PRODUCCIÓN Y USO DE
ANTÍGENOS RECOMBINANTES
PARA EL DESARROLLO DE UN KIT DE DIAGNÓSTICO
PARA LA ENFERMEDAD DE CHAGAS
LABORATORIO DE ENZIMOLOGÍA DE PARÁSITOS CENTRO DE INGENIERÍA GENÉTICA (CIGEN)
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE CIENCIAS
Juan Luis Concepción, Luisana Avilan, Wilfredo Quiñonez, Ana Caceres, David Rosales.
http://www.ing.ula.ve/~enzimo/espanol.html
LA ENFERMEDAD DE CHAGAS ES UN PROBLEMA DE SALUD PUBLICA
Cerca de 100 millones de personas viven en áreas endémicas (un cuarto de la población de América Latina).
En América Latina de 18-19 millones de personas están infectadas por Trypanosoma
cruzi.
Se estima que hay 500.000 nuevos casos por años y 50.000 muertes son atribuidas a esta enfermedad y sus complicaciones.
El Banco Mundial estima que esta enfermedad produce una pérdida anual de 2.7 millones de años-hombre.
En Venezuela más de tres millones de personas están en riesgo de contraer la enfermedad y el número total de personas infectadas es de 800.000 para 1996 (PAHO).
La enfermedad de Chagas es la mayor causa de morbilidad en nuestro continente producida por una enfermedad parasitaria y la tercera a nivel mundial, sólo superada por la Malaria y la Esquistosomiasis.
LA ENFERMEDAD DE CHAGAS ES:
• Una enfermedad parasitaria olvidada por los países del primer mundo (desarrollados).
• Trypanosoma cruzi, el agente causante de enfermedad de Chagas se a
convertido en uno de los asesinos más grandes con el que conviven los venezolanos cotidianamente en las áreas rurales.
• Una enfermedad de pobres y por lo tanto puede ser considerada como clasista.
• La enfermedad de Chagas no tiene cura en la fase crónica por quimioterapias y tampoco hay métodos preventivos por vacunas.
Antígenos usados en el serodiagnóstico de la enfermedad de Chagas
Extractos de T.cruzi (epimastigotes)
y parásitos enteros.
Producen reacción cruzada!!!
Fracciones semipurificadas
ANTÍGENOS RECOMBINANTES
Epimastigotes de T.cruzi Promastigote L. mexicana
EL ANTÍGENO IDEAL
Sensibilidad y Especificidad ~ 100 %
Falsos Negativos
Falsos Positivos
(+)
(-)
FASES PARA EL DESARROLLO
ETAPA I
Producción y caracterización de los Antígenos Recombinantes
ETAPA II
Se ha trabajado con tres antigenos recombinantes
ETAPA I
Antígeno recombinante 11 Antígeno recombinante 10 Antígeno recombinante 7 Western blotETAPA I
Escalamiento en la producción de los antígenos recombinantesProducción en fermentadores
Purificación de antígenos mediante columnas de afinidad (IMAC).
Ruptura celular: Sonicador French press
ETAPA II
Escenarios Clínicos y potenciales usuarios:
- Bancos de Sangre - Clínicas
ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
DESARROLLO DEL KIT DE DIAGNÓSTICO UTILIZANDO LOS ANTÍGENOS RECOMBINANTES
ü
D.O. 490 nm 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 SNCH LC LCD LCI LCL LCM LV (X = 0.796) SCH
Distribución de los valores de absorbancia de los sueros de pacientes con leishmaniasis mediante ELISA, usando 1.5 µg de Pgr7/pozo y una dilución de los sueros de 1/100. sueros de personas no chagásicas (SNCH) (controles negativos), sueros de personas chagásicas (SCH) (controles positivos), leishmaniasis cutánea (LC), leishmaniasis cutánea difusa (LCD), leishmaniasis cutánea intermedia (LCI), leishmaniasis cutánea localizada (LCL), leishmaniasis mucocutánea (LCM) y leishmaniasis visceral (LV). La línea azul representa el cutoff.
ANALISIS POR ELISA
Distribución de los valores de absorbancia de los sueros de pacientes con otras enfermedades mediante ELISA, usando 1.5 µg de Pgr7/pozo y una dilución de los sueros de 1/100. sueros de personas no chagásicas (SNCH) (controles negativos), sueros de personas chagásicas (SCH) (controles positivos), lepra (L), artritis reumatoide (AR), sífilis (S), hepatitis (H), blastocistosis (B), malaria (M), virus de inmunodeficiencia humana (VIH), toxoplasmosis (T). La línea azul representa el cutoff. D.O. 490 nm 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 SCH (X = 0.513) SNCH L AR S H B M HIV T
ANALISIS POR ELISA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Pgr7
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
Pgr7
ANALISIS POR WESTERN BLOT
DE SUEROS UTILIZANDO A LA Pgr7
ETAPA II
DESARROLLO DEL KIT DE DIAGNÓSTICO UTILIZANDO LOS ANTÍGENOS RECOMBINANTES
Escenarios Clínicos y potenciales usuarios: - Áreas rurales - Ambulatorios - Uso doméstico
Los números en rojo son las localidades del Estado Barinas empleadas en el estudio epidemiológico de la Enfermedad de Chagas. Santa Bárbara de Barinas (1), Caño Hondo (2), Banco de Sangre del Hospital Luis
Razetti Barinas (3), San Rafael de Canaguá (4), El Boral – San Silvestre (5), Suripá (6), Hato Viejo (7), Mata de León (8), San Silvestre (9), Potreritos (10), Las Malvinas-San Rafael de Canaguá (11), Morrocoy-San Silvestre (12), El Tamayero (13), Torunos (14). 1 2 3 4 11 10 6 14 9 7 5 12 13 8
0 4 8 12 16 20 Santa B árbara de Barinas Ca ño Hondo Sabaneta Banco de Sangre San Rafael de Canagu á El Boral Surip á Hato Viejo
San SilvestreMata de Le ón
Potrero de la VirgenPotreritosLas MalvinasMorrocoy
Torunos Tamayero Otros Prevalencia
Prevalencia
%
EPIDEMIOLOG
EPIDEMIOLOG
Í
Í
A DE LA ENFERMEDAD DE
A DE LA ENFERMEDAD DE
CHAGAS EN EL ESTADO BARINAS
REQUISITOS PARA ENSAYOS CLINICOS RÁPIDOS
FÁCIL USO
PEQUEÑOS VOLÚMENES DE MUESTRA RAPIDEZ
PERFORMANCE CLÍNICA
FIABILIDAD
BAJOS PRECIOS DE VENTA
ALTO VALOR AGREGADO FLEXIBILIDAD
21% 26% 11% 5% 37% Hemobio-Chagas Chagas-Hemagen Polichaco Kit Ihat Bioelisacruzi 44% 40% 5% 3% 2%
6% Chaga Test - Prueba Winer
Ultra Elisa Rapido Action
Pharmatest - IgG Elisa Bioschile Gota Gruesa 29% 7% 7% 22% 35%
Chaga Test -Prueba Winer Ultra Elisa Rápido
Chagas Hai Chagas Latex Chagas EIA
Kits más utilizados para el diagnóstico de la enfermedad de CHAGAS
VENEZUELA
MÉXICO
Necesario es hacer énfasis en disminuir las brechas de iniquidad y
en los déficit de atención social (MSDS). Uno de estos déficit y
desigualdad es sin duda alguna la continua exposición de las
personas (especialmente en áreas campesinas) a la enfermedad
de Chagas. Son los lideres comunitarios a través de sus
organizaciones, los verdaderos protagonistas en permanecer
vigilantes por la
seguridad de la salud
en sus comunidades y
hacer las denuncias oportunas ante los demás organismos para
que cumplan con los requisitos fundamentales de hacer
verdaderas políticas de salud para incrementar la calidad de vida.
Millones de personas enfermas de Chagas en Venezuela y en Latino América tienen una profunda esperanza en no seguir siendo olvidados y poder ser tomadas en cuenta por la comunidad científica y para que los gobiernos hagan verdaderas políticas de estado, destinando recursos para combatir una indiscutible vergüenza del siglo XXI en nuestro continente.
Nuestros esfuerzos, sentimientos, amor, vigilia y esperanza por una pronta cura radical para millones de seres humanos desarmados frente a uno de los mayores asesinos en la vida cotidiana de las poblaciones Latino Americanas, y esperando que desde nuestra labor científica logremos aportar pistas que sirvan para desenmascarar y combatir a tan vil parásito.
GRACIAS
Ministerio de Salud y Desarrollo Social.
Universidad de Los Andes (CDCHT).
Fundación Pérez Guerrero (ONU). .
Al Núcleo de Desarrollo Endógeno de San Silvestre (Barinas): Ing. José Hernández, Dr. Álvaro Gil.
Laboratorio de Referencia Barinas.
Lideres Comunitarios Organizados del Estado Barinas.
A mis estudiantes de postgrado y pregrado y a todas las personas enfermas de Chagas, pues ellos son los verdaderos héroes de este trabajo.