Enzimas

19 método del ácido trinitrobencenosulfónico (TNBS), el método de Balashingam que usa el para-dimetil amino benzaldehído, etc. (Mahmoud, 1994).

La estructura de los hidrolizados proteicos está basada fundamentalmente en las estructuras de los aminoácidos, péptidos y proteínas. Los aminoácidos presentan propiedades y características que se deben fundamentalmente a su naturaleza iónica anfotérica ácido-base, puesto que tienen la capacidad de desarrollar una carga positiva o negativa de acuerdo con el pH al que se encuentren, esto determina que exista una propiedad denominada como punto isoeléctrico, en el que las cargas positivas y negativas están equilibradas, por lo tanto la carga neta total es cero. Los aminoácidos a valores de pH menores de su punto isoeléctrico se encuentran en forma catiónica y por encima del punto isoeléctrico en forma aniónica (Stryer, 1985; Lehninger, 1970).

20 estructura química y provocan una pérdida de su actividad catalítica (Novozymes, 1999; Belitz y Grosch, 1992).

FIGURA Nº 1.5 Estructura de la enzima

Fuente: Sánchez, S. y Demain, A.L. “Enzyme and Microbial Technology”(2002)

1.3.4.1 Naturaleza Química

Las enzimas tienen una estructura primaria que está definida por la secuencia de la cadena de aminoácidos adjuntos. También tiene una estructura secundaria que se forma cuando la cadena de aminoácido se retuerce en una configuración tridimensional mantenida junta por uniones de hidrogeno entre aminoácidos y uniones azufre – azufre (disulfuro), que son comunes a algunos aminoácidos. Muchas proteínas tienen además una estructura terciaria, en la que la proteína se pliega sobre ella misma y se mantiene de nuevo junta por uniones de hidrogeno. Esta estructura terciaria se rompe, en general, fácilmente por el calor o productos químicos, ocasionando la desnaturalización o desactivación de las enzimas. (Rittmann, 2001).

Las enzimas son moléculas de proteína de cadena larga y pesos moleculares que van de 10 000 a 1 millón, además muchas enzimas son proteínas combinadas a una molécula orgánica de bajo peso molecular conocida como coenzima. (Pelczar ,1981)

21 Las enzimas hidrolíticas pueden ser extracelulares, o exoenzimas, que actúan por fuera de la pared celular para romper moléculas grandes en pequeñas de forma que pueden atravesar la pared celular. Pueden ser también intracelulares, o endoenzimas, que funcionan dentro de la célula. Algunas enzimas están estrechamente asociadas con la pared celular y pueden actuar como exoenzimas o endoenzimas, dependiendo del lugar en que se producen las reacciones en las que intervienen (Rittmann, 2001).

1.3.4.2 Propiedades

Como las enzimas son proteínas o proteínas combinadas con otros grupos químicos, poseen las mismas propiedades características de las proteínas; se desnaturalizan con el calor, precipitan con el etanol o concentraciones elevadas de sales inorgánicas como el sulfato de amonio, y no dializan a través de membranas semipermeables (Pelczar ,1981).

Los atributos más sobresalientes de las enzimas son la especificidad de actuación y el enorme poder catalítico (Lehninger, 1979).

La especificidad es una de las propiedades más sorprendentes de la molécula enzimática. Si bien, los catalizadores inorgánicos, poseen también esta propiedad, las enzimas son mucho más selectivos y característicos en sus cualidades de selectividad (Neilands y Stumpf, 1967).

Las moléculas del sustrato se unen a un sitio particular en la superficie de la enzima, denominada sitio activo, donde tiene lugar la catálisis. La estructura tridimensional de este sitio activo, donde solo puede entrar un determinado sustrato (ni siquiera sus isómeros) es lo que determina la especificidad de las enzimas. El acoplamiento es tal que (E. Fisher ,1988). Enunció: “el sustrato se adapta al centro activo o catalítico de una enzima como una llave a una cerradura”.

22 Pasos que ocurren durante la acción enzimática:

 Sustrato se enlaza a la enzima.

 Ocurren alteraciones químicas que incluyen rompimiento y formación de enlaces.

 La enzima libera el producto de la reacción.

Con respecto a la eficiencia catalítica, (Fennema ,1982). Menciona que está muy alta, por cuanto una molécula de enzima es capaz de transformar de 10 000 a 1 millón de moléculas de sustrato por minuto.

1.3.4.3 Efecto del pH sobre la actividad enzimática

La actividad enzimática guarda también relación con el estado iónico de la molécula y, especialmente, de la parte proteica, puesto que las cadenas polipeptídicas contienen grupos que pueden ionizarse (principalmente grupos carboxilos y aminos de los aminoácidos constituyentes) en un grado que depende del pH existente.

Como la conformación de las proteínas depende, en parte, de sus cargas eléctricas, habrá un pH en el cual la conformación será la más adecuada para la actividad catalítica. Este es el llamado pH óptimo. La mayoría de las enzimas son muy sensibles a los cambios de pH. Desviaciones de pocas décimas por encima o por debajo del pH óptimo pueden afectar drásticamente su actividad. Sin embargo, la gran mayoría de las enzimas tienen un óptimo entre pH 4 y 8. (Braverman, J.B.S. 1967).

El pH, tiene un efecto muy marcado que afecta la configuración de la proteína, modificando su estructura terciaria, lo que produce una alteración en la actividad enzimática. La mayoría de las enzimas presentan una actividad catalítica máxima a un determinado valor óptimo de pH, la mayoría tiene un pH óptimo entre 4 a 8, sobre o bajo este pH la actividad disminuye. Un cambio intencional del pH puede ser usado para la destrucción específica de una enzima. En general, los pH extremos inactivan las enzimas debido a la desnaturalización proteica (Hicks, 2001; Lehninger, 1970). Para determinar el

23 efecto del pH en la actividad enzimática el ensayo se realiza bajo condiciones de saturación, como se muestra en la Figura N° 1.6

FIGURA Nº 1.6 Efecto del pH sobre la actividad enzimática Fuente: Whitaker et al. “Principles of enzimology for the food sciences”. (1994)

1.3.4.4 Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática

Aunque el rango general de temperaturas adecuadas para las reacciones enzimáticas es muy estrecho, los cambios ligeros suelen tener una considerable influencia. La temperatura óptima para la mayoría de las reacciones enzimáticas está, entre 30 °C y 40 °C. Al aumentar la temperatura, la velocidad de reacción aumenta y, para casi todas las enzimas, un incremento de 10 °C duplica e incluso triplica la velocidad de reacción como se muestra en la Figura N° 1.7. Sin embargo, al ser proteínas, a partir de cierta temperatura, se empiezan a desnaturalizar por el calor (Elsa Aguirre, Tesis – UNALM, 2006). La velocidad de reacción enzimática aumenta con la temperatura dentro del intervalo en que la enzima es estable y retiene su capacidad catalítica. Cuando se aumenta la temperatura por encima de este intervalo, la actividad enzimática se modifica y se produce la inactivación de la enzima por un proceso de desnaturalización, con la pérdida de la estructura terciaria.

La mayoría de enzimas tienen su óptimo en el intervalo de 30 °C a 50 °C, inactivándose a más de 75 °C. Algunas enzimas son más resistentes al calor.

El tiempo de una reacción enzimática tiene relación con la temperatura óptima (Hicks, 2001).

24

FIGURA Nº 1.7 Efecto de la temperatura en la actividad enzimática Fuente: Patnaik Pratap, R. “Temperature optima of enzymes”(2002).

1.3.4.5 Efecto del tiempo

La concentración de producto con respecto al tiempo presenta un comportamiento exponencial como se muestra en la Figura N° 1.8. Se presentan 3 fases, en la primera un tiempo corto de adaptación de la enzima al sustrato, luego una fase de crecimiento, en donde la velocidad de reacción llega a un máximo y finalmente una fase estacionaria en donde ya no hay un incremento en la concentración de producto debido a que el sustrato se vuelve escaso (Hicks, 2001).

FIGURA Nº 1.8 Representación gráfica del curso grafico de una reacción Fuente: Eisenthal R. Danson, Enzyme Assays: Oxford University Press (2002).

25 1.3.4.6 Enzimas proteolíticas

Las enzimas proteolíticas o proteasas catalizan la rotura de la unión peptídica y poseen su propia especificidad, es decir, atacan preferentemente ciertos tipos de uniones peptídicas.

Existen dos tipos de proteasas: las endopeptidasas atacan los enlaces peptídicos internos de las proteínas y descomponen a las proteínas en fragmentos peptídicos más pequeños, tienen una especificidad hacia los aminoácidos hidrofóbicos; y las exopeptidasas rompen los enlaces externos catalizando la eliminación de residuos aminoacídicos desde los extremos N o C terminales, denominadas aminopeptidasas y carboxipeptidasas respectivamente, dando como resultado aminoácidos individuales (Lehninger, 1970; Novozymes, 1999). En la Figura N° 1.9 se presenta un esquema de la acción de las enzimas proteolíticas.

FIGURA Nº 1.9 Hidrólisis de proteínas con endo y exoproteasas Fuente: Lehninger, “Clasificación Internacional de Enzimas”.(1993)

Las enzimas utilizadas para la hidrólisis de proteínas son de diferentes fuentes son obtenidas de tejidos animales, las enzimas de origen microbiano aisladas a partir de hongos o bacterias (Cheftel et al., 1989).

1.3.4.7 Proteasas Comerciales

Actualmente se encuentran disponibles comercialmente muchas proteasas grado-alimenticio (Tabla 1.5).Estas proteasas pueden ser clasificadas, por su

26 origen, (animal, vegetal, bacteriano o fúngico), por su modo de acción catalítica (endo- o exo-actividad). Las endoproteasas hidrolizan enlaces amídicos dentro de la cadena de la proteína. Las exoproteasas, por el contrario, eliminan aminoácidos terminales de las proteínas o péptidos. La naturaleza del centro catalítico de las proteasas difiere de acuerdo con los aminoácidos y otros ligandos que intervienen en la formación del complejo enzima-sustrato.

TABLA Nº 1.5 Algunas de las proteasas disponibles comercialmente en grado alimenticio.

Tipo de Proteasa Nombre Fuente Temp( °C) ^Rango _{de pH} Sitio de acción catalítica

Serinproteasa

Animal

Tripsina

Porcino , bovino

30-60 7.0-9.0 *Lis (o Arg)---

Quimotripsina 45-55 8.0-9.0 *Trp (o Tir ,Fe)

Elastasa 6.0-8.0 *Ala---

Bacteriana

Substilisin. Carlsberg. Bacillus Licheniformis 50-60 6.0- 10.0

*AAhf---

Alcalasa

Subst. BPN. Bacillus

40-55 6.0- 10.0

Substilisin Novo amyloliquefaciens

Cisteinproteasas

Plantas

Papaína Papaya 40-75 5.0-8.0 *Fe(oVal,Leu)

Bromelaina Piña 20-65 5.0-8.0 AAhf ---

Ficina Látex de Ficus 5.0-8.0

Aspartato

proteasas

Animal Pepsina Porcino, bovino 1.0-

4.0

Fe(o Tir ,Leu ) *- Trp

Quimosina Becerro 4.0-6.0 (o Fe ,Tir )

Fúngica

Aspergilopeptidasa

A Aspergillus saitoi 35-50 2.0-5.0 Glu ,Asp ,Leu

Newlasa Rhizopus sp. 40-50 3.0-6.0 Similar a la

peptidasa

Métalo proteasas

Animal Carboxipeptidasa A Páncreas

7.0-8.0

*Carbonilo del AA Terminal del

péptido Excepto Pro ,Arg

,Lis

Bacteriana Neutrasa Bacillus

amyloliquefaciens 40-55 6.0-7.5 -Fe ,Leu ,Val *-- Termolisina B. thermoproteolyticus 7.0-9.0 lie ,Leu ,Val Preparaciones

enzimáticas Mezcla de Papaína,

quimopapaina y lisozima .Mezcla de

tripsina, quimiotripsina,

elastasa y Carboxipeptidasa.

Papaína cruda Fruto de la papaya

5.0-9.0

Muy amplia especificad Pancreatina Páncreas (bovino) 30-80 7.0-9.0

Muy amplia especificad Veron P, Sumicina

LP, Biocina A

Aspergillus oryzae 40-55 4.0-8.0 Muy amplia especificad

Pronasa Streptomyces Griseus

7.0-9.0 Muy amplia especificad

Fuente: Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana 2008, Universidad de Lleida-España

* Indica sitio de acción de la proteasa sobre el sustrato.

AAhf Indica AAs hidrofóbicos.

27 1.3.4.8 Enzima Neutrasa

La enzima neutrasa es una endoproteasa que se puede utilizar en la mayoría de los casos en los que las proteínas tienen que ser dividido moderadamente o más extensivamente a péptidos. Es una proteasa bacteriana producida por una cepa seleccionada de Bacillus amyloliquefaciens. Neutrasa se utiliza para actualizar las proteínas de origen vegetal y animal. Neutrasa 1.5 MG es un color marrón claro, de flujo libre, sin polvo microgranulado con un tamaño medio de partícula de alrededor de 300 micras. Los productos cumplen con la FAO / OMS del JECFA y FCC recomienda especificaciones de enzimas de grado alimenticio, complementados con los límites máximos de 5 x 104/g para el recuento viable total.

Los componentes activos de neutrasa son fácilmente solubles en agua en todas las concentraciones que se producen durante el uso normal. Las condiciones óptimas de trabajo para Neutrase son a 45 °C - 55 °C y pH 5,5 - 7,5. Neutrasa puede es inactivado por tratamiento térmico por 2 minutos a 85

°C. (Novo Nordisk, 2012).