Adhesión celular

Como fue evidenciado en presencia de sales, el pH bajo dificulta el crecimiento bacteriano inicial de los aislamientos, alterando la actividad metabólica de los mismos. Esto se observa debido a la presencia de una fase lag prolongada durante las primeras 6 horas del ensayo. A medida que aumentó el tiempo del ensayo, los aislamientos demostraron adaptación al medio, logrando llegar hacia la fase exponencial.

En el caso de L. plantarum (Figura 8F) y S. enterica (Figura 8G), para los cuales se espera tolerancia, se observan bajos valores de OD600 en casos sometidos a pH 2 en comparación con aquellos sometidos a medio en condiciones normales. Igualmente, todos los controles mostraron un aumento en su crecimiento reflejado en valores de OD600 superiores en el tiempo. Una mejor representación del efecto de estas condiciones en el crecimiento bacteriano podría ser obtenida con un mayor número de puntos en las curvas de crecimiento en todos los casos planteados.

Hasta el momento, estos 5 aislamientos (3.3.MRS, 3.5.MRS, 4.2.MRS, 4.3.MRS, 4.3.BDA) mostraron poseer perspectivas de ser utilizados como agente de control microbiano frente a posibles patógenos gastrointestinales, ser incapaz de resistir la presencia de antibióticos y resistir a condiciones de SB y pH similares a las encontradas en el TGI.

Si bien el ensayo planteado demostró ser eficaz para la visualización de la resistencia a las condiciones planteadas, sería enriquecedor la implementación de técnicas que permitan observar la expresión génica que se da en estas condiciones. Se sabe por bibliografía que la expresión génica de las bacterias resistentes cambia a su beneficio y algunas ya poseen la capacidad de expresar genes específicos que les sirve como herramienta para la resistencia (65). Un ejemplo de esto es la enzima BSH (bile salt hydrolase en inglés). Esta enzima es expresada por un gran número de BALs utilizadas como probióticos. Es responsable de la hidrólisis del colesterol presente en la bilis disminuyendo sus niveles en suero (66). El estudio de la actividad de esta enzima supondría un acercamiento aún más profundo a la efectividad de la cepa potencialmente probiótica y los beneficios que supondría su administración.

En este ensayo se estudiaron los 5 aislamientos que superaron las etapas anteriores:

3.3.MRS, 3.5.MRS, 4.2.MRS, 4.3.MRS, 4.3.BDA. Se probó el ensayo de adherencia celular, utilizando la línea celular HT-29 (adenocarcinoma de colón humano), que presenta crecimiento adherente y una variedad de usos como modelo in vitro. Entre ellos se destacan el estudio de la respuesta inmune por infección bacteriana, screening de potenciales drogas y toxinas, evaluación de terapias contra el cáncer, y la adhesión e invasión de microorganismos (108).

Primeramente, se crecieron precultivos ON de dichos aislamientos y se midió su crecimiento comparando con escala McFarland, resultando en una concentración de 1,5 x 10⁹ ufc/mL para todas las bacterias. Se efectuaron diluciones seriadas de cada aislamiento en orden de infectar, con una concentración de 1,5 x 10⁶ ufc/mL, células HT-29 con una concentración celular de 2,0 x 10⁵ células/pocillo, en 3 placas de 24 pocillos. Se utilizan estas concentraciones en ambos casos debido a que la bibliografía recomienda un MOI (multiplicity of infection) de 5:1 (bacteria:célula) en ensayos de adhesión celular (109). Las diluciones de las bacterias se realizaron en SF, y la última dilución se realiza en medio DMEM + 10 % SFB, en orden de infectar las células con su medio de crecimiento. Luego de transcurridas 3 horas de infección, se tomaron sobrenadantes (medio y lavados) y tripsinizados para plaquear en MRS y observar la viabilidad de las bacterias.

Se desarrollaron una serie de controles en las placas de 24 pocillos, cuyo correcto procesamiento se visualizó en los plaqueos posteriores en MRS. Uno de los controles trata de solo células, en orden de visualizar tanto ausencia de crecimiento bacteriano como cambios en el metabolismo de las células independiente de la infección bacteriana (visible a partir del viraje del indicador de pH). Otro control utilizado es la presencia de bacteria en medio DMEM + 10% SFB, y se realizó con el fin de apreciar si los aislamientos presentan una tendencia a adherirse al plástico de las placas y si los mismos presentan mayor/menor viabilidad por tener contacto con un medio diferente a MRS. El último control consta de solo medio DMEM + 10%, teniendo el objetivo de observar ausencia de crecimiento bacteriano como control de contaminación. Como bacteria control se utiliza L. plantarum, que posee la habilidad de adherirse a células HT-29 (110,111).

En la Tabla 18, se detalla el crecimiento de cada uno de los aislamientos durante las distintas etapas del ensayo de adherencia celular, mediante los resultados obtenidos en los plaqueos en MRS. En la misma, se presentan de forma numérica los recuentos contables, exhibiéndose en formato de concentración en escala logarítmica en base 10 (Log10) en orden de simplificar la visualización de estos. A su vez, se presentan colores en aquellos casos extremos de placas no contables, placas con un número de colonias mayor a 250, y ausencia de crecimiento bacteriano.

Tabla 18. Resultados del ensayo de adhesión de aislamientos a línea celular HT-29.

Con HT-29 Sin HT-29

Aislamiento

Inóculo bacteriano

inicial

Bacteria adherida (tripsinizados)

Bacteria no adherida (lavados)

Bacteria sola (tripsinizados)

Bacteria sola (lavados)

Log10 (ufc/mL) Crecimiento

3.3.MRS 5,8 6,1

3.5.MRS 6,6 6,4

4.2.MRS 6,5 7,0

4.3.MRS 5,9 5,2

4.3.BDA 6,5 6,9

L. plantarum 7,0 6,7

En referencia a los inóculos bacterianos iniciales de cada aislamiento, se observa que los mismos poseen un crecimiento que promedia una concentración Log10 de 6,3 (en un rango entre 5,8 y 6,6). Este valor refleja una correlación con el crecimiento de los precultivos establecidos a partir de la escala McFarland (10⁶). En contraste, L. plantarum fue el microorganismo con mayor crecimiento, con una concentración Log10 de 7, por lo que su crecimiento fue subestimado en escala McFarland.

Se decidió considerar la tripsinización como un paso clave en la detección de bacterias adherentes, ya que HT-29 posee crecimiento en adherencia. Por lo tanto, se considera que durante el paso de tripsinización celular las bacterias que estén adheridas van a ser tripsinizadas junto a estas células En orden de observar dicho potencial de adherencia de los aislamientos, se obtuvieron alícuotas para las bacterias adheridas (tripsinizadas) y para las bacterias no adheridas a HT-29 (DMEM + lavados).

En cuanto a la bacteria adherida, se observan valores en concentración Log10 aproximados a los inóculos bacterianos iniciales, que promedian 6,3 (en un rango de 5,2 – 7). Estos valores expresan una correlación con los valores obtenidos en los inóculos bacterianos iniciales, permitiendo establecer que la mayoría de los aislamientos presentaron adhesión contra HT- 29. Con respecto a L. plantarum, se detalla que la misma mantiene el orden de crecimiento en la adherencia a células HT-29.

Sin embargo, se observan patrones de crecimiento mayores a 250 colonias aisladas (amarillo) o con formación de césped (verde) en las alicotas de DMEM + lavados para las bacterias no adheridas a HT-29, inclusive L. plantarum. Esto se traduce en que hay bacteria remanente en el medio de cultivo y en los lavados sin capacidad de unión a las células. Una posible conclusión es que los aislamientos evaluados sean capaces de crecer en medio DMEM, al encontrarse metabólicamente activos, estos aislamientos podrían haber crecido durante las tres horas de incubación. El medio DMEM se caracteriza por ser un medio rico en glucosa (4,5 g/L), permitiendo el crecimiento celular de HT-29, pero a su vez, siendo metabolizado por las BALs en orden de generar crecimiento (112).

Con motivo de observar el comportamiento de los aislamientos frente al medio de cultivo DMEM y su capacidad de adherirse al plástico de la placa, se investigó la interacción de los

aislamientos sin HT-29, obteniendo alícuotas para bacterias posiblemente adheridas a la placa (tripsinizadas) y bacterias no adheridas (DMEM + lavados).

Con relación a las bacterias posiblemente adheridas a la placa, se obtuvieron resultados que confirman ausencia de colonias (rojo) y crecimiento mayores a 250 colonias aisladas (amarillo). Según bibliografía, L. plantarum posee baja interacción con placas de poliestrieno, siendo un resultado que se confirma en este ensayo (113). Sin embargo, los aislamientos 3.5.MRS y 4.2.MRS denotan presencia de bacterias luego de la tripsinización sin células. Un factor que pudo haber afectado dicho resultado es una incorrecta manipulación, produciendo que la bacteria presente en la tripsinización no sea bacteria unida a la placa, sino producto de lavados mal ejecutados. Por otro lado, puede que dichos aislamientos presenten una velocidad de crecimiento mayor con respecto al resto de los aislamientos estudiados, produciendo mayor cantidad de bacterias presentes en el medio, y que las mismas se peguen a la placa de poliestireno. Otra alternativa estriba en la capacidad intrínseca de las bacterias a adherirse a la placa, sin considerar la velocidad de crecimiento. Existen reportes de diversas especies de Lactobacillus y Enterococcus con la habilidad de adherirse a poliestireno, por lo que no se descarta que exista este mecanismo en este ensayo (113,114).

Referente a las bacterias no adheridas, en otras palabras, la bacteria removida durante la extracción de DMEM + lavados, todos los aislamientos y L. plantarum demostraron un crecimiento excesivo en formato de césped, en placas de MRS. Este resultado es acorde a lo esperado, la ausencia de células conlleva a que las bacterias que no estén adheridas a la placa, sino que estén presentes en el medio de cultivo y lavados. A su vez, la ausencia de células no genera competencia a las bacterias por el medio de cultivo, por lo que es razonable pensar que hay mayor cantidad de glucosa disponible, y, por ende, una mayor propagación bacteriana.

A modo de conclusión del ensayo, se determina que los aislamientos generaron mecanismos de adherencia celular frente a HT-29. Se obtuvieron colonias contables en MRS a partir de los tripsinizados de célula/bacteria, que se correlacionan con la concentración inicial inoculada de bacteria. De todos modos, sería prudente realizar otro ensayo que no sobreestime el crecimiento bacteriano con medio DMEM, en orden de no generar interacciones inespecíficas con la placa de poliestireno.

Es posible reflexionar acerca de diversas perspectivas sobre este ensayo. Primeramente, sería conveniente observar mediante microscopía óptica el estadío de las células HT-29 durante la incubación con las bacterias en las 3 horas del ensayo. Es clave identificar si la confluencia celular se mantiene constante durante el mismo, de forma de confirmar que las bacterias no están promoviendo la muerte celular de las mismas. En adición, la microscopía óptica también puede ser un método utilizado para visualizar interacciones célula-bacteria.

Debido a que la microscopía óptica permite ver longitudes de onda mayores a 700 nm, y las bacterias y células tienen un rango de 500 – 5.000 nm, y 10.000 – 100.000 nm, respectivamente, es posible observar interacciones entre ambas. Por otro lado, existen otras técnicas de microscopía adaptables a dicha necesidad, como la microscopía de fluorescencia, microscopía confocal, microscopía electrónica de transmisión (TEM) y microscopía electrónica de barrido (SEM) (115,116). La citometría de flujo es otra técnica adaptable para estudiar la unión entre bacteria y célula (117).

Otro ensayo posible de ejecutar como perspectiva es la sustitución de medio de cultivo DMEM + 10% SFB, por suero (NaCl 0,9%). La utilidad de este ensayo recae en el mantenimiento del crecimiento tanto de las bacterias como de las células, inhibiendo la promoción y muerte celular y bacteriana. En consecuencia, a partir de la concentración bacteriana inoculada en las células HT-29, se debería visualizar un porcentaje con capacidad de adherencia y otro porcentaje sin adherencia, que reflejen la distribución total de la concentración bacteriana inoculada. De esta forma, se evita la competencia célula/bacteria por los nutrientes presentes en el medio de cultivo.

Un enfoque orientado hacia biología molecular deriva en la identificación mediante PCR de adhesinas presentes en los aislamientos, así como también posibles receptores celulares que puedan otorgar la especificidad en la adhesión celular. Se han reportado diversas adhesinas con capacidad de adherencia a células. E. facium BGG09-28 posee propiedades probióticas y presenta una adhesina denominada aggE que se adhiere a componentes de la matriz extracelular (118). L.rhamnosus GG también posee propiedades probióticas y una adhesina que media su adhesión con el epitelio intestinal es SpaCBA (119). L. plantarum AC131 es otra cepa que presenta proteínas de adhesión celulas, como lo son MapA (mucus adhesion protein) y MUB (mucus-binding protein) (120). Sería interesante examinar qué adhesinas pueden presentar los aislamientos obtenidos, mediante diseño de primers específicos que logren su identificación, en orden de determinar sus mecanismos de adherencia celular.

La competencia entre bacterias potencialmente probióticas y patogénicas por la adherencia a HT-29 es otro ensayo para reflexionar. Se han documentado ensayos donde se utiliza una cepa patógena (E. coli) marcada con fluorescencia, que se incuba durante 2 horas con células HT-29 y luego se agregan cepas de L. plantarum o L. fermentum, incubando por 1 hora. Como resultado, se logró disminuir la adhesión de E. coli a HT-29, observable a partir de la disminución de fluorescencia, medida mediante espectrofotometría de fluorescencia (121).

Sería adecuado probar la capacidad de aislamientos de inhibir el crecimiento de patógenos ya adheridos a las células.

Finalmente, sería recomendable realizar ensayos de citotoxicidad con el fin de corroborar que la bacteria en estudio no solo se une a la célula, sino que también no presente efectos adversos frente a la viabilidad celular.

En conclusión, se logró visualizar mediante recuento de colonias que los 5 aislamientos (3.3.MRS, 3.5.MRS, 4.2.MRS, 4.3.MRS, 4.3.BDA) presentaron adherencia a células HT-29, siendo de interés identificarlos de forma bioquímica y molecular.