Desarrollo de biopelÍculas en un reactor de lecho fluidificado de flujo descendente a diferente relación DQO/sulfato y tiempo de residencia hidráulico.

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(1)INSTITUTO POTOSINO DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA Y TECNOLÓGICA, A.C. POSGRADO EN CIENCIAS APLICADAS Desarrollo de biopelículas en un reactor de lecho fluidificado de “Título de la tesis” flujo descendente a diferente relación DQO/sulfato y tiempo de residencia (Tratar de hacerlo comprensible para elhidráulico público general, sin abreviaturas). Tesis que presenta Elda Zoraida Piña Salazar Para obtener el grado de Maestra en Ciencias Aplicadas En la opción de Ciencias Ambientales Codirectores de Tesis: Dr. María de Lourdes Berenice Celis García Dr. Francisco Javier Cervantes Carrillo San Luis Potosí, S.L.P., 15 de octubre de 2010.

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(3) Créditos Institucionales Esta tesis fue elaborada en la División de Ciencias Ambientales del Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica, A.C., bajo la codirección de la Dra. María de Lourdes Berenice Celis García y del Dr. Francisco Javier Cervantes Carrillo y la asesoría de la Dra. Mónica Alicia Meraz Rodríguez.. Durante la realización del trabajo el autor recibió una beca académica del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT-221808). El trabajo de investigación de esta tesis fue financiado por el Proyecto de Ciencia Básica SEPCONACYT-62028, otorgado a la Dra. María de Lourdes Berenice Celis García.. El posgrado en Ciencias Aplicadas con opción terminal en Ciencias Ambientales del Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica se encuentra inscrito dentro del Programa Nacional de Posgrados del CONACYT.. iii.

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(5) A mi familia; a mi madre la Sra. Ma. Dolores Salazar Chávez, a mi padre el Sr. Ranulfo Piña Martínez, a mi hermano el Sr. Omar Alfredo Piña Salazar y especialmente a mi hermana la Srita. Perla Dinorah Piña Salazar, a mi novio el Dr. Aarón Morelos Gómez y a mis amigos por todo su cariño y apoyo en el transcurso de esta etapa de mi vida.. A mis amigos Diana Piña, Dalila Garay, Patricia Yañez, Mayra Rodríguez, Julián Carrillo y Adriana Mata por brindarme su amistad incondicional.. v.

(6) Agradecimientos. A mis directores de tesis Dra. María de Lourdes Berenice Celis García y Dr. Francisco Javier Cervantes Carrillo por sus enseñanzas, paciencia, confianza, apoyo y valiosos comentarios durante la realización de este trabajo de tesis.. A la Dra. Mónica Alicia Meraz Rodríguez de la UAM-Iztapalapa por su asesoría, disponibilidad y valiosos comentarios durante el desarrollo de la presente tesis.. A la Dra. Lilia Montoya Lorenzana, posdoctorante de la División de Biología Molecular de este Instituto y a la M. en C. Berenice Flores Aguilar por su apoyo y enseñanzas referentes al análisis microbiológico molecular que llevé a cabo, tanto en los experimentos de extracción de ADN, PCR y DGGE como en el análisis de las secuencias obtenidas.. A los técnicos de la División de Ciencias Ambientales, M. en C. Dulce Isela Fátima Partida Gutiérrez y M. en C. Guillermo Vidriales Escobar por su disponibilidad y apoyo técnico en la realización de los experimentos de la tesis.. Al Dr. Ángel Gabriel Alpuche Solís de la División de Biología Molecular del IPICYT por permitirme hacer uso de su laboratorio, y a la técnico académico M. en C. Rosalba Castillo Collazo por el apoyo y asesoría brindados.. A mis compañeros y amigos de la División de Ciencias Ambientales: Mayra, Julián, Adriana, Víctor, Rodrigo, Alejandra, Mariana, Daniel, Litza, Claudia, Luis y Emilia por su apoyo y tiempo compartidos.. vi.

(7) Contenido Constancia de aprobación de la tesis. ii. Créditos institucionales. iii. Acta de examen. iv. Dedicatorias. v. Agradecimientos. vi. Índice de tablas. x. Índice de figuras. xii. Índice de ecuaciones. xv. Anexos. xvii. Lista de abreviaturas. xviii. Resumen. xx. Abstract. xxi. 1. Introducción. 1. 2. Antecedentes 2.1 Digestión anaerobia 2.1.1 Proceso biológico de sulfato-reducción 2.1.2 Bacterias sulfato-reductoras 2.1.2.1 Factores que condicionan el crecimiento y función de las BSR 2.1.2.1.1 pH 2.1.2.1.2 Temperatura 2.1.2.1.3 Toxicidad por sulfuro 2.2 Biopelículas 2.3 Reactores en el estudio del proceso de sulfato-reducción 2.4 Factores involucrados en el desempeño de un reactor sulfatoreductor. 3. Justificación 4. Hipótesis y Objetivos 4.1 Hipótesis. 3 5 8 12 12 12 12 14 16 18 23 25. vii.

(8) 4.2 Objetivo general 4.3 Objetivos específicos 5. Materiales y métodos 5.1 Materiales 5.1.1 Reactor de lecho anaerobio de flujo ascendente (UASB) 5.1.2 Reactor de lecho fluidificado de flujo descendente (LFFD) 5.1.3 Medios de cultivo 5.1.3.1 Medio basal para la alimentación de los reactores 5.1.3.2 Medio basal para las actividades específicas 5.1.3.3 Solución de oligoelementos 5.1.4 Inóculo 5.2 Métodos 5.2.1 Operación del reactor UASB 5.2.2 Operación de los reactores LFFD 5.2.3 Seguimiento del desempeño de los reactores LFFD 5.2.4 Actividad sulfato-reductora (ASR) del inóculo 5.2.5 Actividad sulfato-reductora de la biopelícula 5.2.6 Actividad metanogénica (AME) del inóculo 5.2.7 Actividad metanogénica de la biopelícula 5.2.8 Análisis molecular de la comunidad microbiana 5.2.8.1 Extracción de ADN genómico 5.2.8.2 Amplificación del ADN 5.2.8.3 Concentración y cuantificación de los productos de PCR 5.2.8.4 Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) 5.2.8.5 Análisis de las secuencias 5.3 Análisis químicos 5.3.1 Medición de DQO 5.3.2 Medición de pH 5.3.3 Medición de alcalinidad como carbonato de calcio 5.3.4 Medición de sulfato, acetato y lactato 5.3.5 Medición de sulfuro 5.3.6 Determinación de los sólidos suspendidos totales y volátiles del inóculo y sólidos inmovilizados en el soporte 5.4 Cálculos 5.4.1 Cálculo de la eficiencia de remoción de DQO 5.4.2 Cálculo de la concentración de DQO removida por BSR 5.4.3 Cálculo de la concentración de DQO removida por bacterias no sulfato-reductoras viii. 25 25 26 26 26 27 27 28 29 29 30 30 30 31 31 32 33 33 34 34 36 38 38 40 40 40 41 41 42 43 43 44 44 45 45.

(9) 6.. 7.. 8. 9.. 5.4.4 Cálculo de la eficiencia de remoción de sulfato 5.4.5 Cálculo de la concentración teórica de acetato en los reactores 5.4.6 Cálculo de la concentración de acetato consumido 5.4.7 Cálculo de las actividades específicas ASR y AME del lodo inóculo y de las biopelículas 5.4.8 Balance másico total de compuestos azufrados 5.4.9 Balance porcentual de remoción de substratos alimentados Resultados y discusión 6.1 Determinación de la actividad específica del inóculo de los reactores LFFD 6.2 Desempeño de los reactores LFFD 6.2.1 Desempeño del reactor RA 6.2.2 Desempeño del reactor RB 6.2.3 Desempeño del reactor RC 6.2.4 Desempeño del reactor RD 6.2.5 Consumo de substratos y balance másico total de azufre en los reactores LFFD 6.2.6 Comparación y discusión del desempeño de los reactores LFFD en fase de arranque 6.3 Desarrollo y desempeño de las biopelículas de los reactores LFFD 6.3.1 Perfiles de velocidad de producción de sulfuro por las biopelículas 6.3.2 Perfiles de biomasa adherida al soporte en los reactores LFFD 6.3.3 Actividades específicas de las biopelículas 6.4 Sólidos volátiles inmovilizados al final de la operación de los reactores LFFD 6.5 Discusión integrante del comportamiento de los reactores LFFD operados y sus respectivas biopelículas 6.6 Análisis de la comunidad microbiana 6.6.1 Concentración de ADN de los inóculos, de las biopelículas y de los líquidos de reactor 6.6.2 Perfiles de DGGE Conclusiones y Perspectivas 7.1 Conclusiones 7.2 Perspectivas Referencias bibliográficas Anexos ix. 46 46 47 47 48 48. 52 53 55 57 59 60 63 67 74 75 77 79 81 84 86 86 89 107 108 111 123.

(10) Índice de tablas. Tabla 2.1. Reacciones involucradas en la degradación anaerobia de materia orgánica.. Tabla 2.2. 4. Propiedades de algunas BSR identificadas que crecen a temperatura ambiente. Tabla 2.3. Influencia de la relación. 11 DQO/SO42-. en el proceso de. sulfato-reducción. Tabla 5.1. 20. Composición del medio basal de alimentación de los reactores UASB y LFFD.. 28. Tabla 5.2. Composición del medio basal para determinar la AME.. 28. Tabla 5.3. Composición del medio basal para determinar la ASR.. 28. Tabla 5.4. Composición de la solución de oligoelementos.. 29. Tabla 5.5. Condiciones de operación de los reactores LFFD para evaluar la influencia de la relación DQO/SO42- y del TRH durante el arranque.. 30. Tabla 5.6. Mezcla de reacción para la PCR.. 36. Tabla 6.1. Balance másico total de compuestos azufrados en los 66. reactores LFDD. Tabla 6.2. Desempeño promedio de los reactores LFFD en el periodo pseudo-estable de su fase de arranque.. Tabla 6.3. 67. Actividades sulfato-reductoras específicas (g DQO-H2S/g SSV-d) del inóculo y de las biopelículas al final de la operación de los reactores LFFD.. Tabla 6.4. 80. Actividades metanogénicas específicas (g DQO-CH4/g SSV-d) del inóculo y de las biopelículas al inicio y al final de la operación de los reactores LFFD con acetato como substrato.. 80 x.

(11) Tabla 6.5. Concentración de ADN de los productos de PCR.. Tabla 6.6. Afiliación. taxonómica. de. las. secuencias. 88 del. gen. bacteriano ARNr 16S de las bandas cortadas del gel de DGGE de los reactores RA y RB. Tabla 6.7. Afiliación. taxonómica. de. las. 93 secuencias. del. gen. bacteriano ARNr 16S de las bandas cortadas del gel de 94. DGGE del reactor RC. Tabla 6.8. Afiliación. taxonómica. de. las. secuencias. del. gen. bacteriano ARNr 16S de las bandas cortadas del gel de 95. DGGE del reactor RD.. xi.

(12) Índice de figuras. Figura 2.1. Diagrama general de digestión anaerobia de la materia orgánica.. 3. Figura 2.2. Etapas del ciclo biológico del azufre.. 6. Figura 2.3. Distribución de especies de sulfuro en función del pH.. Figura 5.1. Diagrama del reactor de lecho de lodo anaerobio de flujo. 13. ascendente (UASB). Figura 5.2. Diagrama. del. 26. reactor. de. lecho. fluidificado. de. flujo. descendente (LFFD). Figura 6.1. 27. Caracterización del inóculo. ASR (g DQO-H2S / g SSV-d) y AME (g DQO-CH4 / g SSV-d) antes de inocular el reactor UASB; y al día 50: inóculo para los reactores LFFD.. Figura 6.2. 52. Concentración de sólidos suspendidos volátiles en el efluente (■) de los reactores LFFD; a) RA, b) RB, c) RC y d) RD.. Figura 6.3. 54. Desempeño del reactor RA. a) Perfil de concentración de sulfuro disuelto (◊), porcentaje de eficiencia de remoción de sulfato (∆) y porcentaje de eficiencia de remoción de DQO (□); b) Perfil de concentración de alcalinidad de bicarbonato (o), alcalinidad total (●), pH en el afluente (x) y pH en el efluente (-).. Figura 6.4. 55. Desempeño del reactor RB. a) Perfil de concentración de sulfuro disuelto (◊), porcentaje de eficiencia de remoción de sulfato (∆) y porcentaje de eficiencia de remoción de DQO (□); b) Perfil de concentración de alcalinidad de bicarbonato (o), alcalinidad total (●), pH en el afluente (x) y pH en el efluente (-).. Figura 6.5. 57. Desempeño del reactor RC. a) Perfil de concentración de xii.

(13) sulfuro disuelto (◊), porcentaje de eficiencia de remoción de sulfato (∆) y porcentaje de eficiencia de remoción de DQO (□); b) Perfil de concentración de alcalinidad de bicarbonato (o), alcalinidad total (●), pH en el afluente (x) y pH en el efluente (-). Figura 6.6. 59. Desempeño del reactor RD. a) Perfil de concentración de sulfuro disuelto (◊), porcentaje de eficiencia de remoción de sulfato (∆) y porcentaje de eficiencia de remoción de DQO (□); b) Perfil de concentración de alcalinidad de bicarbonato (o), alcalinidad total (●), pH en el afluente (x) y pH en el efluente (-).. Figura 6.7. 61. Porcentaje de DQO consumida y fracción de DQO consumida vía sulfato-reducción (SR) u otros procesos metabólicos en cada uno de los reactores LFFD.. Figura 6.8. Velocidad. de. producción. de. sulfuro. (mg. 63 H2S/L-d). cuantificada en el inóculo (tiempo 0) y en las biopelículas formadas a diferentes días de operación de los reactores, y la concentración de sólidos inmovilizados (SVI/Ls) (■) en los reactores RA (a), RB (b), RC (c), RD (d). Figura 6.9. 75. Cantidad de sólidos volátiles inmovilizados sobre el soporte (g SVI/Ls) por los cuatro reactores LFFD al día final de su operación.. Figura 6.10. 82. Geles de agarosa de los productos de PCR de las muestras de. inóculos,. biopelículas. y. líquidos. de. reactor.. La. identificación de las muestras es la siguiente: C+: control positivo de PCR; C-: control negativo de PCR; I1: inóculo de RA y RB; I2: inóculo de RC y RD. L: líquido de reactor; B: biopelícula. El primer número después la letra indica el reactor (1=RA, 2=RB, etc.), el segundo número indica el día en que se tomó la muestra a partir de la inoculación: 0 = 0 xiii.

(14) días, 1 = 7 días, 2 = 14 días, 3 = 21 días, 4 = 28 días, 5 = 35 87. días. Figura 6.11. Perfil de DGGE del gen ARNr 16s de los reactores LFFD RA y RB. La identificación de las muestras es la siguiente: I1: inóculo de RA y RB; L: líquido de reactor; B: biopelícula. El primer número después de la letra indica el reactor (1=RA, 2=RB); el segundo indica el día en que se tomó la muestra: 0 = 0 días, 1 = 7 días, 2 = 14 días, 3 = 21 días, 4 = 28 días, 5 = 35 días. Los códigos en las bandas indican las bandas que se cortaron. El asterisco indica las bandas que se lograron secuenciar.. Figura 6.12. 90. Perfil de DGGE del gen ARNr 16s del reactor LFFD RC. La identificación de las muestras es la siguiente: I1: inóculo de RA y RB; L: líquido de reactor; B: biopelícula. El primer número después de la letra indica el reactor (1=RA, 2=RB); el segundo indica el día en que se tomó la muestra: 0 = 0 días, 1 = 7 días, 2 = 14 días, 3 = 21 días, 4 = 28 días, 5 = 35 días. Los códigos en las bandas indican las bandas que se cortaron. El asterisco indica las bandas que se lograron 91. secuenciar. Figura 6.13. Perfil de DGGE del gen ARNr 16s del reactor LFFD RC. La identificación de las muestras es la siguiente: I1: inóculo de RA y RB; L: líquido de reactor; B: biopelícula. El primer número después de la letra indica el reactor (1=RA, 2=RB); el segundo indica el día en que se tomó la muestra: 0 = 0 días, 1 = 7 días, 2 = 14 días, 3 = 21 días, 4 = 28 días, 5 = 35 días. Los códigos en las bandas indican las bandas que se cortaron. El asterisco indica las bandas que se lograron secuenciar.. 92. xiv.

(15) Índice de ecuaciones. Ecuación 2.1. Ecuación general del proceso de sulfato-reducción.. 5. Ecuación 2.2. Ecuación media de reducción de sulfato.. 5. Ecuación 2.3. Formación del sulfuro de hidrógeno.. 5. Ecuación 2.4. Precipitación de sulfuros metálicos.. 5. Ecuación 2.5. Formación de dióxido de carbono.. 6. Ecuación 2.6. Disolución de dióxido de carbono en medio acuoso.. 6. Ecuación 2.7. Producción de ácido carbónico.. 6. Ecuación 2.8. Primera disociación del ácido carbónico.. 6. Ecuación 2.9. Segunda disociación del ácido carbónico.. 6. Ecuación 2.10. Relación DQO/sulfato.. 7. Ecuación 2.11. Primera disociación del sulfuro de hidrógeno.. 13. Ecuación 2.12. Segunda disociación del sulfuro de hidrógeno.. 13. Ecuación 5.1. Cuantificación de la alcalinidad total.. 42. Ecuación 5.2. Cuantificación de la alcalinidad por bicarbonato.. 42. Ecuación 5.3. Eficiencia de remoción de DQO.. 45. Ecuación 5.4. Concentración de DQO removida por BSR.. 45. Ecuación 5.5. Concentración de DQO removida por bacterias no sulfato-reductoras.. 45. Ecuación 5.6. Eficiencia de remoción de sulfato.. 46. Ecuación 5.7. Concentración teórica de acetato en los reactores.. 46. Ecuación 5.8. Concentración de acetato producido en los reactores de la oxidación incompleta de lactato.. 46. Ecuación 5.9. Concentración de acetato consumido.. 47. Ecuación 5.10. Actividad sulfato-reductora específica.. 47. Ecuación 5.11. Actividad metanogénica específica.. 47. Ecuación 5.12. Mili-equivalentes electrónicos donados por la oxidación incompleta de lactato. xv. 49.

(16) Ecuación 5.13. Mili-equivalentes electrónicos aceptados por el sulfato. 50. reducido. Ecuación 5.14. Mili-equivalentes electrónicos donados por acetato.. Ecuación 5.15. Mili-equivalentes electrónicos donados por la DQO consumida. Ecuación 5.16. 50. 50. Mili-equivalentes electrónicos aceptados por otros procesos metabólicos.. 50. Ecuación 5.17. Porcentaje de DQO consumida vía sulfato-reducción.. 51. Ecuación 5.18. Porcentaje de DQO consumida vía otros procesos metabólicos.. Ecuación 5.19. 51. Porcentaje de DQO como lactato consumida vía 51. sulfato-reducción. Ecuación 5.20. Porcentaje de DQO como acetato consumida vía sulfato-reducción.. 51. xvi.

(17) Anexos Anexo 1. Soluciones empleadas en el análisis molecular. 123. Anexo 2. Fundamento de la determinación de alcalinidad. 125. Anexo 3. Concentración de sulfuro en fase gaseosa. 127. Anexo 4. Análisis estadístico del desempeño de los reactores LFFD. 128. Anexo 5. Imágenes de los reactores UASB y LFDD empleados. 131. Anexo 6. Productos científicos. 132. xvii.

(18) Lista de abreviaturas ADN AGV. Ácido desoxirribunocleico Ácidos grasos volátiles (acetato, propionato y butirato). AME. Actividad metanogénica. ARNr 16s. Subunidad 16s del ácido ribonucleico ribosomal. ASR. Actividad sulfato-reductora. ATE. Aceptores terminales de electrones. BESA. Ácido 2-bromoetanosulfónico.. BSR. Bacterias sulfato-reductoras. CH4. Metano. CH2O. Materia orgánica. CO2. Dióxido de carbono. CoA. Coenzima A. CSTR. Continuos stirred tank reactor (Reactor completamente mezclado) Drenaje ácido de mina. DAM DGGE DQO. Denaturing gradient gel electrophoresis (Electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante) Demanda química de oxígeno. DQO/SO42-. Relación demanda química de oxígeno/sulfato (g/g). EPS. Exopolisacáridos. ER. Eficiencia de remoción. fs. Fracción de electrones a síntesis de biomasa. H2S. Sulfuro. Ka. Constante de disociación ácida. Ks. Constante de afinidad al substrato. LFFD. Lecho fluidificado de flujo descendente. PBS. Phosphate buffered saline (Buffer de fosfatos salino). PCR. Polymerase chain reaction (Reacción en cadena de la polimerasa) xviii.

(19) pKa. Logaritmo negativo de la constante de disociación de un ácido.. PVP-CTAB rpm. Polyvinylpyrollidine - Cetyltrimethyl-ammonium bromide (Poli vinil pilorridona-bromuro de cetiltrimetil amonio) Revoluciones por minuto. SO32-. Sulfito. S2O32-. Tiosulfato. SO42-. Sulfato. SR. Sulfato-reducción. SSV. Sólidos suspendidos volátiles. SST. Sólidos suspendidos totales. STI. Sólidos totales inmovilizados. SVI. Sólidos volátiles inmovilizados. TRH. Tiempo de residencia hidráulico. UASB. Upflow Anaerobic Sludge Blanket (Reactor de lecho anaerobio de flujo ascendente) Rendimiento celular; masa celular seca por mol de substrato disponible.. Yx. xix.

(20) Piña Salazar Elda Zoraida (2010). Desarrollo de biopelículas en un reactor de lecho fluidificado de flujo descendente a diferente relación DQO/sulfato y tiempo de residencia hidráulico. Tesis de Maestría. Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica. San Luis Potosí, México. Palabras clave: acetato, biomasa inmovilizada, actividad sulfato-reductora, sulfuro.. Resumen Un contaminante potencial en agua es el sulfato (SO42-), el cual se descarga principalmente al ambiente en efluentes industriales. El SO42- puede ser reducido a sulfuro mediante sulfato-reducción (SR) biológica. El sulfuro es un marcador de contaminación del agua. El principal metabolito producido de la SR es el acetato, lo que implica presencia de materia orgánica en el efluente de los reactores de tratamiento por lo que se traduce en baja eficiencia de remoción de materia orgánica (DQO). La eficiencia de remoción de SO42- incrementa al aumentar la relación DQO/SO42-; la operación del reactor a tiempos de residencia hidráulica (TRH) altos mejora la remoción de DQO al permitir el desarrollo de microorganismos con tiempos de duplicación mayores que consumen la DQO remanente. Los reactores de biopelícula como el reactor de lecho fluidificado de flujo descendente (LFFD) son una alternativa eficaz para la SR; sin embargo, su fase de arranque constituye un paso crucial en el desarrollo de la biopelícula, al seleccionar y aclimatar la biomasa que formará la comunidad microbiana capaz de sobrevivir bajo las condiciones operacionales del reactor para lograr la remoción completa de DQO y SO42-. El objetivo de este trabajo fue estudiar la influencia de la relación DQO/SO42- y del TRH en el desarrollo de una biopelícula en la fase de arranque (35 días) de un reactor LFFD sin operarlo en lote por periodos prolongados (>40 d). Cada reactor fue inoculado con 1.6 g SSV/L de lodo granular; se utilizó polietileno de baja densidad como material de soporte; la alimentación consistió en medio mineral a pH 5.5 con 1 g DQO/L de acetato-lactato (70%:30%) y sulfato de sodio. Se llevaron a cabo 4 experimentos en continuo a temperatura ambiente bajo diferentes valores de TRH y DQO/SO42-: 1 día y 0.67 (RA), 1 día y 2.5 (RB), 2 días y 0.67 (RC), ó 2 días y 2.5 (RD). El inóculo se mantuvo activo bajo condiciones de SR en un reactor UASB, las actividades sulfato-reductora (ASR) y metanogénica (AME) fueron de 0.02 a 0.30 g DQO-H2S/g SSV-d y 0.08 g DQO-CH4/g SSV-d, respectivamente. En el periodo pseudo-estable (últimos 7 días) de operación de los reactores RA, RB, RC y RD, la producción de sulfuro fue de 47.9, 55.2, 72.8 y 83.2 mg H2S/L; las eficiencias de remoción de SO42- fueron de 9.8, 43.1, 22.4 y 66.1% y las eficiencias de remoción de DQO fueron 33.4, 35.6, 71.6 y 69.8%, respectivamente. En los cuatro experimentos hubo consumo de lactato y acetato por bacterias sulfato-reductoras (BSR), sin embargo, en los reactores operados a TRH de 2 días (RC y RD) fue mayor el consumo de substratos por BSR y por otros microorganismos. La cantidad de biomasa inmovilizada fue mayor en RA (1.9 g SSV/Ls) y menor en RD (0.9 g SSV/Ls) y las ASR fueron mayores en RA y RB. La comunidad microbiana en las biopelículas fue diferente a la del inóculo; los microorganismos identificados en RA y RB fueron BSR principalmente, entre ellos Desulfovibrio, mientras que en RC y RD se formó una comunidad microbiana más heterogénea compuesta por BSR y géneros como Clostridium y Chloroflexi. Este trabajo mostró la formación de una biopelícula en un LFFD en 35 días y la influencia de la relación TRH y DQO/SO42- en el desempeño del reactor, composición microbiana y actividad de la biopelícula. La producción de sulfuro y remoción de SO42- aumentó al incrementar la relación DQO/SO42- y la remoción de DQO mejoró al aumentar el TRH. Además se demostró que la biomasa planctónica tiene una contribución importante en el desempeño del reactor. xx.

(21) Piña Salazar Elda Zoraida (2010). Biofilm development in a down-flow fluidized bed reactor at different COD/sulfate ratio and hydraulic residence time. Tesis de Maestría. Instituto Potosino de Investigación Científica y tecnológica. San Luis Potosí, México. Key words: acetate, immobilized biomass, sulfate-reducing activity, sulfide.. Abstract Sulfate (SO42-) is a potential pollutant of water; it is discharged to the environment in several industrial effluents. Sulfate can be reduced to sulfide through the biological sulfate reduction (SR) process. Sulfide is a marker of pollution in water. The main metabolite produced of SR is acetate, which implies the presence of organic matter in the effluent treatment reactors which produces low organic matter removal efficiency expressed as chemical oxygen demand (COD). Sulfate removal efficiency increases when the COD/SO42- ratio is increased; the high hydraulic residence time (HRT) increases COD removal efficiency allowing the development of microorganisms with higher duplication time which consume remaining COD. Biofilm reactors as the down-flow fluidized bed reactor (DFFBR) are an effective alternative to carry out SR. However its start-up phase constitutes a crucial step in the biofilm development, selecting and acclimatizing the biomass that will compose the microbial community and will be able to survive under the operational conditions of the reactor, to achieve complete COD and sulfate removal. The aim of this work was to study the influence of DQO/SO42- ratio and HRT in the development of a biofilm during the start-up (35 days) of a DFFBR without being operated in batch for a long period (> 40 d). Each reactor was inoculated with 1.6 g VSS/L of granular sludge, grinded low density polyethylene was used as support material. The feed consisted of mineral medium at pH 5.5 with 1g COD/L (acetate-lactate, 70:30) and sodium sulfate. Four experiments were conducted in continuous regime at room temperature under different HRT and COD/SO42-: 1 day and 0.67 (RA), 1 day and 2.5 (RB), 2 days and 0.67 (RC) or 2 days and 2.5 (RD). Before inocultion, the inoculum was maintained under sulfate-reducing conditions in a UASB reactor, the sulfate-reducing activity (SRA) was between 0.02 and 0.30 g COD-H2S/g VSS-d and the methanogenic activity (MA) was 0.08 g COD-CH4/g VSS-d. In the pseudo-stable period (last 7 days) of the start-up of reactors sulfide production was 47.9, 55.2, 72.8 and 83.2 mg H2S/L; sulfate removal efficiencies were 9.8, 43.1, 22.4 and 66.1%, and COD removal efficiencies were 33.4, 35.6, 71.6 and 69.8% in RA, RB, RC y RD, respectively. Lactate and acetate were consumed in the four reactors by sulfate-reducing bacteria (SRB). However, substrate consumption by SRB and other microorganisms was higher in the reactors operated at 2 days (RC and RD). The immobilized biomass was higher in RA (1.9 g VSS/Ls) and lower in RD (0.9 g VSS/Ls) and SRA was higher in RA and RB. Microbial community established in the reactors was different than the inoculum microbial community; SRB from the genera Desulfovibrio were identified mainly in RA and RB, while a more heterogeneous microbial community composed by SRB, Clostridium and Chloroflexi was established in RC and RD. This work demonstrated biofilm formation in a DFFBR in 35 days and the influence of HRT and COD/SO42- ratio in the reactor performance, microbial composition and biofilm activity. Sulfide production and sulfate removal increased when COD/SO42- ratio was increased, and COD removal efficiency increased when HRT was increased. Moreover it was demonstrated that planktonic biomass contributes in great extent to the performance of the reactor. xxi.

(22) 1 INTRODUCCIÓN Un contaminante potencial es el sulfato, el cual puede ser reducido a sulfuro (marcador de la contaminación del agua)| mediante el proceso de sulfatoreducción biológica (Lettinga, 1998). Las aguas residuales que contienen sulfato y materia orgánica son generadas por muchos procesos industriales tales como la agroindustria, la industria papelera, la industria de alimentos, la industria textil, la industria electrónica, la industria fotográfica, la tenería, la minería, entre otras (Hulshoff Pol et al., 1998). Aunado a la presencia de sulfato, es posible encontrar en las aguas residuales otras formas menos oxidadas del azufre tales como tiosulfato (S2O32-), sulfito (SO32-) o sulfuro de hidrógeno (H2S), lo que condiciona la necesidad de tratamiento de estas aguas (Liamleam y Annachhatre, 2007). Se han encontrado concentraciones de sulfato de hasta 200 mg/L en efluentes agroindustriales o mayores a 1000 mg/L en efluentes de industrias papeleras o de fermentación (Hulshoff Pol et al., 1998). La industria minera, por su parte, genera efluentes ácidos con alta cantidad de sulfato y baja cantidad de materia orgánica expresada como demanda química de oxígeno (DQO). A este tipo de efluente se le conoce como drenaje ácido de mina (DAM), el cual constituye un problema severo de contaminación. Al respecto, Maree y Strydon (1985) reportaron aguas residuales de minas con cerca de 1980 mg/L de sulfato, 100 mg/L de DQO y presencia de algunos metales, mientras que Neculita et al. (2007) encontraron concentraciones de DQO menores a 10 mg/L en este tipo de efluentes. Para los efluentes con bajo contenido de DQO y metales en solución, la sulfato-reducción se considera una alternativa viable de bio-tratamiento que permite la remoción de metales presentes en el agua, remoción de sulfato y producción de bajas cantidades de lodo residual (Kaksonen et al., 2003a), sin embargo, este proceso requiere la adición externa de donadores de electrones ó materia orgánica (Hulshoff Pol et al., 1998; Kolmert y Johnson, 2001; Liamleam y Annachhatre, 2007; Bayrakdar et al., 2009). La sulfato-reducción forma parte de la digestión anaerobia y es llevada a cabo por los microorganismos conocidos como bacterias sulfato-reductoras 1.

(23) (BSR). Este proceso se ha estudiado a nivel laboratorio en diferentes configuraciones de reactores como los reactores de tanque agitado (CSTR), reactores de lecho de lodo (UASB) y reactores de lecho fluidificado de flujo descendente (LFFD). El reactor LFFD es un reactor de biopelícula, es decir, la remoción de contaminantes es llevada a cabo por la comunidad microbiana establecida sobre un material de soporte inerte, lo que permite retener durante largos periodos de tiempo la biomasa en el reactor y por consecuencia una biopelícula estable y activa, y eficiencias altas de remoción de contaminantes (Celis-García et al., 2004). De acuerdo con investigaciones recientes, aunque el sulfato sea removido con altas eficiencias en un reactor LFFD sulfato-reductor, la baja remoción de materia orgánica constituye un problema que debe resolverse, debido a que la oxidación incompleta de substrato genera acetato en el efluente y éste al estar presente a altas concentraciones y pH bajo puede llegar a ser inhibitorio de la actividad metabólica de la biopelícula formada (Reis et al., 1990; Nagpal et al., 2000; Kaksonen et al., 2003a,b; Celis-García et al., 2007; Sahinkaya et al., 2007). La presente investigación aborda esta problemática en busca de las condiciones de arranque que pueden favorecer una biopelícula que sea capaz de llevar a cabo con eficiencia el proceso de sulfato-reducción a pH ácido con remoción eficiente de materia orgánica. Dicho proceso sería potencialmente aplicado al tratamiento de DAM. Para ello, la estrategia utilizada fue la aplicación de condiciones para la selección de BSR en la biopelícula con base en los parámetros operacionales del reactor, como son la relación DQO/SO42- y el tiempo de residencia hidráulico (TRH), de tal manera que se logre el desarrollo y actividad eficiente de la biopelícula en la remoción de sulfato y DQO.. 2.

(24) 2 ANTECEDENTES 2.1 Digestión anaerobia La digestión anaerobia consiste en la transformación de la materia orgánica en biogás mediante la acción de varios grupos de microorganismos. Las etapas de la. digestión. anaerobia. son:. hidrólisis,. acidogénesis,. acetogénesis. y. metanogénesis. El proceso de sulfato-reducción forma parte del esquema general de la digestión anaerobia en presencia de sulfato (Fig. 2.1), por lo que es un proceso inherente a otras etapas de la digestión anaerobia (Visser, 1995), las cuales se describen brevemente a continuación: a. Hidrólisis: Conversión de moléculas complejas (proteínas, polisacáridos y lípidos) a compuestos más simples (aminoácidos, azúcares y ácidos grasos de cadena corta) por la acción de bacterias hidrolíticas. b. Acidogénesis o fermentación: Degradación de los productos de hidrólisis a compuestos como alcoholes, ácidos grasos volátiles (AGV) como lactato, butirato, propionato y acetato, así como hidrógeno y dióxido de carbono. c. Acetogénesis: Generación de acetato e hidrógeno a partir de AGV. d. Metanogénesis: Generación de metano, ya sea a partir de acetato o a partir de hidrógeno y dióxido de carbono.. Figura 2.1 Diagrama general de digestión anaerobia de la materia orgánica (Gibson 1990; Lens et al., 2000). Las líneas punteadas indican que el proceso sólo se lleva a cabo en presencia de sulfato. 3.

(25) La tabla 2.1 muestra las principales reacciones involucradas en la digestión anaerobia, las cuales son llevadas a cabo por microorganismos fermentativos, acetogénicos, metanogénicos y en ocasiones sulfato-reductores.. Tabla 2.1 Reacciones involucradas en la degradación anaerobia de materia orgánica en sistemas anaerobios (Tahuer et al., 1977; Gibson 1990; Oude Elferink et al., 1994). ∆G° (KJ/mol). Reacciones Reacciones fermentativas 3CH3CHOHCOO- → CH3COO- + 2CH3CH2COO- + HCO3- + H+. -124.99. CH3CH2OH + HCO3- + H2 → CH3CH2COO- + 2H2O. -66.84. 3CH3CH2OH +. 2HCO3-. -. -. +. → CH3COO + 2CH3CH2COO + H + 3H2O -. +276.93. -. CH3CH2OH + CH3COO → CH3CH2CH2COO + H2O. -38.6. CH3COO- + HCO3- + H+ + 3H2 → CH3CH2COO- + 3H2O. -116.35. Reacciones acetogénicas CH3CH2COO- + 2H2O → CH3COO- + HCO3- + H+ + 2H2O. -4.2. CH3CH2OH + H2O → CH3COO- + H+ + 2H2. +9.6. Reacciones metanogénicas 4H2 + HCO3- + H+ → CH4 + 3H2O -. CH3COO + 2H2O →. -135.6. CH4 + HCO3-. -31.0. Reacciones sulfato-reductoras CH3COO- + SO42- → 2HCO3- + HS-. -47.6. 2-. -. CH3CH2COO + 3/4SO4 → CH3COO +. HCO3- + 3/4HS-. + 1/4H. +. -37.7. CH3CH2CH2COO- + 1/2SO42- → 2 CH3COO- + 1/2HS- + 1/2H+ -. CH3CHOHCOO + CH3CH2OH +. 1/2SO42-. 1/2SO42-. -. → CH3COO + -. → CH3COO +. HCO3- + 1/2HS-. HCO3-. -. -27.8 +. -80.0. +. -66.4. +H. + 1/2HS + 1/2H + H2O. 4H2 + SO42- + H- → HS- + 4H2O -. -151.1 -. -. CH3COO : acetato; CH3CH2COO : propionato; CH3CH2CH2COO : CH3CHOHCOO-: lactato; CH3CH2OH: etanol; H2: hidrógeno. 4. butirato.

(26) 2.1.1 Proceso biológico de sulfato-reducción La sulfato-reducción biológica es el proceso por el cual el sulfato se reduce a sulfuro mediante la disminución del estado de oxidación del azufre desde S6+ hasta S2-, lo que se logra al transferir 8 electrones por átomo de azufre. Mientras que el sulfato se reduce a sulfuro, la materia orgánica (CH2O) dona electrones para oxidarse a compuestos como acetato (CH3COO-) ó dióxido de carbono (CO2) (Ec. 2.1). 2(CH2O) + SO42- → 2HCO3- + H2S. (Ec. 2.1). Según Liamlean y Annachhatre (2007) el sulfuro puede encontrarse como sulfuro (S2-) o como sulfuro de hidrógeno (H2S) en el caso de que se combine con hidrógeno del medio (Ec. 2.2 y 2.3, respectivamente), lo cual está condicionado por el valor de pH del medio en el que se encuentre, tal como se expresara más adelante. 8H+ + 8e- + SO42- → S2- + 4H2O. (Ec. 2.2). S2- + 2H+ → H2S. (Ec. 2.3). El sulfuro de hidrógeno formado puede utilizarse para la precipitación de metales (Ec. 2.4). Los sulfuros metálicos insolubles producto de la precipitación de metales deben separarse de las corrientes acuosas para procesarlos posteriormente recuperando los metales removidos (Lens y Kuenen, 2001). H2S + M2+ → MS (s) + 2H+. (Ec. 2.4). donde: M2+ = Fe2+, Cu2+, Mg2+, Pb2+, Zn2+, étc.. 5.

(27) La sulfato-reducción forma parte del ciclo biológico del azufre (Figura 2.2) y se lleva a cabo en la zona reductiva no asimilativa del mismo. Las principales etapas de este ciclo son: 1) reducción asimilativa de sulfato, 2) mineralización, 3) oxidación de sulfuro, 4) reducción no asimilativa de azufre, y 5) reducción no asimilativa de sulfato o sulfato-reducción. Esta última es llevada a cabo por las bacterias sulfato-reductoras (Visser, 1995).. Figura 2.2 Etapas del ciclo biológico del azufre (Visser, 1995).. La oxidación microbiana de la materia orgánica o mineralización produce alcalinidad (bicarbonato) (Ec. 2.1) a partir de dióxido de carbono que en medio acuoso genera ácido carbónico. A partir del ácido carbónico se genera el bicarbonato (Ec. 2.5 a Ec. 2.9). HCO3- + H+ → CO2 (g) + H2O. (Ec. 2.5). CO2 (g) → CO2 (ac). (Ec. 2.6). CO2 (ac) + H2O → H2CO3. (Ec. 2.7). H2CO3 ↔. HCO3-. (Ec. 2.8). HCO3-. +. +. +H. +. +H ↔H +. CO32-. (Ec. 2.9). Si la materia orgánica (CH2O) es oxidada mediante sulfato-reducción, la eficiencia del proceso estará influenciada por la proporción de sulfato y materia orgánica en el agua a tratar, es decir, la relación DQO/SO42-. La reducción de 6.

(28) sulfato, entonces, está condicionada a la presencia de una mínima cantidad teórica de materia orgánica expresada como DQO. Como se presentó en la ecuación 2.2, para que se reduzca un mol de sulfato (96 g) se necesitan 8 equivalentes de electrones (e-); de acuerdo con Rittmann y McCarty (2001) 8 g de DQO pueden donar 1 equivalente de electrones (e-). De lo anterior se puede calcular que por cada 64 g de DQO se pueden reducir 96 g de SO42- y la relación DQO/SO42- teórica sería 0.67 (Ec. 2.10), o expresado de otra manera, 1 mg de sulfato puede oxidar 0.66 mg DQO (Speece, 1996).. DQO 64 g = = 0.67 SO42 − 96 g. (Ec. 2.10). En el proceso de sulfato-reducción se pueden usar como donadores de electrones el acetato y el hidrógeno molecular (acetato mediante BSR acetotróficas e hidrógeno por BSR autotróficas), mismos que son consumidos por microorganismos metanogénicos, lo cual propicia la competencia entre las BSR y los metanóegenos por estos substratos. De igual manera, las BSR compiten con las bacterias acetogénicas por propionato en presencia de sulfato como aceptor de electrones. Lo anterior da lugar a una competencia entre los grupos bacterianos involucrados en la digestión anaerobia (Widdel, 1988; Visser, 1995; Omil et al., 1998). Sin embargo, en ausencia de sulfato las BSR pueden obtener energía de la fermentación de materia orgánica (Lens y Kuenen, 2001). De acuerdo con Maillacheruvu y Parkin (1996), existen dos puntos clave a considerar en la subsistencia de una población microbiana en sistemas con materia orgánica compleja: la competencia entre las BSR, microorganismos metanogénicos y microorganismos fermentadores por el donador de electrones, y la inhibición bacteriana por el sulfuro generado como producto de la sulfatoreducción. La presencia de sulfato en las aguas residuales aumenta considerablemente la complejidad de las rutas de degradación de materia orgánica. (Widdel,. 1998),. al. generar 7. competencia. entre. las. bacterias.

(29) acidogénicas, acetogénicas y metanogénicas con las BSR por los substratos disponibles (Lens y Kuenen, 2001). Al considerar las rutas metabólicas desde el punto de vista cinético; afinidad a substrato y tasa de crecimiento específica bacteriana (Ks y µmáx, respectivamente), y termodinámico, las BSR pueden competir por los mismos substratos con los microorganismos metanogénicos (Lettinga et al., 1998); por ejemplo, para el caso del acetato, la Ks de los microorganismos metanogénicos es alrededor de 32.8 mg acetato/L mientras que la de las BSR es de 9.3 mg acetato/L (Rittmann y McCarty, 2001), por lo cual, la sulfato-reducción será el proceso dominante en reactores anaerobios que tratan aguas residuales con cantidades altas (entre 1000 y 5000 mg/L) o no limitantes de sulfato (Ward y Winfrey, 1985; Widdel, 1988; Lens et al., 2000; Velasco et al., 2008). Al respecto, Velasco et al. (2008) logró 98% de remoción de sulfato al operar un reactor UASB a una relación DQO/SO42- de 2.5 con una concentración de sulfato de 1.5 g/L, mientras que Hidalgo y García-Encina (2001) mencionan que el operar un reactor UASB a concentraciones de sulfato entre 2.0 y 4.0 g/L permite el desarrollo satisfactorio de la sulfato-reducción. Por su parte, la metanogénesis predomina en ambientes con baja concentración de sulfato, menos de 25 mg/L (Stams, 1994; Hidalgo y García-Encina, 2001).. 2.1.2 Bacterias sulfato-reductoras Las. bacterias. sulfato-reductoras. son. microorganismos. que. requieren. condiciones anaerobias y potencial redox de -200 mV para realizar sus funciones. metabólicas. (Church. et. al.,. 2007).. Algunas. pueden. tolerar. concentraciones de O2 (de aproximadamente 15 µM) y reducirlo por un periodo de tiempo limitado (Lens y Kuenen, 2001; Dolla et al., 2006) u ocasionalmente crecer con SO32- o S2O32- como aceptores de electrones. Otros aceptores de electrones utilizados por las BSR, aunque en menor medida son azufre elemental (S0) o nitrato (NO3-) para producir H2S o NH3, fumarato, dimetilsulfóxido (DMSO), Mn (IV) y Fe (III) (Lens y Kuenen, 2001; Tahuer et al., 2007). Pueden crecer en presencia o ausencia de sulfato (agente oxidante o 8.

(30) aceptor de electrones) utilizando vías metabólicas diferentes, una fermentativa y otra oxidativa, ya sea de manera heterótrofa o autótrofa. Se ha identificado amplia biodiversidad microbiana de BSR en sedimentos marinos y ecosistemas acuáticos (Conell et al., 1984; Church et al., 2007), en plantas de tratamiento de agua residual, en DAM o en lagunas carbonatadas (Muyzer y Stams, 2008). Estas bacterias presentan morfología variada: estafilococos,. vibriones,. agregados. similares. a. sarcinas. y. filamentos. multicelulares. Existen dos procesos que soportan el crecimiento de las BSR. Éstos son la oxidación de materia orgánica (fosforilación a nivel substrato) y la reducción de sulfato (fosforilación de transporte de electrones) (Widdel, 1988). En general, los donadores de electrones para las BSR son los productos finales de la fermentación, tales como compuestos de bajo peso molecular o ácidos alifáticos dicarboxílicos, así como alcoholes y compuestos aromáticos polares e hidrocarburos. Las fuentes de carbono preferidas por las BSR son los compuestos de bajo peso molecular derivados de la degradación anaerobia de carbohidratos, proteínas y lípidos (Kaksonen et al., 2004b), aunque también pueden crecer en presencia de glucosa, fructosa, etanol e hidrógeno como substrato (Liamleam y Annachhatre, 2007). Las BSR se clasifican en dos grupos de acuerdo a su capacidad para oxidar substratos: a) BSR que generan acetato como producto final a partir de la oxidación incompleta de substrato (BSR-OI), muchas veces con la formación simultánea de CO2 (Rabus et al., 2006). Estos microorganismos carecen de un mecanismo enzimático para la utilización de acetato por lo que éste es el producto principal de la oxidación incompleta. Dentro de este grupo se encuentran los géneros Desulfovibrio,. Desulfomonas,. Desulfotomaculum,. Desulfobulbus. y. Thermodesulfobacterium (Madigan et al., 1997). b) BSR que oxidan completamente el substrato (BSR-OC) hasta CO2. Este tipo de microorganismos obtiene su energía directamente del acetato 9.

(31) mediante el ciclo del ácido cítrico modificado o por medio de la ruta de la Acetil CoA (Muyzer y Stams, 2008). A este grupo de bacterias pertenecen los géneros Desulfobacter, Desulfococcus, Desulfosarcina, Desulfonema y Desulfobacterium (Madigan et al., 1997). Se ha observado que las BSR-OI crecen sobre un número limitado de substratos tales como lactato, etanol, piruvato, propionato y malato. Por su parte, las BSR-OC se especializan en la oxidación de los AGV, en especial del acetato, aunque crecen también con etanol o piruvato como substratos, y sólo algunas pueden crecer autotróficamente en presencia de H2 y CO2 (Hao et al., 1996). La tabla 2.2 muestra algunas propiedades de varios géneros de BSR que pueden encontrarse en el intervalo de temperatura mesofílica. De acuerdo con Kaksonen et al. (2003b) y Celis et al. (2009), la oxidación de materia orgánica dentro del proceso de sulfato-reducción se lleva a cabo de manera incompleta mayoritariamente. Las BSR-OI se duplican más rápido que las BSR-OC; los tiempos de duplicación de las BSR-OI son de 3 a 10 horas y los de las BSR-OC son 16 a 20 horas (Oude Elferink et al., 1994). Las BSR-OC utilizan la mayor parte de la energía que obtienen para mantenimiento celular, y tan solo el 10% para síntesis celular, por lo que se observa bajo rendimiento celular (Yx). Por ejemplo, de acuerdo con Rittmann y McCarty (2001) el valor del rendimiento celular para las BSR con H2 como donador de electrones y CO2 como fuente de carbono es de 0.28 g SSV/g H2, mientras que el rendimiento celular de las BSR con acetato como donador de electrones y fuente de carbono es de 0.057 g SSV/g DQO; sin embargo, estos no son valores absolutos de rendimiento celular debido a que dependen de la especie bacteriana y del substrato disponible (Rabus et al., 2006). De manera general, los donadores de electrones que permiten cambios altos de energía libre y con mecanismos enzimáticos simples y comunes (H2, formato, etanol, lactato y malato) permiten crecimiento más rápido en comparación con los substratos complejos como los compuestos aromáticos o hidrocarburos (Rabus et al., 2006). 10.

(32) Tabla 2.2 Propiedades de algunas BSR identificadas que crecen a temperatura ambiente (Rabus et al., 2006; Tahuer et al., 2007).. Desulfobacter. Desulfococcus Desulfosarcina Desulfobacterium. Desulfonema. Acetato. Desulfomonas Desulfobulbus. Etanol. Desulfovibrio. Temperatura óptima de crecimiento °C orientis 37 ruminis 37 antarticum 20 – 30 acetooxidans 35 guttoideum 31 sapomandens 38 desulfuricans 30 – 36 vulgaris 30 – 36 gigas 30 – 36 africanus 30 – 36 salexigens 30 – 36 baculatus 28 – 37 sulfodismutans 30 – 35 sapovorans 34 pigra 37 propionicus 28 – 39 elongatus 35 postgatei 28 – 32 hydrogenophilus 28 – 32 latus 28 – 32 curvatus 28 – 30 multivorans 35 niacini 29 variabilis 33 autotrophicum 20 – 26 vacuolatum 25 – 30 phenolicum 28 indolicum 28 cathecolicum 28 limicola 30 magnum 32. Lactato. Desulfotomaculum. Especie. Hidrógeno. Género. Oxidación. Donadores de electrones. i i i c i c i i i i i i i i i i i c c c c c c c c c c c c c c. +* + nr + nr + + + + + (+) (+) +a + + +* (+) +* +* +* +* (+) +* -. + + + + + + + + + + + + + + + + + + + (+) + -. + + nr + ++ (+). + (+) + + + + (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+). a. (+) a. +a +a + + + (+) + + + + + (+) (+) (+) (+) -. c = completa, i = incompleta, + = utilizado, +* = crecimiento autotrófico, ( ) = pobremente utilizado, - = no utilizado, +a = datos no reportados.. 11.

(33) 2.1.2.1 Factores que condicionan el crecimiento y función de las BSR A continuación se presentan los factores fisicoquímicos involucrados en el crecimiento y actividad metabólica de las BSR.. 2.1.2.1.1 pH La mayoría de las BSR prefieren un ambiente de pH entre 7.5 y 8.0, su crecimiento es inhibido a valores de pH menores de 5.5 o mayores de 9.0 (Widdel y Hansen, 1992). Sin embargo, se ha reportado el proceso de sulfatoreducción a pH menores a 5.0 (Koschorreck, 2008), pH alrededor de 3.0 en sedimentos (Koschorreck et al., 2003), así como la operación de reactores sulfato-reductores a pH alrededor de 3.0 (Kaksonen et al., 2003a; Kimura et al., 2006; Jong y Parry, 2006), aunque la velocidad de reducción de sulfato se reduce conforme disminuye el pH.. 2.1.2.1.2 Temperatura La temperatura óptima para la mayoría de los cultivos puros de BSR es entre 28°C y 38°C y una temperatura límite más alta de 45 °C (Widdel y Hansen, 1992). La mayoría de las BSR termófilas presentan crecimiento óptimo entre 54°C y 70°C, su temperatura máxima de crecimiento e s de 56°C a 85°C, por ejemplo en los géneros Desulfotomaculum y Termodesulfobacterium. Las Archaea sulfato-reductoras del género Archaeoglobus tienen un crecimiento óptimo a 83°C y un máximo a 92°C (Rabus et al., 2006).. 2.1.2.1.3 Toxicidad por sulfuro El producto metabólico del proceso de sulfato-reducción (sulfuro) inhibe el crecimiento y actividad de las BSR, así como de otras bacterias (Rinzema y Lettinga, 1988; González-Silva, 2007). El sulfuro es un ácido diprótico que se disocia en solución dependiendo del equilibrio químico (Ec. 2.11 y 2.12) (Hulshoff Pol et al, 1995). La especiación en solución de dicho ácido se presenta en la figura 2.3. 12.

(34) H2S (l) → H+ + HS- pka1 = 6.97 (25°C) ó 6.9 (30°C) -. 2-. +. HS → S + H. pka2 = 12.9 (25°C). (Ec. 2.11) (Ec. 2.12). Figura 2.3 Distribución de especies de sulfuro en función del pH. Según el valor de pKa de la primera disociación, el sulfuro en solución está presente principalmente como sulfuro de hidrógeno (H2S) y bisulfuro (HS-). Se reconoce la existencia de permeabilidad de membrana sólo a H2S, por lo que el mecanismo de toxicidad por sulfuro más aceptado es que el H2S no disociado es el agente que genera toxicidad celular, debido a que dentro de las células este compuesto reacciona con los componentes celulares formando puentes sulfuro o bisulfuro de las cadenas polipeptídicas, lo que inhibe la actividad bacteriana (Oude Elferinck et al., 1994). Otro mecanismo propuesto es la combinación de algunas de las especies de sulfuro (H2S, HS- y S-2) con sitios activos de las enzimas como el ion Fe2+ de la ferrodoxina, citocromos y de otros componentes esenciales en la célula, lo que causa que los sistemas de transporte de electrones cesen su actividad (Okabe et al., 1992). El sulfuro puede también afectar el pH intracelular (Hulshoff Pol et al., 1998) o precipitar metales esenciales para el crecimiento bacteriano que se encuentren presentes en el medio, de tal modo que reduce su biodisponibilidad (Isa et al., 1986). De acuerdo con la distribución de especies de sulfuro en función del pH, así como la toxicidad de éstas, el intervalo de pH óptimo para la sulfato-reducción es 13.

(35) alrededor de 7.0, debido a que existe un equilibrio entre la forma disociada y no disociada del sulfuro (especie tóxica) que permite la presencia y actividad de BSR, y no estaría favorecido el predominio de la especie tóxica en el medio (Visser et al., 1996). La inhibición del crecimiento de las BSR puede producirse por sulfuro, pH y metales (Visser et al., 1996). Sin embargo, tanto el sulfuro como los metales pueden removerse al formar un precipitado insoluble de sulfuro metálico tal como se indicó en la Ec. 1.4, disminuyendo la toxicidad del sulfuro (Karri et al., 2006). Por ello, las BSR están involucradas en el tratamiento de aguas contaminadas por metales (Nagpal et al., 2000). Según Kaksonen et al. (2003a) y Celis-García et al. (2004), la toxicidad del sulfuro se ve atenuada en asociaciones de BSR en biopelícula, por lo que las propiedades de inmovilización de los microorganismos toman gran relevancia mayoritariamente al tratar efluentes con alto contenido de sulfato.. 2.2 Biopelículas Una biopelícula es el producto de la asociación de microorganismos que conviven en sintrofía, unidos por interacciones electrostáticas y exopolímeros a una superficie inerte o viva. Se desarrolla principalmente en situaciones de estrés ambiental sobre las poblaciones que la conforman, por ejemplo alta fuerza cortante. Su desarrollo involucra los procesos de adhesión, crecimiento y desprendimiento celular de manera natural o debido a las fuerzas de corte (Nikolaev y Plakunov, 2007). Al estar formada de diversos microorganismos, se comporta como una comunidad microbiana integral en la que puede existir competencia entre las especies que la forman por los substratos disponibles que aseguren su subsistencia, tal es el caso de la competencia por acetato entre las BSR y los microorganismos metanogénos (Lens et al., 1998; Stoodley et al., 2002; Tahuer et al., 2007). La formación de una biopelícula está influenciada por el tipo de microorganismos presentes y sus actividades in situ, por lo que es importante 14.

(36) considerar su estructura, capacidad de transferencia de transferencia de masa y actividad microbiana. Algunas características de este tipo de asociaciones bacterianas son la heterogeneidad, distribución de microorganismos de manera no uniforme, presencia de cavidades, poros y filamentos, así como su espesor; característica dependiente de las condiciones de crecimiento, edad de la biopelícula y de las condiciones hidrodinámicas presentes en donde se desarrolle. El espesor de las biopelículas implicadas en tratamiento de agua residual es del orden de micrómetros. Las cavidades de las biopelículas permiten el intercambio de nutrientes y productos metabólicos del interior al exterior de la misma, y viceversa (Beer y Stoodley, 2006). Los exopolímeros constituidos por 50 a 80% de materia orgánica, principalmente carbohidratos y proteínas, son el principal componente estructural de una biopelícula, los cuales la protegen de deshidratación, de agentes tóxicos o de las fuerzas de corte. Éstos determinan las propiedades físicas de la biopelícula, mientras que las propiedades fisiológicas dependen de las células bacterianas presentes. La viscosidad e hidrofobicidad son parámetros clave en una biopelícula, la primera debe ser tal que no entorpezca significativamente la difusión de substrato, mientras que la segunda favorece la formación de agregados esféricos o películas planas por disminución de la superficie de contacto entre la película y el líquido (Stoodley et al., 2002; Beer y Stoodley, 2006; Nikolaev y Plakunov, 2007). En una biopelícula, las capas externas protegen a las internas de las condiciones de estrés a que esté sometida (presencia de metales o sulfuro, por ejemplo), debido a que los componentes de dichas capas, entre ellos los exopolisacáridos secretados por los microorganismos que conforman la biopelícula, oponen resistencia a la transferencia de masa del exterior al interior de la biopelícula como el sulfuro presente (Gantzer, 1989). Las biopelículas se constituyen de comunidades de microorganismos metabólicamente estructuradas que provienen de una especie única microbiana o de una comunidad de múltiples especies microbianas, en las que se 15.

(37) desarrollan asociaciones sintróficas entre los microorganismos presentes, o bien, competencia entre éstos (Tahuer et al., 2007) por substratos. Las biopelículas formadas en procesos anaerobios, como la sulfato-reducción, se forman gracias a la adhesión de las células planctónicas (células suspendidas) sobre el material de soporte. Las células planctónicas provienen de un consorcio microbiano que se utiliza como inóculo o de un cultivo puro de BSR. Diversos estudios han reportado la formación de biopelículas sulfato-reductoras en diferentes tipos de reactores, en los que la mayoría de las BSR que se adhieren sobre el soporte son las BSR-OI, debido muy probablemente a los tiempos de duplicación mayores de las BSR-OC en comparación con los de las BSR-OI (Nagpal et al., 2000; Kaksonen et al., 2003a,b; Celis et al., 2009).. 2.3 Reactores en el estudio del proceso de sulfato-reducción En los últimos 25 años, el proceso de sulfato-reducción se ha estudiado en diferentes configuraciones de reactores como los reactores continuos de tanque agitado (CSTR), reactores de lecho de lodo de flujo ascendente (UASB), y reactores de biopelícula como los reactores de lecho fluidificado, entre otros (Celis-García et al., 2007; Alvarado Lassman et al., 2008). Los reactores biológicos operados bajo condiciones de sulfato-reducción presentan varias ventajas en comparación con algunos tratamientos químicos que buscan la remoción de sulfato. El proceso de sulfato-reducción genera menores cantidades de lodo biológico reutilizable o producción de lodo más espeso en comparación con el método de precipitación química con hidróxidos (Kaksonen et al., 2204a; Bayrakdar et al., 2009). Los reactores de lecho fluidificado tienen la característica de que una biopelícula se desarrolla sobre un soporte inerte (partículas de silicato, polietileno, esferas de vidrio poroso, gránulos de polímero sintético, polvo de carbón activado, partículas de piedra pómez, étc.) lo que mejora la transferencia másica al proveer gran área superficial de biomasa expuesta a substrato (Kaksonen y Puhakka, 2007). Las principales ventajas de este tipo de reactores 16.

(38) son el patrón hidrodinámico que provee un buen mezclado haciendo más eficiente el transporte de substrato a la biopelícula, el bajo tiempo de residencia hidráulico y la degradación de la materia orgánica con alta eficiencia (Celis et al., 2009). De acuerdo con Buffière et al. (1995) y Kaksonen et al. (2003b), los reactores fluidificados son más estables y eficientes en el tratamiento anaerobio de aguas residuales. Estudios previos como los de Nagpal et al. (2000), Kaksonen et al. (2003a,b) y Celis et al. (2009), han reportado la formación de una biopelícula sulfato-reductora con predominio de BSR-OI, atendiendo a sus tiempos de duplicación menores que los de las BSR-OC; alrededor de 3 y 15 horas, respectivamente. La oxidación incompleta de substrato es un problema frecuente en los reactores de biopelícula que impide la remoción eficiente de DQO al. favorecer. la acumulación. de. acetato. en. el. efluente.. Altas. concentraciones de acetato pueden inhibir la actividad metabólica bacteriana de la biopelícula bajando el pH, así como la acidificación del sistema al no producirse la alcalinidad suficiente para neutralizarlo (Kaksonen et al., 2003a,b; Weijma et al., 2000). Un tipo de reactor de lecho fluidificado es el reactor LFFD; el cual por su configuración permite el desarrollo de una biopelícula sobre partículas de un material inerte denominado soporte, formando un lecho que flota y que se fluidifica con un flujo descendente, lo que genera la expansión del lecho y permite la salida de partículas que tienden a precipitar (Celis et al., 2004). Los reactores LFFD presentan varias ventajas sobre otro tipo de reactores, tales como la posibilidad de recuperación de precipitados metálicos o de otros sólidos del líquido del reactor mediante su fondo cónico, alto tiempo de retención de biomasa (Nicolella et al., 2000) y formación de una biopelícula delgada pero activa debido a la buena difusión de substrato hacia la biopelícula y de productos desde la biopelícula (Buffière y Moletta, 2000). Se ha reportado que en muchos reactores de biopelícula, la formación de una biopelícula madura y estable toma varios meses debido a que su desarrollo 17.

(39) implica un balance entre la adhesión, crecimiento y desprendimiento celular (Cresson et al., 2006). Al respecto, la fase de arranque de un reactor LFFD es la fase más crítica para su desempeño óptimo, debido a que durante esta etapa ocurre la selección de los microorganismos que formarán la biopelícula (VillaGómez, 2006). La importancia de lograr una corta y eficiente fase de arranque del reactor radica en lograr establecer la comunidad microbiana con una estructura adecuada que sea capaz de sobrevivir a las condiciones operacionales y nutricionales del reactor, aunada a su efectividad en la remoción del sulfato y la DQO presentes (Cresson et al. 2008; Zhao et al., 2010). 2.4 Factores involucrados en el desempeño de un reactor sulfato-reductor El buen funcionamiento de un reactor y la eficiencia en su desempeño está determinado por las variables de operación utilizadas y las características del inóculo a utilizar. Para llevar a cabo la sulfato-reducción de manera eficiente, además de la relación DQO/SO42-, es necesario regular otros factores, tales como la composición del afluente (tipo de DQO), las características del inóculo (tipo de lodo, composición bacteriana, propiedades de fijación de los microorganismos, tiempo experimental e inoculación con especies nuevas), la disponibilidad. de. substrato. y. nutrientes,. pH,. temperatura,. condiciones. operacionales (Celis-García et al., 2007) y diseño del reactor (Huslhoff Pol et al., 1998). Por esta razón, el tratamiento de agua residual con sulfato a nivel industrial depende en gran medida de la relación DQO/SO42-, del caudal a tratar, así como de la concentración de DQO presente. En cuanto a la relación DQO/SO42-, Rinzema y Lettinga (1988) describieron que al disminuir dicha relación del valor estequiométrico, aumenta la importancia de la competencia por los substratos entre las BSR y los microorganismos metanogénicos. En presencia de relaciones DQO/SO42mayores a la estequiométrica, en teoría existe la suficiente cantidad de materia orgánica disponible para reducir el sulfato presente de manera completa, y el excedente de materia orgánica presente puede ser removida al acoplarse el proceso de metanogénesis al proceso de sulfato-reducción (Fernández-Polanco 18.

(40) y García Encina, 2006). De acuerdo con Isa et al. (1986) una alta concentración de sulfato (5 g SO42-/L) y baja concentración de DQO (0.1 g DQO/L) en forma de acetato o acetato más etanol no inhibió la coexistencia de los microorganismos metanogénicos y BSR en un reactor de biopelícula fija. Por su parte, FernándezPolanco y García Encina (2006) reportaron que para relaciones DQO/SO42menores que la estequiométrica, las BSR son capaces de predominar sobre los microorganismos metanogénicos en presencia de condiciones de sulfato no limitantes debido a que compiten mejor por los substratos según su cinética; sin embargo, se necesita la adición de substrato para completar la reducción del sulfato. En la tabla 2.3 se presentan algunos trabajos en reactores sulfatoreductores con diferente relación DQO/SO42-, lo que permite elucidar que una relación DQO/SO42- mayor a la estequiométrica permite mayor remoción de sulfato que la relación DQO/SO42- estequiométrica o menor. De acuerdo con Zhao et al. (2010), el tipo de substrato o materia orgánica que se encuentre disponible para las BSR determinará el grado de la actividad sulfato-reductora, al involucrar la afinidad de las bacterias al substrato. Entre los substratos que pueden utilizar las BSR se encuentran el lactato y el acetato. El primero, pese a su costo, es un excelente substrato debido a la gran preferencia y energía que obtienen las BSR al utilizarlo, mientras que el segundo sólo puede oxidarse por algunas BSR y también por microorganismos metanogénicos lo que genera competencia entre ambos, además de permitir producir baja cantidad de biomasa (Kaksonen y Puhakka, 2007). En cuanto al inóculo, es necesario que presente las características o naturaleza necesaria para el proceso que se desee llevar a cabo. Existen métodos químicos y microbiológicos para disminuir la competencia entre las BSR y los metanógenos que permiten obtener un lodo con las características deseadas. Para obtener un consorcio primordialmente de BSR, se puede manipular la relación metanógenos/BSR del lodo al añadir cultivo puro de BSR o crear condiciones desfavorables para las poblaciones no deseadas (Hulshoff Pol et al., 1998). 19.

(41) Tabla 2.3 Influencia de la relación DQO/SO42- en el proceso de sulfato-reducción. Tipo de reactor UASB. Biomasa Lodo de un digestor anaerobio municipal. Lote CSTR. Lodo activado residual. Fuente de carbono Glucosa. DQO/SO42- F/M Hallazgo o aportación nr. Acetato. nr. Melazas. 2.7 1.6. CSTR. Lodo anaerobio acidogénico. Lodo metanogénico acondicionado con lactato. Lodo granular (planta piloto UAM). Melazas. 5.0 – 2.0. Lactato. 0.34 – 20.9. Etanol. 0.67 – 2.5. Lecho empacado LFFD. Lodo enriquecido de un efluente de bebida Lodo granular de UASB a escala. Lactato. nr 1.67 – 0.67. LFFD. Biopelícula de un LFFD con etanol-lactato a DQO/SO42- = 0-6.. Acetato o lactato, propionato y butirato. Etanol-lactato o etanol. CSTR. UASB. 0.67. Referencia. 1.2 72 – 89% de SO42- removido y 20% de DQO Erdirencelebri et degradada. al., 2007 nr 2 % de DQO degradada. 0.56 Asociación microbiana. 96% de degradada. nr Enriquecimiento de BSR acetogénicas.. DQO Wang et al., 2008.. 0.37 Al disminuir la DQO/SO42- de 3.0 a 2.0 Ren et al., 2007 aumentaron las BSR, BA y APHs. nr Presencia de acetato y propionato a alta Shabir et al., DQO/SO42- (SR y metanogénesis). 2008 nr. Máxima concentración de sulfuro disuelto a Velasco et al., DQO/SO42- de 2.5. Conversiones de sulfato y 2008 etanol de 94 y 87 %, respectivamente. 0.96 63 % de remoción de SO42-. Álvarez et al., 2006 20.09 A DQO/SO4 de 1.75 (día 187), la SR fue el Celis-García et proceso principal. A DQO/SO42- de 0.67 (día al., 2007 369) el consumo de DQO y sulfato fueron 75 y 93 %, respectivamente. 1.78 El consumo máximo de DQO y SO42- fueron Gallegos-García 80 y 42 %, respectivamente. et al., 2009. CSTR= Reactor completamente mezclado, UASB = Reactor anaerobio de lecho granular de flujo ascendente, LFFD = reactor de lecho fluidificado de flujo descendente, BA = bacterias acetogénicas, APHs = acetogénicas productoras de hidrógeno, nr = no reportado. SR= Sulfato-reducción.. 20.

(42) Para mejorar el desarrollo de las BSR, después de su selección por inhibición de los microorganismos metanogénicos, se pueden utilizar estrategias como presencia de sulfato en el sistema que se esté trabajando o temperaturas altas (65°C) (Omil et al., 1996; Visser et al., 1993); o el manejo del pH en el medio debido a que, aunque el pH óptimo para el crecimiento de las BSR es alrededor de 7.0, muchos microorganismos de este tipo pueden crecer en pH menores, mientras que los microorganismos metanogénicos requieren pH neutro para sobrevivir (entre 6.5 y 7.6) (Rittmann y McCarty, 2001). En algunas ocasiones se ha recurrido al uso de cultivos puros de microorganismos para llevar a cabo el proceso de sulfato-reducción; Kosinska y Miskiewicz (1999) reportaron el uso de un cultivo puro de Desulfovibrio desulfuricans para tratar efluentes de una granja industrial de cerdos, de procesos de producción de levadura y de colorantes orgánicos en reactores en lote a diferentes relaciones DQO/SO42-, en donde encontraron que valores mayores al estequiométrico favorecieron el proceso de sulfato-reducción con los efluentes de granja de cerdos y de producción de levadura. Estos autores reportaron que un cultivo en lote de D. desulfuricans con un efluente de una granja de cerdo alcanzó una eficiencia de remoción de sulfato del 98% y 20% de remoción de la DQO a las 96 horas, por lo que para remover la DQO remanente se adicionaron nuevas concentraciones de sulfato. Por otro lado, un cultivo similar en cuanto a microorganismo y efluente, pero con una relación DQO/SO42- de 0.65, necesitó la adición de materia orgánica extra para reducir el sulfato remante después de 96 horas de cultivo. En el caso del efluente de procesos de producción de levadura, una relación DQO/SO42- de 4.7 provocó casi la reducción completa del sulfato (99%) con un 25% de degradación de la DQO, pero posteriormente, al ajustar la relación DQO/SO42- a 2.3, mejoró la eficiencia de remoción de DQO (59%) aunque disminuyó la eficiencia de remoción de sulfato (85%). El proceso de sulfato-reducción con el efluente de la industria de manufactura de colorantes presentó un patrón diferente a los anteriores debido a la presencia de compuestos nitro tóxicos para las BSR, debido a que en este caso una relación DQO/SO42- menor a la estequiométrica (0.46) no permitió que Desulfovibrio removiera sulfato aún después de 340 horas de cultivo en lote con 21.

(43) una degradación de DQO insignificante, mientras que a una relación mayor a la estequiométrica (1.6) la degradación de DQO fue de 36% y la remoción de sulfato mejoró a 88%. Por otro lado, Cresson et al. (2006) estudiaron el impacto de la presencia de nutrientes en el crecimiento de una biopelícula con el objetivo de reducir el tiempo de colonización durante la fase de arranque en un reactor de biopelícula metanogénico. Al respecto, encontraron que la limitación de nutrientes no afectó el crecimiento de la biopelícula y la degradación de DQO a bajas velocidades de carga orgánica (0.5 g DQO/L-d) durante la fase inicial de la operación del reactor (fase de aclimatación); sin embargo, concluyeron que es importante la presencia de nutrientes para el desarrollo adecuado de la biopelícula. En cuanto a la influencia de los factores de operación del reactor, como el TRH y carga orgánica en la formación de una biopelícula, Cresson et al. (2006, 2007) encontraron que un incremento en la velocidad de carga orgánica durante la fase inicial de operación de reactores de biopelícula metanogénicos, a un TRH corto (24 h) y con bajas restricciones hidrodinámicas, permitió favorecer el crecimiento de la biopelícula y acortar el periodo inicial de la operación, dado que cuantificaron 2 g SVI/L sobre un soporte a los 35 días de operación de un reactor metanogénico de lecho fluidificado inverso turbulento a un TRH de 1 día. Esto fue atribuido al rápido lavado de la biomasa suspendida en el reactor que podría competir con los microorganismos fijados sobre el soporte. Por otro lado, se ha reportado que la velocidad de flujo influye en la estructura y propiedades de una biopelícula sulfato-reductora. Al respecto, se han encontrado que biopelículas crecidas a velocidad superficial alta (0.1 m/s) lograron desarrollarse más compactas pero activas que las crecidas a flujos más bajos de este valor (Dunsmore et al., 2002).. 22.