DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA M M É É T T O O D D O O S S D D E E A A N N Á Á L L I I S S I I S S
Práctica (Ciclo 3)
Práctica (Ciclo 3)
DETERMINACIÓN DEL
DETERMINACIÓN DEL
PESO
PESO
MOLECULAR DE UNA
MOLECULAR DE UNA
PROTEÍNA
PROTEÍNA
USANDO C
USANDO C
ROMA
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T
T
OGRAF
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ÍA POR
ÍA POR
EXCLUSIÓN MOLECULAR.
EXCLUSIÓN MOLECULAR.
Sección 2
Sección 2
5QM2
5QM2
Díaz López Mónica/ Equipo: Trejo Solórzano Alejandra
Introduccion
La cromatografía es una técnica que permite la separación de moléculas diferentes
presentes en una misma muestra. El método está basado en la circulación de una
fase móvil (que arrastra a la mezcla de compuestos a separar), a través de una
fase estacionaria. Dependiendo de la afinidad relativa que por ambas fases tengan
los distintos compuestos presentes en la mezcla resultará su separación.
La cromatografía de exclusión molecular (a menudo también llamada filtración en
gel o de tamiz molecular) es una de las técnicas más sencillas de las empleadas
en la separación de proteínas y ácidos nucleicos. Este tipo de cromatografía se
realiza en columnas cilíndricas rellenas con algunos de los geles que se fabrican
con este fin y que pueden ser de varios tipos: dextranos con enlaces cruzados
(sephadex), agarosa (sepharose, Bio-gel A), poliacrilamida (Bio-gel B), etc. Todos
estos geles (fase estacionaria) se hallan constituidos por gránulos (partículas) de
un material esponjoso hidratado, que contiene poros con un t amaño de diámetro
determinado. Hypothetical partial structure of sephacryl Cuando se hace pasar una
mezcla de moléculas de distinto tamaño, a través de una columna de filtración en
gel; aquellas moléculas con un tamaño mayor que el diámetro de los poros de las
partículas, sólo podrán moverse en su camino, a través de la fase estacionaria, en
el espacio que queda entre las partículas; y por lo tanto, no se verán retrasadas en
su descenso. En cambio aquellas moléculas capaces de penetrar en las partículas
se verán retrasadas por la fase estacionaria; en mayor medida, cuanto menor sea
su tamaño. Por lo tanto, las moléculas eluyen en este tipo de cromatografía por
orden decreciente de tamaño molecular. Mecanismo de la cromatografía de
exclusión Las mallas del gel permiten la entrada selectiva de las partículas de
menor masa molecular. De ahí que las partículas de mayor peso molecular salgan
primero.
Mecanismo de la cromatografía de exclusión Las mallas del gel permiten la entrada selectiva de las partículas de menor masa molecular. De ahí que las partículas de mayor peso molecular salgan primero.
Objetivos
Utilizar el gel apropiado para eluir proteínas de peso molecular conocido y
determinará su volumen de elución (Ve)
Realizar una gráfica que relacione los volúmenes de elución relativos (Ve/Vo),
y el logaritmo de los pesos moleculares de las proteínas patrón.
Determinar el peso molecular de una proteína problema
Resultádos
A. DETERMINACION DEL VOLUMEN VACIO DE LA COLUMNA. Tabla 1. Determinación de volumen vacío (Vo) de la Columna.
No. de fracci ón Volumen de elució n (mL) A 615nm 1 3 0,002 2 6 0,002 3 9 0,002 4 12 0,002 5 15 0,002 6 18 0,002 7 21 0,528 8 24 0,843 9 27 0,083 10 30 0,018 11 33 0,007 12 36 0,003
1. ¿Cuál es el volumen vacío de la columna?
- El volumen vacío de la columna es de 21 mL, esto depende de la altura de la misma.
Volumen Vácío de lá columná
Fig. 1 Perfil de Elución de Dextrana Azul 2000 para la determinación del volumen vacío en la columna cromatografica.
B. DETERMINACION DEL VOLUMEN DE ELUCION (Ve), DE LAS PRTEINAS PATRON Y PROBLEMA.
Tabla 2. Determinación de volumen de elución de las proteínas. Volumen de
elución (mL)
Abso rb anc ia Albúmina
(Problema)
Lisozima Hemoglobina Tripsina
3 0,03 -0,014 -0,012 0,007 6 -0,015 -0,039 -0,013 0,034 9 0,114 0,007 -0,015 0,013 12 0,804 0,028 -0,009 0,043 15 0,721 0,039 0,958 -0,015 18 0,202 0,062 1,378 0,128 21 0,041 0,331 0,968 0,049 24 0,101 -0,333 0,558 0,164 27 0,026 0,672 0,27 0,273 30 -0,006 0,995 0,118 0,337 33 0,039 1,186 0,045 0,368 36 -0,01 1,047 0,013 0,203 39 0,089 0,87 0,009 0,282 42 0,052 0,572 -0,002 0,368 45 -0,023 0,298 -0,002 0,481 48 -0,031 0,167 -0,001 0,553 51 0,008 0,034 -0,001 0,251 54 0,024 0,142 0,103 -0,1 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 A b s o r b a n c i a ( n m ) Volumen de Elución (mL)
57 0,002 0,004 0,06 60 0,075 -0,021 0,063 63 0,042 -0,003 -0,023 66 0,009 -0,042 -0,023 69 0,034 -0,032 0,034 72 0,019 0,014 0,086 75 0,086 0,08
Fig. 2 Perfil de Elución de las proteínas patrón utilizadas y la proteína problema.
C. DETERMINACION DE LA RELACION Ve/Vo.
Tabla 3. Relación de Ve/Vo y el logaritmo del peso molecular de las proteínas patrón y problema.
Prot eínas Vo (mL) Ve (mL) PM Log PM Ve/Vo Lisozima 15 33 14400 4,16 2,20 Tripsina 24 51 24000 4,38 2,13 Hemoglobina 24 21 64500 4,81 0,88 Al bu mi na 15 15 67000 4,83 1,00 -0,1 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 -0,5 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1,1 1,2 1,3 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 54 57 60 63 66 69 72 75 A b s o r b a n c i a a 4 0 5 n m A b s o r b a n c i a a 2 8 0 n m Volumen de Elución (mL)
Perfil de Elución de proteínas patrón y proteína problema
Cálculos.
= /
Relación de volúmenes= (24)(21)= 0.88
Fig. 3. Curva tipo empleando el método de Andrews y Whitaker del volumen e elución relativo respecto al logaritmo del peso molecular.
Calculo del PM con la ecuación de la recta. Y=mx+b
Ve/Vo= m (logPM) + b
Utilizando el valor de que obtuvimos en la relación Ve/Vo de nuestra proteína problema:
1= -2.16 (logPM) +11.33
1−11.33
−2.16
= 4.78
Antilog PM (4.78)= 60200 Daltones
a) ¿Cuál es el peso molecular
Según los cálculos realizados, de acuerdo a la curva tipo, el peso molecular es de 60200 daltones, por lo tanto el valor obtenido experimentalmente para nuestra proteína problema (albúmina), no esta tan alejado del valor calculado, es similar.
b) Mencionar 5 métodos para determinar peso molecular.
Electroforesis: La electroforesis en gel de SDS se usa comúnmente para obtener estimaciones de peso molecular fiables para polipéptidos desnaturalizados. Las
y = -2,1535x + 11,315 R² = 0,9175 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 4,10 4,20 4,30 4,40 4,50 4,60 4,70 4,80 4,90 V o l u m e n d e E l u c i o n R e l a t i v o V e / V o Log PM
Curva tipo
proteínas migran a través del gel hacia el electrodo positivo a una velocidad que es inversamente proporcional a su peso molecular.
Método de Kjeldah mediante la determinación del nitrógeno orgánico: Primero
reaccionan las proteínas en una mezcla con H2SO4 en presencia de catalizadores, donde el nitrógeno orgánico pasa a sulfato de amonio. La mezcla se neutraliza con una base y se destila recogiendo en ácido bórico. Luego se titula, el contenido de nitrógeno es proporcional a las proteínas de la muestra
Espectrometría de masas: Por un método de tinción con plata superficial compatible con la digestión proteica.
c) Mencionar ventajas y limitaciones del método empleado. Ventajas
-Utiliza materiales comunes para el montaje del sistema cromatografico. -No utiliza mucha cantidad de muestra.
Desventajas
-No es posible observar el desarrollo cuando la muestra es incolora. -Para una buena resolución es necesario mantener todos los parámetros controlados.
-El tiempo de separación delas moléculas pequeñas es mucho mas prolongado.
Discusion
En esta práctica se llevó a cabo un método cromatográfico para determinar el peso molecular de una proteína problema, que en este caso fue Albúmina.
Primero se llevó a cabo el empaquetamiento de la columna con el gel Sephadex G-75, que es un gel de dextrana con un intervalo de fraccionamiento de 3000-80000 daltones, luego se realizó la determinación del volumen vacío para conocer el volumen intersticial que existe entre las esferas del gel de la fase estacionaria (Sephadex G-75), esta determinación se realizó con dextrana azul 2000 con un peso molecular de 2000 kDa, asegurando que no entrara en los poros del gel y solo pase entre las esferas del mismo, el volumen vacío resulto de la f racción de volumen a la que se presentó mayor absorbancia (Tabla 1.), para observar la representación gráfica de los resultados obtenidos durante la cromatografía se realizó el perfil de elución (Fig 1) esperándose un único pico a 615 nm, este volumen vacío dependerá de la velocidad de elución y de la altura de la columna utilizada para el experimento. Para la determinación de la curva tipo se trataron diferentes muestras patrón: Lisozima, Tripsina y Hemoglobina, en nuestro caso se trabajó con Hemoglobina, siendo esta una proteína colorida se leyó a 405 nm. En la Fig 2 Se puede observar que en las diferentes proteínas patrón se presentan diferentes picos de absorción máxima la razón es que la integración de la muestra se llevó a cabo en diferentes bloques; la proteína no está integra y hubo cierta degradación de la misma por lo cual alguno de los picos pueda ser por fragmentos de péptidos.
El peso molecular de la proteína problema fue determinado con la ecuación de la recta de la Fig. 3, que representa la relación del volumen de elución relativa de cada una de las proteínas patrón respecto al logaritmo del peso molecular, se encontró que el valor obtenido experimentalmente es muy similar al calculado.
Conclusiones
Se determinó el peso molecular de una proteína problema mediante la ecuación de la recta de la curva tipo.
Se determinaron algunas de las ventajas y desventajas del método de separación empleado.
Se realizó el perfil de elución de la dextrana azul para determianr volumen vacío.
El volumen de elución es la cantidad de tiempo que se invierte para que la fase móvil salga sin interferencia del analito y depende relativamente de la altura de la columna cromatografica.
Bibliográfíá.
“TÉCNICAS DE SEPARACIÓN. CROMATOGRAFÍA” URL:
http://ocw.uc3m.es/ciencia-e-oin/caracterizacion-de-materiales/material-de-clase-1/Tecnicas_de_separacion_cromatografica.pdf (Consulta
25/10/16)
