agua destilada. A partir de la solución stock se preparan 10 mL de las siguientes diluciones: 1x10^-4, 1x10^-5, y 1x10^-6 M.

Se realiza un espectro de absorción entre 400 y 700 nm de las soluciones 1x10^-4 y 1x10^-6 M. A continuación se mide la absorbancia de las tres soluciones a 610 y a 663 nm.

Cuestiones:

1. Representar gráficamente la absorbancia a las dos longitudes de onda frente a la concentración, calculando el coeficiente de correlación lineal para cada una de las longitudes de onda.

2. Calcular la ratio entre la absorbancia a 610 y la absorbancia a 663 de las tres soluciones.

3. Comentar los resultados obtenidos tanto para los espectros de absorción realizados en el laboratorio como para las gráficas del apartado 1. ¿Se observa alguna desviación de la Ley de Beer-Bougher-Lambert? ¿Cuál podría ser la explicación de estos resultados?

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Y MICROSCOPIA

(código calendario de prácticas: BC)

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