Diversidad de Trichoderma en el agroecosistema cacao del estado de Tabasco, México

(1)

Disponibleenwww.sciencedirect.com

Revista

Mexicana

de

Biodiversidad

www.ib.unam.mx/revista/ RevistaMexicanadeBiodiversidad86(2015)947–961

Ecología

Diversidad

de

Trichoderma

en

el

agroecosistema

cacao

del

estado

de

Tabasco,

México

Trichoderma

diversity

in

the

cocoa

agroecosystem

in

the

state

of

Tabasco,

Mexico

Magdiel

Torres-De

la

Cruz

a

,

Carlos

F. Ortiz-García

b

,

Consuelo

Bautista-Mu˜noz

a,b,c

,

José

Abraham

Ramírez-Pool

c

,

Nayely

Ávalos-Contreras

a

,

Silvia

Cappello-García

a

y

Aracely

De

la

Cruz-Pérez

a,∗

a_División_Académica_de_Ciencias_Biológicas,_Universidad_Juárez_Autónoma_de_Tabasco._Km._0.5_Carretera_{Villahermosa-Cárdenas,}₈₆₀₃₉_Tabasco,_México b_Colegio_de_{Postgraduados,}_Campus_Tabasco._Km._3.5_Carretera_{Cárdenas-Huimanguillo,}_H._Cárdenas,₈₆₅₀₀_Tabasco,_México

c_Departamento_de_{Biotecnología}_y_{Bioingeniería,}_Centro_de_{Investigación}_y_de_Estudios_Avanzados,_Instituto_Politécnico_Nacional._Av._Instituto_Politecnico

Nacional2508,DelegaciónGustavoA.Madero,ColoniaSanPedroZacatenco,07360México,D.F.,México

Recibidoel29deoctubrede2013;aceptadoel8dejuliode2015 DisponibleenInternetel6denoviembrede2015

Resumen

LasplantacionesdecacaodeTabascotienensimilitudconlasselvastropicales.Esteagroecosistemaayudaaconservarlabiodiversidad.En laentidad,losestudiosdediversidadenelagroecosistemacacaoestánrelacionadosconlavegetación,mamíferos,avifauna,insectosyara˜nas. Ladiversidaddehongosnosehaestudiado.ElobjetivodelpresentetrabajofuecaracterizarladiversidaddeHypocrea/Trichodermapresente enlarizósferadeTheobromacacaoenTabasco,México.Paraestefin,seobtuvieroneidentificaron96aislamientosdeHypocrea/Trichoderma

mediantemorfologíaysecuenciasdeITS.LasespeciesencontradasfueronTrichodermaasperellum,T.brevicompactum,T.harzianum/H.lixii,

T.koningiopsis/H.koningiopsis,T.longibrachiatum/H.sagamiensis,T.pleuroticola,T.reesei/H.jecorina,T.spiraleyT.virens/H.virens.Los índicesderiqueza(DMg)yabundancia(H)fueronde1.75y1.69,respectivamente.ElíndicedeuniformidaddePielou(J)fuede0.77.Lamayor

diversidaddeTrichoderma/HypocreasedetectóenlasubregiónChontalpa.Trichodermaharzianum/H.lixiifuelaespeciemásabundante.Todaslas especiesencontradassonprimerregistroparaelagroecosistemacacaoenTabasco.Trichodermaasperellum,T.brevicompactum,T.koningiopsis/ H.koningiopsis,T.pleuroticola,T.reesei/H.jecorinayT.spiralesonregistrosnuevosparalaentidadyTrichodermapleuroticolaesregistronuevo paraMéxico.

Palabrasclave: Biodiversidad;Micromicetos;Rizósferadecacao

Abstract

CocoaplantationsofTabascoaresimilarto rainforests.Thisagro-ecosystemcontributesto preservethebiodiversity.InTabasco,diversity studiesinthecacaoagro-ecosystemarerelatedtothevegetation,mammals,birds,insectsandspiders.Thefungaldiversityhasnotbeenstudied. TheaimofthisstudywastocharacterizethediversityofTrichoderma/HypocreafromthecocoarhizosphereincocoaproductionareasofTabasco. Tothisend,96 strainsofHypocrea/Trichodermawereobtained andidentifiedby morphologyandITS sequences.Trichodermaasperellum,

T.brevicompactum, T.harzianum/H. lixii, T.koningiopsis/H. koningiopsis, T. longibrachiatum/H. sagamiensis, T.pleuroticola, T.reesei/H. jecorina,T.spiraleyT.virens/H.virens,weretheidentifiedspecies.Therichness(DMg)andabundance(H)indexeswere1.75y1.69,respectively.

ThePielouuniformityindex(J)was0.77.ThehighestdiversityofTrichoderma/HypocreawasdetectedintheChontalpasubregion.T.harzianum/

H.lixiiwasthemostabundant.AllthespeciesarefirstreportforthecocoaagroecosystemofTabasco.Trichodermaasperellum,T.brevicompactum,

∗_Autor_para_{correspondencia.}

Correoelectrónico:[email protected](A.DelaCruz-Pérez).

LarevisiónporparesesresponsabilidaddelaUniversidadNacionalAutónomadeMéxico. http://dx.doi.org/10.1016/j.rmb.2015.07.012

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T.koningiopsis/H.koningiopsis,T.pleuroticola,T.reesei/H.jecorinayT.spirale,arenewreportsforthestate.Trichodermapleuroticolaisnew recordforMexico.

Keywords: Biodiversity;Micromycetes;Cocoarhizosphere

Introducción

ElestadodeTabascoesproductordecacaoconmásde500 a˜nosdepráctica(Córdova-Ávalosetal.,2001).Susplantaciones secaracterizanporserunagroecosistemaarboladodesombra, queformaunpaisajeheterogéneoacausadeladiversidad florís-ticaasociadaaellos.Debidoalascondicionesclimáticasdonde secultivayporestablecersebajoundoseldiversificadode som-bra,esteagroecosistematienesimilitudconlasselvastropicales

(Greenberg, Bichier y Cruz, 2000). Además, éste contribuye

considerablementeaconservarlabiodiversidad,provee impor-tantesserviciosambientales (Vandermeer,2003)y aportauna cantidadsignificativademateriaorgánicaqueprotegeelsuelo

(RiceyGreenberg,2000;Rivas-Rojas,2005).

EnelagroecosistemacacaodelestadodeTabasco,los estu-diosdediversidadestánrelacionadosconlavegetación,avese insectos(Córdova-Ávalosetal.,2001;Greenbergetal.,2000;

Ibarra, Arriaga y Estrada, 2001; Mu˜noz, Estrada y Naranjo,

2005;Pérez-DelaCruzetal.,2009;Pérez-DelaCruz,

Sánchez-Soto,Ortiz-García,Zapata-MatayDelaCruz-Pérez,2007);sin

embargo,ladiversidaddehongoshasidopocoestudiada.Las característicasúnicasdeesteagroecosistemasugierenla existen-ciadeunaampliadiversidaddehongos,talescomoespeciesdel géneroTrichoderma,cuyoteleomorfoesHypocrea (Ascomy-cota:Hypocreales).

Trichoderma/Hypocreaes un género de hongos cosmopo-litayhabitantedesuelos,maderaendescomposicióny restos deplantas(KleinyEveleigh,1998).Diversasespeciesdeeste género están asociadas con la rizósfera de plantas o pueden relacionarsedemaneraendofítica(Harman,Howell,Viterboy

Chet,2004).Estoshongossoncomponentespredominantesde

lamicobiotadel sueloenvariosecosistemas,entrelos quese incluyenlosagrícolas(DeBellis,KernaghanyWidden,2007). Algunasespeciesdeestegénerotienenimportanciaeconómica, debido a la producción de enzimas y antibióticos. También se utilizan como agentesde control biológico de enfermeda-des vegetales y como estimuladores del crecimiento vegetal

(Harmanetal.,2004;KubicekyPenttilä,1998).

Uno de los estudios sobre diversidad de

Tricho-derma/Hypocrea en el agroecosistema cacao, basados en morfología y secuencia de genes, es el de Rivas-Cordero

y Pavone-Maniscalco (2010). Estos autores evaluaron la

diversidad de especies de Trichoderma en la rizósfera de plantasdeT.cacaoL.delestadodeCarabobo,Venezuela.En México, Sánchezy Rebolledo (2010)evaluaron ladiversidad de Trichoderma en el agroecosistema agave tequilana, en la regióndeLosAltosSurdeJalisco,México.

A pesarde laimportancia de lasespecies del género Tri-choderma,enel estadode Tabasconoexisten estudiossobre

elconocimientodesubiodiversidadenplantacionesdecacao. Así,enesteestudioseaislaroneidentificaronespeciesde Tri-chodermapresentesenlarizósferadeplantasdeT.cacaodel estado de Tabasco, y tambiénse caracterizóla diversidadde

Hypocrea/Trichoderma.Sedescribelaimportanciaeconómica ybiotecnológicadelasespeciesencontradas.

Materialesymétodos

El estado de Tabasco se encuentra situado al sureste de la República Mexicana entre los 17◦1500 - 18◦3845 N, 90◦5908-94◦0700O.Ensuterritorioseencuentran2 pro-vincias fisiográficas: Llanura Costera del Golfo Sur(70%) y SierradeChiapasyGuatemala(30%).Lossuelos predominan-tessonvertisoléutrico(433,000ha),histosolfíbricoyasociación degleysoles(341,078ha)yfluvisoléutrico(245,828ha)(

López-Güemez et al., 2007; Palma-López, Cisneros-Domínguez,

Moreno-Cáliz y Rincón-Ramírez, 2007). El clima

predomi-nante es cálido húmedo con abundantes lluvias en verano

(Velázquez, 1994), temperaturas medias anuales superiores a

los26◦C(GarcíayVidal-Zepeda,1990a),convaloresmínimos

entre 20-22◦Cenenero, y máximosentre30-34◦Cen mayo

(GarcíayVidal-Zepeda,1990b).Laprecipitaciónmediaanual

es de 2,432mm,conperiodos de precipitacióny sequía defi-nidos(CNA,2005).Poseeunasuperficiedeaproximadamente 24,661km2yenellaseasientan17municipiosquesereparten en2 grandesregiones:Grijalvay Usumacinta.Laregión Gri-jalvasedivideen3subregiones:lasubregióndelaChontalpa, formadaporlosmunicipiosdeHuimanguillo,Cárdenas, Cun-duacán,Comalcalco yParaíso;lasubregiónCentro, integrada porlosmunicipiosdeCentro,JalpadeMéndezyNacajuca,yla subregiónSierra,constituidaporlosmunicipiosdeTeapa,Jalapa yTacotalpa.LaregiónUsumacintasedivideen2subregiones: lasubregiónlosRíos,formadaporlosmunicipiosdeBalancán, Centla,EmilianoZapata,JonutayTenosique,ylasubregiónlos Pantanos,integradaporlosmunicipiosdeMacuspana,Jonutay Centla.Laentidadcuentaconunasuperficiede236,812hapara eldesarrollodelaagricultura,delascuales41,086haestán ocu-padasconplantacionesdecacao,distribuidasen10municipios delassubregionesChontalpa,CentroySierra,endondela pri-meraconcentralamayorsuperficiecultivada,aproximadamente el16.38%delasuperficieestatal(Sagarpa,2000)(fig.1).

Los sitios de muestreo se ubicaron en 3 subregiones: Chontalpa (Huimanguillo,Cárdenas, Cunduacán, Comalcalco y Paraíso), Centro (Centro, Jalpa de Méndez y Nacajuca) y Sierra (Teapa y Tacotalpa). De esta manera se consideraron los 10municipiosqueconcentraneltotaldelaproducciónde cacaoenlaentidad.Encadamunicipiolosmuestreos consistie-ronen3muestrascompuestasdesuelosuperficial(0-20cmde

(3)

Figura1.UbicacióndelestadodeTabascoenlaRepúblicaMexicana(recuadroinferior)ydistribucióndelasplantacionesdecacaoenTabasco,México(recuadro superior).

Fuente:OEIDRUS,2009.

profundidad).Asuvez,cada muestracompuestarepresentóa 1haalconsiderar5submuestras;entonces,las3muestras com-puestasrepresentarona3haencadamunicipio.Lascoordenadas yaltituddelossitiosdemuestreocompuestoseaprecianenla

tabla1.Elprocesodemuestreoserealizódurantelaépocade

lluvias(octubreadiciembrede2012).Cadasubmuestrase reco-lectódelarizósferadelárboldeT.cacao,a1mdedistanciadel tronco.

LosaislamientosdelasespeciesdeTrichodermase obtuvie-ronpor elmétodo de diluciónen placa(Nelson, Toussoun y

Marasas,1983),paralocual,sediluyeron10gdesuelodecada

muestracompuestaen90mldeaguadestiladaestéril(dilución 1:10).Seprepararon2dilucionessucesivas(1:100y1:1,000),de lascuales,sedispersóunaalícuotade0.5mldecadasuspensión deformauniformesobrelasuperficiedeunacajadePetriconel mediodecultivoagardextrosaypapa(PDA)acidificado(1mlde ácidoláctico/1l).Elácidolácticosea˜nadióalmediodecultivo antesdevaciarenlascajasdePetri.Seprepararon3 repeticio-nespordiluciónutilizada.Lasplacassembradasseincubarona 25◦C,12hluz/oscuridaddurante7días.Elcrecimientode Tri-chodermafuereconocidoporlaformacióndeparchesocojines verdesdeconidios.Lascoloniasvisiblesdurantelos5y7días despuésdelasiembrasetransfirieronacajasdePetriconmedio PDAy se incubaroncomo se mencionóanteriormente,como recomiendaMichel-Aceves(2001).

Lascolonias de Trichoderma se cultivaron usando la téc-nicadecultivosmonospóricos(Estrada,VélezyLópez,1997). Loscultivosfueronalmacenadosa4◦Chastalaidentificación morfológicayextraccióndeADN.Todoslosaislamientos des-critosenelpresenteestudioestánconservadosenlacolección dehongosdelaDivisiónAcadémicadeCienciasBiológicasde laUniversidadJuárezAutónomadeTabasco.

LascepasfueronsembradasencajasdePetriconPDAe incu-badasdurante7días,paradeterminarlascaracterísticasdela

colonia:tama˜no,morfologíayconidiación.Además,seinoculó unasuspensióndeesporassobre discosdePDAde0.5cm de diámetro,bajouncubreobjeto,paraobtenerestructuras micros-cópicas de cada aislamiento. Todos los discos inoculados se incubaron a 25◦C en una cámara húmeda durante 3-5 días. Lascaracterísticasmicroscópicasdeconidióforos,fiálides, coni-dios y clamidosporas fueron observadas bajo el microscopio decampoclaroyfotodocumentadasmediantedigitalizaciónde imágenes.Posteriormente,sellevóacabolamorfometríaconel softwareImageTool®_3.00_para_Windows._Para_la_{identificación}

morfológicadelasespeciesdeHypocrea/Trichodermaseutilizó laclaveinteractivadeSamuels,Chaverri,FarryMcCray(2002) y éstaseconfirmóconlasdescripcioneshechasporChaverri,

Castlebury,Overton,&Samuels(2003);GamsyBissett(2002);

Krausetal.(2004);Park,BaeyYu(2006);Samuelsetal.(2006)

ySamuels,LieckfeldtyNirenberg(1999).

ElADNgenómicodelasespeciesdeTrichodermaseobtuvo delmiceliode5coloniassembradasencajasdePietriconPDA y72hdeincubación.Elmiceliofuehomogeneizadoen400␮L debufferdeextracciónPBS,enuntuboEppendorfde1.5ml. Seguidamente,elADNseobtuvosiguiendoelprotocolodelKit AxyPrepMultisource GenomicADNMinipep(Axigen®).La calidad deADN seevaluó engel deagarosaal1%(Agarosa UltraPure,Invitrogen®)ycuantificóenunespectrofotómetro PerkinElmer®_(Lambda_BIO₁₀®_)._Las_regiones_ITS1,_ITS2_y

5.8delARNribosomalseamplificaronporreacciónencadena delapolimerasa(PCR),utilizandolos iniciadoresuniversales

ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)eITS5(GGAAGT

AAAAGT CGTAACAAGG)(White,Bruns,Lee yTaylor,

1990).Laamplificaciónse realizósegúnprotocolodeAhrens

y Seemüller (1992), conmodificaciones en lasreacciones de

PCR cuyo volumen final fue de 25␮L: agua ultrapura esté-ril (16.05␮L), solución amortiguadora Buffer 10X (2.5␮L), MgCl2 a50mM(1.25␮L),dNTPmezcla a10mM (0.5␮L),

(4)

Tabla1

LocalizacióndesitiosdemuestreoyaislamientosdeTrichoderma/HypocreaobtenidosdelarizósferadeTheobromacacaoenTabasco,México,2013. Municipio Localidad LatitudNorte LongitudOeste Altitud(m) Aislamientosobtenidos Númerode

aislamientos Paraíso R/a.Moctezuma1 18◦2219.3 93◦1342.4 3 TTC1,TTC2,TTC3,TTC4 4

R/a.Oriente 18◦2106.9 93◦1257.8 3 TTC5 1 Ej.Occidente-San Francisco 18◦2037.9 93◦1524.5 3 TTC6,TTC7,TTC8 3 Cárdenas PobladoC-28 18◦0146.7 93◦2942.0 3 TTC9,TTC10,TTC11,TTC12, TTC13 5 R/a.Ocampo 18◦0149.3 93◦2129.7 21 TTC14,TTC15,TTC16 3 R/a.RíoSeco1 18◦0347.2 93◦2304.4 23 TTC17,TTC18,TTC19 3 Comalcalco R/a.Arena4 18◦1325.4 93◦2331.1 6 TTC20,TTC21,TTC22,TTC23,

TTC24

5 R/a.GregorioMéndez1 18◦1459.9 93◦1712.7 12 TTC26,TTC27,TTC28 3

FincaCholula 18◦1703.9 93◦1235.7 3 TTC29 1

Cunduacán Ej.JoséMaríaPino Suárez

18◦0830.1 93◦1729.1 21 TTC31.TTC32 2 R/a.LaPiedra1 18◦0745.2 93◦1152.4 14 TTC35,TTC37,TTC39 3 R/a.Huimango2 18◦0801.0 93◦0954.8 3 TTC40,TTC41,TTC42,TTC44 4 Huimanguillo R/a.VillaFlores2 17◦4806.6 93◦2416.5 3 TTC45,TTC46,TTC47 3

R/a.Paredón1 17◦4459.6 93◦2357.8 7 TTC48,TTC49,TTC50,TTC51, TTC52

5 Ej.RafaelMartínez 17◦4256.8 93◦2345.7 5 TTC54,TTC55 2 JalpaDeMéndez R/a.Hermenegildo

Galeana2

18◦1033.4 93◦0848.5 12 TTC56,TTC57,TTC58,TTC59, TTC61

5 Ej.Huapacal 18◦1148.1 93◦1028.5 4 TTC62,TTC63 2 R/a.BenitoJuárez2 18◦0959.1 93◦1120.0 5 TTC64 1 Nacajuca R/a.RiveraAlta 18◦1051.0 93◦0215.0 8 TTC66,TTC67 2 R/a.Vainilla 18◦0851.7 93◦0147.1 10 TTC68,TTC69,TTC70 3 R/a.Allende 18◦0938.1 93◦0200.8 7 TTC73,TTC74,TTC75,TTC76 4 Centro R/a.Plátanoycacao4 17◦5904.2 93◦1007.9 2 TTC77,TTC79,TTC81,TTC82,

TTC84

5 R/a.BuenaVista1 17◦5659.2 93◦0623.2 12 TTC85,TTC86 2 R/a.González4 17◦5729.6 93◦0525.7 11 TTC87,TTC88,TTC89,TTC90,

TTC91,TTC92

6 Tacotalpa Ej.Zunuyypatastal 17◦2810.3 92◦5056.7 155 TTC93,TTC95 2 R/a.Pochitocal1 17◦3718.9 92◦4510.6 14 TTC96,TTC97 2 R/a.Puyacatengo1 17◦3937.2 92◦5420.7 14 TTC98,TTC100,TTC101,

TTC102,TTC103,TTC104

6 Teapa R/aAllende3 17◦3602.9 92◦5927.7 29 TTC105,TTC106 2 Ej.Allende2 17◦3320.0 92◦5908.7 90 TTC107.TTC108,TTC109 3 Ej.VicenteGuerrero 17◦3015.7 92◦5402.5 91 TTC111,TTC113,TTC114,

TTC115

4

LascepasobtenidasfueronidentificadasconlassiglasTTC(TrichodermaTabascocacao)seguidasdeunnúmeroquelasdiferencia.

iniciadoresITS4eITS5a10pmol(1.25␮Ldecadauno),Taq DNApolimerasa(Invitrogen®)a1U(0.2␮L)yADNblancoa 50ng(2␮L).

El procedimiento para la PCR consistió en los siguien-tes ciclos: 1 de 95◦C por 4min, 35 de 95◦C por 1min, 35 de 58◦C por 1min, 35 de 72◦C por 2min y un ciclo

de 72◦C durante 10min. Los productos de la PCR se

sometieron a electroforesis en gel de agarosa para visuali-zación y medida de la especificidad. La cuantificación del

ADN se realizó por espectrofotometría (NanoDrop 2000,

Thermo Scientific®). Los productos fueron enviados para secuenciación a Macrogene®, y las secuencias obtenidas se compararon con la base de datos del banco de genes del NationalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI, 2014)

(www.ncbi.nlm.nih.gov/).Para lacomparación de los valores

generadosconlasecuenciadeestudioseconsideróunasimilitud

≥97%(StackebrandtyGoebel,1994).Lasinonimiaaceptada

está basada en Index Fungorum (www.indexfungorum.org/), MycoBank (www.mycobank.org) y Enciclopedia de la vida

(http://eol.org/pages/192915/names/synonyms).

Las secuencias de nucleótidos fueron alineadas usando el programa Crustalx 2.1 (Thompson, Gibson, Plewniak,

Jeanmougin y Higgins, 1997).La inferencia filogenética fue

realizada por el método neighbor-joining (NJ) (Saitou y Nei, 1987) usando el programa MEGA6 (Tamura, Stecher,

Peterson, Filipski y Kumar, 2013). El soporte de las ramas

en el árbol de NJ se estimó mediante el método de

Bootstrap, usando 1,000 réplicas (Felsenstein, 1985). Las distancias evolutivas se estimaron usando el método P. distance (Nei y Kumar, 2000), excluyendo gaps y datos faltantes. Los valores de bootstrap ≥ 70% se considera-ron significativos (Felsenstein, 1985). Como grupo externo

(5)

TTC70 64 64 99 53 64 99 68 52 TTC91 TTC64 TTC6 TTC11 TTC105 TTC100 TTC75 TTC76 TTC92 TTC89 TTC77 TTC62 TTC12 TTC114 TTC73 TTC44 TTC68 TTC42 TTC41 TTC90 TTC111 TTC74 TTC40 TTC82 TTC39 TTC37 TTC5 TTC57 TTC56 TTC48 TTC19 TTC13 TTC109 TTC108 TTC115 TTC95 TTC87 TTC97 TTC96 TTC106 TTC98 TTC10 TTC49 TTC103 TTC9 TTC7 TTC69 TTC14 TTC16 TTC32 TTC23 TTC59 TTC31 TTC67 TTC58 TTC15 TTC66 TTC104 TTC17 TTC102 TTC54 TTC85 99 99 94 99 58 94 99 89 0.01 65 89 65 99 99 91 TTC93 TTC4 TTC47 TTC50 TTC86 TTC55 TTC79 TTC45 TTC52 TTC113 TTC81 TTC27 TTC101 TTC26 TTC28 TTC88 TTC84 TTC21 TTC63 TTC18 TTC61 TTC20 TTC24 TTC51 TTC2 TTC1 TTC29 TTC46 TTC35 TTC107 TTC22

AF138287 Aspergillus flavus T. asperellum T. koningiopsi/H. koningiopsi T. longibrachiatum/H. sagamiensis T. ressei/H.jecorina T. brevicompactum T. spirale T. virens/H. virens T. pleuroticola T. harzianum/H. lixii JQ040370 JQ040317 JQ040334 JQ040380 JN108926 EU280082 TTC8 TTC3 JQ040377 JQ040400 EU280079

Figura2.Relaciónfilogenéticade96aislamientosdeTrichodermainferidoporanálisisdesecuenciasdeADNr(ITS1,58SyITS2).Lafilogeniafueinferidaporel métodoneighbor-joining,yladistanciaevolutivafueestimadaporelmétodoP.distance.Losnúmerosenlosnodosrepresentanelporcentajedelbootstrappingcon 1,000repeticiones.Labarradeescala=0.01sustitucionesporsitio.

(6)

Tabla2

EspeciesdeTrichoderma/HypocreapresentesenlarizósferadeTheobromacacao,identificadospormorfologíayamplificacióndelosespaciadorestranscritos internos(ITS)1y2,ydelaregión5.8SdelARNribosomal.Tabasco,México,2013.

Aislamiento Identificaciónmorfológica/molecular Identidad(%) Cepadereferencia(GenBank)

TTC1 T.asperellum 100 JQ040322.1 TTC2,TTC51 T.asperellum 100 JQ040322.1 TTC22,TTC35 T.asperellum 100 JQ040312.1 TTC24,TTC29, T.asperellum 99 JQ040317.1 TTC46,TTC107 T.asperellum 99 KF815050.1 TTC45,TTC47 T.brevicompactum 99 JQ040334.1 TTC50 T.brevicompactum 99 EU280087.1 TTC52,TTC55 T.brevicompactum 99 FJ610287.1 TTC79,TTC86 T.brevicompactum 99 JQ040334.1 TTC5 T.harzianum/H.lixii 100 HG940500.1 TTC6,TTC9 T.harzianum/H.lixii 99 JQ040359.1

TTC10 T.harzianum/H.lixii 99 AY605732.1

TTC11 T.harzianum/H.lixii 99 JF923807.1

TTC12 T.harzianum/H.lixii 99 JF923806.1

TTC13,TTC82 T.harzianum/H.lixii 99 EU280079.1

TTC40,TTC44,TTC48,TTC68,TTC73,TTC74,TTC87, T.harzianum/H.lixii 100 HG940500.1 TTC90,TTC95,TTC96TTC97,TTC108,TTC111,TTC114 T.harzianum/H.lixii 100 HG940500.1

TTC37,TTC39 T.harzianum/H.lixii 99 JQ617299.1

TTC39 T.harzianum/H.lixii 100 KJ439172.1

TTC41,TTC42 T.harzianum/H.lixii 99 AY605743.1

TTC49 T.harzianum/H.lixii 99 EF191298.1

TTC56,TTC57 T.harzianum/H.lixii 99 AY605743.1

TTC62,TTC89,TTC105 T.harzianum/H.lixii 99 JF923806.1

TTC64,TTC91,TTC70 T.harzianum/H.lixii 99 EU280077.1

TTC73 T.harzianum/H.lixii 99 JQ040358.1 TTC75,TTC76,TTC77,TTC92,TTC100 T.harzianum/H.lixii 99 KC330218.1 TTC87,TTC95,TTC96 T.harzianum/H.lixii 100 JQ040358.1 TTC98 T.harzianum/H.lixii 99 JQ040358.1 TTC103 T.harzianum/H.lixii 99 KC139308.1 TTC106 T.harzianum/H.lixii 99 JQ040358.1

TTC115 T.harzianum/H.lixii 99 EF191298.1

TTC81 T.reesei/H.jecorina 100 JQ040380.1 TTC113 T.reesei/H.jecorina 99 JQ040380.1 TTC18 T.koningiopsis/H.koningiopsis 99 JQ040370.1 TTC20 T.koningiopsis/H.koningiopsis 99 JQ617300.1 TTC21 T.koningiopsis/H.koningiopsis 100 JQ040370.1 TTC61 T.koningiopsis/H.koningiopsis 99 JQ617301.1 TTC63 T.koningiopsis/H.koningiopsis 100 JQ040370.1

TTC84 T.koningiopsis/H.koningiopsis 99 AB568478.1

TTC26,TTC27,TTC101 T.longibrachiatum/H.sagamiensis 99 JN108926.1 TTC28,TTC88 T.longibrachiatum/H.sagamiensis 99 FJ361041.1 TTC3,TTC7,TTC8 T.pleuroticola 99 JQ040377.1 TTC4 T.spirale 99 JF439515.1 TTC54,TTC85 T.spirale 99 EU280082.1 TTC93 T.spirale 99 JQ040382.1 TTC14,TTC15 T.virens/H.virens 99 JQ973614.1 TTC16 T.virens/H.virens 99 KF691803.1 TTC69 T.virens/H.virens 98 JX424333.1 TTC17,TTC102,TTC104 T.virens/H.virens 100 KC176361.1 TTC23,TTC31,TTC58 T.virens/H.virens 99 JQ040400.1

TTC32 T.virens/H.virens 99 EU280073.1

TTC59,TTC66,TTC67 T.virens/H.virens 99 JQ973614.1

se utilizó una secuencia de Aspergillus Aspergillus

ﬂa-vus (número de acceso GenBank: AF138287); también se

utilizaron secuencias de GenbBank de 9 especies de Tricho-derma: Trichoderma harzianum (EU280079), T. pleuroticola

(JQ040377), T. virens (JQ040400), T. spirale (EU280092),

T. brevicompactum (JQ040334), T. reesei (JQ040380),

T.longibrachiatum(JN108926),T.koningiopsis(JQ040370)y

T.asperellum(JQ040317).Laeleccióndelosgruposexternos delgéneroTrichodermasebasóenlosresultadosdela compara-cióndelassecuenciasdeestudioconlabasededatosdelbanco de genes del National Center for Biotechnology Information

(7)

Seanalizaron la riquezaespecífica y laabundancia de las especiesdeTrichodermafueron.Lariquezaespecíficasecalculó medianteelíndicedediversidaddeMargalef(DMg),porentidad

ysubregión:

DMg=(S−1)/logN

dondeNeselnúmerototaldeindividuosySelnúmerode espe-cies.Esteíndicerepresentalariquezadeespeciesenunsentido clásico, peroen funcióndel númerototal deindividuos (ais-lamientos)obtenidosenelmuestreo.Laabundanciaseobtuvo medianteelíndicedediversidadsegúnShannon-Wiener:

H=−Σipi(logpi)

dondepi eslaproporcióndelnúmerototaldeindividuosque

aparecerepresentadaenlaespeciei.Elíndiceproporcionaun indicador(H)delarelaciónentreelnúmerodeespeciesencada subregiónestudiada y sus respectivas abundanciasnuméricas

(Magurran,1991).

Tambiénseevaluólaequitabilidadconelíndicede unifor-midaddePielou:

J=H_(observado)/H_(má_x)

dondeH (máx) esladiversidadmáximaposiblequesepodría

obtenersitodaslasespeciesfueranigualmenteabundantes.El índicerepresenta la uniformidad en la distribución numérica entrelasdiferentesespeciesdelconjuntoestudiado(Magurran,

1991).

Paracompararlacomposicióndelascomunidadesfúngicas entrelassubregionesincluidasenlapresenteinvestigaciónse obtuvoelíndicedesimilituddeSorensen(ISS),quesecalculó conlafórmulaqueestableceMueller-Dombois(1981):

ISS=[(2C)/(A+B)∗100]

70

60

50

40

Chontalpa Centro Sierra

30

20

10

0

T

. harzianum/H. lixii T. virens/H. virens

T . asperellum T . brevicompactum T . koningiopsis/H. koningiopsis T . longibrachiatum/H. sagamiensis T . spirale T . pleuroticola T . reesei/H. jecorina

Figura3. RiquezadeespeciesdeTrichoderma/Hypocreaenelagroecosistema cacao,porsubregiónproductiva,enTabasco,México,2013.

dondeCeselnúmerodeespeciescomunesalas2muestras;A

representatodaslasespeciesdelaprimeramuestra,Brepresenta todasespeciesdelasegundamuestra.

Además, la frecuencia de constancia (FC) se calculó de acuerdo conHeredia-Abarca (1999),afin de conocerla pre-sencia de las especies de Trichoderma en cada subregión muestreada.Igualmente, se construyóunacurva de acumula-cióndeespeciestomandocomounidaddeesfuerzocadasitiode muestreo.Estacurvapermitiócalcularelesfuerzodemuestreo necesariopararegistrarelmayornúmerodeespeciesposibles enelagroecosistemadeestudio. 10 9 8 7 6 5 Número de especies 4 3 2 1 0

R/a. Moctezuma 1R/a. Oriente 1 Ej. Occidente-San Francisco

Poblado C-28R/a. Ocampo_{R/a. Río Seco} 1 R/a. Arena

4

R/a. Gregorio Méndez 1 Finca Cholula Ej. José Ma. Pino Suárez

R/a. La Piedra 1

R/a. Huimango 2R/a. Vi lla Flores 2

R/a. Paredon 1

Ej. Rafael Martinez R/a. Hermenegildo Galeana

2 Ej. Huapacal R/a. Benito Juárez

2 R/a. Rivera Alta R/a. V ainilla R/a. Allende

R/a. Plátano y cacao 4

R/a. Buena V ista 1 R/a. Gonzalez

4

Ej. Zunuy y patast al R/a. Pochitocal 1 R/a. Puyacatengo 1 R/a Allende 3 Ej. Allende 2. Ej. V icente Guerrero

(8)

Figura5. Trichodermaasperellum.a)coloniaenmediodecultivoPDA,despuésde14díasa25◦C;b)conidióforo;c)fiálides;d)conidios;e)clamidospora. Descripción:Samuelsetal.(1999);http://nt.ars-grin.gov/taxadescriptions/keys/TrichodermaIndex.cfm.

Resultados

Seobtuvieron96aislamientosdeTrichoderma/Hypocreaa partirdemuestrasdesuelodelagroecosistemacacaoenTabasco, México.Losaisladosfueronidentificadosmediantemorfología y secuenciasdeITS,conlafinalidadde conocerlariquezay abundanciadeespecies(tabla2).

Enlafigura2semuestraelárbolfilogenéticoobtenidocon

lassecuenciasdelos 96aislamientosde Trichodermay otras secuencias obtenidas del GeneBak. El árbol de NJ mostró2 ramasprincipales:unaalbergaaT.koningiopsisyT.asperellum, ylaotrasesubdivideenotras2,unaquealbergaaT. longibra-chiatum,T.reeseiy T.brevicompactum,ylaotraaT.spirale,

T.virens,T.pleuroticolayT.harzianum.Conbaseenlossoportes delasramasdebootstrap,los96aislamientosdeTrichoderma

correspondena9especies,todasellasconsoportessuperiores a89%debootstrap(tabla3;fig.2).Deestamanera,se deter-minaron9taxa,locualresultóenunDMg=1.75yunH=1.69.

Lamayor diversidadsedetectó enlasubregiónChontalpa (8 especies,DMg=1.8);aunqueladiferenciaconlassubregiones

restantesfuemínima:Centro(7especies;DMg=1.76)ySierra

(6 especies, DMg=1.7) (fig.3).La curvade acumulación de

Tabla3

Clados formados por secuencias de ADN de aislamientos Tricho-derma/HypocreapresentesenlarizósferadeTheobromacacaoenTabasco, México,2013. Clado Bootstrap (%) Núm.de aislamientos Especie 1 99 46 T.harzianum/H.lixii 2 99 3 T.pleuroticola 3 99 14 T.virens/H.virens 4 99 4 T.spirale 5 99 7 T.brevicompactum 6 94 6 T.reesei/H.jecorina 7 99 5 T.longibrachiatum/H.sagamiensis 8 94 7 T.koningiopsis/H.koningiopsis 9 89 8 T.asperellum

especies mostróestabilidaddespués de22 sitiosdemuestreo y, aunquese realizaronotrasexploraciones,nose localizaron nuevostaxonesdeestegénero(fig.4).

Enelpresenteestudio,laespeciemásabundantefueT. har-zianum/H.Lixii(47.9%),queestuvopresenteen20de30sitios muestreadosyquetambiénfuedominanteen18sitiosde mues-treo.DespuésdeT.harzianum/H.lixii,T.virens/H.virensfue

(9)

Figura6.Trichodermabrevicompactum.a)coloniaenmediodecultivoPDA,despuésde14díasa25◦C;b)conidióforo;c)fiálides;d)conidios;e)clamidospora. Descripción:Krausetal.(2004);http://nt.ars-grin.gov/taxadescriptions/keys/TrichodermaIndex.cfm.

laespeciemásabundante (14.6%),y estuvopresenteen8 de 30sitiosmuestreados;sinembargo,éstanodominóenninguna localidad.Sieteespeciesmássepresentaronconunafrecuencia inferioral10%:T.asperellum(9.4%)(fig.5),T.brevicompactum

(7.3%)(fig.6),T.koningiopsis/H.koningiopsis(6.3%)(fig.7),

T. longibrachiatun/H. sagamiensis (5.2%), T. spirale (4.2%) (fig.8),T.pleuroticola (3.1%)(fig.9)y T.reesei/H.jecorina

(2.1%)(fig.10).

ElíndicedeuniformidaddePielou(J)fuede0.77.Elvalor deJindicóuniformidadenladistribucióndelasespecies,con dominanciadepocasespecies.Considerandounmismoesfuerzo enelmuestreorealizado,elnúmerodeespecies(S)incrementó demaneraimportante,desdeelprimersitio(S=3)hastaelsitio 13(S=8)(fig.4).

EnrelaciónconelISS,lacomunidaddeTrichodermadela subregiónChontalpafueun88%similaralacomunidad encon-tradaenlasubregiónCentro,ydeun71.4%conlasubregiónde laSierra.Asítambién,lacomunidaddelasubregiónCentrofue un76.9%similaralasubregiónSierra.Conbaseenla presen-ciadelasespeciesenlas3subregionesevaluadas,lasespecies

T.harzianum/H. lixii,T. virens/H.virens, T.longibrachiatun/ H.sagamiensisyT.spiralemostraronunaFCdel100%.Las4 especiesrestantesmostraronunaFCdel67%.Laespeciecon menorFCenlasubregiónfueT.pleuroticola(tabla4).

Discusión

SeevaluóladiversidaddeTrichoderma/Hypocreapresente enlarizósferadeplantasdeT.cacaoenTabasco,México.Los estudiosdelasespeciesdeTrichodermasonescasosenelsureste deMéxico.Hastaelmomentopresente,laidentificaciónde espe-cies deHypocrea/Trichodermarequiere lacombinación tanto decaracterísticasmorfológicascomodesecuenciasdealgunos genes,comoporejemplo,ITS (DruzhininayKubicek,2005). Basadosencaracterísticasmorfológicasysecuenciacióndelas regionesITS1eITS2,enelagroecosistemacacaoenTabasco, México, seidentificaron9especies.EnelsurestedeMéxico, este es el primer estudio del género Trichoderma/Hypocrea

basadoenunamplionúmerodemuestras,combinadascon iden-tificaciónmolecular.Loanterior limitalacomparacióndelos resultadosobtenidosdeotrasbiocenosis.

En relación con estudios sobre diversidad de

Hypo-crea/TrichodermaenMéxico,SánchezyRebolledo(2010),en elagroecosistema agave tequilana,enla regiónde LosAltos SurdeJalisco,México,obtuvieron4especiesdeTrichoderma

apartirde66aislados,conunaDMgde0.71,lacualesinferior

ala obtenida en elpresenteestudio. De acuerdo con

Hoyos-CarvajalyBissett(2011),labajadiversidaddeTrichodermaen

(10)

Figura7.Trichodermakoningiopsis/H.koningiopsis.a)coloniaenmediodecultivoPDA,despuésde14díasa25◦C;b)conidióforo;c)fiálides;d)conidios; e)clamidospora.Descripción:Samuelsetal.(2006);http://nt.arsgrin.gov/taxadescriptions/keys/TrichodermaIndex.cfm.

porlocualladiversidadencontradaenlapresenteinvestigación (DMg=1.75) refleja el efectobenéfico de un manejo

conser-vacionista y revela las bondades del ecosistema cacao en el mantenimientodeladiversidaddeestegénerodehongos.

En el presente estudio, la diversidad de

Tricho-derma/HypocreaobtenidadelarizósferadeT.cacaofuemayor

a la que documentan Rivas-Cordero y Pavone-Maniscalco

(2010) en la rizósfera de plantas de T. cacao del estado de

Carabobo, Venezuela. Estos autores identificaron 6 especies a partir de 35 aislados, con una DMg=1.37. Sin embargo,

paraAmérica del Surse hanregistradoíndices relativamente mayores(10especies/53aislamientos,DMg=2.26;Druzhinina,

Kopchinski,Komon,Bissett,SzakacsyKubicek,2005),el

sud-estedeAsia(14/96,DMg=2.84;Kubicek,Bissett,Druzhinina,

Gradinger y Szakacsc, 2003), China (13/135, DMg=2.44;

Zhang, Druzhinina, Kubicek y Xu, 2005) y Cerde˜na (isla

del mar Mediterráneo) (14/482, DMg=2.1; Migheli et al.,

2009).

Laestabilidadmostradaporlacurvadeacumulaciónde espe-ciesindicóqueelnúmerodeespeciesregistradasenestetrabajo es muycercano alquealbergaelagroecosistemamuestreado, en larizósfera,enelestadodeTabasco, y queelesfuerzode muestreo quefalta porrealizarparaobtenerotras especieses poco(fig.4).

Los resultados del presente estudio muestran la predomi-nancia de T. harzianum/H. lixii/, similar a lo obtenido por

Rivas-CorderoyPavone-Maniscalco(2010)parael

agroecosis-tema cacaodelestadodeCarabobo,Venezuela.Sinembargo, otros estudios también evidencian la predominancia de esta especie (Kullnig, Szakacs y Kubicek, 2000; Wuczkowski,

Druzhinina,Gherbawy,Klug,PrillingeryKubicek,2003;Zhang

etal.,2005).

En relacióncon lapresencia de lasespecies enlas subre-giones evaluadas, T. harzianum/H. lixii, T. virens/H. virens,

T.longibrachiatun/H.sagamiensisyT.spiraleestuvieron pre-sentesenlas3subregionesdondesecultivacacaoenTabasco;

(11)

Figura8.Trichodermaspirale(Synanamorfo).a)coloniaenmediodecultivoPDA,despuésde14díasa25◦C,conabundantemicelioaéreo;b)conidióforo;c)fiálides; d)conidios;e)clamidospora.Descripción:Chaverri,Castlebury,OvertonySamuels(2003);http://nt.arsgrin.gov/taxadescriptions/keys/TrichodermaIndex.cfm.

sinembargo,T.brevicompactumyT.koningiopsis/H. koningiop-sissóloseencontraronenlaregióndelaChontalpayCentro. Todaslasespeciesencontradas enlasubregióndelaSierrase presentaronenlasubregióndelaChontalpa,exceptoT.reesei. Trichodermapleuroticola únicamentesepresentóenla subre-gióndelaChontalpa(tabla4).Lamayorriquezadeespeciesse encontróenlasubregióndelaChontalpa,quealbergalamayor superficiecultivadaconT.cacao(OEIDRUS,2009)

Las 9 especies de Trichoderma/Hypocrea encontradas en el presente estudio constituyen el primer registro para el agroecosistema cacao en el estado de Tabasco. Asítambién,

T.asperellum(fig.5),T.brevicompactum(fig.6),T. koningiop-sis/H. koningiopsis (fig.7),T. spirale (fig.8),T. pleuroticola

(fig. 9) y T. reesei/H. jecorina (fig. 10) son nuevos regis-tros para la entidad; y T. pleuroticola (fig. 9) es un registro nuevoparaMéxico.

DelasespeciesdeTrichoderma/Hypocreaencontradasenel presenteestudio,T.brevicompactum,T.harzianum/H.lixii,T. koningiopsis/H.koningiopsisyT.virens/H.virenssehan regis-tradoenelagroecosistemacacaoenVenezuela(Rivas-Cordero

y Pavone-Maniscalco,2010).También, T.harzianum/H.lixii,

T. longibrachiatun/H. sagamiensis y T. reesei/H. jecorina se registraron por Sánchez y Rebolledo (2010) en el agroe-cosistema agave tequilana en Jalisco, México. En Tabasco,

DelOlmo-Ruiz,Cifuentes-Blanco,Vidal-GaonayRosique-Gil

(2010)documentaronlapresenciadeT.harzianum/H.lixiiyT.

longibrachiatun/H.sagamiensisen unaplantación deplátano (Musaparadisiaca).

Delasespeciesencontradasenesteestudio,T.asperellum,T. harzianum/H.lixii,T.longibrachiatun/H.sagamiensis,T.virens/ H. virens, T. spirale y T. koningiopsis/H. koningiopsis son especies que tienenaplicación como agentes de control bio-lógico de hongos fitopatógenos (Evans, Holmes y Thomas,

2003;HjeljordyTronsmo,1998;KraussySoberanis,2001).De

maneraparticular,T.harzianum/H.lixiiyT.virens/H.virensson especiesutilizadasparaelcontroldePhytophthorapalmivoray

Moniliophthoraroreri,2hongospatógenosdelcacao(Benítez,

Rincón, Limón y Codón, 2004; Evans et al., 2003; Harman,

2000; Krauss y Soberanis,2001; Migheli, Whipps, Budge y

Lynch, 1995). También T. virens/H. virens se ha registrado

como promotor del crecimiento en algunas especies

vegeta-les (Contreras-Cornejo, Macías-Rodríguez, Cortés-Penagos y

López-Bucio,2009),yT.asperellumescapazdecolonizarel

sistemaradicaldealgunasespeciesvegetaleseinducir resisten-ciaapatógenos(Yerdidiaetal.,2003).Trichodermapleuroticola

eselagentecausaldepérdidasdeproducciónencultivosde hon-goscomestibles(Sobieralskietal.,2012).Trichodermareesei/ H.jecorinaesunhongodeimportanciaeconómicadebidoasu altacapacidaddeproduccióndeenzimasindustriales(Kubicek

y Penttilä, 1998). Trichoderma brevicompactum se ha

regis-tradocomoproductordeantibióticos(Degenkolb,Gräfenhan,

Nirenberg,GamsyBrückner,2006).Finalmente,T.

longibra-chiatun/H.sagamiensistieneimportanciaagronómicay biotec-nológica,porejemploenlaproduccióndelasenzimascelulasa, glucanasasehidrolasas;además,esunpatógenooportunistaen humanosinmunocomprometidos(Kredicsetal.,2003).

(12)

Figura9.Trichodermapleuroticola.a)ColoniaenmediodecultivoPDAdespuésde14díasa25◦C;b)conidióforo;c)fiálides;d)conidios;e)clamidospora. Descripción:Parketal.(2006);http://nt.ars-grin.gov/taxadescriptions/keys/TrichodermaIndex.cfm.

Losresultadosdeestetrabajo,incluyendoelíndicede diver-sidaddeShannon-WienerydeequitatividaddePielou,servirán comoreferenciaparafuturasinvestigacionessobrelaecología de las especies del género Trichoderma. Además, los resul-tadosobtenidos demuestran laalta diversidadde especiesde

Trichoderma/Hypocrea que pueden encontrarse en ambien-tespoco perturbados.Así también,este estudiorevela queel

agroecosistema cacao es un áreade investigación con poten-cialbiotecnológico.Asimismo,elconocimientodeladiversidad de Trichodermay laobtencióndeaisladosregionales forman elprimerpasoenlabúsquedadeagentesdecontrolde enfer-medadesvegetales.Lautilidadpotencialdelosaislamientosy especiesobtenidasenelcontrolbiológicodediversas enferme-dadespuedeevaluarseenfuturasinvestigaciones.

Tabla4

EspeciesdeTrichoderma/HypocreapresentesenlarizósferadeTheobromacacaoysufrecuenciadeconstanciaporsubregión.Tabasco,México,2013.

Especies Subregiones Frecuenciadeconstancia(%)

Chontalpa Centro Sierra

T.harzianum/H.Lixii 1 1 1 100 T.virens/H.virens 1 1 1 100 T.asperellum 1 0 1 67 T.brevicompactum 1 1 0 67 T.koningiopsis/H.koningiopsis 1 1 0 67 T.longibrachiatum/H.sagamiensis 1 1 1 100 T.spirale 1 1 1 100 T.pleuroticola 1 0 0 33 T.reesei/H.jecorina 0 1 1 67

(13)

Figura10.Trichodermareesei/H.jecorina.a)coloniaenmediodecultivoPDA,despuésde14díasa25◦C;b)conidióforo;c)fiálides;d)conidios;e)clamidospora. Descripción:GamsyBissett(2002);http://nt.ars-grin.gov/taxadescriptions/keys/TrichodermaIndex.cfm.

Agradecimientos

Estetrabajofuellevadoacaboconelfinanciamientootorgado porelProgramadeMejoramientodelProfesorado(PROMEP) delaSecretaríadeEducaciónPública,México, yelproyecto (Conacyt)CB-2008-01-106570:Estudioetiológico, epidemio-lógicoydeformasdecontroldeMoniliophthoraroreri,agente causaldelamoniliasisdelcacao,enMéxico.

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