Práctica #4
PROPIEDADES DE PROTEÍNAS, CARBOHIDRATOS Y
LÍPIDOS
I.
Objetivos
* Estudiar la estructura, clasificación y función de las distintas macromoléculas de importancia biológica.
* Conocer distintas pruebas colorimétricas que permitan la detección de macromoléculas.
* Discutir los efectos de condiciones ambientales como el pH y la temperatura sobre la actividad enzimática.
* Observar la presencia de azúcares y almidón en alimentos.
* Conocer las reacciones de importancia biológica para la identificación de las características de los lípidos.
II.
Introducción
Todos los organismos vivos poseen carbohidratos, proteínas, lípidos, y ácidos nucleicos. Estas moléculas son frecuentemente llamadas macromoléculas. Todas las macromoléculas son polímeros sintetizados a partir de la unión de bloques estructurales (compuestos orgánicos) más sencillos, denominados monómeros. Los polímeros pueden ser degradados en sus monómeros constituyentes mediante reacciones de hidrólisis.
Las macromoléculas tienen diferentes estructuras y propiedades químicas. Por ejemplo, los lípidos (compuestos de ácidos grasos) poseen muchos enlaces C-H y relativamente poco oxígeno, mientras que las proteínas (compuestas de aminoácidos) poseen grupos amino(NH3+) y carboxilo(-COOH)s. Estas subunidades características y grupos químicos, le confieren diferentes propiedades químicas a las macromoléculas. Por ejemplo, los monosacáridos tales como la glucosa son polares y solubles en agua, mientras que los lípidos son compuestos no polares e insolubles en agua..En este laboratorio estudiaremos solamente los carbohidratos, lípidos y proteínas.
Los carbohidratos son moléculas compuesta fundamentalmente de carbono, hidrógeno y oxígeno en una relación 1:2:1 (por ejemplo la fórmula química de la glucosa es C6H12O6). Todos los carbohidratos están formados por cadenas de carbono de tamaño variable, saturadas con grupos hidroxilo (-OH), que pueden tener una función aldehídica (-CHO) o cetónica (-C=0). Los carbohidratos pueden ser clasificados en:
Monosacáridos: Ejemplos son la glucosa, fructuosa y galactosa. Son sólidos, cristalinos, incoloros o blancos, dulces y solubles en agua. Su solubilidad, se debe a que tanto los radicales hidroxilo, como el grupo carbonilo son polares y establecen por ello enlaces de hidrogeno con las moléculas de agua también polares. Dentro de sus propiedades químicas destaca que poseen poder reductor frente a determinadas sustancias (por ejemplo el licor de Fehling), debido a la presencia del grupo carbonilo que puede oxidarse a ácido con facilidad por
disoluciones alcalinas de plata o cobre. Esta propiedad es utilizada para detectar su presencia en medios biológicos.
Disacáridos: son dulces, solubles en agua, cristalizables y por hidrólisis se descomponen en sus monosacáridos constituyentes. Entre los disacáridos de mayor interés biológico, se pueden citar como ejemplo maltosa formada por dos moléculas de -glucosa, lactosa formada por una molécula de -galactosa y otra de -glucosa y sacarosa formada por una molécula de -glucosa y otra de -fructosa.
Polisacáridos: son los azúcares más abundantes en la naturaleza y los de mayor peso molecular, formados por más de diez monosacáridos, unidos entre sí. Son insípidos, amorfos e insolubles en agua. Algunos pueden formar dispersiones coloidales. Los polisacáridos realizan funciones biológicas de dos tipos: de reserva energética y estructural. Los primeros (almidón y el glucógeno) presentan enlaces de tipo , mientras los segundos (celulosa y la quitina), poseen enlaces de tipo .
Las proteínas son las macromoléculas más versátiles de las células. Cumplen funciones estructurales, de catalizadores (enzimas), de transporte, de regulación, de protección y de almacenamiento Una de las funciones más importantes de las proteínas es la de participar como catalizadores biológicos de reacciones químicas importantes, es decir, compuestos que incrementan la velocidad de la reacción química sin alterarla. El material en el cual el catalizador reacciona se llama sustrato, y es modificado durante la reacción para formar un nuevo producto. El sitio activo de una enzima puede unirse con el sustrato, formando el complejo enzima-sustrato. Es aquí donde ocurre la catálisis. Cuando ésta se completa, el complejo se disocia en enzimas y productos.
Los lípidos son un grupo muy heterogéneo de macromoléculas que se definen por el hecho de que son solubles en solventes en disolventes orgánicos como la gasolina, benceno, xilol, cloroformo, pero prácticamente insolubles en agua. El componente principal de las grasas o lípidos son los ácidos grasos, que son almacenados y transportados en forma de triglicéridos (3 ácidos grasos unidos a una molécula de glicerol).
Cuando en su molécula contienen ácidos grasos insaturados, las grasas se presentan como aceites, tal es el caso de los vegetales. Si contienen ácidos grasos saturados dan lugar a grasas sólidas o semisólidas, como ocurre en los animales (sebos y mantecas). Desde el punto de vista nutritivo son la mayor fuente de calorías, siendo utilizadas como reserva energética de uso no inmediato. Además, son portadoras de vitaminas liposolubles (A, D, E, K) y contienen los llamados ácidos grasos esenciales, de gran importancia para el buen funcionamiento del organismo. Algunos lípidos como el colesterol, forman parte importante de las membranas celulares.
Los lípidos se clasifican de varias formas, una de ellas es atendiendo a la presencia ácidos grasos (saponificables) o no (no saponificables) en su composición, dividiéndose así en dos grupos:
1. Lípidos saponificables 2. Lípidos no saponificables
A. Simples A. Terpenos
1. Acilglicéridos (grasas o aceites)
B. Esteroides 2. Céridos (ceras) C. Prostaglandinas B. Complejos
1. Fosfolípidos 2. Glucolípidos
Entre las grasas biológicamente importantes encontramos a los fosfolípidos, los carotenoides y esteroides. Los fosfolípidos son un componente importante de la membrana celular, otros lípidos actúan como hormonas y algunos funcionan como almacén de energía a largo plazo (1 gr de grasa almacena más del doble de energía que 1 gr de carbohidratos).
En el laboratorio, es posible extraer conclusiones acerca de la identidad, composición (pureza, autenticidad) y calidad (frescura, vida útil) de una grasa/aceite empleando diferentes métodos químicos o físico-químicos y sensoriales. Entre los métodos químicos (índices) destacan el de saponificación (cantidad de hidróxido potásico necesaria para la saponificación de 1 g de grasa), yodo (cantidad en gramos de yodo que resulta ligada por cada 100 g de grasa), acidez (cantidad en miligramos de hidróxido potásico necesaria para la neutralización de los ácidos grasos libres presentes en1 g de grasa) y de peróxidos (cantidad en miligramos de oxígeno activo en 1 Kg de grasa).
III.
Procedimiento
Durante la sesión de laboratorio se realizarán seis experimentos que le permitirán conocer algunas propiedades químicas de las macromoléculas. . Para lograr éste objetivo, los miembros pares o impares de cada uno de los subgrupos de laboratorio definidos en la primera sesión de laboratorio, realizarán y analizarán un experimento, de acuerdo a las indicaciones del instructor.
Al finalizar los experimentos, todos los miembros de cada subgrupo se reúnen para hacer una discusión de los resultados obtenidos y completar el reporte. Cada subgrupo debe estar preparado para presentar y discutir sus resultados.
Experimento1.- Reconocimiento de proteínas
Reconocimiento de proteínas
Los componentes más importantes del reactivo de Biuret son NaOH y CuSO4, siendo el ión Cu2+el que reacciona con el grupo amino del enlace peptídico produciendo una coloración violeta. La intensidad de la coloración está relacionada con el número de enlaces peptídicos en la reacción
1. Prepare 5 tubos de ensayos limpios y secos. Dispense las siguientes soluciones: Tubo 1: 2 ml de albúmina,
Tubo 2: 2 ml de miel
Tubo 3: 2 ml de solución de gelatina Tubo 4: 2 ml solución de aminoácidos, Tubo 5: 2 ml de agua destilada, y
2. Agregue a cada tubo 5 gotas del reactivo de Biuret y agite.
3. Haga observaciones y compare. Describa sus observaciones en el reporte
Experimento 2.- Propiedades de las proteínas
Propiedades de las enzimas.- Velocidad de reacción de la catalasa y el efecto del pH en
la reacción enzimática
La enzima catalasa es muy activa en todas las células. Cataliza la reacción que disocia el peróxido de hidrogeno (fuerte agente oxidante potencialmente dañino) producto del metabolismo celular. En este experimento se usara una suspensión de levadura (Saccharomyces cereviciae) al 1.5 %, como fuente de la enzima catalasa y el H2O2 como sustrato.
Formule una hipótesis que relacione la presencia o no de la enzima catalasa en el cultivo de levadura y el uso del H2O2 como sustrato. Prediga los resultados
Tubo Contenido H2O H2O2 H2O2/HCl (0,1 M) H2O2/NaOH (0.1 M) 1 H2O 5.0 ml 0.0 ml 0.0 ml 0.0 ml 2 H2O2 (3%) 4.5 ml 0.5 ml 0.0 ml 0.0 ml 3 H2O2 (6%) 4.0 ml 1.0 ml 0.0 ml 0.0 ml 4 H2O2+ HCI 3.5 ml 0,5 ml 1,0 ml 0,0 ml 5 H2O2+NaOH 3.5 ml 0,5 ml 0,0 ml 1,0 ml pH
Nota: utilice la probeta graduada para H2O2, HCl y NaOH. Complete con dH2O hasta obtener el
volumen final (5 ml)
2. Utilizando bandas medidoras, mida el pH en cada uno de los tubos de ensayo y anótelo en el reporte en el cuadro respectivo.
3. Tome con una pinza 1 disco de papel de filtro y sumérjalo por 5s en la suspensión de catalasa(verifique que cada disco sea individual y que se encuentre libre de residuos, evite tocarlo con las manos).
4. Déjelo secar al aire ligeramente por unos 10 segundos.
5. Con otra pinza, tome el disco y déjelo caer hasta el fondo de un tubo de ensayo que contiene una solución de H2O2 (3%) (no toque la solución con la pinza). Tan pronto el disco alcance o detenga la caída el fondo del tubo, inicie el cronómetro.
Al iniciarse la reacción observe las características de la solución y el movimiento del disco.
6. Mida la distancia (mm) que recorren los discos, midiendo la altura de la columna de H2O2en el tubo de ensayo.
7. Cuando el disco alcance la superficie de la solución detenga el cronómetro y anote el tiempo transcurrido.
8. Repita este experimento (pasos 3 - 7) con otros 4 discos. Si sus resultados no son consistentes, repita el experimento hasta que los resultados sean similares.
9. Repita el experimento en los otros tubos de ensayo utilizando otros discos (5 discos para cada tubo) 10.Complete el cuadro en el reporte y describa los resultados obtenidos.
11.Calcule la velocidad promedio de reacción (mm/s).
12.Al finalizar el experimento, dispense el contenido de los tubos de ensayo en las botellas debidamente rotuladas.
Experimento 3.- Reconocimiento de carbohidratos
Algunos azúcares (como la glucosa) son capaces de reducir otros compuestos y se denominan azúcares reductores (todos los mono y disacáridos con un grupo libre aldehído y cetónico son agentes reductores en soluciones alcalinas).
El reactivo de Benedict es una solución alcalina que contiene iones cobre, los cuales pueden oxidar grupos aldehídos o cetonas a ácido carbónico. A su vez lo iones Cu se reducen a óxido cuproso que forma un precipitado rojo.
La siguiente reacción explica dicho fenómeno:
RCHO + 2Cu2+ + 4OH- ---> RCOOH + Cu2O + 2H2O
Cuando el reactivo de Benedict está en presencia de un azúcar reductor, éste produce cambios en la coloración de la solución que varía de amarillo a verde o rojo dependiendo de la cantidad y el tipo del azúcar presente, siguiendo la siguiente escala:
azul verde naranja rojo rojo-marrón
(-) (+) (++) (+++) (++++)
Por otra parte, compuestos a base de iodo reaccionan con polisacáridos que producen soluciones de diferentes colores. Específicamente, la amilosa rinde un color azul–negro oscuro, mientras la celulosa forma un precipitado rojo-marrón y el glicógeno produce rojizo. Monosacáridos y disacáridos son demasiado pequeños para reaccionar con el I2. Es así que esta prueba permite distinguir entre mono/disacáridos y polisacáridos. También permite evaluar el curso temporal de la hidrólisis de algún polisacárido.
1. Prepare 12 tubos de ensayos, y dispense 2 ml de las siguientes soluciones (2 para cada tipo de muestra): Tubo Contenido 1, 2: dH2O 3, 4: macerado de papa 5, 6: macerado de cebolla 7, 8: solución de sacarosa (1%) 9,10: solución de glucosa (1%) 11,12: solución de almidón (1%)
2. A cada uno de los tubos de ensayo con números impares, añada 3 gotas del reactivo de Benedict. 3. Coloque los tubos de ensayo en baño de maría por 5-10 min y observe regularmente los cambios en la
coloración de la solución. Anote en el reporte la coloración final obtenida a los 20 minutos.
4. A los tubos de ensayo con números pares agregue 3 -5 gotas de Lugol. Observe y anote en el reporte los cambios en coloración.
5. Tome otros 2 tubos de ensayo (13,14) y dispense 3 ml de almidón en cada tubo.
6. Tome dos pequeñas muestras de cada tubo (una gota). Colóquelas en tubos de ensayo aparte y realice la prueba de Lugol y Benedict a cada muestra. Anote sus observaciones.
7. Al tubo de ensayo 13, dispense 5 gotas de HCl (20%) y colóquelo en agua hirviendo durante 15 min. Coloque el tubo 14 en agua hirviendo sin agregar ácido.
8. Después de esperar este tiempo remueva una gota de la solución de cada tubo y realice la prueba de lugol a cada muestra. Anote sus resultados. Repite esta operación hasta que obtenga un resultado negativo a la prueba de Lugol en el tubo 13.
9. Deje enfriar la solución y neutralice el pH añadiendo suficiente NaOH (10%) al tubo 13.
10.Siguiendo el procedimiento del punto 6, realice la prueba de Benedict y Lugol a los tubos 13 y 14. Anote en el reporte, sus resultados.
11.Dispense el contenido de los tubos de ensayo en las botellas debidamente rotuladas.
Experimento 4.- Reconocimiento de lípidos
El reconocimiento de los lípidos se realiza con el colorante Sudán III, un colorante liposoluble que tiñe las grasas selectivamente de color rojo-anaranjado. En presencia de una mezcla de lípidos y agua, Sudán III se mueve hacia la capa de lípidos, formando una banda roja.
1. Prepare 5 tubos de ensayo con las siguientes soluciones: Tubo Contenido 1 dH2O 2 1 ml aceite vegetal 3 1 ml de solución desconocida 1 4 1 ml de solución desconocida 2 5 1 ml leche regular
2. A cada uno de los tubos de ensayo, añada 5 gotas de Sudan III.
3. Mezcle el contenido de cada tubo y anote en el reporte el color del contenido del tubo.
4. Para comprobarla solubilidad de los lípidos en disolventes orgánicos, coloque en un tubo de ensayo: 1 ml de aceite+ 1 gota de Sudán III + 10 ml de acetona.
5. Tape y agite enérgicamente. Espere unos segundos. Describa sus resultados.
Experimento 5.- Propiedades de lípidos
Los lípidos más abundantes son los que posen ácidos grasos, es decir, los lípidos saponificables. De ellos los triglicéridos (grasas y aceites) son los más característicos
En los seres vivos, la hidrólisis de los triglicéridos se realiza mediante la acción de enzimas específicas (lipasas) que dan lugar a la formación de ácidos grasos y glicerina. En este caso, la enzima lipasa es hidrosoluble pero su sustrato (triacilgliceroles) no lo es, por lo que se hace importante la participación de agentes emulsificantes (sales biliares) que reducen la tensión superficial de las grasas, separando las grasas en gotas mas pequeñas, aumentando así el área superficial de exposición a la acción enzimática.
Los ésteres de ácidos grasos reaccionan en caliente con el hidróxido de sodio o potasio descomponiéndose en los dos elementos que las integran: glicerina y ácidos grasos. Éstos se combinan con los iones sodio o potasio del hidróxido para dar jabones (saponificación).
En este experimento demostraremos la hidrólisis y emulsificación por detergentes de las grasas.
(a) Saponificación
1. Dispense3 ml de aceite (sin pipetearlo) a un tubo de ensayo. 2. Añada 3 ml de NaOH 0.1 My agite enérgicamente.
3. Caliente al baño María por unos 20-30 minutos. Al finalizar este tiempo anote sus observaciones.
(b) Emulsificación
1. Dispense 3ml de aceite a dos tubos de ensayo. A uno de ellos añada 3 ml de dH2O (puede teñir el agua con cualquier colorante vegetal para facilitar la observación). Describa que pasa en la mezcla agua: aceite.
2. Al segundo tubo de ensayo con aceite, añada 3 ml de agua y 2 gotas de solución de detergente liquido.
3. Tape ambos tubos y agite enérgicamente. Observe qué pasa en cada tubo inmediatamente después de agitar. Luego haga observaciones al transcurrir 1 min, 5 min y 30 min. Haga un registro de sus observaciones.
Experimento 6.- Reconocimiento de macromoléculas en alimentos
En la semilla, proteínas, carbohidratos y lípidos, se encuentran en diferente proporción y son importantes para el desarrollo del embrión que dará pie a la germinación de la planta.
Este experimento utiliza semillas de maní, frijol, maíz y arroz para aplicar las pruebas colorimétricas de reconocimiento de macromoléculas.
Se utilizarán las mismas pruebas descritas en los experimentos previos para identificar la presencia y la abundancia relativa de las macromoléculas en las semillas.
1. Seleccione 4 semillas de: maní, frijol, maíz y arroz. Realice un corte longitudinal cerca de la mitad del grano, y coloque la parte con el mejor corte de cada semilla en una fila de la placa de reacción o en tubos de ensayo separados y rotulados para cada semilla.
2. Por filas, en la placa de reacción, agregue 2-5 gotas de los siguientes reactivos en cada espacio: reactivo de Biuret, lugol, Sudán III y reactivo de Benedict previamente calentado. En el caso de trabajar con tubos de ensayo, coloque las gotas de reactivo de manera que todas las semillas sean probadas con cada reactivo.
3. Espere unos segundos. Elabore un cuadro, anote sus resultados y responda las preguntas especificadas en el reporte.
Al finalizar los experimentos de esta práctica, debe prestar especial atención en dejar limpios todos los materiales utilizados y el área de trabajo.
Los tubos de ensayo deben quedar limpios, sin residuos y colocados boca-abajo en sus respectivas gradillas para permitir el secado rápido.
