Congreso Nacional Laboratorio Clínico 2018

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AGRADECIMIENTOS

• Elena Sukhacheva, Manager global Scientific Affairs Hematology; Beckman Coulter

(Switzerland)

• Àngels Doñate, Beckman Coulter Barcelona • Juan Gimeno, Beckman Coulter Barcelona

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ALGORTIMOS DIAGNÓSTICOS

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Primer paso analítico: Hematimetría

Criterios de revisión y validación de hemogramas

Datos hemograma OBJETIVO: identificar patología hematológica y observación del frotis de sangre periférica CytoDiff

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CBC/Diff Result Normal WBC Result Validation Reporting Abnormal WBC Result

Slidemaking Slide Staining

Manual Count Reporting Pathology Review Reporting  25%  75%  2%

“WORK FLOW” LABORATORIO HEMATIMETRÍA

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Marker Cellular Expression

CD36-FITC Monocitos, ERIs, Plaquetas

CD2-PE Linfocitos T, LGG (células NK), blastos LA-T CD294-PE Eosinófilos, Basófilos, Linfocitos T activados CD19-ECD Linfocitos B, blastos LA-B

CD16-PC5 Neutrófilos, Monocitos pro inflamatorios (anormales), linfocitos T/NK CD16-positivos

CD45-PC7 Todos los leucocitos

Reactivo CytoDiff (6-marcadores, 5-colores)

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Ba Classifier B-Cell Classifier Non-WBC Classifier Mo Classifier IG-EO Classifier LyT Classifier BlastOther Classifier Eo Classifier Im Mo Classifier B Blast Classifier Mo± Classifier Ly ± Classifier Ne Classifier

El algoritmo CytoDiff propone una selección poblacional celular sencilla que facilita la interpretación de resultados. 13 histogramas secuenciales conforman el diagrama final reduciendo la complejidad.

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From CD19 gate From LyT&NK gate From IG & Eo gate

From Mo gate From CD36 gate

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Morphological population

Immunological populations

Pathological populations

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Region/Gate name

Description Xt T-Blasts

Xb B-blasts

Xn non-T and non-B Blasts Xm Monoblasts

T+ CD16+ T and NK lymphocytes

T- CD16-negative T and NK lymphocytes Mo+ Pro-inflammatory monocytes (CD16+)

Mo- Non-inflammatory monocytes (CD16-)

Información en % y # de las poblaciones celulares leucocitarias detectadas

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CytoDiff populations Cytology populations B ly = B-lymphocytes CD16 negative T/NK-lymphocytes CD16 positive T/NK lymphocytes Lymphocytes Mo=Monocytes CD16neg

+ Monocytes CD16pos Monocytes CD16pos SSChigh neutrophils Mature Neutrophils

Eosinophils Eosinophils Basophils Basophils

CD16neg SSChigh immature granulocytes Immature granulocytes Blasts=B-cell precursor +

T-cell precursor +

Non B and non T precursor + Mono precursor

Blast cells

Estos parámetros nos aportan:

1. Información adicional para el diagnóstico y tratamiento del paciente 2. Test de selección de patología como paso previo a paneles de citometria

especializados

3. Inmunomonitorización (control celular de la sepsis, control inmunológico de la aplicación de drogas inmunosupresoras e inmunoterapia)

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¿en qué puede contribuir?

• Aporta información adicional de elevada especificidad en pacientes con sospecha de enfermedad hematológica; la Hematimetría suele ser el primer contacto del paciente con el proceso diagnóstico.

• En el seguimiento de pacientes con patología hematológica conocida; detección de células anormales y/o inmaduras.

• Complementar los algoritmos diagnósticos basados en reglas expertas de Hematimetria y ampliar/contrastar la información del frotis de sangre periférica.

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• El objetivo del estudio es comparar la identificación de células patológicas mediante la observación al microscopio óptico como método de referencia en el primer estadio diagnóstico en el laboratorio de rutina y la detección mediante citometría de flujo WBC-Diferencial

• Se han estudiado hasta el momento 500 pacientes en los que el análisis del frotis de sangre periférica es requerido (reglas expertas, algoritmos diagnósticos, alarmas internas y/o criterios numéricos del hemograma).

• Se han incluido también pacientes Hematológicos y Oncológicos en seguimiento.

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¿Cuándo hacemos Cytodiff?

• Linfocitosis absoluta; linfocitosis relativa (valorar el hemograma con alarmas y gráficas)

• Monocitosis absoluta (valorar evolución, historia clínica del paciente)

• Pediátricos con alarmas y/o gráfico anormal

• Gráfico anormal (no separación poblaciones

leucocitarias; mala distribución de las

poblaciones) • Pancitopenia • Casos control

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0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 UTILIDAD DE CYTODIFF:

RESULTADOS POR PATOLOGIA

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VALORACIÓN INICIAL DEL ESTUDIO

• Estudiamos 75.000 hemogramas de pacientes de Atención Primaria

• 5.5% aparece alarma Abnormal Lympho • 1.2% aparece alarma Atypical Lympho

• 2% de las muestras presentan Linfocitosis absoluta (>4.500 células)

• Se realizan frotis por diferentes reglas expertas y algoritmos diagnósticos en un 3-5% del total de muestras.

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GRUPO PACIENTES SOSPECHA SLP

• Estudio sobre 100 pacientes con sospecha de SLP (alarma, linfocitosis, gráficos)

CONDICIÓN OBSERVADA N (sobre 100 pacientes)

LEUCOCITOSIS (>12.500X103_/µl) ₅₅ LINFOCITOSIS RELATIVA (>45%) ₇₃ LINFOCITOSIS ABSOLUTA (>4.5X103_/µl) _{77 (Ẋ=11.6)} MONOCITOSIS ABSOLUTA (>1.000X103/µl) 40 LINFOCITOSIS Y MONOCITOSIS ₃₆ ALARMAS EN EL HEMOGRAMA ₇₈ ALARMA % Abnormal Lympho 60 Atypical Lympho 20 Blasts/Abnormal Lympho? 14 Blasts? 6

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100 PACIENTES SOSPECHA DE SLP FSP PRUEBAS COMPLEMENTARIAS (INMUNOFENOTIPO, ASPIRADO MO, SEROLOGIA)

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LINFOCITOSIS ALARMAS HEMOGRAMA GRÁFICOS ALTERADOS FROTIS SANGRE PERIFÉRICA PRUEBAS COMPLEMENTARIAS (INMUNOFENOTIPO, ASPIRADO MO…)

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Paciente de 65 años de edad, mujer, control por DM II linfocitosis progresiva de dos años de evolución y citología de aspecto reactivo en anteriores revisiones del frotis. En el hemograma: linfocitosis de 6x103_{/µl; alarma Abnormal Lympho.}

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Linfocitosis absoluta citológicamente de aspecto maduro, con alguna célula de citoplasma abundante y de carácter probablemente reactivo.

Escasas sombras celulares. Se recomiendan controles evolutivos.

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CytoDiff, sugiere población de predominio T (CD19 débil) y algunas células NK. Inmunofenotipo básico SLP: 78% CD3, 14% CD19 y 7% CD56.

BUENA CORRELACIÓN ENTRE CYTODIFF E INMUNOFENOTIPO (citología)

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Paciente de 60 años de edad, varón, con amputación extremidad I Antecedentes de Hemorragia rectal auto limitada.

Absceso periungueal. Ligero MEG e insomnio. Control ordinario en Medicina Familiar. En el hemograma: linfocitos de 1.1 x103_{/µl; monocitosis de 15.2 x10}3_{/µl; sin alarmas.}

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Linfocitosis absoluta con monocitopenia; CYTODIFF con presencia de población de predominio B pero con cluster celular de morfología atípica, ausencia de monocitos. Inmunofenotipo SLP, población CD19 75%, CD4 68%, CD8 28% y CD3 13%. Monoclonal.

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Paciente de 41 años de edad, varón, sin antecedentes de interés. Acude a urgencias por fiebre y MEG de dos semanas de evolución. Motivo consulta: edemas en EEII.

Leucocitosis con linfocitosis y monocitosis; alteración del gráfico de dispersión. Anemia y trombopenia. LEUCOCITOSIS+ANEMIA+TROMBOPENIA. Alarma Blasts?

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LA (no B, no T)

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HEMATOLOGICAL DISORDER

BLASTS FLAG % BLASTS CELLAVISION % BLASTS CYTODIFF AML SI 2 7 AML SI 71 91 AML-QT SI 1,3 1,81 AML-QT SI 33,5 38,6 AML final QT NO 0 0 AML DX SI 20 19,64 AML DX SI 45,5 35,29 SMD SI 11 15 SMD SI 3 4 SMD NO 1 1 MPD-MF SI 1 1 MPD-MF SI 1 1 MPD-MF SI 1 1 MPD-MF SI 18 17 MPD-MF SI 7 10 MPD-TE SI 27 31

CORRELACIÓN CIFRA BLASTOS (MICROSCOPIO vs CYTODIFF)

.Existe buena correlación

.Los resultados son mejores a menor cifra de células

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PRUEBAS COMPLEMENTARIAS (INMUNOFENOTIPO, ASPIRADO MO…) ???? LINFOCITOSIS Abnormal Lympho Gráfico anormal CYTODIFF: CD19%= 2.34 NO BLASTOS CYTODIFF: CD19%= 3.63 NO BLASTOS LINFOCITOSIS Abnormal Lympho Gráfico anormal ???? ¿CYTODIFF ANTES? ¿CYTODIFF DESPUÉS?

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Normal WBC Result CBC/Diff Result Validation Reporting Abnormal WBC Result Pathology Review  25% Remisol Middleware Reflex CytoDiff Test Analyze on FC 500  20% CytoDiff Result  5% Manual Diff  1% +

ETAPA INTERMEDIA Y COMPLEMENTARIA A LA REVISIÓN CITOLÓGICA DE LAS

MUESTRAS PATOLÓGICAS

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60 FSP SUGESTIVOS SLPC

30 FSP MORFOLÓGICAMENTE NORMALES (8 linfocitosis progresivas; control evolutivo)

4 FSP ASPECTO REACTIVO

(1 paciente con Mononucleosis Infecciosa) 6 FSP SUGESTIVOS LGG (100) FROTIS SANGRE PERIFÉRICA CYTODIFF CD19% >15: 40 PACIENTES CYTODIFF CD19% <15: 60 PACIENTES LINFOCITOSIS Abnormal Lympho Gráfico anormal

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CYTODIFF CD19% >15: 40 PACIENTES CYTODIFF CD19% <15: 60 PACIENTES_{30 NORMALES} 4 POBLACIÓN T+ 8 POBLACIÓN T/NK 1 LAM 43 PACIENTES 40 SLPC 43 NO SLPC ¿17?

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8 SLPC CYTODIFF NORMAL PARA CD19% 2 MONONUCLEOSIS 1 MONOCITOSIS MADURA 1 TUMOR SÓLIDO 1 HIV 1GM-MM INMUNOFENOTIPO CITOMETRIA: 48 SLPC TIPO B 8 SLP CD56 3 SLPT 1 LAM 4 LINFOCITOSIS POLICLONAL B (64 PACIENTES) 30 LINFOCITOSIS MONOCLONAL B (LLC) 6 LINFOCITOSIS MONOCLONAL B NO LLC 3 TRICOLEUCEMIAS 2 LINFOMAS FOLICULARES 4 LEZM 3 LDCGB 2 SD SEZARY 1 SLPT ¿14?

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CONSIDERACIONES DE LA TÉCNICA

X_b46.46% ¿Blastos?

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X_b41.46% ¿Blastos?

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POBLACIÓN CD2-94+ (25,24%) ¿BASÓFILOS?

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En conclusión:

CYTODIFF permite incrementar la especificidad y ampliar la información del diferencial leucocitario del analizador hematológico en el diagnóstico de patología relacionada con esta serie.

Se obtiene información útil en la orientación diagnóstica de muestras que deben ser analizadas por citometría de flujo específica, aportando mayor seguridad y objetividad a la citología del frotis de SP.

El análisis de las muestras es sencillo y rápido por que su uso resulta ágil en laboratorios de Hematología de rutina.

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