Una vez comprobada la acumulación lipídica cardíaca con el envejecimiento, cabe preguntarse qué mecanismos bioquímicos y moleculares subyacen a esta acumulación. Para ello, se procedió a analizar los niveles de algunas proteínas de interés, claves en la regulación del metabolismo energético cardíaco, con el objetivo de determinar si existe una pérdida de flexibilidad metabólica cardíaca con la edad que pudiera estar reflejada en las proteínas implicadas en la captura celular de AG (FAT/CD36) y de glucosa (GLUT4). Así, en los animales de 3, 8 y 24 meses de edad, se determinaron los niveles de ARNm de los genes involucrados en la captura de estos sustratos energéticos, así como la cantidad total y la distribución subcelular de las proteínas en corazón.
Medidas Colesterol en suero (mmol/L)
Colesterol en corazón (mg colesterol/g de tejido)
TAG en suero (mmol/L)
TAG en corazón (mg TAG/g de tejido)
3m AL 1,39 ± 0,32a 1,76 ± 0,05a 0,37 ± 0,03a 3,01 ± 0,36a
8m AL 1,80 ± 0,09a 1,96 ± 0,14b,* 0,39 ± 0,03a,* 3,48 ± 0,39a
8m FR 1,70 ± 0,23a 1,46 ± 0,14c 0,20 ± 0,05b 2,91 ± 0,43a
24m AL 3,76 ± 0,12b 2,13 ± 0,09b,+ 0,54 ± 0,11c 4,55 ± 0,40b
24m FR 3,48 ± 0,35b 1,54 ± 0,14c 0,30 ± 0,07a 3,28 ± 0,20a
4.4.1.- Efecto del envejecimiento sobre los transportadores FAT/CD36, GLUT1 y GLUT4 en corazón. Estudio de los cambios producidos con la alimentación
Es conocido que la reubicación permanente de FAT/CD36 en la MP se vincula con una mayor captación de AG y se correlaciona con un aumento de los TAG plasmáticos, que tienen como consecuencia la disminución de la captación de la glucosa en respuesta a insulina (Steinbusch y cols., 2011, Coort y cols., 2007). Tras un ayuno de 36h, nuestros resultados muestran que los niveles de ARNm y proteína FAT/CD36 en los animales de 8 meses de edad disminuyen un 20%, mientras que en 24 meses se incrementan significativamente hasta un 50% (Figura 41, A-B).
Así mismo, Figura 41-B, resulta muy revelador que los niveles proteicos no se reduzcan en respuesta a la realimentación en animales de 8 y 24 meses como sí ocurre en 3 meses, lo que sugiere una alteración en la flexibilidad y/o en la respuesta metabólica a la disponibilidad de sustratos procedentes de la sangre derivados de la transición ayuno (mayor contenido en AG que de glucosa), a la alimentación (mayor contenido en glucosa disponible que de AG).
FAT/CD36 (PCR a Tiempo Real)
24m Ayuno 24m 30 min 24m 180 min 0
1 2 3
a, b
b b
Unidades arbitrarias (ua)
FAT/CD36 (PCR a Tiempo Real)
3m Ayuno 3m 30 min 3m 180 min 0
1 2 3
a b
c
Unidades arbitrarias (ua)
FAT/CD36 (PCR a Tiempo Real)
8m Ayuno 8m 30 min 8m 180 min 0
1 2 3
a
a
b
Unidades arbitrarias (ua)
A.
Figura 41: Efecto de la edad y de la alimentación sobre los niveles de FAT/CD36 en extracto total de corazón. Niveles de ARNm determinados por PCR-Real Time relativos al gen 18S ARNr (A), y de proteína determinados por Western-blot (B) expresados en unidades arbitrarias (ua) relativas al control (ratas de 3m Ayuno). n= 6-8 animales por condición y por duplicado. Análisis de Anova seguido de test Tukey. Letras diferentes indican diferencias significativas a p<0,05, aa p<0,01; a respecto a 3m Ayuno; b respecto a 8m Ayuno; * condición Ayuno y 30 min; + condición Ayuno y 180 min; # condición 30 min y 180 min.
Con objeto de estudiar las proteínas implicadas en la captación de glucosa sensible a insulina se midieron los niveles de ARNm y proteicos de GLUT4, Figura 42, comprobándose que en ratas ayunadas 36h los niveles de ARNm tienen una tendencia a incrementarse con la edad alcanzando significatividad en los animales envejecidos de 24 meses; sin embargo, los niveles de proteína no muestran cambios significativos con la edad. Es de destacar que la presencia de nutrientes, como consecuencia de la alimentación incrementa la cantidad de proteína especialmente a los 30 minutos.
GLUT4 (PCR a Tiempo Real)
3m Ayuno 3m 30 min 3m 180 min 0
1 2 3 4 5
b
a
Unidades arbitrarias (ua)
a
GLUT4 (PCR a Tiempo Real)
8m Ayuno 8m 30 min 8m 180 min 0
1 2 3 4 5
a
a a
Unidades arbitrarias (ua)
GLUT4 (PCR a Tiempo Real)
24m Ayuno 24m 30min 24m 180min 0
1 2 3 4 5
b b
Unidades arbitrarias (ua)
c
A.
FAT/CD36 Extracto total Tej Card
3m AL 8m AL 24m AL
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
Ayuno
a,bb
a
#
* +
*
*
30 min 180 min
FAT/CD36 /-actina (ua) FAT/CD36 β-actina
Ay 30 180 Ay 30 180
Ay 30 180
Figura 42: Efecto de la edad y de la alimentación sobre los niveles del transportador de glucosa (GLUT4) en extractos totales de corazón. Niveles de ARNm determinados por PCR-Real Time relativos al gen 18S ARNr (A), y de proteína determinados por Western-blot (B) expresados en unidades arbitrarias (ua) relativas al control (ratas de 3m Ayuno). n= 6-8 animales independiente y por duplicado. Análisis de Anova seguido de test Tukey. Letras diferencias indican diferencias significativas entre los grupos estudiados, *p<0,05, *condición Ayuno y 30 min.
Para completar este estudio se midieron en extractos totales de corazón los niveles proteicos del transportador GLUT1 implicado en la captación basal de glucosa;
como se observa en la Figura 43, en los animales de 8m se produce una disminución en los niveles de GLUT1 que tienden a incrementarse a los 24m, respecto a los valores observados a los 3 meses. Por otro lado, la RC aumenta de forma significativa la cantidad total de GLUT1, tanto en 8m como en 24 meses de edad (Figura 43).
Figura 43: Efecto de la edad y de la RC sobre los niveles del transportador de glucosa (GLUT1) en extracto total de corazón determinado por Western-blot expresados en unidades arbitrarias (ua) relativas al control (ratas de 3m Ayuno). n= 6-8 animales por condición y por duplicado. Análisis de Anova seguido de test Tukey. Letras diferentes indican diferencias significativas *p<0,05, así * respecto 8m AL y 8m FR, + respecto 24m AL y 24m FR.
GLUT1 Extracto Total Tej Cardiaco
3m AL 8m AL 8m FR 24m AL 24m FR 0.0
0.5 1.0 1.5
*
+
GLUT1 /-actina (ua) GLUT1
3AL 8AL 8FR 24AL 24FR
β-actina
GLUT4 Extracto Total Tej Cardiaco
3m AL 8m AL 24m AL
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
Ayuno 180 min
* *
*
30 min
GLUT4 /- actina (ua)
GLUT4 β-actina
4.4.2.-Localización de los transportadores FAT/CD36 y GLUT4 en las fracciones subcelulares del corazón con la edad. Efecto de la restricción calórica
Nos interesaba conocer la distribución subcelular de los transportadores de los sustratos energéticos tanto en las MP, MI como en las mitocondrias con el envejecimiento. Para ello se aislaron las fracciones según el método descrito por Lei y cols., 2004. Con este método hemos conseguido separar ambas fracciones MP y MI con un alto grado de pureza, utilizando la Na+/K+-ATPasa como marcador de MP y la EEA1 como marcador de MI.
Es importante destacar que, el transportador de AG (FAT/CD36) se encuentran localizados, fundamentalmente, en la MP y en menor medida en las MI (Figura 44).
Además, aunque se ha constatado también la presencia de FAT/CD36 en las mitocondrias, su nivel no varía con la edad.
Por otro lado a diferencia del transportador de AG, el transportador de glucosa (GLUT4) se localiza principalmente en la MI excepto en las ratas de 24 meses de edad (Figura 44-B). Además, los niveles de proteína GLUT4 varían con la RC, observándose un incremento en el contenido de GLUT4 en la MP a expensas de la disminución en la MI (Figura 44-B).
FAT/CD36 Mitocondrias Tej Card 3m
3m AL 8m AL 8m FR 24m AL 24m FR 0
2 4 6 8 10 12
*
+ FAT/CD36 /-actina (ua)
FAT/CD36 MP Tej Card 3m
3m AL 8m AL 8m FR 24m AL 24m FR 0
2 4 6 8 10 12
a,c
*
+
FAT/CD36/ Na+K+ATPasa (ua)
FAT/CD36 MI Tej Card 3m
3m AL 8m AL 8m FR 24m AL 24m FR 0
2 4 6 8 10 12
+
a
FAT/CD36/ EEA1 (ua)
a
M. I.
3mAL 8mAL 8mFR 24mAL 24 mFR
FAT/CD36 EEA1
Mitocondrias 3mAL 8mAL 8mFR 24mAL 24 mFR
FAT/CD36 β-actina FAT/CD36
Na+K+/ATPasa
M.P.
3mAL 8mAL 8mFR 24mAL 24 mFR
A.
Figura 44: (A) Unidades arbitrarias de FAT/CD36, (B) de GLUT4 en las diferentes fracciones subcelulares de corazón. Imágenes de Western-blots representativos (arriba) y cálculos densitométricos asociados (abajo). Se utiliza la Na+/K+-ATPasa como marcador de MP y la EEA1 como marcador de MI.
Media ± SEM n= 6-8 animales por condición y por duplicado. Análisis de Anova seguido de test Tukey.
Letras diferentes indican diferencias significativas a p<0,05; aa p<0,05, así a respecto a 3m AL; b respecto a 8m AL; c respecto a 24m AL, * compara 8m AL y 8m FR y + compara 24m AL y 24m FR.