PCR Basic Technology Realplex. Adriana Freire Machado Eppendorf do Brasil 94 C. Adriana Freire Machado Eppendorf do Brasil

(1)

Agenda

•

Día 28/7/10-Miércoles -PCR en tiempo real- teoría -Estrategias de optimización

-Cuantificación y análisis de calidad de ADN-Biophotometer plus -hands on: cuantificación absoluta

-Software realplex

•

Día 29/7/10-Jueves

-Hands on-cuantificación relativa-expresión génica -Como prevenir contaminación en su laboratorio de biología

molecular

-análisis expresión génica -análisis genotipficación -análisis ensayos

+/-Parte 1 – PCR en Tiempo Real

Adriana Freire Machado Febrero/2010 Eppendorf do Brasil

Aplicaciones

•Cuantificación absoluta y relativa

•Perfil de la expresión génica

•Determinación del número de copias de genes

•Discriminación alélica

•Tasa de SNP

•Identificación génica

•Validación de los datos de Microarrays

•Detección de patógenos

•Cuantificación de carga viral

(2)

Realplex

Adriana Freire Machado Eppendorf do Brasil PCR Basic Technology

Reacción da polimerase en cadena (PCR)

T CT AATC ACT CTC AC C CTTACCT AC A T A A G G G GG G G G G GG Pol

Reactivos de la PCR

•

Template/ DNA target

•

Primer (2)

•

dNTPs

•

_{DNA polimerasa (encima)}

•

Bufer de la reacción (KCl, Mg2+_{, pH 8.3)}

Realplex

Adriana Freire Machado Eppendorf do Brasil PCR Basic Technology 94°C ~55°C

PCR

TCT AATC ACTCTC AC C CTTACCTACA T A A G G G GG G G G G GG 5‘ 3‘ 5‘ 3‘ Desnaturación De las cadenas “Anealling” do primer 72°C Elongación por la polimerasa

Fases de la PCR

Realplex

Adriana Freire Machado Eppendorf do Brasil PCR Basic Technology

Amplificación de PCR

Amplificación

Exponencial

21= 2 copies 22=

(3)

Realplex

Adriana Freire Machado Eppendorf do Brasil

PCR Convencional

-Ventajas de la PCR •Sensibilidad •Especificidad Desventajas de la PCR

•Cuantificación no es tan fácil

•Complexa manipulación pos PCR

Realplex

PCR quantitativa - Prós y Contras

PCR cuantitativa:

Combina amplificación de PCR ydetección fluorescente Detección sensible e específica

•Cuantificación fácil y precisa

•Sin manipulación pos PCR Detección en tubo“

Posee todos los beneficios de PCR convencional y compensa sus desventajas!

PCR Basic Technology

Reacción de la polimerasa en cadena (PCR)

Reactivos de PCR

•

Template/ DNA target

•

Primer (2)

•

dNTPs

•

DNA polimerasa (encima)

•

Bufer de la reacción (KCl, Mg2+_{, pH 8.3)} T CT AATC ACT CTC AC C CTTACCT AC A T A A G G G GG G G G G GG Pol

+marcador

fluorescente

(4)

Adriana Freire Machado Eppendorf do Brasil Marcadores del DNA

Ej. SYBR Green I

Excitación 494 nm

Formatos de detección I

Emisión 521 nm

Realplex

SYBR

®

Green

•

Intercalarte de DNA doble cadena

•

Fluoróforo en suspensión

•

Inespecífico

•

Curva de disociación o melting

•

Noo permite multiplex

•

La emisión de fluorescencia es proporcional al número de moléculas y al tamaño del amplicon

•

Mas barato

Realplex

Curva de melting o de disociación

Temperature [°C] 94 92 90 88 86 84 82 80 78 76 74 72 70 68 66 64 62 60 - d I / d T ( % ) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 -10 -20 -30 -40 -50 -60 Primer dimers Product of Interest

(5)

Realplex

Curva de melting o de disociación

•

Checa la especificidad de los productos generados

•

Aumento de laa temperatura= reducción del sinal de Sybr Green desnaturalización

•

Diferentes amplicons=diferentes picos en la curva de melting

* tamaños de amplicon e cuantidad GC

•

Posibilidad de identificación de cepas diferentes

diseño de la reacción

Adriana Freire Machado

Sistemas basados en hibridización de sonda

• Hibridación de las sondas internas en el produto del PCR

• Interacción de los dos fluorocromos a una corta distancia:

FRET

Fluorescence Resonance Energy Transfer

(Resonancia de la fluorescencia por transferencia energética)

Formatos de Detección II

T A G C C T GACG A G R Q Reporter Quencher Dyes (JOE,VIC,FAM,TET ,ROX,TAMRA... T CT AATC ACT CTC A G G G GG G ATGCTG GAATCGGACTGCTC T A T T A CGG C GC C T A G C C T GACG A G R Q

El principio TaqMan

Taq Polimerasa:

una encima, dos actividades

•5´-3´DNA Polimerasa

•5´-3´Exonucleasa (actividad TaqMan)

A G C C A C C T T TAGCCTGACGAGTACGACCT T T R TAGCCTGAC

(6)

Multiplexing

Dos o más sondas y Dyes (marcadores) en un tubo

T A G C C T GACG A G FAM Q Quencher T A G C C T G C A G A G Vic Q Quencher Albo 1 Albo 2

Tipos de Cuantificación

Cuantificación Absoluta:

-Determinación del número exacto de moléculas.

Valores numéricos con alguna unidad, como número de copias o nanogramas de DNA.

Cuantificación Relativa:

-Análise comparativa del ácido nucléico alvo com o do controle interno ou do calibrador.

Son comparados os Ct’s de cada muestra los resultados representan ordenes de grandeza

(p.e: 5x más o menos expresión de un determinado gene).

PCR Fase I

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1 10 20 30 40 ciclos P ro d u to Vista linear 1 10 100 1000 1 10 20 30 40 ciclos Vista log exponencial linear platô

(7)

Adriana Freire Machado 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 123456789 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 Detecció cinética (PCR cuantitativa ) cycles P ro d u c t

Detección End point (PCR convencional)

PCR - cinética vs. Detección End point

threshold

Ct(Threshold Cycle)- representado por el ciclo en el cual la producción de fluorescencia

cruza el umbral establecido. El cálculo del Ct siempre se realiza en la fase exponencial de la curva. Nº de ciclos F lu o re s c e n c ia Cantidad Inicial Ct Curva Estándar Ct Ct Ct

Baseline o línea base -se refiere a los ciclos iniciales en los que no hay cambios

detectables en la cantidad de fluorescencia, y sólo se detecta la fluorescencia .

Threshold

Threshold (Umbral)-es el umbral en el que se produce un cambio significativo en la

fluorescencia

Background Fluorescence Curva de amplificación

El Princípio Real Time

Cuantificación absoluta

Desconhecido

(8)

Adriana Freire Machado Número de ciclo fl u o re s c e n c e GAPDH (control) GAPDH (treatment) TNFα (control) TNFα (treatment) analysis line ¿Como obtener el punto correcto de cuantificación?

threshold level – 10x SD

Noiseband=10 veces “standard deviation”

arriba del “ruido” da baseline.

Best^R2=punto donde tiene mejor

correlación entre las replicatas de los estándares.

Adriana Freire Machado Algoritimo CalQPlex en el software realplex

CalQplex-Algorithm

x x x x x x x x x xx x xx x x x xx xx x x x x x Fluorescence Cycle-Number CalQplex-Ct-value (reference point) Change over from

the exponential to the non-exponential

(9)

Cuantificación relativa

•

Quien es el calibrador?

Control (Calibrador):

- Muestra sin tratar

-Tiempo 0

- individuo sano etc.

Cuantificación Relativa

Usado principalmente para estudios de expresión génica

•

Expresa los valores relativos a una muestra de referencia (calibrador, control, etc)

•

Requiere usar un gen de referencia (control endógeno)para normalizar

- Generalmente genes housekeepings o RNA ribosomal - No debe variar con el tratamiento

Sistema control (calibrador) Sistema Experimental

Gen referencia Gen target

∆∆Ct= ∆Ct of sample –∆Ct of calibrator

∆Ct= endogenous Ct – gene of interest Ct

Cuantificación Relativa

∆_C t Sample ∆C_t Calibrator Housekeeping Gene ∆C_t ∆_C t ∆ ∆_C t 2-∆ ∆Ct_{= Change in Expression Level}

Gene of Interest

15 20

(10)

Cuantificación Relativa

real-time PCR efficiency and

amplification performance

PCR inhibitors:

Hemoglobin, Urea, Heparin Organic or phenolic compounds

Glycogen, Fats, Ca2+

Tissue matrix effects Laboratory items, powder, etc.

RNA / DNA degradation PCR reaction components DNA concentration tissue degradation

PCR enhancers:

DMSO, Glycerol, BSA Formamide, PEG, TMANO, TMAC etc.

Special commercial enhancers: Gene 32 protein, Perfect-Match, Taq-Extender, AccuPrime, E. Coliss DNA binding

unspecific PCR products

DNA dyes lab management

hardware: PCR platform & cups cycle conditions