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MICROBIOLOGÍA
GENERAL
2018
TRABAJO PRÁCTICO Nº 4
INTRODUCCIÓN A LA GENÉTICA
BACTERIANA
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INDICE
TRANSFERENCIA HORIZONTAL DE GENES EN BACTERIAS
... 31. CONJUGACIÓN BACTERIANA ... 3
1.1 El plásmido F
... 3
1.2 Formas de presentación del plásmido F y su utilidad en genética bacteriana
... 4
2 ALGUNOS CONCEPTOS BÁSICOS DE TRANSDUCCIÓN Y TRANSFORMACIÓN ... 6
CUESTIONARIO
... 103
FIGURA 1. Esquema de la organización del plásmido F.
TRANSFERENCIA HORIZONTAL DE GENES EN BACTERIAS
Las bacterias intercambian y adquieren nuevo material genético básicamente a través de tres procesos: conjugación, transducción o transformación.
1. CONJUGACIÓN BACTERIANA
La conjugación es el proceso de transferencia de material genético entre una célula bacteriana dadora y una receptora. Fue descubierto por Joshua Lederberg y Edward Tatum en 1946. Este proceso que requiere del contacto directo entre ambas bacterias es promovido por determinados tipos de plásmidos presentes en la célula dadora. Estos plásmidos transportan genes que codifican para estructuras de superficie especializadas que posibilitan el establecimiento del contacto célula-célula y funciones específicas que median la transferencia de la información genética. La mayoría de los plásmidos conjugativos codifican además para sistemas que aseguran que la célula receptora no tenga ya un elemento similar.
Algunos de estos plásmidos se pueden integrar al cromosoma bacteriano. En este caso, si se produce la conjugación, se puede transferir parte del propio plásmido más un segmento adyacente del cromosoma, que a su vez podrá recombinarse con secuencias homólogas del cromosoma del receptor, dando lugar a un cromosoma híbrido.
La información genética transferida a menudo beneficia al receptor. Las ventajas pueden incluir resistencia a antibióticos, tolerancia a tóxicos o xenobióticos o la capacidad de utilizar o sintetizar nuevos metabolitos.
1.1 El plásmido F
El factor de fertilidad de E. coli K12, el plásmido conjugativo F, fue el primero en ser caracterizado. En este plásmido se distinguen diferentes regiones (Fig. 1): i) la región tra, donde se encuentra oriT que es el
origen para la transferencia conjugativa así como genes que codifican para funciones relacionadas con la transferencia conjugativa (biosíntesis y ensamblaje del pelo sexual, estabilización, regulación, replicación asimétrica y transferencia del ADN); ii) la zona RepFIA
u oriV, que está implicada en la replicación vegetativa del plásmido F, la incompatibilidad de F respecto de otros plásmidos, y con el reparto de las copias replicadas de F a las células hijas y iii)
secuencias de inserción (IS3, IS2 y Tn1000) que permiten la integración de F en varios lugares del cromosoma.
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FIGURA 2. Conjugación bacteriana entre una célula F+ (o F´) y una célula F.-
1.2 Formas de presentación del plásmido F y su utilidad en genética bacteriana
El plásmido F tiene la capacidad de permanecer como tal o de integrarse al cromosoma bacteriano, por lo que puede encontrarse en uno de tres posibles estados en la célula aceptora:
• Plásmido F autónomo – las células se denominan F+
• F integrado - las células se denominan Hfr (o de alta frecuencia de recombinación),
• Plásmido F’: es el plásmido F que además contiene genes provenientes del cromosoma - las células se denominan F’ (F-prima).
Cuando una célula F+ o F’ transfiere el plásmido por conjugación, una de las dos cadenas parentales
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sirviendo a su vez como molde para la síntesis de una nueva cadena complementaria. Al final del proceso, ambas células en el par conjugativo poseen una copia del plásmido (Fig. 2).
En el caso de las células Hfr, como el plásmido no se transfiere completo, la célula receptora sólo adquirirá genes nuevos si éstos pueden estabilizarse mediante recombinación homóloga (Fig. 3).
FIGURA 3. Generación de una célula Hfr y su posterior conjugación con una célula F-.
Dependiendo de la secuencia de inserción implicada en la integración, su localización dentro del cromosoma de E. coli, y de la orientación en que se produzca la inserción se pueden obtener distintas células Hfr. La transferencia de ADN por cada cepa Hfr es unidireccional y linear, o sea, los genes del dador ingresan al receptor en un orden determinado y de manera secuencial. Por ello la frecuencia relativa obtenida para un determinado marcador (es decir, el nº final de recombinantes obtenido) guarda una relación inversa con el tiempo en que éste comienza a aparecer (a menor tiempo de aparición, mayor frecuencia final de ese marcador) y con el sitio de inserción y orientación del plásmido F en el genoma. De hecho, en la población de bacterias algunas células reciben el marcador antes y otras después, dentro de un cierto rango de tiempo.
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Si se grafica la frecuencia de obtención de recombinantes en función del tiempo para cada marcador se obtiene una curva característica para cada uno. Cada curva presenta una pendiente característica y culmina en una meseta (momento a partir de un punto ya no entra más ese marcador). A partir de estas curvas se puede determinar el tiempo de entrada inicial del marcador, extrapolando la pendiente de la curva al eje de las abscisas. El tiempo en que comienza a detectarse un determinado marcador, así como la frecuencia final de dicho marcador en los transconjugantes provee una estimación de su distancia respecto del origen de transferencia y permite determinar la posición relativa de un marcador desconocido respecto a otros conocidos. Por ello esta
herramienta se puede utilizar para la elaboración de mapas genéticos del cromosoma bacteriano.
(Experimentos de conjugación interrumpida, Fig. 4).
Una cepa Hfr puede revertir a F+ si la escisión se da a
través de las mismas secuencias de inserción implicadas en su formación; o a F’, si la escisión involucra a secuencias repetidas diferentes a las IS que las que le dieron origen (Figura 5). En este último caso, el plásmido conjugativo que se origina posee uno o más genes de la bacteria que se ubicaban en las cercanías del sitio de integración original. Por ello, estos plásmidos se denominan F'.
2 ALGUNOS CONCEPTOS BÁSICOS DE TRANSDUCCIÓN Y
TRANSFORMACIÓN
La transducción es un proceso mediante el cual se transfieren genes desde una bacteria a otra
mediante la acción de un virus bacteriano o bacteriófago. Esta herramienta también es utilizada por los biólogos moleculares para introducir en forma controlada un gen extraño en el genoma de una célula receptora.
El proceso de la infección comienza cuando la partícula del fago se adsorbe sobre receptores en la superficie de la bacteria e inyecta el ADN contenido en su cápside. Este ADN tenderá a expresar su programa genético, pero el resultado final dependerá de que el fago sea de tipo virulento o de tipo
FIGURA 4. Experimento de conjugación interrumpida y determinación de los tiempos de entrada de distintos marcadores.
FIGURA 5. Generación de un plásmido F´ a partir de una célula Hfr.
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FIGURA 6. Transducción generalizada en bacterias.
atemperado. En el primer caso, se produce el ciclo lítico, como resultado del cual se producen muchas
copias del ADN fágico y cápsides proteicas donde este se empaqueta. Las nuevas partículas (viriones), una vez completadas y ensambladas, lisan a la bacteria, quedando libres en el medio y preparadas para infectar nuevas células de la especie bacteriana hospedadora. Este proceso se puede visualizar sobre un césped bacteriano como placas de lisis, también llamadas calvas.
Si el fago es de tipo atemperado, al ingresar en la bacteria se pueden reprimir las funciones líticas del fago e incorporarse el ADN del fago por recombinación específica de sitio conservativa en el genoma bacteriano generando un profago. Ante condiciones adversas, se puede inducir el ciclo lítico previa escisión del profago del genoma.
Como consecuencia de la activación del ciclo lítico del fago se pueden generar partículas fágicas transductoras, partículas que pueden tener o no restos del ADN viral, pero que transportan una porción
de material genético de la célula hospedadora. Estas partículas son las que median el proceso de transducción, ya que al igual que los fagos silvestres inyectan de forma habitual el ADN que porta a la célula receptora, pero en este caso los genes provenientes de la bacteria dadora pueden recombinarse con el ADN de la célula receptora y expresar su información generando así cepas bacterianas nuevas.
Se distinguen dos tipos de transducción: generalizada y especializada, según el fago que les dio
origen sea de tipo virulento o atemperado, respectivamente. En la transducción generalizada (Fig. 6), la partícula transductora (pseudovirión) se forma por empaquetamiento anómalo de ADN bacteriano y sólo de éste, durante el ciclo virulento de un fago lítico, por lo que puede contener cualquier fragmento del genoma bacteriano. Junto con la utilización de cepas Hfr, la transducción generalizada ha sido de suma utilidad para la elaboración de mapas genéticos del cromosoma bacteriano, ya que ambas metodologías
se complementan.
Por el contrario, la transducción especializada (Fig. 7) es consecuencia de la inducción del ciclo lítico de un fago atemperado, por lo que el número de marcadores que pueden ser transferido se restringe a los
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FIGURA 7. Transducción especializada en bacterias.
loci genéticos adyacentes al sitio de integración del profago (Fig. 8). Estas partículas por lo tanto contienen
ADN del fago.
La transformación (Figura 9) es la introducción de ADN libre en una bacteria. Hay células capaces de
captar ADN desde el medio y por lo tanto son naturalmente transformables, pero también la competencia, o sea la capacidad de adquirir ADN se puede inducir, mediante perturbaciones químicas (cationes
divalentes) o físicas (shock eléctrico) de la envoltura bacteriana.
FIGURA 8. La escisión defectuosa del fago toma genes del hospedador.
FIGURA 9. Transformación bacteriana con fragmentos de ADN (panel izquierdo) y ADN plasmídico (panel derecho).
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TRABAJO EXPERIMENTAL
I. CONJUGACIÓN BACTERIANA
Objetivo
Reconocer experimentalmente uno de los mecanismos de transferencia horizontal de genes por el que las bacterias pueden adquirir resistencia a los antibióticos.
Metodología
Cada grupo realizará una conjugación entre las siguientes cepas:
Escherichia coli MC4100: SmR
Escherichia coli XL1Blue: [F´ TcR]
La cepa receptora MC4100 lleva en su cromosoma un gen que confiere resistencia a estreptomicina. La cepa dadora, XL1Blue, contiene un plásmido que incluye un gen que confiere resistencia a tetraciclina.
1.- En el centro de una caja de Petri conteniendo medio LB-agar, colocar varias colonias de cada una de las cepas y mezclarlas con el ansa.
2.- Incubar a 37ºC durante dos horas.
3.- Sembrar la mezcla por agotamiento de ansa en una caja de Petri conteniendo LB-agar suplementado con 20 µgr/ml de Sm y 10 µgr/ml de Tc.
4.- Sembrar por depósito y posterior quemado una colonia de cada una de las cepas utilizadas para la conjugación en una placa con el mismo medio de cultivo.
5.- Incubar a 37ºC durante 24 hs. 6.- Observar y sacar conclusiones.
II. FAGOS
Objetivo
Observación y reconocimiento de placas de lisis del fago P1 que desarrollaron sobre un césped bacteriano.
Metodología
Se realizaron diluciones seriadas en medio LB de un lisado del fago P1. En un tubo de hemólisis estéril se mezclaron 100 μl de la dilución 10-4 del fago con 100 μl de un cultivo saturado de la cepa de E. coli
JM109. Luego se agregó al tubo 3 ml de medio LB soft (LB conteniendo 0,5% agar) precalentado a una temperatura de aproximadamente 42°C, se agitó en un vortex, y la mezcla se esparció uniformemente sobre una placa de LBA. Se dejó reposar hasta solidificación y posteriormente se incubó en estufa a 37ºC durante toda la noche.
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CUESTIONARIO
1. Defina conjugación.
2. ¿A que se denomina factor F? ¿Cómo definiría una cepa F+ y una F-?
3. ¿A que se denomina célula dadora y célula receptora?
4. ¿A que se denomina Hfr? ¿Una cepa Hfr puede actuar como dadora o como aceptora? ¿Qué utilidad
tienen este tipo de cepas?
5. ¿A que se denomina F’? ¿Cómo se origina? ¿Qué ventajas tiene su uso respecto a una cepa F+ o una
Hfr?
6. ¿Cuáles son los tres tipos de cruzas posibles entre cepas que transportan un plásmido F libre o
integrado y una cepa que carece del mismo? ¿Cuál es el resultado de la conjugación en cada caso?
7. ¿Cuándo interviene la proteína RecA durante el proceso de conjugación? 8. ¿Una cepa F+ recA+ puede conjugar con una cepa F- recA-?
9. Explique por qué los recombinantes de una conjugación de Hfr x F- son generalmente F-, mientras que
los transconjugantes de F+ x F- son usualmente F+.
10. ¿A qué se denomina marcadores seleccionables y no seleccionables? 11. ¿Cómo se pueden visualizar los bacteriófagos?
12. ¿Cómo se determina el título de un fago? ¿En qué unidades se expresa? 13. ¿Qué tipos de transducción conoce? Mencione las diferencias entre ellas.
14. ¿Qué tipo de partículas se pueden distinguir en un lisado de un bacteriófago que hace transducción
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PROBLEMAS
1. Dadas las siguientes cepas:
I. XL2: Hfr leu+ met+ trp- recA+
II. Rc84: F- leu- met- trp+ recA+
a) Describa el fenotipo más relevante que posee cada una e indique cuál de estas cepas podría actuar
como dadora o aceptora en un experimento de conjugación.
b) Escriba el genotipo del transconjugante más probable e indique que genes funcionarían como
marcadores de selección y de contraselección.
c) Detalle los componentes más relevantes del medio de cultivo que utilizaría para seleccionar estos
transconjugantes, justificando su respuesta.
d) ¿Qué ocurriría si la cepa XL2 fuera recA-? ¿Y si la cepa RC84 fuera recA-?
2. Usted realiza una conjugación entre dos cepas de E. coli:
I. A12: F- trp- met- leu- recA+ StrR
II. B15: Hfr trp+ met+ leu- recA+ TetR
a) Describa el fenotipo más relevante que posee cada una e indique cuál de estas cepas podría actuar
como dadora o aceptora en un experimento de conjugación.
b) Escriba el genotipo del transconjugante más probable e indique que genes funcionarían como
marcadores de selección y de contraselección.
c) Detalle los componentes más relevantes del medio de cultivo que utilizaría para seleccionar estos
transconjugantes, justificando su respuesta.
d) ¿Qué ocurriría si la cepa A12 fuera recA-? ¿Y si la cepa B15 fuera recA-?
3. Dadas las siguientes cepas:
I. BB45: Hfr gal+ StrR recA+
II. CS487: F- TetR leu- met- trp- gal- recA+
a) Describa el fenotipo más relevante que posee cada una e indique cuál de estas cepas podría actuar
como dadora o aceptora en un experimento de conjugación.
b) Escriba el genotipo del transconjugante más probable e indique que genes funcionarían como
marcadores de selección y de contraselección.
c) Detalle los componentes más relevantes del medio de cultivo que utilizaría para seleccionar estos
transconjugantes, justificando su respuesta.
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4. Dada las siguientes cepas:
I. CV456: Hfr AmpR leu- met+ recA+
II. XC456: F- CmR trp- recA+
III. GH456: F- CmR trp- recA
-IV. CV345: [F´ AmpR] trp- recA+
a) Indique qué cepas le podrían servir como dadoras o aceptoras en experimentos de conjugación.
Detalle cuales serían los pares posibles.
b) Para cada cruza productiva, escriba el genotipo del transconjugante generado, y diseñe el medio
de cultivo que utilizaría para seleccionarlo, indicando los componentes más relevantes y justificando su respuesta.
5. Dadas las cepas de E. coli K12 detalladas más abajo, usted desea realizar la transferencia de material
genético por conjugación. I. Y1023: Hfr TcR recA
-II. DH104: F- met- leu- AmpR recA
-III. X3030: [F’ KmR]
IV. JM120: F- trp- SmR recA+
a) Indique qué cepas le podrían servir como dadoras o aceptoras en experimentos de conjugación.
Detalle cuales serían los pares posibles.
b) Para cada cruza productiva, escriba el genotipo del transconjugante generado y diseñe el medio de
cultivo que utilizaría para seleccionarlo, indicando los componentes más relevantes y justificando su respuesta.
6. Usted cuenta con las siguientes cepas: A- Hfr ile+ his+
B- F- ile- his+ recA+ TcR
C- [F’ CmR] gal
-D- F- ile- his+ recA- CmR
a) Indique qué cepas se podrían utilizar como dadoras o aceptoras en un experimento de
conjugación.
b) Teniendo en cuenta la respuesta del ítem (a), ¿qué cruzas permitirían obtener transconjugantes?
En cada caso, indique el genotipo del transconjugante que espera obtener y diseñe el medio de cultivo que utilizaría para seleccionarlo. Indique los componentes más importantes y justifique su respuesta.
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i) En un experimento de conjugación donde la cepa dadora es una Hfr y la aceptora una cepa F-,
las transconjugantes obtenidas son F+.
ii) En un experimento de conjugación donde la cepa dadora es una Hfr, la cepa aceptora debe poseer la proteína RecA funcional.
iii) En un experimento de conjugación donde la cepa dadora es una F+, la cepa aceptora debe
poseer la proteína RecA funcional.
iv) En un experimento de conjugación deben existir marcadores de selección que impidan el crecimiento de ambas cepas parentales (dadora y aceptora) y permitan el crecimiento de las transconjugantes deseadas.
v) Se debe cultivar la cepa [F’ CmR] gal- en medio sintético conteniendo galactosa como única
fuente de carbono y cloranfenicol.
vi) Para que una cepa F+ de origen a una cepa Hfr o F’ es esencial que tenga exprese la proteína
RecA.
7. Se realiza un experimento de tiempo de entrada entre conjugando una cepa donante Hfr de genotipo
a+ b+ c+ d+ StrR con una aceptora F- que tiene el genotipo a- b- c- d- StrR (En ambas cepas, los genes a,
b, c, d están espaciados igualmente). Como resultado de este experimento se obtienen los resultados
que se muestran en la tabla.
Tiempo de
conjugación (min) a+ StrR Nº de recombinantes obtenidos cada 100 Hfr b+ StrR c+ StrR d+ StrR
0 0.01 0.006 0.008 0.0001 10 5 0.1 0.01 0.0004 15 50 3 0.1 0.001 20 100 35 2 0.001 25 105 80 20 0.1 30 110 82 43 0.2 40 105 80 40 0.3 50 105 80 40 0.4 60 105 81 42 0.4 70 103 80 41 0.4
a) En este experimento, que función cumplen los genes a, b, c, d y el marcador de resistencia a Str.
b) ¿Cuál es el tiempo de entrada estimado para los genes a, b, c, d?
c) Explique la baja frecuencia de recombinación en el plateau para las recombinantes d+ StrR.
8. Se lleva a cabo un experimento de conjugación interrumpida utilizando 3 cepas Hfr distintas (Hfr-1,
Hfr-2 y Hfr-3, todas derivadas de la misma cepa original), y una cepa F-. En la tabla se indica la cepa
Hfr utilizada en cada cruza y el tiempo (en min) de aparición en la cepa aceptora de cada marcador de selección
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Hfr-1 marcador b+ a+ c+ f+ g+ Tpo (min) 3 5 16 27 59 Hfr-2 marcador e+ f+ c+ d+ b+ Tpo (min) 6 24 35 46 48 Hfr-3 marcador d+ c+ f+ e+ g+ Tpo (min) 4 15 26 44 58En base a los resultados obtenidos, esquematice el orden relativo en que se encuentran los genes a, b, c, d, e, f y g en el cromosoma bacteriano (Tenga en cuenta las distancias relativas entre los genes
considerando los tiempos de entrada). Indique con una flecha la posición relativa y orientación del factor F integrado en cada cepa Hfr.
9. Se realiza un experimento de conjugación entre una serie de cepas Hfr (todas derivadas de la misma
cepa original) que poseen el genotipo m+ n+ o+ p+ q+ r+ con una cepa F- que posee el genotipo m- n- o
-p- q- r-. La conjugación se interrumpe a intervalos regulares y se determina el orden de aparición de
los genes de cada una de las cepas Hfr en la cepa receptora. El orden de transferencia de los genes (en orden decreciente de frecuencia de aparición) que observa para cada par es el siguiente.
Hfr dadora orden Hfr1 m+ q+ p+ n+ r+ o+ Hfr6 n+ r+ o+ m+ q+ p+ Hfr9 o+ m+ q+ p+ n+ r+ Hfr15 q+ m+ o+ r+ n+ p+
Esquematice el orden de los genes en el cromosoma bacteriano y la ubicación del factor F en el cromosoma de cada cepa Hfr, indicando con una punta de flecha su polaridad.
10. El orden de los genes en una cepa Hfr es a, b, c, d. En una conjugación entre una cepa Hfr donante que
tiene el genotipo a+ , b+, c+ d+ x - StrS y una F- que tiene un genotipo a - b - c - d – x+ StrR, 90% de las
recombinantes d+ StrR son x -, y 100% de las c+ d+ x - StrR son x -. El tiempo de entrada de a, b, c y d son
de 5, 10, 15 y 20 minutos, el del gen StrR es de 55 minutos. Indique dónde se encuentra localizado el
gen x, justificando su respuesta.
11. ¿Cuál es el título de un stock de fagos si en la dilución 10-6 se cuentan 53 placas de lisis?. Tenga en
cuenta que el volumen de la dilución que se mezcló con un cultivo saturado de la bacteria suceptible al fago fue de 0,05 ml.
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12. Se dispone de 5 ml de un stock de fago T4 para titular. Para ello, inicialmente se realizó una dilución
1:5 y a partir de esta primera dilución se realizaron 8 diluciones seriadas más al décimo (diluciones 10-1
a 10-8). Luego, se mezclaron en tubos de hemolisis por separado y por duplicado, 0,2 ml de las
diluciones que se detallan en la tabla con 0,1 ml de un cultivo de la bacteria susceptible, y se adicionó a cada mezcla 3 ml de LB suplementado con 0.5% de agar, para posteriormente volcarla sobre la superficie de una placa de LBA. Luego de la incubación, se contó el número de unidades formadoras de placas (ufp) obtenidas en cada caso, obteniéndose los resultados de la tabla:
Dilución Número de ufp 10-5 520 y 480
10-6 60 y 54
10-7 3 y 6
10-8 0 y 1
Calcule el título del stock de fago. ¿Qué esperaría observar en las placas correspondientes a diluciones menores que 10-5 ?.
