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esterilización
D. Carlos Mingo Pascual
Ldo. en C. Químicas y Director Comercial de la empresa Controltecnica
LA ESTERILIZACIÓN
FÁCIL, SEGURA,
PRECISA, REPRODUCIBLE Y VALIDABLE
E
l proceso de esterilización en auto-clave puede resultar difícil en algu-nas ocasiones. Por ejemplo, cuando esterilizamos líquidos o sólidos (instrumen-tación, vidrio, filtros o textiles) para su pos-terior uso en el laboratorio, el proceso de esterilización debe asegurar la esterilización del producto, siempre reproducible. En los productos esterilizados para su uso en la-boratorio no se puede testar la esterilidad a posteriori, ya que dicho test podría con-taminar de nuevo el producto, impidiendosu posterior utilización. La validación de los procesos se ha convertido en una materia importante a la hora de asegurar resultados reproducibles que puedan ser verificados. Es más, deben considerarse los aspectos relativos a la seguridad durante el autocla-vado, y en particular, cuando se esterilizan líquidos. Normalmente la esterilización se lleva a cabo a temperaturas de 121°C, lo que corresponde a una presión de vapor aproximada de 2 bares. Estas altas tempe-raturas y la consiguiente presión pueden
considerarse un riesgo potencial impor-tante para el usuario si el autoclave tiene defectos de diseño o la esterilización no se realiza correctamente.
Esterilización de líquidos y líquidos de desecho en frascos
La esterilización de líquidos es una de las tareas más demandadas hoy en día en los laboratorios. Pero este proceso puede conllevar mucho tiempo, los frascos de-ben permanecer abiertos o ventilados y parte del líquido puede llegar a ebullición y evaporarse o incluso los frascos pueden estallar debido a esta ebullición. Otro pro-blema a tener en cuenta es saber si el líqui-do del interior de los frascos ha alcanzalíqui-do la temperatura requerida de esterilización (ej. 121°C) o cuándo debería ser seguro sacar los frascos del autoclave, una vez completado el proceso de esterilización.
Observando el proceso de esterilización para líquidos, éste se divide en tres fases: 1. Fase de calentamiento hasta alcanzar el
equilibrio (H)
2. Fase de esterilización, por ejemplo a 121°C durante 20 min.(S)
3. Fase de enfriamiento hasta alcanzar una temperatura segura para retirar el mate-rial esterilizado. (C).
La Figura 1 detalla las fases individuales en forma de gráfico. La línea azul represen-ta la temperatura registrada en el recipiente situado en el interior del autoclave; la línea Figura 1. Proceso de esterilización / Fases. Línea azul: Temperatura en el interior de la cámara del
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esterilización
roja representa la temperatura registrada en el líquido. Se puede apreciar claramente que el recipiente alcanza la temperatura de-seada mucho más rápido, mientras que el líquido que permanece en el interior de los frascos, necesita más tiempo para alcanzar la temperatura de esterilización.
Durante la fase de calentamiento, la energía térmica del vapor se transfiere a los frascos, lo que conlleva una condensación del vapor. Dicho proceso de condensación y su consiguiente transferencia térmica re-quiere de tiempo, explicando así el lapsus de tiempo que existe entre el calentamien-to del recipiente y el calentamiencalentamien-to de los líquidos de su interior. El tiempo requerido para alcanzar las mismas temperaturas en el interior y exterior de los frascos se denomi-na “tiempo de equilibrio”.
Muchos de los autoclaves utilizados hoy en día en los laboratorios aún no están equi-pados con un medidor de temperatura en un frasco de referencia, por lo que la tem-peratura exacta del líquido que se quiere esterilizar no se está midiendo, y no se pue-de utilizar este dato para regular el proce-dimiento de esterilización. Estos autoclaves comienzan la fase de esterilización una vez que se ha alcanzado la temperatura en los recipientes, luego no se toma en conside-ración el lapsus de tiempo existente entre el calentamiento de los frascos y el calen-tamiento del líquido en sí. De este modo, los líquidos no alcanzarán la temperatura de esterilización deseada y en consecuencia, la efectividad biológica del proceso de esteri-lización no se podrá asegurar. Dependiendo de la resistencia de los microorganismos a eliminar, éstos se inactivarán sólo en parte.
Medición de la temperatura en un frasco de referencia
Midiendo la temperatura del interior de un frasco de referencia mediante un sensor in-troducido en el mismo, se puede determi-nar la temperatura exacta del líquido que se desea esterilizar y así se podría regular el proceso de esterilización. La esteriliza-ción en sí comenzará sólo cuando el líqui-do del frasco de referencia haya alcanzalíqui-do la temperatura de esterilización.
El frasco de referencia deberá rellenarse con agua. Es crucial que el tamaño y el lle-nado del frasco de referencia se correspon-da con el tamaño y el frasco más grande y con más líquido que se quiera esterilizar.
Temperatura de extracción segura
El sensor de temperatura que mide en el interior del vaso de referencia es necesario
para asegurarnos que se ha alcanzado la temperatura de esterilización en el líqui-do a esterilizar. Pero también es necesa-rio para retirar los vasos del autoclave de forma segura una vez finalizado el proceso de esterilización. En el interior del auto-clave, los líquidos se han calentado hasta
temperaturas considerablemente superio-res a la temperatura de ebullición (100°C). El calor transferido al interior de los líqui-dos, junto con el exceso de presión, po-dría ocasionar considerables peligros para el usuario. Por ejemplo, podría darse una ebullición retardada, lo que significa que el líquido empezaría a bullir de forma repen-tina cuando se abriera el autoclave. Esta ebullición instantánea generará una onda de presión consistente en vapor y líquido caliente, erupcionando de los vasos. ¡1 li-tro de agua generaría 1000 lili-tros de vapor! Debido al potencial riesgo de peligro de explosión de recipientes, los autoclaves utilizados para la esterilización de líquidos deben estar sujetos a las correspondientes regulaciones y normas. La norma DIN EN 61010-2-040 estipula que los autoclaves usados para la esterilización de líquidos deben estar equipados con dispositivos de seguridad y prevención de apertura de la puerta previa a que los líquidos hayan al-canzado la temperatura segura de extrac-ción. Una extracción segura se define de forma estándar cuando la temperatura es 20°C inferior a la temperatura de ebullición del agua a temperatura y presión atmos-férica. Esto significa que la extracción de seguridad se da a los 80°C. Los autoclaves Figura 2. Medición de la temperatura.
LA NORMA DIN EN
61010-2-040 ESTIPULA
QUE LOS AUTOCLAVES
USADOS PARA LA
ESTERILIZACIÓN DE
LÍQUIDOS DEBEN
ESTAR EQUIPADOS
CON DISPOSITIVOS
DE SEGURIDAD Y
PREVENCIÓN DE
APERTURA DE LA
PUERTA PREVIA A
QUE LOS LÍQUIDOS
HAYAN ALCANZADO LA
TEMPERATURA SEGURA
DE EXTRACCIÓN
esterilización
modernos están equipados con bloqueos de la puerta dependientes de la temperatu-ra y presión internas. Esto previene la aper-tura del autoclave cuando la presión aún es alta y los líquidos no han alcanzado la temperatura segura de extracción de 80°C.
El enfriamiento de los líquidos hasta la temperatura segura de extracción puede conllevar bastante tiempo. Un tamaño de autoclaves utilizado con frecuencia en los laboratorios es aquel con una capacidad de recipientes de aproximadamente 150 litros. En este tipo de autoclaves, llenos de botellas con líquido a esterilizar, el total del ciclo de esterilización podría llevarnos hasta 10 horas. Lo que significaría que en un día de trabajo, no podríamos llevar a cabo más de una esterilización completa. Por ello es recomendable equipar el autoclave con un sistema de enfriamiento que reduzca consi-derablemente el tiempo necesario para es-terilizar el lote y que prevenga las desventa-jas de la esterilización de líquidos.
Enfriamiento rápido – máxima productividad y seguridad
Los sistemas de re-enfriamiento para au-toclaves básicamente distinguen entre dos tipos de sistemas de refrigeración: a. Enfriamiento por evaporación –
ebu-llición del líquido durante la fase de enfriamiento
b. Enfriamiento por radiación – calor irradiado por el líquido, no hay ebu-llición del líquido con este sistema de refrigeración
a) El enfriamiento por evaporación suele ser el tipo de enfriamiento más usado en los autoclaves. Puede ser:
w Auto-enfriamiento, liberando vapor lentamente
w Enfriamiento por ventilación de aire – el aire ambiente frío es impulsado hacia los recipientes desde el exterior
w Refrigeración por agua sin soporte de presión
Todos los sistemas de enfriamiento co-mentados anteriormente tienen serias des-ventajas en la esterilización de líquidos y pueden conllevar peligro, si el proceso de esterilización no se lleva a cabo de forma adecuada, ya que este tipo de enfriamiento requiere que el líquido se enfríe pasando por el punto de ebullición.
1. Cuando los líquidos bullen durante la fase de enfriamiento, se pierde parte del líquido. La pérdida de líquido suele rondar entre el 3 y el 10%, pero puede ser considerablemente superior, de-pendiendo del contenido del líquido. Especialmente, si el contenido de pro-teínas del líquido es alto, éste tenderá a hervir incluso más, incrementando de nuevo la perdida de líquido.
2. Como los líquidos deben hervir para enfriarse, los botes sólo podrán llenar-se hasta la mitad o hasta una tercera parte de ellos para prevenir la pérdida de líquido durante la ebullición. Esto conlleva, por una parte, una conside-rable pérdida en la productividad, ya que el 50-70% de la capacidad de los botes se pierde.
3. Por otra parte, seguramente no poda-mos prevenir que los líquidos se de-rramen por la ebullición, y deberemos limpiar el autoclave para evitar que los líquidos, como por ejemplo aque-llos hechos con Agar, se introduzcan en el interior de la válvula de drena-je y la obstruyan cuando se enfríen y solidifiquen.
4. Los líquidos sólo podrán hervir si están abiertos, por lo que los botes deberán estar abiertos o por lo menos ventila-dos (tapa entre-abierta). Si nos olvida-mos de ventilar los botes o lo haceolvida-mos de forma indebida, el líquido no podrá hervir durante la fase de enfriamiento y no se enfriarán. Una vez que el vaso de Figura 3. Enfriamiento con soporte de presión. Figura 4. Ultracooler.
EL ENFRIAMIENTO
RÁPIDO CON SOPORTE
DE PRESIÓN SUPONE
UNA GANANCIA
SUSTANCIAL EN LA
PRODUCTIVIDAD,
YA QUE EL TIEMPO
DEL PROCESO EN
COMPARACIÓN CON LA
AUTO-REFRIGERACIÓN
SE REDUCE
CONSIDERABLEMENTE
referencia haya alcanzado la temperatu-ra de 80°C y el autoclave nos permita abrirlo, los vasos cerrados hermética-mente aún conservarán la temperatura de esterilización con su consiguiente presión. Esto plantea un peligro consi-derable, ya que estas botellas pueden explotar durante la retirada del autocla-ve y el líquido contenido en el mismo puede evaporarse espontáneamen-te–similar a una ebullición retardada. Recuerden que 1 litro de agua genera 1.000 litros de vapor.
Por ello se recomienda, al adquirir un au-toclave, definir exactamente qué aplicación se utilizará y cómo debe estar equipado el mismo con lo que respecta a la productivi-dad y seguriproductivi-dad.
b) Enfriamiento por radiación
(Enfriamiento rápido con soporte de presión)
Tiene ventajas considerables en compa-ración con la refrigecompa-ración por evapocompa-ración. Durante el enfriamiento rápido con soporte de presión, el recipiente se enfría a través de toda su superficie gracias a serpentines de enfriamiento conectados externamente con agua fría. Antes de que la refrigeración se active después de la fase de esteriliza-ción, el vapor del interior de los recipientes a presión se sustituye por aire comprimido filtrado estéril. Este aire presurizado evita de forma segura que el líquido llegue a ebullición durante la fase de enfriamiento. El calor se transfiere desde el líquido a las paredes frías del recipiente por medio de radiación, enfriándolas.
El enfriamiento rápido con soporte de presión supone una ganancia sustancial en la productividad, ya que el tiempo del proceso en comparación con la auto-re-frigeración se reduce considerablemente. Considerando que la auto-refrigeración requiere hasta 10 horas en un proceso general de esterilización, el tiempo de en-friamiento por enen-friamiento rápido con so-porte de presión puede reducirse hasta un 60% en función de la cantidad de líquidos procesados.
Por otra parte, todos los peligros e incon-venientes descritos en la refrigeración por evaporación (ebullición tardía, la pérdida de líquido, durante la ebullición, sin refri-geración en el interior de los botes hermé-ticamente sellados) se eliminan de forma fiable, ya que el líquido no hierve. Este tipo de refrigeración permite que las botellas se llenen hasta su nivel máximo, ganando
productividad. Podrá incluso utilizar bote-llas herméticamente cerradas; luego abrir o ventilar las botellas ya no será necesario.
Optimizar aún más los ciclos
Los nuevos autoclaves permiten optimizar aún más el enfriamiento de líquidos en módulos. Esto aumenta aún más la pro-ductividad, e influye en la calidad de los líquidos a esterilizar. Muchos de los líqui-dos contienen ingredientes que no son muy termoestables. Los líquidos deben ser esterilizados, el tiempo, sin embargo, que estarán expuestos al calor, debe ser tan corto como sea posible de modo que los componentes termolábiles no sufran impactos negativos.
Módulo 1 – Ventilador radial
El ventilador radial genera una corriente de aire en el interior de los recipientes del autoclave durante la fase de enfriamiento. Esta corriente de aire obliga al calor de las paredes del recipiente a enfriarse por enfriamiento rápido con presión de apoyo. Este proceso acortará el tiempo de enfria-miento hasta en un 70% en comparación con la auto-refrigeración.
Módulo 2 – Ultracooler (Ultraenfriamiento)
El ultracooler es un intercambiador adi-cional de calor enfriando las paredes con agua y está integrado directamente en el interior del autoclave. Por medio de una transferencia térmica mejorada sustancial-mente, el tiempo de enfriamiento puede Figuras 5 y 6. Ineficaz eliminación del aire.
esterilización
reducirse hasta en un 90% con respecto a la auto-refrigeración.
Esterilización de sólidos y bolsas de desechos
Cuando esterilizamos sólidos (por ejemplo, instrumentos, material de vidrio, puntas de pipeta en cajas, filtros y textiles), así como residuos en bolsas de destrucción hay que asegurarse de que una atmósfera de vapor se está construyendo exactamente sobre y dentro del producto a esterilizar. Muchos autoclaves no eliminan el aire de forma fia-ble del autoclave y del producto. Si el aire permanece dentro del autoclave y del pro-ducto, el efecto de la esterilización no será posible, ya que sólo el vapor transporta la energía térmica requerida para desactivar de forma fiable los microorganismos.
Eliminación del aire ineficaz
Las ilustraciones 5 y 6 muestran una elimi-nación de aire ineficaz utilizando el ejem-plo de una caja con puntas de pipeta y bolsas de desecho. Si el autoclave se ca-lienta simplemente, el aire se desplaza y una atmósfera de vapor se acumula dentro del recipiente del autoclave pero el aire permanecerá en el interior del producto a esterilizar impidiendo que el vapor entre donde se necesita su energía térmica para conseguir un efecto esterilizante.
A la misma temperatura en forma de va-por (va-por ejemplo, 121°C), el aire contiene sólo una fracción de la energía térmica re-querida. Para productos que no pueden ser esterilizados dentro de una atmósfera de vapor, hay esterilizadores de aire caliente– sin embargo, se esterilizan a temperaturas más altas
(180–250°C) que requieren mucho más tiempo (hasta varias horas de esterilización). El efecto de esterilización del aire a tempe-raturas de 121°C–134°C no está determina-do en la praxis.
Eliminación eficaz del aire
Para una eliminación completa y reprodu-cible del aire del autoclave y del produc-to a esterilizar, deberá llevarse a cabo un pre-fraccionamiento del vacío. Por tanto, el autoclave deberá estar equipado con un sistema de vacío. Durante la fase de calentamiento, van teniendo lugar los ci-clos de vacío para la eliminación eficaz del aire, seguido de inyecciones de vapor. Por lo general, se aplica un triple fraccionado de pre-vacío–dependiendo del producto, sin embargo, podrían ser necesarias más fracciones.
Secado de objetos sólidos – Superdry (Supersecado)
Los sólidos como se suelen colocar en el interior de un horno de secado después del proceso de esterilización. Los nuevos autoclaves permiten el secado de sólidos directamente después del proceso de es-terilización. Esterilización y secado en un solo proceso. Así, no sería necesario el manejo de los materiales esterilizados, lo que podría producir una re-contaminación.
Esterilización de sustancias biológicas peligrosas
La esterilización de sustancias biológi-camente peligrosas es un reto especial. Durante la fase de calentamiento, el aire del interior del autoclave se sustituye con vapor. El aire se desplaza del autoclave y se libera a la habitación donde esté insta-lado. El TRBA 100–Reglamento Técnico de Materiales Biológicos de Trabajo–exige que, en los laboratorios de Nivel de segu-ridad S2, el aire de escape de un autoclave debe ser entendido como aire posible-mente contaminado por microorganismos procedentes del producto esterilizado. Debe utilizarse, pues, un proceso adecua-do. En el caso de autoclaves, se utiliza ge-neralmente la filtración. Por tanto, el auto-clave deberá estar equipado con un filtro de escape de aire. Todo el aire contami-nado desplazado desde el autoclave pasa al filtro siendo retenidos los microorganis-mos en él. El filtro se esteriliza „in-line“ durante el proceso de esterilización para desactivar los microorganismos retenidos en el mismo.
La norma TRBA 100 hace referencia sólo al aire de escape liberado, pero no al condensado recogido. Durante el proceso de esterilización, el vapor se condensa en el producto a esterilizar y se convierte de
nuevo en agua (condensado). Este agua también puede estar contaminada por mi-croorganismos. Por lo que el condensado debe permanecer dentro del autoclave du-rante el proceso de esterilización y también debe ser esterilizado „in line“ antes de ser drenado.
Cualificación y validación
Durante la cualificación se verifica si un equipo es adecuado para el uso que se le quiere dar así como el proceso a llevar a cabo – por ejemplo un proceso de esteri-lización – considerando el producto a ser esterilizado con un resultado continuo (re-producible). Generalmente, el proceso de cualificación se divide en 3 partes básicas: 1. IQ – Cualificación de la instalación:
verifica que el equipo ha sido fabri-cado e instalado de acuerdo a sus especificaciones.
2. OQ – Cualificación de la operación: verifica que el equipo trabaja gene-ralmente de acuerdo a las funciones especificadas.
3. PQ – Cualificación del Rendimiento: ve-rifica que el dispositivo, con el produc-to a tratar, funciona de acuerdo con las especificaciones.
El objetivo de la cualificación y validación es una prueba documentada de que un dis-positivo es adecuado para su uso previsto.
El efecto del proceso de esterilización en el autoclave se verifica durante la OQ y PQ (con material a esterilizar) por medio de data loggers externos de temperatura y presión, así como usando bio-indicadores basados en Bacilus Stearothermophilus. Mientras que los data loggers (registrado-res de datos) externos de temperatura y presión proporcionan evidencia de que el controlador del autoclave muestra y docu-menta valores fiables así como de que éste lleva a cabo la esterilización dentro de los valores de tolerancia, los bio-indicadores proporcionan evidencia de la eficiencia biológica.
Ensayos en Autoclaves según Normas de Farmacopea
Por último, cabe destacar la necesaria flexi-bilidad que se requiere en la configuración de los autoclaves para poder adaptarse al cumplimiento de programas y test especí-ficos como los dictados por las normas de Farmacopea (ejemplos: 3.2.1 Recipientes de vidrio para uso farmacéutico, 3.2.9 cie-rres de goma para recipientes de prepa-raciones parenterales, polvos o liofilizados en polvo, etc.)
