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El final de las décadas de los ochenta y noventa han traído una eclosión de nuevos métodos diagnósticos que han de-terminado un nuevo enfoque en la clasificación de las neo-plasias hematológicas. Así, en pocos años hemos pasado de las clasificaciones basadas en la morfología1-4o en la
res-puesta clínica5 a un intento de clasificación basado en la
etiopatogenia molecular/bioquímica6,7. Sin embargo, es
evi-dente que todavía queda un largo camino por recorrer para completar este propósito; por este motivo, en la reciente propuesta de la Organización Mundial de la Salud (OMS)6
aún conviven entidades clasificadas con métodos muy sofisti-cados junto a otras perfiladas de manera más convencional. De entre las nuevas metodologías diagnósticas, la citometría de flujo, por la rapidez en la obtención de resultados y su relativa sencillez técnica, se ha revelado como una herra-mienta de primer orden para facilitar el diagnóstico y segui-miento de estas entidades. Su información no sólo ha per-mitido refinar las antiguas clasificaciones morfológicas e identificar entidades de origen y pronóstico específicos, sino que además parece asociarse, al menos en algunos casos, a alteraciones moleculares específicas, como veremos con detalle más adelante.
En este trabajo intentaremos resumir los avances de mayor relevancia clínica alcanzados gracias a esta metodología en relación con el diagnóstico de las leucemias agudas, ha-ciendo hincapié en la integración de los datos aportados por la citometría con los obtenidos mediante otras técnicas, de manera particular, por la citogenética y los estudios de ge-nética molecular. En este sentido, es nuestro objetivo cen-trar la información que se revisa en los factores que afectan al diagnóstico y clasificación de las leucemias agudas y en datos útiles para el seguimiento de la enfermedad mínima residual (EMR).
Análisis inmunofenotípico de las leucemias agudas: conceptos generales
La identificación de la población neoplásica es fundamental en el estudio del fenotipo leucémico. Para la discriminación de las diferentes poblaciones celulares presentes en mues-tras leucémicas, en un primer paso resulta de gran utilidad la consideración simultánea de las características de disper-sión de luz –frontal (FSC) y lateral (SSC)– de cada subpo-blacion celular, en relación con el patrón de expresión del antígeno panleucocitario CD458-12. El segundo paso del
aná-lisis consiste en la identificación antigénica de entre las sub-poblaciones celulares presentes en la muestra de la clona o las clonas que contienen células neoplásicas.
Los estudios inmunofenotípicos han contribuido a estable-cer pronósticos específicos en los diferentes subtipos de leucemias linfoblásticas agudas de línea B y, en menor gra-do, en las de línea T8,13-15. Además, resultan imprescindibles
para el diagnóstico de las leucemias agudas no linfoblásti-cas (LANL) M0 y M7, y muy útiles para el diagnóstico de las formas variantes de la LANL M3. Por otra parte, también es cierto que, aunque hoy por hoy parece difícil establecer una relación estrecha entre expresión antigénica, subtipo morfo-lógico y genotipo en la mayoría de los casos8,16-19, existe una
novedosa tendencia a asociar perfiles inmunofenotípicos ca-racterísticos a entidades con alteraciones biológicas especí-ficas y que mayoritariamente presentan alteraciones citoge-néticas/moleculares concretas20-26.
Leucemias agudas no linfoblásticas
Las LANL han sido definidas por el Grupo Europeo para la Caracterización Inmunológica de las Leucemias (EGIL) en función de la expresión de dos o más de los siguientes mar-cadores: mieloperoxidasa detectada por técnica inmunológi-cas (citMPO), CD13, CD33, CD65 y CD117, siendo probable-mente citMPO el marcador más específico de la línea mieloide17,27. A este respecto, es de destacar la reciente
des-cripción de un perfil inmunofenotípico con positividad para estos 5 marcadores mieloides (fenotipo panmieloide), no vin-culado específicamente a ningún subgrupo de la clasificación French-American-British (FAB), que conformaría un grupo de LANL de buen pronóstico, con mayor supervivencia21.
En nuestro entorno se sigue utilizando de un modo predomi-nante la clasificación FAB para el diagnóstico de las LANL1,2,28. En relación con esta clasificación, los subtipos
M0, M7 y, en menor grado, M6 necesitan con frecuencia para su identificación del inmunofenotipo, la LANL M3 pre-senta un perfil inmunofenotípico –HLADR–, CD13+ hetero-géneo, CD15–/+ débil, CD34–/+ débil– que, aun no siendo completamente específico, sí es muy característico8,16,22,29,
mientras que en los otros subtipos los hallazgos fenotípicos son habitualmente más heterogéneos8,16,30. Adicionalmente,
determinadas características inmunofenotípicas se han rela-cionado con alteraciones citogenéticas (tabla 1) y manifesta-ciones clínicas de la enfermedad. Así, por ejemplo, dentro de este grupo de LANL la expresión de CD34, que es la ca-racterística inmunofenotípica que con mayor frecuencia se ha asociado a mal pronóstico8,31, se ha vinculado a la
exis-tencia de alteraciones citogenéticas en general, y en particu-lar con inv(16), t(8;21), –5/5q–, 7/7q–, del(11)(q23) y altera-ciones de 3q16. Otros marcadores relacionados con la
existencia de alteraciones citogenéticas han sido CD2, CD9, CD10, CD15, CD19 y TdT16,19. Además, se han descrito otros
Aplicación de la citometría de flujo al diagnóstico
y seguimiento inmunofenotípico de las leucemias agudas
Francisco José Ortuño Giner
ay Alberto Orfao
baServicio de Hematología y Oncología Médica. Hospital General Universitario J.M. Morales Meseguer. Murcia. bServicio General de Citometría. Departamento de Medicina y Centro de Investigación del Cáncer.
Universidad de Salamanca.
Correspondencia: Dr. F.J. Ortuño Giner. Servicio de Hematología y Oncología Médica. Hospital General Universitario J.M. Morales Meseguer. Marqués de los Vélez, s/n. 30008 Murcia.
Correo electrónico: fortunog@aehh.org
marcadores asociados a mal pronóstico, entre los que desta-caremos CD44-6v32, CD5633 y CD11b34, y también a buen
pronóstico, como CD5835.
La expresión de antígenos linfoides en la LANL, muy útil para el estudio de la EMR, se ha asociado tanto a cariotipos de mal pronóstico –t(9;22), del (11)q(23)– como de pronóstico favorable –t(8;21), t(15;17) e inv(16)–, si bien considerada en conjunto no ha evidenciado cambios en el pronóstico 16,36-38, pareciendo más apropiada su valoración en el contexto
del perfil inmunofenotípico global y de los hallazgos citoge-néticos8. Otro aspecto a considerar en el estudio fenotípico
de las LANL es el hallazgo de más de una subpoblación de células leucémicas, lo que puede ocurrir en hasta el 85% de
los casos y que, como la expresión de antígenos linfoides, tiene implicaciones para el estudio de la EMR39.
A continuación revisaremos con más detalle las característi-cas fenotípicaracterísti-cas de cada uno de los subtipos FAB (tabla 2), así como algunas de las nuevas entidades ya incluidas en la clasificación de la OMS6y otras que, probablemente, lo
se-rán en un futuro próximo (tabla 3).
Leucemias agudas no linfoblásticas mínimamente diferenciadas o FAB M0
Los blastos de las LANL M0 característicamente presentan un FSC y SSC bajos, y habitualmente se localizan en regio-nes cercanas a la de los linfoblastos en los diagramas de CD45/SSC8,10,40. Hasta ahora se aceptaba que los blastos
de esta entidad no presentaban positividad en ninguna tin-ción citoquímica, pero en ellos se detectaba en la mayoría de los casos mieloperoxidasa por técnica inmunocitoquími-ca (citMPO). Adicionalmente, se consideraba que expresa-ban un perfil mieloide inmaduro CD34+, HLA-DR+, CD117+, CD15–, CD14– con expresión variable de CD13, CD33 y CD11b, si bien su detección (incluso la positividad para más de uno de ellos) no era tan específica como la po-sitividad para citMPO asociada a la negatividad de la mielo-peroxidasa por técnica citoquímica para establecer el diag-nóstico8,18,40-42. Muy recientemente se ha comunicado19una
expresión variable de citMPO en esta entidad con casi un 50% de casos negativos (menos del 10% de blastos citM-PO+) y objetivándose un porcentaje más elevado de casos con positividad para CD13 que CD3319,30. Otros autores han
apuntado que el perfil inmunofenotípico se relacionaría con el grupo de edad y se objetivaría más frecuentemente en adultos el fenotipo CD13+, CD33+, CD34+ y TdT+, en tanto que en niños sería algo más frecuente la negatividad o ex-presión débil de CD34, CD13 y, en menor grado, TdT, aso-ciada a una expresión intensa de CD3343, aunque también
se cuestionan estos datos36.
TABLA 1
Características citológicas, citogenéticas e inmunofenotípicas más frecuentes en las leucemias agudas no linfoblásticas
FAB Cariotipo Inmunofenotipo asociado Incidencia (%)
M0/M1 t(9;22)(q34;q11) o del(11)(q23) CD19 y/o CD20 y/o CD24 100 frente a 28
M2 t(8;21)(q22;q22) CD13– 55 frente a 11
M3 t(15;17)(q22;q12) CD13+/DR–/CD7–/CD19– 81 frente a 16
M4 inv(16)(p13;q22) CD13+/CD34+/CD36+ 66 frente a 15
M4 t(11;15)(q23;q12) CD13+/CD14+/CD15+/CD18+/
CD33+/CD34–/CD36+/CD2+/CD9– < 1%
M4/M5 del(11)(q23) o t(9;11)(p11;q23) Ag de línea B 100 frente a 72
Tomada de Casasnovas et al16.
TABLA 2
Perfil inmunofenotípico de las leucemias agudas no linfoblásticas incluidas en la clasificación FAB sin alteraciones citogenéticas específicas
M0 M1 M2 M4 M5a M5b M6 M7b MPO ± o + + + + ± ± +a – CD13 ± o + + + + – o ± ± o + +a ± CD34 + + ± o – + ± o + ± o – ±a ± CD33 ± + + + + + +a + CD117 + + ± o + ± o + ± – ± o +a + HLA-DR + + + + + + + + CD15 – – o ± + + – o ± – o ± + – o ± CD14 – – – + ± + – – CD4 – o ± – o ± – ± o + ± + – o ± – o ± CD11b – – o ± ± o + ± o + ± + – o ± – o ± CD2 – o ± – – – o ± – – – – CD7 – o ± – – – o ± ± ± – – TdT ± o + – o ± – – o ± – ± ± CD71 ± ± ± ± ± ± ++c – o ± CD41a – – – – – – +d + CD42b – – – – – – +d + CD61 – – – – o ± – o ± – o ± +d + CD56 – – – o ± ± o + ± o + – o ± – –
aEn la fracción de blastos mieloides; ben megacarioblastos; cen elementos de serie eritroide; den megacarioblastos.
TABLA 3
Perfil inmunofenotípico de las leucemias agudas no linfoblásticas con alteraciones citogenéticas específicas
M2t(8;21) M3t(15;17) M4Eo inv(16) t(9;22)a –5/5q– –7/7q– 3q21-q26 11q23 t(10;11)b MPO + + + ± + + + + ± CD13 ± o + + + + + + + ± o – – CD34 + ± o – (M3v +) + + + + + ± o + CD33 + + o ± + + + + + + CD117 + ± o – + ± o – CD65 + + + ± o – ± o – + + + HLA-DR + ± o – + + + CD15 + ±c + + + + + + CD14 – – ± o + ± ± o – – ± o – CD4 – – ± o + ± + CD11b + ± o + ± ± o – + CD38 + CD2 – ±d ± o + ± o – – ± o + ± o – ± o – CD19 + – – + o ± – ± o + ± o – ± o – CD56 ± o + ± o – ± o – ± o – ± o – ± o – ± o – +
A la vista de todo lo anterior resulta controvertida la pro-puesta de los siguientes criterios diagnósticos revisados para esta entidad: a)recuento de blastos apropiado para el diagnóstico de LANL; b) positividad de mieloperoxidasa (MPO) por técnica citoquímica o negro Sudán < 3%; c) ne-gatividad para citCD3, citCD22 y citCD79, y d) positividad para CD13, CD33, CD11b, CD65 o CD117 y/o positividad para MPO estudiada mediante inmunohistoquímica, citome-tría o ultraestructura41.
Por otra parte, la expresión de CD10 en este subgrupo se ha relacionado con t(9;22) y reordenamientos de 11q2316.
Otras series objetivan la expresión de antígenos linfoides B y T en hasta un 80% de los casos de LANL escasamente dife-renciadas, refiriendo expresión de TdT en entre el 30 y el 68% de los casos, de CD7 entre el 25 y el 32%, y tanto de CD2 como de CD4 hasta en un 33 y un 32% de los pacien-tes, respectivamente16,18,19; asimismo, algunos autores
espe-culan con la mayor expresión de antígenos linfoides, con la excepción de TdT, en niños19y el posible origen monocítico
de algunas LANL M0 en las que se detecta coexpresión de CD4 con CD14, CD11b y/o CD11c18. Es también motivo de
debate el posible significado pronóstico de la expresión de CD7 y CD34 en este grupo8,19,44. Por último, hay que
des-tacar que éste es el subgrupo FAB en el que se ha objetivado un mayor porcentaje de elementos con fenotipo indiferencia-do CD34+/CD38–, lo que podría estar relacionaindiferencia-do con su in-madurez y mal pronóstico16,45.
Leucemias agudas no linfoblásticas sin maduración o FAB M1
Las LANL M1 presentan un patrón de FSC/SSC y de CD45/SSC similar al de las leucemias M0, aunque en casos individuales pueden mostrar mayor complejidad interna y/o granularidad (SSC)8,10. Su inmunofenotipo reflejaría un
gra-do de maduración intermedio entre las LANL M0 y M2, siendo habitualmente los blastos CD13+, CD33+, HLA-DR+ y CD117+ (el 25% de los casos pueden ser negativos para CD33 o CD13)42. En contraste con la LANL M0, la expresión
de CD34, aunque habitual, es ligeramente menos frecuen-te; hasta en un 25% de los casos puede detectarse expre-sión débil de CD4 y CD15. Merece destacarse que es en el subgrupo de LANL M1 donde la expresión de CD34 parece relacionarse más claramente con la existencia de cariotipos anómalos16.
Leucemias agudas no linfoblásticas con maduración o FAB M2
La mayor diferencia entre las LANL M1 y M2 estriba en la existencia de maduración y de un menor porcentaje de blas-tos. Característicamente se aprecia la existencia de una po-blación heterogénea en cuanto a su dispersión de luz, pre-sentando el diagrama CD45/SSC un continuo desde la región de mieloblastos hasta la de los elementos más madu-ros de la serie mieloide de línea granulocítica10. La expresión
de CD34 es más débil y menos frecuente, y la de CD15, más intensa y frecuente que en las M0 y M1. La mayoría de los casos son HLA-DR+, CD33+ y CD13+, lo que confirma que se trata de neoplasias con más diferenciación que M0 y M18.
Leucemias agudas no linfoblásticas con maduración o M2 y
t(8;21). La LANL M2 con t(8;21) es una entidad de buen
pronóstico en adultos46 y, según algunos autores, de mal
pronóstico en niños47. Presenta el perfil inmunofenotípico
característico, aunque no específico, CD15+, CD18+, CD34+ y HLA-DR+, al que se asocia la expresión de CD19 y, menos a menudo, de CD54 y CD56, así como una expre-sión variable de CD138,16,25,48; también es frecuente la
ex-presión de CD11742. Es de resaltar el valor predictivo que
sobre el diagnóstico de esta entidad se ha atribuido al feno-tipo CD19+/CD34+24. Estas leucemias suelen presentar un
CD34 más intenso que en el resto de M2; por otra parte, suele existir negatividad para CD14 y CD436. Entre las
va-riantes descritas cabe destacar: a)LANL M2 con t(8;21) y pérdida de un cromosoma sexual, en las que no se expre-san CD19 ni otros antígenos linfoides16; b)un subgrupo con
morfología M2 y t(8,21), negatividad para CD13, CD33 y CD14 pero positividad para citMPO49, y c) la variante
CD56+, que se asociaría a mal pronóstico50,51.
Leucemia aguda no linfoblástica promielocítica o FAB M3 o leucemia aguda no linfoblástica con t(15,17) y variantes
La LANL M3 típica presenta FSC y SSC altos (ambos relati-vamente heterogéneos, particularmente el SSC)10. Presenta
además un CD45 débil (expresión similar a la de células de médula ósea de línea de granulocito neutrófilo) y una expre-sión tanto de HLA-DR como, sobre todo, de CD34 menos intensa y frecuente (20-28% de los casos) que en el resto de LANL16,29. De hecho se acepta que el inmunofenotipo
ca-racterístico de LANL M3 asociado a la t(15;17) con reorde-namiento de RARαsería CD15–/+ (débil), CD13+ (hetero-géneo), CD33+, CD9+, HLA-DR–, CD34–, CD7–, CD19– y CD14–22,29,36,52. Recientemente se ha propuesto la creación
de un scoreen función de: a) el patrón característico de maduración granulocítica con escasa o nula expresión de CD34 y bloqueo en la adquisición de CD15; b)la expre-sión heterogénea de CD13, y c)la existencia de una pobla-ción blástica única en funpobla-ción de su patrón de FSC/SSC/ CD45; este scorepermitiría establecer de una manera sen-sible y específica el diagnóstico diferencial entre pacientes con LANL M3/PML-RAR α+ (score: 3) y LANL M3/PML-RAR α– (score: 0)22.
El perfil inmunofenotípico descrito no es completamente es-pecífico de las M3, ya que ocasionalmente puede apreciar-se en las LANL M28. En este sentido, es interesante
recor-dar que, en comparación con los casos de M2, además de la expresión de CD34 menos intensa y frecuente, en las M3 habitualmente se objetiva una expresión ligeramente más débil y heterogénea de CD13 junto a negatividad para HLA-DR29. Por otra parte, también es importante recordar
que puede apreciarse expresión de CD2 tanto en M3 típicas (28% de los casos) como en la variante microgranular (M3v); en este sentido, el fenotipo CD2+/HLA-DR– se aso-ciaría significativamente a t(15;17), típica de buen pronósti-co, independientemente de la morfología8,16, mientras que
el fenotipo CD2+/CD34+ se asocia a morfología hipogranu-lar (M3v) y a reordenamientos que involucran a bcr329.
Por último, en relación con este subgrupo cabe resaltar 5 puntos: a)el patrón de dispersión de luz permitiría eventual-mente distinguir la forma clásica de la variante M3v (a ex-pensas de células más inmaduras con menor FSC/SSC), siendo también la expresión de CD34 más frecuente en este último subtipo53; b)según algunos autores, en los pacientes
con perfil inmunofenotípico «típico» CD15±, HLA-DR± y CD34± en los que la citogenética no objetive t(15;17), de-bería descartarse obligatoriamente la existencia de reorde-namiento de RARα mediante FISH y técnicas molecula-res22,52; c) el tratamiento con ATRA puede asociarse al
denominado síndrome del ácido retinoico, que se ha vincu-lado a expresión más intensa de CD13 en el diagnóstico54;
d) la expresión poco frecuente de CD14+ se asocia a mal pronóstico55, y e)la expresión de CD56 se asociaría a
leuce-mias con t(11;17)(q23;q21) y formación del gen de fusión PLZF-RARα, que son resistentes al tratamiento con ATRA56.
Leucemia aguda mieloide/natural killer. Esta entidad, de re-ciente descripción, se encuadra entre las LANL M3 por su morfología más frecuente y a menudo difícil de diferenciar de la M3v23,57. Se trata de una leucemia originada en un
progenitor no bien caracterizado25, con presentación
agresi-va en individuos de edad aagresi-vanzada y que no responde a ATRA por carecer de reordenamientos de RARα. Su inmu-nofenotipo más frecuente es CD56+, HLA-DR–, CD33+, CD11a+, CD13+ débil, CD34 variable (negativo o positivo débil), CD15+ débil, CD16–, CD2– y CD3–23. Esta entidad
debe diferenciarse de casos con morfología M3 y M3v con fenotipo CD56+, CD33+, CD13+, CD11a+, HLA-DR–, CD34– y CD16–, y reordenamiento de PML-RARα; para ello resulta imprescindible el estudio molecular en estos pacientes57.
Leucemias agudas no linfoblásticas mielomonocíticas o FAB M4 y leucemias agudas no linfoblásticas monocíticas o FAB M5a y M5b
Estas dos entidades presentan mayor dispersión frontal y angular de luz que las M0 y las M1; sin embargo, las M5 presentan una imagen más homogénea, mientras que las M4 y M4Eo tienden a presentar fracciones celulares con mayor dispersión de luz8,10. Ambos grupos son similares
desde el punto de vista inmunofenotípico, aunque la expre-sión de CD34 es más intensa y frecuente en las M4 y M5a que en las M5b. En el diagrama SSC/CD45 los elementos blásticos más diferenciados de la serie monocítica tienden a observarse en la zona normal de monocitos, siendo esto más evidente en las M5b; en cualquier caso, ambos subti-pos resultan los más difíciles de diferenciar basándose úni-camente en su dispersión de luz o en los diagramas SSC/CD45. En las M4, si existe un componente mieloide de tipo granulocítico diferenciado, también puede apreciarse en la zona donde se situarían los elementos normales de la serie granulocítica en estadios intermedios de maduración8.
Habitualmente el fenotipo tanto de las LANL M4 como M5 presenta expresión de HLA-DR+, CD33+, CD14+ y CD15+, siendo la expresión de este último marcador más frecuente en las M4. Es característico del componente monocítico que la expresión de CD33 sea más intensa que la de CD13; de hecho el perfil CD33++, CD13–/+, CD34– se asocia al subti-po M5 (aunque no es específico de éste)8,16. La expresión
de CD56 se ha asociado a diferenciación monocítica y los casos positivos para este marcador tienen tendencia a pre-sentar mayor incidencia de anomalías de 11q23 asociados a una menor supervivencia33,48,55. También puede
observar-se en este grupo la expresión de CD4 y/o más débilmente de CD78,16,18. Por otra parte, en las LANL M5 se aprecia un
porcentaje significativamente menor de positividad de CD117 (el 21 frente al 69-70%) que en las LANL M0 y M142; además, esta positividad estaría restringida a los
esta-dios más inmaduros, siendo negativas para este marcador la mayoría de LANL M5b58.
El fenotipo CD14+/HLA-DR– se ha asociado con mal pro-nóstico55. Por otra parte, recientemente se ha descrito una
asociación que comprendería morfología M4, fenotipo CD2+, CD13+, CD14+, CD15+, CD18+, CD33+, CD36+, CD34– y HLA-DR+, cariotipo t(11;15)(q23;q12), sexo feme-nino y presentación con anemia intensa y trombocitopenia moderada16.
Leucemia aguda no linfoblástica M4Eo o leucemia aguda no
linfoblástica con inv(16). La inv(16) o t(16;16)(p13;q11) se
asocia constantemente a LANL M4Eo y se ha considerado hasta la actualidad una alteración de buen pronóstico. Su perfil fenotípico presenta expresión simultánea de CD34
in-tenso en los blastos de línea de neutrófilo, CD13, CD15, CD64, CD65, CD117, HLA-DR y CD36, y con menor fre-cuencia (31%) expresión de CD216y también de CD1436,59,60.
De forma característica se detecta en las LANL con inv(16) sobrexpresión de citMPO tanto en los mieloblastos CD34+ como en los monoblastos y promonocitos61.
Leucemia aguda no linfoblástica M5 con t(9;11).Este
sub-grupo cursaría con expresión de CD33 o CD65 y CD15 o CD4 y ausencia de CD34 o CD13 habitualmente asociados a expresión de CD56 y del marcador 7.136,61. Las
alteracio-nes que afectan a 11q se recogen más detalladamente en el apartado «Leucemias agudas no linfoblásticas con otras alteraciones citogenéticas e inmunofenotípicas no relaciona-das con los subtipos FAB».
Leucemia agudas no linfoblástica eritroide o FAB M6
Ésta es una entidad poco frecuente y no bien definida in-munofenotípicamente. Su patrón de dispersión de luz es habitualmente similar al que se observa en las M0 con muy bajo FSC y SSC10. Suelen ser positivas para CD34+ (débil),
HLA-DR+ (débil) y a menudo CD13–/+ (débil) y CD33–/+ (débil). Se puede diferenciar dos subtipos: una variante temprana o inmadura, inclasificable fenotípicamente, y una variante tardía o madura que presenta positividad para CD71 y/o la glicoforina-A17. En este sentido, se postula que
la glicoforina-A no se expresaría en las BFU-E y sólo apare-cería en CFU-E o estadios posteriores62. En cualquier caso,
unido a la subpoblación de células blásticas, en el diagrama SSC/CD45 habitualmente se aprecia un importante compo-nente eritroide.
Leucemia aguda no linfoblástica megacarioblástica o FAB M7
La leucemia aguda megacarioblástica es, como la M6, una entidad poco frecuente que supone únicamente un peque-ño porcentaje de todas las LANL. Su diagnóstico requiere la demostración de más de un 30% de blastos de línea mega-cariocítica entre la celularidad no eritroide. La confirmación de la línea no es posible mediante citología convencional o por citoquímica y se basa en el estudio inmunofenotípico, aunque también puede establecerse mediante demostra-ción ultraestructural de la peroxidasa plaquetaria con mi-croscopia electrónica28.
En el análisis mediante citometría de flujo de este subgrupo, los megacarioblastos leucémicos expresarían de mayor a menor frecuencia CD61 (GpIIIa) de membrana o citoplas-mático, CD41 (GpIIb/IIIa) y/o CD42 (complejo Gp Ib/V/ IX)8,17.
Se ha descrito asimismo la presencia de diversos marcado-res mieloides y, más raramente, la expmarcado-resión de CD5648. Es
muy importante descartar la existencia de falsos positivos por adhesión de plaquetas a elementos blásticos de otras lí-neas o por coincidencia de ambos delante del láser en el momento del análisis citométrico; para ello es recomenda-ble confirmar los casos positivos mediante microscopia de fluorescencia, o alternativamente efectuar el estudio simul-táneo de diversos anticuerpos en muestras anticoaguladas con EDTA63.
Leucemias agudas no linfoblásticas con otras alteraciones citogenéticas e inmunofenotípicas no relacionadas con los subtipos FAB
Leucemia aguda no linfoblástica con t(9;22).Los pacientes
con LANL y t(9;22) expresan más frecuentemente antígenos linfoides (Ly) que otros pacientes con LANL
(aproximada-mente el 61 frente al 24%), por lo que ante el hallazgo de LANL Ly+, particularmente de línea B, parece recomenda-ble el cribado de esta alteración16. Por otra parte, en los
pa-cientes con LANL Ph+ de novoexiste una menor expresión de CD11b que en los pacientes con LMC en crisis blástica, lo que puede ayudar en determinados casos a su diagnóstico diferencial; en este sentido hay que recordar que la expresión de CD11b se asocia a los estadios más maduros –posteriores al de promielocito– de la serie mieloide neutrófila16,64.
Leucemia aguda no linfoblástica con –5/5q–, –7/7q– y
3q21-q26.Las LANL con estas alteraciones presentan
habi-tualmente un fenotipo común basado en la expresión de CD13+, CD15+, CD18+, CD33+ y CD34+, difiriendo en la reactividad para CD14, CD65 y marcadores asociados a lí-nea linfoide. Así, CD14 se expresa en la mayoría de los ca-sos con –5/5q– mientras que es infrecuente en –7/7q– y ex-cepcional en las alteraciones de 3q. Por el contrario, CD65 se expresa mayoritariamente en casos con alteraciones de 3q. Los marcadores linfoides tanto T como B son infrecuen-tes en casos con –5/5q–, en tanto que se expresan en apro-ximadamente la mitad de casos con –7/7q–16.
Leucemia aguda no linfoblástica con trisomía 8.El
inmuno-fenotipo de las LANL con trisomía 8 no presenta caracterís-ticas específicas. Con respecto a otras LANL, estas leuce-mias expresan con algo mayor frecuencia CD13 y CD33, con una expresión similar de CD3416.
Leucemia aguda no linfoblástica con reordenamientos de
11q23. Las alteraciones de 11q23 implican
reordenamien-tos del gen MLL y se considera que están asociadas a mal pronóstico en la LANL65. Pueden presentarse como t(6;11)
(q27;q23), t(9;11)(p22;q23), t(9;11;19)(p22;q23;q13.3), t(2;11)(11;17)(q37;q11q23;q11), t(11;17)(q23;q25), t(11;19) (q23;p13.1), t(11;19)(q23;p13.3) y t(1;22)(q23;q11), y a ellos se asocia morfología M4 o M566. En estos pacientes los
blastos, aunque presentan maduración a línea monocítica, tienen un fenotipo relativamente heterogéneo; independien-temente del subtipo morfológico, presentan positividad ≥80% para CD11b, CD13, CD15, CD18, CD32, CD33, CD38, CD64, HLA-DR y, con menor frecuencia (42%), para CD3466.
Con respecto a la expresión de marcadores linfoides, existe cierta controversia; así, mientras que algunos autores postu-lan que más de la mitad de los casos expresa un marcador linfoide B (p. ej., CD19), otros indican que la presencia de marcadores linfoides asociados a células B, T o natural ki-ller (NK) no parece significativamente diferente de la de otros pacientes con M4 o M5 sin alteraciones de 11q2316,66.
Pese a ello, hay autores que han objetivado una asociación significativa entre reordenamientos de MLL y la expresión de CD56 (cuyo gen también se localiza en 11q23) en casos con diferenciación monocítica y que presentaban una ten-dencia a menor supervivencia33,48; en este sentido, se
reco-mienda estudiar la existencia de reordenamientos de MLL en los pacientes con LANL de estirpe monocitaria CD56+48.
Por otra parte, se discute si los pacientes con reordena-mientos de MLL, t(9;11) y, a menudo, con morfología M5, que son los de relativo mejor pronóstico dentro de este sub-grupo, expresan menos frecuentemente CD14, CD34 y otros marcadores linfoides B16,66,67.
Recientemente se ha descrito un nuevo anticuerpo mono-clonal (denominado 7.1) que sería altamente sensible y es-pecífico para la identificación por citometría de flujo de ni-ños con leucemias agudas mieloides y linfoblásticas con reordenamientos de 11q23, mientras que en las LANL del adulto su sensibilidad y especificidad serían limitadas68.
Leucemias agudas no linfoblásticas con t(10,11). Ésta es
una entidad de muy reciente descripción, definida por la existencia de reordenamientos de MLL y CALM, que acom-pañaría de manera constante al producto de fusión MLL/AF10 resultante de la t(10;11)(p13;q14). Esta altera-ción, de mal pronóstico, no estaría asociada a ningún subti-po FAB de forma particular; sin embargo, los casos que presentan diferenciación, tanto mieloide como monocítica (M2 y M5), sí parecen relacionarse con el fenotipo CD4+, CD13–, CD33+, CD65+69.
Estudio de la enfermedad mínima residual en las leucemias agudas no linfoblásticas
Hasta la fecha los estudios de monitorización de EMR en las LANL se han basado en el seguimiento de inmunofenotipos que, en el momento del diagnóstico, presentan alguna ca-racterística que permite diferenciarlos de las células mieloi-des inmaduras sanas: inmunofenotipos leucémicos. Estas alteraciones se pueden agrupar en: a) expresión aberrante de antígenos asociados a líneas no mieloides; b)expresión asincrónica de antígenos vinculados a diferentes estadios de maduración; c)sobrexpresión antigénica; d)alteraciones en el patrón de dispersión de luz de las células mieloides; e)
ausencia de expresión de antígenos mieloides, y f) expan-sión de inmunofenotipos presentes en muestras normales en muy baja frecuencia. No existe unanimidad con respecto a qué porcentaje de pacientes con LANL presentan aberra-ciones antigénicas, oscilando entre el 20 y más del 80% en las series publicadas8,16,25,36,70,71.
Esto podría ser debido, al menos en parte, a que en la prác-tica los paneles de anticuerpos, tanto para el estudio inicial como de la EMR, están sujetos a discusión y varían amplia-mente entre diferentes grupos. En este sentido, algunos au-tores han indicado que el inmunofenotipo de las LANL es inestable, y que por ello sería necesario el uso de un amplio panel que incluya hasta 8 tubos con tres AcMo para un adecuado seguimiento de la EMR72. También se ha descrito
que en las LANL en recaída existiría un menor número de aberraciones antigénicas en relación con el diagnóstico ini-cial, lo que haría más complejo el estudio de la EMR73. Por
el contrario, otros investigadores indican que los fenotipos leucémicos son estables a lo largo de la enfermedad y per-miten un adecuado seguimiento de la EMR74. En este
senti-do, se ha recalcado la utilidad del seguimiento de los asin-cronismos CD34+/CD56+, CD33–/CD15+, CD33–/CD13+, CD15+/CD117+, CD15+ (intenso)/CD34+ y CD14+/CD34+ en las LANL en general69,75,76 y, de manera particular, en
pacientes con LANL M2 y t(8;21), así como en algunas M1 y M2 la utilidad de CD15/CD3476y/o CD15/CD11724,77.
La estrategia propuesta recientemente78,79parte de un panel
inicial con las asociaciones: CD15/CD117/CD34, CD15/ CD33/CD34, CD15/CD34/HLA-DR, CD34/CD38/CD19, CD34/ CD56/CD33, HLA-DR/CD33/CD13, CD7/CD13/CD19, CD65/ CD11b/CD4, CD2/CD14/CD13, CD61/glicoforinaA/CD45, CD10/ CD5/CD20 y CD71/CD11b, con el objeto de caracterizar las asociaciones inmunofenotípicas anómalas más útiles para su uso en estudios ulteriores. Con esta estrategia se han ha-llado múltiples fenotipos aberrantes en el momento del diagnóstico en la mayoría de los pacientes (75%), que pos-teriormente han permitido el seguimiento de la EMR con una sensibilidad en el entorno de 1 ×10–4. Entre los
fenoti-pos aberrantes detectados, son de destacar por su frecuen-cia los asincronismos madurativos CD117+/CD33+/HLA-DR– (34%), CD34+/CD117+/CD33+/HLA-CD117+/CD33+/HLA-DR– (21%), CD34–/CD15–/CD14–/CD33+ (19%), CD34+/CD33–/CD13+ (19%), CD117+/CD11b+ (13%) y la expresión aberrante de
CD2 (17%), que se acompaña en la mayoría de las ocasio-nes de un patrón inadecuado con alta dispersión frontal y angular de luz78. Por otra parte, es importante tener en
cuenta que en los pacientes con más de una población leu-cémica en el diagnóstico, el seguimiento de la EMR debe incluir el estudio tanto de la población predominante como el de las diferentes subpoblaciones blásticas minoritarias detectadas39. La aportación más relevante de este abordaje
es la objetivación de tasas de recaída específicas, asociadas a 4 categorías de riesgo diferente, en función de la cantidad de EMR detectada (< 10-4, ≥10–4-≤ 10–3, ≥10–3-≤10–2y ≥
10–2) en el primer estudio medular con criterios de remisión
morfológica tras finalizar el tratamiento de inducción79.
Todo lo arriba expuesto no debe hacernos olvidar que el es-tudio de las EMR en las LANL es una labor compleja, y que en algunos pacientes puede llegar a ser difícil la distinción entre células inmaduras sanas y leucémicas basándose ex-clusivamente en sus características inmunofenotípicas79,80.
En este sentido, una alternativa más simple para el segui-miento de las EMR en adultos con LANL sería el estudio de la relación entre células CD34+CD33+ y células CD34+ CD19+ en médula ósea. Así, se ha comprobado que un co-ciente ≥10 al finalizar los tratamientos citostáticos (después de la intensificación) se asocia a menor supervivencia global y supervivencia libre de enfermedad, y además predice la recaída81.
Leucemias agudas linfoblásticas
En los pacientes con leucemia aguda linfoblástica (LLA), los estudios inmunofenotípicos definen subgrupos de riesgo/ pronóstico específico, por lo que hoy por hoy son obligados en el diagnóstico y clasificación de estas entidades15. En
este sentido, es posible determinar con gran precisión, tanto en la línea linfoide B como en la línea linfoide T, el grado de diferenciación de la célula neoplásica según la reactividad de las células leucémicas con un panel de anticuerpos8.
En líneas generales, las LLA presentan características de dispersión de luz –FSC y SSC– menores que las LANL (simi-lar o menor que los subtipos M0 y M1) y también una me-nor expresión de CD459. Con respecto a su inmunofenotipo,
es de destacar la existencia de controversia acerca de la «estabilidad» inmunofenotípica entre el diagnóstico y la re-caída. Algunos autores consideran que podrían existir cam-bios en el perfil inmunofenotípico hasta en un 46% de ca-sos (más frecuentemente en las LLA de línea T); este efecto sería independiente del grupo de edad, y en su mayoría se trataría de cambios de subgrupo intralínea y pérdidas o ga-nancias de antígenos mieloides, que además no influirían en el pronóstico13. Otros autores defienden, por el contrario,
la estabilidad fenotípica de la clona leucémica y postulan la existencia de un mínimo porcentaje de cambios62,82-84.
Mencionaremos algunos puntos de interés con respecto a este grupo de entidades. En primer lugar, merece destacar-se que, como noción general, destacar-se acepta que en los niños las LLA-T tienen peor pronóstico que las LLA-B y, dentro de es-tas últimas, las CD10+ serían las que tendrían mejor
pro-nóstico; por el contrario, en adultos las leucemias de línea T tendrían mejor pronóstico que las de línea B55. En segundo
lugar, se considera que las leucemias CD2+/CD19+ en pa-cientes pediátricos constituirían un subgrupo específico de buen pronóstico85. En tercer lugar, se plantea que, ante un
cuadro leucémico en adultos con predominio de células de aspecto linfoide con positividad de CD20 y de inmunoglobu-linas de superficie (sIg) y CD10–, conviene tener presente la posibilidad de una variante blastoide de un linfoma del manto cuyo fenotipo sería además de pan B+, CD5+ y CD23–86. En cuarto lugar, tiende a considerarse la expresión
intensa de CD45 en las leucemias linfoblásticas de línea B como un factor de mal pronóstico, aunque éste sigue sien-do un tema abierto de debate87-89. En quinto lugar, la
inten-sidad de expresión de CD20 parece correlacionarse negati-vamente con la supervivencia en las LLA de progenitores B88, y por último, merece la pena recordar que, después de
una década de debate, se acepta que la expresión de mar-cadores mieloides no supone diferencias en el pronóstico de las LLA en niños90-93.
Leucemias linfoblásticas de línea B
Este grupo de leucemias se define por la expresión de, al menos, dos de los marcadores más tempranos de línea B: CD19, citCD22 o citCD79a. En función de la expresión de diversos marcadores de línea B y otros no específicos de lí-nea, se puede establecer 4 categorías según la mayor o me-nor diferenciación de la clona proliferante. Por otra parte, es interesante recordar que la expresión de CD34, un marca-dor que no es imprescindible ni para la asignación de línea ni para la catalogación en grupos, se asocia significativa-mente a buen pronóstico en las LLA de línea B en niños, mientras que por el contrario en adultos su presencia está asociada a mal pronóstico94-96(tabla 4).
Leucemia pro B (EGIL B-I) (leucemia linfoblástica aguda de
precursores B CD10–).Corresponde a la proliferación de las
células B más inmaduras. El fenotipo es positivo para algu-no de los marcadores que definen la línea linfoide B en sus estadios más tempranos: citCD22, CD19, citCD79a y en la mayoría de los casos expresan CD34. A menudo no expre-san otros antígenos de diferenciación B y, por definición, no expresan CD10. Se asocian hasta en un 25% a t(4;11) in-crementándose notablemente su incidencia en niños meno-res de un año, y son de peor pronóstico que el subtipo EGIL B-II8,17,55.
Leucemia linfoblástica aguda común (EGIL B-II) (leucemia
linfoblástica aguda de precursores B CD10+). Suponen el
60% de las LLA en niños y se consideran de buen pronósti-co, alcanzándose hasta un 85% de remisiones a largo plazo en ese grupo de edad, aunque su pronóstico en adultos es más sombrío. Tanto en esta entidad como en la anterior, los blastos suelen ser muy pequeños, con escasa dispersión frontal (FSC) y lateral (SSC) de luz. Algunos casos tienen muy poca expresión de CD45, por lo que en el diagrama SSC/CD45 se disponen en la región de serie eritroide8,87.
TABLA 4
Perfil inmunofenotípico de las leucemias linfoblásticas de línea B (EGIL)
citCD22 CD19 CD79a CD34 CD10 TdT sCD22 CD20 CD38 CD45 Cµ SIg
Pro-B (E-I) + ± + + – + ± – ++ ± – –
Común (E-II) + + + ± ++ + + ± + ± – –
Pre-B (E-III) + + + – + + + + ± + + – o ±
B maduras (E-IV) + ± + – ± ± ± + ± + – +
El fenotipo suele ser positivo para citCD22, citCD79a, CD19 y HLA-DR y, por definición, CD10 positivo y sIg negativo. La mayoría de los casos suelen ser además CD24+, CD34+ y TdT+. La expresión de CD22 y en mayor medida de CD20 aumenta con el grado de madurez de la clona leucémi-ca8,15,17,55. Este grupo diagnóstico presenta un pronóstico
significativamente mejor en niños menores de 12 meses y discretamente mejor en niños de un año o mayores en com-paración con los grupos EGIL B-III y B-IV97.
En los pacientes con fenotipo de precursor B (EGIL I y B-II) se han descrito varias alteraciones citogenéticas que afectan al pronóstico. Las más frecuentes serían t(9;22), al-teraciones de 11q23 y t(12,21), que comentaremos de for-ma específica en un otro apartado8,15,98.
Leucemia pre B (EGIL B-III).Suponen aproximadamente un
25% de las LLA de los niños y corresponden a un estadio de maduración más tardío que las anteriores. Este grupo se define por la positividad para las cadenas pesadas µen ci-toplasma, en presencia o no de reactividad para CD1015.
Como en las LLA de precursores B, el fenotipo suele ser po-sitivo para citCD22, CD19, CD10 y HLA-DR, y sIg negativo. La práctica totalidad de casos son CD24+. La reactividad para CD20 y TdT es variable, y CD34 suele ser negati-vo8,15,17,98.
En líneas generales, se considera que este grupo tiene peor pronóstico que las LLA de precursores B (EGIL B-I y B-II), si bien este mal pronóstico se relaciona de manera particular con la presencia de t(1;19). Esta alteración se detecta en un 5% de los niños con LLA de precursores B (EGIL B-I y EGIL B-II)15y hasta en un 25% de los adultos con fenotipo
pre B99. La traslocación comporta la creación del gen de
fu-sión E2A-PBX1 y se asocia a fenotipo cIgµ+, CD19+, CD10+, CD24+, CD9+, expresión variable de CD20 (al me-nos con ausencia parcial de expresión) y negatividad para CD34, fenotipo que tiene un valor predictivo para esta tras-locación del 50%26.
Leucemias B maduras (EGIL B-IV). Representan del 2 al
5% de todas las LLA y equivalen al linfoma de Burkitt en su fase leucémica. En la actualidad se considera una enferme-dad curable, aunque de pronóstico intermedio en niños100;
por el contrario, en adultos sigue siendo considerada una entidad de mal pronóstico101. En la práctica totalidad de los
pacientes se objetivan reordenamientos de c-mycen el cro-mosoma 8, presentando la clásica t(8;14)(q24;q32) o las variantes t(2;8)(p11;q24) o t(8;22)(q24;q11) cuando las traslocaciones afectan a los genes de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas, o de las cadenas ligeras kappa o lambda, respectivamente8,17.
Las células de la LLA-B tienen más dispersión frontal y an-gular de luz que las LLA EGIL-I a III y pueden, por consi-guiente, objetivarse tanto en la región de linfocitos como de monocitos en los diagramas de SSC/CD45. El fenotipo es, en la mayoría de los casos, positivo para CD19, CD20, CD22 y CD24, y con frecuencia también para CD10+. El diagnóstico diferencial con las otras LLA de línea B se
esta-blece basándose en la positividad para sIg, con mayor fre-cuencia de tipo IgM o, alternativamente, por la expresión ci-toplasmática de una cadena ligera, aunque es de destacar que recientemente se ha descrito la existencia de casos con t(8;14) y negatividad tanto para sIg como para cadenas lige-ras citoplasmáticas102. También es de resaltar la existencia
de pacientes con inmunofenotipo propio de LLA-B que no tienen morfología L3, de manera particular algunos casos con t(1;19) y t(14;18) que presentan morfología L1103. Las
células blásticas de estos pacientes suelen presentar una elevada tasa proliferativa6.
Leucemias linfoblásticas de línea T
Las LLA de línea T tienen una importante dispersión frontal (FSC) y baja o intermedia dispersión lateral (SSC) de luz, y en los diagramas de SSC/CD45 pueden apreciarse tanto en la región de monocitos como en la de linfoblastos y/o mielo-blastos8. Estas entidades se definen por la expresión
cito-plasmática o en membrana de CD3; en este sentido, es im-portante recordar que la reactividad para CD2 y/o CD7 no es suficiente para adscribir un caso como de línea T, aun-que CD7 se exprese en la práctica totalidad de las LLA-T25,104. Por otra parte, es de resaltar que una
caracterís-tica de las neoplasias T en general, y de las LLA-T en parti-cular, es la pérdida de antígenos de línea y la expresión aberrante de antígenos de otras líneas, lo que puede dificul-tar su clasificación8,17,105. Asimismo merece destacarse la
baja frecuencia de positividad para los antígenos CD34 y HLA-DR, particularmente en niños92, en quienes se asocia a
un peor pronóstico94.
En función del grado de diferenciación tímica se definen (con diferente terminología según el origen de los autores) 4 subgrupos cuyo pronóstico es objeto de debate y que revi-saremos a continuación8,14,15,17,106,107(tabla 5).
Leucemias pro T (EGIL T-I) (leucemias linfoblásticas agudas
pre T).El fenotipo pro T, que podría ser el de peor
pronósti-co dentro de las LLA de línea T, suele presentar únicamente positividad para citCD3 y CD7, siendo negativo para CD3 en superficie (sCD3), CD4, CD8 y otros antígenos de línea T8,14,17,104.
Leucemias pre T (EGIL T-II) (leucemias linfoblásticas
agu-das T corticales tempranas).Las LLA pre T o de fenotipo
cortical temprano son el segundo grupo en incidencia den-tro de las LLA-T. Su fenotipo es CD2+, habitualmente sCD3–, y presentan positividad variable para CD5, CD7 y positividad intensa para TdT8,14,17. Es de interés recordar
que en las LLA de línea T la expresión de CD2 se ha asocia-do a buen pronóstico14.
Leucemias T corticales (EGIL T-III) (leucemias linfoblásticas
agudas T corticales tardías).Las LLA-T corticales o de
feno-tipo cortical tardío son las más frecuentes dentro de las LLA-T. Su fenotipo se define por la positividad para CD1a independientemente de la positividad para otros marcado-TABLA 5
Perfil inmunofenotípico de las leucemias linfoblásticas de línea T (EGIL)
citCD3 sCD3 CD7 CD1a TdT* CD2 CD5 CD4/CD8
Pro-T (E-I) + – + – + o ± – – –/–
Pre-T (E-II) + ± + – + o ± + + –/– o +/+
T cortical (E-III) + + + + ± + + ±/±
T maduras (E-IV) + + + – ± o – + + +/– o –/+
res incluyendo sCD3, CD2, CD5, e incluso CD7. Algunos ca-sos pueden presentar positividad simultánea para CD4 y CD8 y positividad débil para sCD3. La TdT es frecuente-mente positiva8,14,17.
Leucemias T maduras (EGIL T-IV) (leucemias linfoblásticas
agudas T tímicas-medulares).El fenotipo medular es
negati-vo para CD1a– y presenta positividad para sCD3 y expresión variable para CD2, CD5 y CD7, así como expresión segrega-da de CD4 o CD8. En algunos casos puede existir positivi-dad débil para TdT8,14,17. Dentro de este subgrupo se
distin-guen LLA-Tαβ+ y LLA-Tγ/δ+.
Leucemias linfoblásticas agudas T γ/δ+
La práctica totalidad de casos de LLA-T γ/δ+ presentan in-munofenotipo TdT+, CD2+, CD3+, CD5+, CD6+ y CD7+. Su perfil CD1a/CD4/CD8 es heterogéneo, siendo la mayoría CD4+/CD8– o CD4+/CD8+ y menos de un 25% CD4–/ CD8–108.
Leucemias linfoblásticas agudas vinculadas con alteraciones citogenéticas específicas
Leucemias linfoblásticas agudas con alteraciones de 11q23.
Las traslocaciones que afectan a 11q23 ocurren en un 60% de las LLA de lactantes, en un 2% en niños y en un 3 a un 6% de adultos. Esta traslocación cursa en la mayoría de los casos con reordenamientos del gen MLL, fenotipo CD10– (EGIL-I o III), y también se asocia a expresión de antígenos mieloides8,64,98. En lactantes resulta particularmente
impor-tante determinar, por su mal pronóstico, la existencia del fe-notipo CD10–, 7.1+ con expresión de CD15 y CD65 o, me-nos frecuentemente, de otros marcadores mieloides y reordenamientos de MLL68,109.
Entre las alteraciones de 11q23 destaca t(4;11)(q21;q23). Esta alteración cursa con el gen de fusión MLL-AF4, se pre-senta hasta en un 25% de las LLA del grupo EGIL B-I, y son de mal pronóstico en adultos y sobre todo en niños, siendo su perfil fenotípico más habitual CD19+ y CD34+, además de CD10–15,55,90,95. Dos excepciones al mal pronóstico
gene-ral de este grupo serían la t(11;19)(q23;p13.3) con reorde-namiento de MLL y fenotipo de precursor B CD10– en niños de entre 1 y 9 años110y la misma alteración con producto
de fusión y asociada a fenotipo T111(tabla 6).
Leucemias linfoblásticas agudas con t(9;22) (reordenamientos de bcr/abl). Se asocia a LLA de precursores B de morfología L2 con fenotipo CD19+, CD34+, CD10+ (EGIL B-II) y frecuen-te (70%) coexpresión de antígenos mieloides, particularmenfrecuen-te CD13 y CD66. Esta alteración estaría presente en un 15 a un 30% de las LLA de adultos y en un 3 a un 5% de los casos pediátricos, asociándose en ambos grupos de edad a mal pro-nóstico15,20,90,98. Recientemente se ha propuesto un perfil
in-munofenotípico característico en el grupo de LLA con t(9;22) del adulto: CD10+ en al menos una subpoblación de los blas-tos y CD34+ con un patrón homogéneo, CD38+ en baja inten-sidad y con patrón heterogéneo, y además CD13+20.
Tanto la t(9;22) como las traslocaciones que afectan a 11q23 se asocian con la expresión de antígenos mieloides, y aunque dichas coexpresiones no comportan per se mal pronóstico, su presencia en pacientes con citogenética nor-mal hace recomendable el cribado de ambas alteraciones mediante PCR8(tabla 6).
Leucemias linfoblásticas agudas con t(12;21)(p13;q22).La
t(12;21)(p13;q22) origina el producto de fusión TEL/AML1. Se objetiva mayoritariamente en LLA comunes y pre B (EGIL
B-II y B-III), y su incidencia está en torno al 20% de los ca-sos de LLA de la infancia, siendo una alteración poco fre-cuente en la LLA del adulto112. Un porcentaje importante de
estos casos expresa marcadores mieloides (CD13, CD33 o CD65)112y, de hecho, en niños se ha demostrado una
aso-ciación significativa entre la expresión de los mismos y la presencia de la alteración112-114. En este sentido, se ha
descrito como característico el fenotipo CD9– (o parcial-mente positivo), CD13+, CD10++, CD34+ bimodal, expre-sión intensa de HLA-DR y CD45 y CD20 positivos débiles o negativos115. De hecho, se ha apuntado que el fenotipo
CD9–/CD20– se asocia a la traslocación de forma sensible y específica, y además tiene un notable valor predictivo (47%)114.
A diferencia de las alteraciones de 11q23 y de t(9;22), este subgrupo se asocia a buen pronóstico, especialmente en los niños de entre 1 y 10 años con fenotipo CD19+, CD10+ y HLA-DR+ (EGIL B-II); de ahí la importancia de la utilización de técnicas de PCR para su cribado112(tabla 6).
Leucemias linfoblásticas agudas con alteraciones de 19p13.
Recientemente se ha descrito la existencia de un grupo de adultos de intermedio o mal pronóstico que presentarían al-teraciones del gen E2A localizado en 19p13, y que se pre-sentarían con fenotipo CD19+, CD10+, TdT+ y HLA-DR+, negatividad para CD20, CD34 y para antígenos mieloides (CD13, CD14 y CD33). Estos pacientes podrían presentar diversas alteraciones citogenéticas con implicación de 19p13: t(1;19)(q23;p13) y t(17;19)(q21;p13)116. Sin
embar-go, en la forma más frecuente, t(1;19), puede asociarse a fenotipo de precursores o pre B117y tiene un pronóstico
in-termedio, tanto en niños como en adultos15(tabla 6).
Estudio de enfermedad mínima residual en las leucemias linfoblásticas agudas
Los estudios de EMR en las LLA habitualmente se basan, al igual que en las LANL, en el seguimiento de los fenotipos leucémicos detectados en el diagnóstico. Como en las LANL, las estrategias implicarían el estudio de la expresión aberrante de antígenos, asincronismos y sobrexpresión anti-génica, alteraciones en el patrón de dispersión de luz, pér-dida de expresión de antígenos y expansión de inmunofeno-tipos de baja frecuencia; además, en las LLA-T son frecuentes los fenotipos tímicos de localización ectópica en médula ósea. Dado que un porcentaje muy elevado de pa-cientes (entre el 91 y el 99%, según diferentes grupos) pre-sentaría fenotipos leucémicos, combinando las anteriores aproximaciones se puede estudiar la EMR con una sensibili-dad del orden de ≤1 ×10–4en la práctica totalidad de los
casos118. En este sentido, la detección de EMR en estudios
puntuales en porcentajes relativamente elevados (≥ 1 × 10–3), o su incremento en estudios consecutivos, está
aso-ciada con la recaída tanto en las LLA de línea B como en las TABLA 6
Perfil inmunofenotípico de las leucemias linfoblásticas de línea B con alteraciones citogenéticas específicas
a CD34 CD10 TdT CD13/ CD20 CD38 CD45 Cµ CD15 t(9;22) +b + +/± + – *11q23 – ±/± – o ± t(12;21) +c ++ +/± – o ± – o ± – o ± t(4;11) + – + – **19p13 – + + –/– – – o ±
aLa mayoría de los casos son CD19+, citCD22+, HLA-DR+, 7.1+; basociado a positividad para CD13; cbimodal.
de línea T82-84,119-124. Por otra parte, es obligado tener
pre-sente a la hora de efectuar los estudios de EMR que las distintas etapas de tratamiento comportan la expansión de precursores B sanos que presentan características inmuno-fenotípicas específicas y distintas de las de las células leu-cémicas125.
Como un requisito previo a los estudios de EMR, es funda-mental conocer el patrón madurativo normal de la serie lin-foide B. Esta línea celular presenta en ausencia de enferme-dad un perfil de maduración bien definido que tiene una alta reproducibilidad y constancia entre individuos y cuyos estadios de mayor a menor inmadurez serían, por este or-den: a1)CD19+ (débil) o –, CD34+, TdT+, CD10–, CD22+ (débil), CD45+ (débil) o –, CD38+ (intenso) y CD20–; a2)
CD19+ (débil) o –, CD34+, TdT+, CD10+ (intenso), CD22+ (débil), CD45+ (débil) o –, CD38+ (intenso) y CD20–; b1)
CD19+, CD34–, TdT–, CD10+, CD22+ (débil), CD45+, CD38+ (intenso) y CD20–; b2) CD19+, CD34–, TdT–, CD10+, CD22+ (débil), CD45+, CD38+ (intenso) y CD20+ (débil), y c) CD19+, CD34–, TdT–, CD10–, CD22+ (inten-so), CD45+, CD38+ (débil) y CD20+ (intenso)124,126y que se
pueden resumir en los indicados anteriormente en los epí-grafes a2, b2 y c126. Estos perfiles inmunofenotípicos
pre-sentarían variaciones en función de la edad de los pacien-tes; así, por debajo de los 15 años existiría un acentuado predominio de las subpoblaciones más inmaduras (ay b), y por encima de esta edad predominaría la subpoblación c
madura. La representación de estos perfiles en los diagra-mas de puntos de los progradiagra-mas informáticos para análisis de datos de citometría evidenciaría la localización de las po-blaciones normales siguiendo una «senda de maduración» establecida, así como la existencia de áreas «vacías» en las que eventualmente se localizarían las células leucémicas con aberraciones fenotípicas120,126.
Para el estudio de las aberraciones inmunofenotípicas se han planteado diversas estrategias simplificadas y de fácil aplicación en la sistemática de un laboratorio de diagnóstico clínico. En este sentido, se ha propuesto el estudio del por-centaje de células inmaduras CD34+/CD19+ o CD20–/ CD19+127, o la utilización de combinaciones
preestableci-das, como: a)CD10FITC, CD20PE, CD45PerCP, CD19APC, y b)CD34FITC, CD9PE, CD45PerCP y CD19APC; estas es-trategias permitirían la detección de EMR en la práctica to-talidad de los pacientes con LLA de línea B120. Otros grupos
defienden el uso de combinaciones específicas para cada paciente. En este último sentido destacaríamos en las LLA de línea B la existencia de un elevado porcentaje de infideli-dades de línea (estudiando CD13, CD33 y CD66); hasta un 46% de casos con asincronismo antigénico, entre los que destacaría la coexpresión de CD10 intenso con CD20 y la expresión de CD20 en células CD19+/CD45–; hasta un 38% de casos con sobrexpresión antígénica de CD10, CD38 y CD58, este último un marcador de buen pronóstico, y finalmente hasta un 30% de casos con expansión de fe-notipos infrecuentes, destacando entre éstos las asociacio-nes CD19+/CD45–, CD19+/CD34+/CD10– y CD19+/CD10+ +/CD34–35,83,118,128.
Los hallazgos anteriores se resumen en la muy reciente pro-puesta de un panel estandarizado de consenso para el estu-dio de EMR en la LLA de precursores B que permitiría, en conjunto, la detección de poblaciones aberrantes en hasta el 98% de los casos. Este panel incluiría, además de las in-fidelidades de línea pertinentes en los casos en los que és-tas se detectaran en el momento del diagnóstico (48%), las siguientes combinaciones: TdT/CD10/CD19 (con un 78% de casos aberrantes), CD10/CD20/CD19 (64% de casos con fenotipo aberrante), CD34/CD38/CD19 (56% de
aberra-ciones), CD34/CD22/CD19 (46%) y CD19/CD34/CD45 (22%)129.
Con respecto a las LLA de línea T, es obligado recordar que presentan más alteraciones en relación con la hematopoye-sis T normal que las LLA de línea B respecto a sus células homónimas sanas. Entre estas alteraciones destacaríamos la existencia de hasta un 63% de casos con infidelidad de línea (estudiando CD13, CD33 y CD19), un 44% de casos presenta asincronismos madurativos, entre los que destaría la coexpresión de TdT+/sCD3+ y de sCD3 (débil) en ca-sos CD7+/TcR+, un 69% de caca-sos muestran fenotipos ectó-picos y un 88% de casos tiene expansión de fenotipos infrecuentes25,82. Recientemente se ha propuesto un panel
de anticuerpos monoclonales de consenso, basado en el mismo principio visto para la línea B, proponiéndose la utili-zación de las siguientes combinaciones antigénicas: TdT/CD7/citCD3, CD7/CD5/CD3, CD7/CD4/CD8, CD7/CD2/ CD3, y CD7/CD38/CD34; de todas ellas la primera sería la más informativa, al detectar aberraciones en hasta un 91% de los casos de LLA-T104.
Leucemias agudas indiferenciadas
Suponen menos del 1% del total de las leucemias agudas cuando se emplea un amplio panel de anticuerpos mono-clonales frente a antígenos de superficie y de citoplasma para su diagnóstico. Estos casos suelen presentar fenotipo CD34+, HLA-DR+, CD38+, CD7+ en ausencia de otros antí-genos específicos de línea. En la actualidad se debate si con estudios exhaustivos, inmunofenotípicos, citogenéticos y moleculares estas entidades existen realmente8,40,55.
Leucemias agudas bifenotípicas
La generalización del análisis inmunofenotípico ha llevado al reconocimiento de casos que no encajan de manera precisa ni en la línea mieloide ni en la linfoide. La incidencia real de las leucemias agudas bifenotípicas (LAB) está por debajo del 5% cuando se aplican criterios estrictos, y los casos que cumplen éstos a menudo se asocian a t(9;22), a reordena-mientos de MLL en 11q23 y t(8;13). Tanto en adultos como en niños se ha objetivado una tendencia a mal pronóstico en este grupo8,27,55.
El EGIL y otros grupos han definido las LAB por la expresión de una serie de marcadores a los que se ha dado puntuación en función de su especificidad para cada línea. En la tabla 7 se recogen dichos marcadores, así como la valoración asigna-da a caasigna-da uno de ellos. El criterio de LAB es la existencia de puntuaciones ≥2 para la línea mieloide y para al menos una de las dos líneas linfoides B o T17,27,130. Otros autores han
pos-tulado muy recientemente que este criterio no sería apropia-TABLA 7
Criterios para la definición de las leucemias agudas bifenotípicas
Puntuación Línea B Línea T Línea mieloide
2 CD79a CitCD3/CD3s Anti-MPO
cit IgM anti-TcR α/β
cit CD22 anti TcR γ/δ 1 CD19 CD2 CD117 CD10 CD5 CD13 CD20 CD8 CD33 CD10 CD65 0,5 TdT TdT CD14 CD24 CD7 CD15 CD1a CD64
do y que el diagnóstico de LAB debería hacerse únicamente ante positividad para citMPO superior al 3% y fenotipo linfoi-de completo25. Bajo este término se incluirían no sólo las
ver-daderas LAB, sino también leucemias agudas bilineales en las que coexisten en un mismo paciente subpoblaciones de células leucémicas de dos o más líneas diferentes.
Leucemias asociadas al síndrome de Down
Además de la mayor tendencia de estos pacientes a presen-tar LLA y LANL, estas últimas de mejor pronóstico que en la población sin trisomía 21131, se ha descrito la existencia de
una entidad específica que se presentaría en niños menores de 6 años a la que se ha denominado trastorno mieloprolife-rativo transitorio asociado al síndrome de Down (TMTAD) y que se caracterizaría por presentar una notable diferencia-ción eritroide y megacariocítica y por entrar espontánea-mente en remisión antes de dos meses tras el diagnóstico132.
Tanto la LANL como el TMTAD tendrían en común el fenoti-po CD45+, CD38+, CD33+ y mayoritariamente CD36+, CD41+, CD61+, CD34+, CD14– y CD64–132,133. Muchos
ca-sos en ambas entidades presentarían positividad de CD7 y también, aunque con menor frecuencia, para CD56. Por el contrario, CD11b y CD13 tenderían a expresarse en LANL pero no en TMTAD, y HLA-DR se expresaría más frecuente-mente en TMTAD que en LANL133.
Inmunofenotipo de la célula stemleucémica
En las LANL se ha relacionado la presencia de poblaciones leucémicas en estadios de diferenciación muy tempranos (CD34+/CD38–) como un factor de mal pronóstico vincula-do a la resistencia a citostáticos y a alteraciones citogené-ticas concretas45. Sin embargo, se conoce que los
proge-nitores leucémicos comparten con los progeproge-nitores sa-nos el fenotipo CD34+, CD71–, HLA-DR– y eventualmente CD38–134-136, y por tanto, aunque algunos datos
prelimina-res apuntan a que la expprelimina-resión de rIL3α(CD123) podría es-tar asociada a la stem cellleucémica pero no expresarse en su homónimo sano135, se puede considerar que, hoy por
hoy, no se han definido características fenotípicas que dis-criminen claramente entre ambas poblaciones135,136.
Por otra parte, esta línea de investigación ha llevado a emitir nuevas propuestas sobre las características inmunofenotípi-cas de los estadios más inmaduros de la hematopoyesis sana, lo que tiene implicaciones en el refinamiento de los procedimientos de selección positiva aplicados al trasplante de progenitores hematopoyéticos y en la identificación de éstos en tejidos no hematopoyéticos, con todo lo que ello implica, tanto para el tratamiento de enfermedades neoplá-sicas como, muy previsiblemente a corto y/o medio plazo, en el tratamiento, cuando menos, de trastornos neurológi-cos y cardiológineurológi-cos81,137-140.
Entre las aportaciones más relevantes en este campo es de destacar la nueva propuesta de estadios de diferenciación en los niveles más tempranos de la hematopoyesis, que po-dría resumirse de la siguiente manera:
1.Los estadios más inmaduros en los que se encuadrarían las células con capacidad de autorreplicación pero sin ca-pacidad de diferenciación estarían definidos de mayor a menor inmadurez por los fenotipos a)CD34–, CD45–, y b)
CD34–, CD45+, CD38±.
2.El estadio de células con capacidad de autorreplicación y de diferenciación incluiría: CD34++, CD90+, CD133+, CD82+, KDR (VEGFR2)+, SIRP+, CD38–, HLA-DR–, CD71–, CD117– (o positivo débil), CD135+ (débil) y gp130+ (débil).
3. Por último, los estadios con capacidad de diferenciación pero no de autorreplicación se definirían por los fenotipos: a)
CD34+, CD38+, HLA-DR+, CD71+, CD117+, CD135+, rIL6+, CD90–, CD133+, y b)CD34+ (débil), CD33+ citCD3+, Lin+81.
Recomendación para el estudio de las leucemias agudas El grupo EGIL recomienda estudiar las leucemias agudas en dos pasos. El primero con el objetivo de caracterizar la línea celular proliferante como B, T o mieloide; este primer paso incluiría los marcadores más específicos y tempranos de cada una de estas líneas, así como unos pocos marcadores asociados al grado de maduración, pero no específicos de línea; un segundo panel se haría en función de los resulta-dos del primero con el objeto de precisar el subtipo de la célula neoplásica17. En este sentido, integrando las
reco-mendaciones más recientes para el estudio de las leuce-mias agudas, se propondría estudiar CD10, CD19, CD13, CD33, CD34, CD45, CD7, CD14, citMPO, citCD3, sCD3, y HLA-DR para la caracterización inicial, estudiando poste-riormente: a)para la línea T: CD1a, CD2, CD5, CD4, CD8 y TdT; b) para la línea B: CD20, CD79a, CD22, CD45, IgM (cIgµ) y TdT; c) para la serie mieloide: CD15, CD11b, CD16, CD10 CD33, CD13, CD56, CD64, CD65 y CD117, además de CD19, TdT, CD2, CD7, y sCD3 para el estudio de infidelidades; d)para la serie monocítica, se analizarían complementariamente los antígenos descritos para la serie mieloide en general, CD4 y CD14; e)para la serie megaca-riocítica: CD61, CD41a y CD42b, y f)para la serie eritroide, CD71, CD36, glicoforina A y CD45. De entre este exhaustivo panel parece especialmente recomendable el uso de las si-guientes combinaciones: CD7/CD1a/CD2, CD10/CD19/CD34, CD19/CD79a/CD10, CD33/CD13/CD45, CD45/CD34/HLADR, CD64/CD34/CD45, CD45/CD71/CD33, CD15/CD34/CD56 y CD2/CD13/CD19141,142. Para finalizar este punto,
recordare-mos que, además del estudio de CD79a, CD22, cIgµ, CD3 y citMPO, el estudio intracitoplasmático de los marcadores CD13 y CD33 para la línea mieloide y de CD61, CD41 y CD42 para la serie megacariocítica es más sensible que su estudio en superficie y puede ser de utilidad en leucemias poco diferenciadas55.
Respecto a los criterios de positividad, el grupo EGIL reco-mendó establecer el punto de corte en la existencia de un 20% de elementos positivos para considerar la expresión de un marcador, con la excepción de algunos marcadores más específicos de línea (citMPO, citCD3 y citCD79a) para los que se acordó rebajar el punto de corte hasta el 10%130. Sin
em-bargo, recientemente se ha propuesto un criterio de positivi-dad basado en la existencia de intensipositivi-dades de fluorescencia media (IFM) superiores en dos desviaciones estándar a los valores de IFM de las poblaciones de las células no marca-das, que, a título personal, nos parece menos arbitrario25.
Como resumen de este apartado, parece claro que, a la vis-ta de la información aporvis-tada, para un adecuado estudio inicial de las leucemias agudas se necesitaría evaluar entre 20 y 30 AcMo de entre los recogidos en la tabla 8, mientras que para el seguimiento sería suficiente la utilización de al-gunas combinaciones «específicas de paciente», que inclui-rían un número considerablemente menor de anticuerpos monoclonales respecto a los empleados al diagnóstico. Conclusiones
En la última década, la citometría de flujo ha pasado de ser una técnica complementaria, que se limitaba a confirmar el origen de las células leucémicas, a ser un análisis de extre-ma importancia, que permite definir estadios de extre-madurez
