Posteriormente realizó sus estudios de posgrado en la Maestría en Sanidad Vegetal en el Departamento de Parasitología Agrícola de la Universidad Autónoma de Chapingo. 4 Medias de incidencia promedio (porcentaje de plantas con pudrición de raíz según genotipo) análisis combinado en dos años y análisis individuales para cada año………. Negro Productor' fue el más tolerante y 'Negro Chapingo' el más susceptible, los cuales fueron analizados molecularmente, no mostrando evidencia de expresión de proteína PR.
INTRODUCCIÓN
2 El mejoramiento genético ha generado variedades con un buen nivel de resistencia a enfermedades y adaptación a todas las áreas productoras de frijol del trópico húmedo de México. Se necesita más investigación sobre el comportamiento patológico de diferentes materiales genéticos, que permita seleccionar y/o generar nuevas variedades con mejores características, reduciendo la contaminación ambiental y mejorando la calidad del grano.
OBJETIVOS
HIPÓTESIS
REVISIÓN DE LITERATURA
Investigaciones relacionadas a enfermedades del frijol
Se cree que la presencia de elementos genéticos involucrados en la transposición y movilización, ubicados en los bordes del fragmento, es una isla de patogenicidad (Aguilera et al., 2006). Este descubrimiento nos permite comprender mejor los mecanismos de defensa y la resistencia contra Fop y patógenos similares (Xue et al., 2015). Este aporte es importante para los programas de mejoramiento de frijol que constantemente necesitan nuevas fuentes de resistencia a la antracnosis (Álzate et al., 2003).
Investigaciones referentes al frijol en el campo agrícola
Se evaluaron tres variedades diferentes de frijol (Pinto Laguna, Pinto Americano y Pinto Saltillo) en condiciones óptimas y subóptimas de humedad edáfica y su impacto en el patosistema en el período marzo-mayo. No hubo efecto significativo sobre el patosistema del frijol por efecto del contenido de humedad, ni por la variedad utilizada para la mancha foliar, ni para la roya común, pero sí hubo efecto significativo para la enfermedad viral y la marchitez. La variedad Pinto Americano fue la más susceptible al desarrollo de la enfermedad por virus del frijol, tanto en términos de incidencia (14,8%) como de severidad (16,2).
Estrategias de defensa de la planta ante los patógenos: Proteínas relacionadas con
- Defensinas
Las PR forman parte de un mecanismo de resistencia inducible, que generalmente se expresa en gran parte de los tejidos vegetales al inicio de la infección (López et al., 2014). Existen diferentes tamaños moleculares en diferentes proteínas PR, típicamente de 5 a 75 kDa (Sels et al., 2008). PR-1 se ha encontrado en varios cultivos, incluidos los frijoles, donde fueron designados PvPR1 y PvPR2 (Walter et al., 1990).
Son polipéptidos de 200 aminoácidos que comparten similitud de secuencia con la taumatina, una proteína de sabor dulce (Rout et al., 2016). Aunque tienen múltiples funciones y actividad antimicrobiana en las plantas, las defensinas se han observado principalmente contra hongos (Lacerda et al., 2014). Se expresan en semillas, mientras que otros están regulados o inducidos durante el desarrollo por diversos factores de estrés abióticos (frío, sequía, metales pesados, deficiencia de potasio) y bióticos (patógenos microbianos) (Sels et al., 2008).
Tienen una distribución muy amplia en todos los reinos eucariotas conocidos: hongos, plantas, animales y recientemente fueron demostrados en un organismo bacteriano (Silva et al., 2014). Se cree que la permeabilización de la membrana parece ser solo uno de una amplia variedad de mecanismos de acción de estas moléculas, aunque algunos estudios sugieren objetivos intracelulares (Lacerda et al., 2014). Aunque se encontró que la sobreexpresión de PDF1.1 confiere resistencia en plantas de Arabidopsis al patógeno Cercospora beticola (Reza, et al., 2016).
El gen PDF1.2 de Arabidopsis se utiliza a menudo como marcador para la caracterización de la respuesta inmune dependiente de jasmonato (Brown et al., 2003).
Fundamento de la extracción de ARN para su uso en PCR
25 que codifican proteínas que proporcionan resistencia a herbicidas e insectos y plagas, aún no existe ninguna planta transgénica disponible contra hongos fitopatógenos, ni tampoco ninguna que contenga defensinas vegetales como factor de resistencia (Lacerda et al., 2014). Todos estos elementos interactúan en las tres etapas principales que componen la PCR: desnaturalización, hibridación y extensión. Los equipos donde se lleva a cabo la reacción se denominan termocicladores, los cuales están diseñados para establecer un sistema homogéneo donde las condiciones necesarias de temperatura y tiempo no cambian en cada uno de los ciclos.
Al final de la reacción, para confirmar si la secuencia objetivo de interés ha sido amplificada, los productos de la PCR o también llamados amplicones se analizan en geles de agarosa para confirmar si la reacción fue exitosa (Tamay de Dios et al., 2013).
MATERIALES Y MÉTODOS
- Localización del experimento
- Tratamientos
- Diseño experimental
- Manejo del cultivo
- Variables evaluadas
- Identificación en campo de las enfermedades
- Análisis de sanidad de las semillas
- Análisis de patógenos en el suelo
- Análisis molecular para detectar Proteínas PR y defensinas
- Muestras vegetales
- Extracción de ARN de las muestras vegetales
- PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) para los genes de interés
- Análisis estadístico
El herbicida utilizado fue la mezcla de Fomesafen 750 ml + Metalaclor 1 lha-1 al día siguiente de la siembra y durante el ciclo de cultivo el manejo de malezas fue manual. La evaluación de la variable PS se realizó cada 10 días, iniciando la evaluación a los 47 días, revisándose semanalmente el cultivo para detectar síntomas actuales de cada una de las enfermedades, en cada una de las 8 plantas marcadas, el porcentaje de daño a folíolos y vainas utilizando la escala visual modificada de y 100 del manual de la Sociedad Estadounidense de Fitopatología 1971 (Un manual de claves de evaluación para enfermedades de plantas) (James, 1971). Para PI se contaron las plantas con síntomas radiculares, dando el valor 0 y 1 (0 = sanas y 1 = enfermas), hasta el final del ciclo, y se determinó la proporción con relación al total, para finalmente construir una enfermedad. curva de progreso.
Cinco días después observaron la tinción y crecimiento de las cepas, tomaron parte del micelio y prepararon preparados con lactofenol y los colocaron uno a uno bajo el microscopio, determinando el patógeno involucrado mediante identificación morfológica (Pastor y Shwartz, 1994). De 250g solo se tomó 1g el cual se diluyó en un tubo con 100ml de agua destilada estéril del cual se tomó 1ml y se diluyó nuevamente en otro tubo así hasta la tercera muestra de la cual se tomó 1ml y se colocó en medio de cultivo PDA. para permitir el crecimiento de microorganismos. Para detectar la presencia/ausencia de proteínas PR y el gen defensina en genotipos de frijol, se realizó un análisis molecular siguiendo los pasos de obtención de muestras de plantas, extracción de ARN y finalmente desarrollo de la técnica de PCR (reacción en cadena). .Polimerasa) para cada una de las muestras.
Las muestras de material vegetal se recolectaron de los genotipos Chapingo negro y productor negro en tres etapas del desarrollo fenológico del cultivo: primeras hojas verdaderas (V3:19 dds), prefloración (R5: 39 dds) y formación de vainas (R7). : 68 dds). ), cinco muestras para cada genotipo en cada etapa. Con base en el protocolo de extracción de ARN modificado por el método del trizol (Farell, 2010), las muestras de plantas congeladas se procesaron con cinco réplicas. El resultado de la extracción se cuantificó utilizando NanoDrop y la integridad se verificó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%.
La PCR en conjunto con transcripción inversa (RT-PCR) fue la técnica utilizada para estimar la presencia del gen de interés (PR1, PR-5 y proteínas defensina) siguiendo el protocolo modificado de Farell (2010) donde se obtuvo el primer ADNc de de las muestras de ARN, se estabilizaron las condiciones de amplificación del termociclador según los cebadores utilizados (el gen de defensa (F: 5'-GGGACGTAACAGATAC-3' .. CGTACAGGCTGCAACTTTGA-3' y R: 5'- AGTGAAGGTGCTCGTTCGT-3') para obtener un producto de PCR, cuya calidad fue verificada mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% y visualizada en un fotodocumento Bio-Rad® utilizando el software GelDoc.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
- Análisis de la sanidad de semillas y suelo
- Resultados en campo: ciclo PV-2015 y PV-2016
- Rendimiento promedio de genotipos en 2 años
- Análisis molecular de los genotipos
En ambos años se observó que todos los genotipos presentaron más de una enfermedad durante el ciclo de la planta (Cuadro 1A). Valor ABCPE promedio de la gravedad de la enfermedad: antracnosis de la vaina, antracnosis de la hoja, tizón común y halo, en un análisis conjunto para diferentes genotipos a lo largo de los ciclos PV-2015 y PV-2016. Se detectaron diferencias altamente significativas entre genotipos respecto a la enfermedad de antracnosis, aunque no se detectó resistencia total en ninguno de los genotipos evaluados, ya que todos presentaron presencia de síntomas de la enfermedad.
La severidad de la enfermedad Antracnosis en vaina mostró diferencias altamente significativas (P<0.0001) en términos de año y genotipo e interacción año x genotipo, lo que coincidió con la antracnosis foliar en los genotipos que mostraron mayor y menor área bajo la curva de progresión de la enfermedad. Los genotipos mostraron diferencias altamente significativas (P < 0.0001) para el análisis del ABCPE de la mancha blanca, los cuales formaron tres grupos en la separación múltiple de medias, considerando al genotipo Élite como el más afectado por la enfermedad y al Blanco Tabasco el más afectado. que produjo el menor daño. La mancha redonda provocó diferencias significativas (P = 0.0227) entre genotipos, las cuales fueron decisivas para el desarrollo de la enfermedad, contrastando la separación de medias en tres grupos, siendo los genotipos Flor de mayo 67 los más afectados y el productor negro el menos afectado. la enfermedad (Figura 5).
Esto coincide con lo mencionado por López et al. 2015), que los genotipos de mayor rendimiento mostraron resistencia a la antracnosis y los de menor rendimiento fueron los más susceptibles a diversas enfermedades. No es la primera vez que esto sucede, Gallego et al. 2010), en un análisis de genotipos de frijol utilizando marcadores moleculares tipo SCAR, no encontró la presencia de genes relacionados con la resistencia a la antracnosis en el material estudiado, justificando que no se han evaluado los genotipos adecuados. En el presente estudio se cree que diferentes factores bióticos y abióticos afectaron los resultados, ya que las muestras de los genotipos evaluados fueron tomadas del experimento establecido en campo y los tiempos no fueron los suficientes como se debía realizar.
Electroforesis en gel de agarosa de ARN de los genotipos Negro productor y Negro Chapingo extraídos de hojas de frijol.
CONCLUSIONES
RECOMENDACIONES
LITERATURA CITADA
Avances en la selección de fuentes de resistencia a las principales enfermedades del frijol común (Phaseolus vulgaris L.) en Costa Rica. Resistencia genética y control químico de la roya del frijol en el trópico húmedo de México. 2008. Marcadores moleculares en el mejoramiento genético de la resistencia a enfermedades del frijol (Phaseolus vulgaris L.): aplicaciones y perspectivas.
Fenología y rendimiento de variedades de frijol (Phaseolus vulgaris L.) de diversos orígenes en tres fechas de siembra. Factores genéticos y ambientales relacionados con la dinámica temporal y efecto de enfermedades en frijol (Phaseolus vulgaris L.) en Marín, Nuevo León, México. Resistencia del frijol a la enfermedad del halo en el Valle de México y progresión de la enfermedad.
Sanidad fitosanitaria de tres variedades de frijol (Phaseolus vulgaris L.) en condiciones favorables y desfavorables de humedad del suelo. Conceptos básicos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la PCR en tiempo real. Genes expresados diferencialmente en genotipos de frijol común (Phaseolus vulgaris L.) resistentes y susceptibles en respuesta a Fusarium oxysporum f.
Medias de prevalencia media (porcentaje de plantas con pudrición de raíz por genotipo) combinadas y análisis anual. Valor promedio del ABCPE de la severidad de las enfermedades: mancha blanca, mancha redonda y roya para los diferentes genotipos durante el ciclo PV-2015. Resultados de la variable rendimiento para los diferentes genotipos evaluados y separación de medias del análisis combinado.
